Universidad Autnoma del Estado de Mxico. Facultad de Qumica. Licenciatura: Qumico Farmacutico Bilogo.

Laboratorio Integral de Farmacologa

Prctica No 5.2 Evaluacin de la absorcin intestinal de un frmaco.

Equipo No 9 Espinoza Galn Julio Cesar Gmez Ruiz Eduardo Gama Domnguez Yunun Prez de Len Rafael

Grupo 72

Realizacin de la prctica: 3/Septiembre /2012 Entrega del reporte: 10/Septiembre/2012

PRCTICA NO 5.2 EVALUACIN DE LA ABSORCIN INTESTINAL DE UN FRMACO. Objetivo: Evaluar la absorcin de un frmaco en una preparacin de intestino invertido in vitro y determinar la influencia del pH en el proceso de absorcin. Marco terico

La barrera gastrointestinal que separa el lumen del estmago e intestino de la circulacin sistmica y de los sitios de accin de frmacos, es una estructura compleja que tiene la caracterstica de comportarse como una membrana semipermeable, permitiendo el paso de muchos compuestos qumicos, as como retardando o previniendo el paso de otros. Las molculas liposolubles, as como molculas pequeas y algunos iones son fcilmente absorbidos a travs del tracto gastrointestinal por difusin pasiva. Por otro lado las molculas altamente polares tambin son absorbidas por mecanismos de transporte activo. Existen factores fisiolgicos que influyen en la absorcin gastrointestinal como son: el pH, el sitio de absorcin, los movimientos peristlticos, entre otros.
pH de los fluidos gastrointestinales Los rangos de pH en los fludos presentes en los segmentos del tracto gastrointestinal son: estmago, pH 1 a 3; intestino delgado, pH 5 a 7, e intestino grueso, pH 8. La influencia del pH es uno de los factores ms importantes en la absorcin de frmacos segn la hiptesis de particin - pH. La mayora de los frmacos que son cidos o bases dbiles se absorben en mejores condiciones en su forma no ionizada debido a su capacidad de difundir a travs de las membranas biolgicas cuando sta es suficientemente liposoluble. El grado de ionizacin de un frmaco depende de su constante de disociacin o pKa y del pH del medio en el cual se disuelve. As podra esperarse que la absorcin de bases dbiles sea ptima en el intestino cuando se encuentran no ionizadas. Por el contrario, los fluidos gstricos cidos tienden a retardar la absorcin de bases dbiles, pero promueven la absorcin de frmacos dbilmente cidos. El intestino delgado es la zona del tracto gastrointestinal que presenta las mejores condiciones fisiolgicas para la absorcin tanto de bases como de cidos. Entre los factores que pueden modificar el pH de los fluidos gastrointestinales se pueden mencionar: Estado de ayuno, perodo en el cual el pH del fluido gstrico vara entre 1 y 2. Ingestin de alimentos, causa ms frecuente de cambios en la acidez, lo que provoca un aumento del pH a 3 o ms en individuos normales. Otros factores son lo estados emocionales, frmacos (anticidos, anticolinrgicos, etc.) y patologas gastrointestinales. Vaciamiento gstrico

La mayora de los frmacos se absorbe mejor en el intestino delgado, de all que el vaciamiento gstrico tenga gran importancia, pudiendo ser, en algunos casos, el factor limitante del proceso de absorcin. Se ha observado en forma experimental que el vaciamiento gstrico sigue una cintica de primer orden respecto al volumen del contenido gstrico. Esta relacin no es estrictamente lineal, ni al principio ni al final del proceso. Un vaciamiento gstrico rpido es recomendable en el caso de formas farmacuticas entricas o de accin sostenida que deben liberar el frmaco en el intestino; aquellas que contienen un frmaco que se disuelve solamente en el medio intestinal; frmacos inestables en el medio gstrico o que se metabolizan a ese nivel; frmacos que se absorben solamente en porciones distales del intestino. Entre los factores que pueden modificar el vaciamiento gstrico destacan: El volumen de lquido ingerido con el medicamento favorece la liberacin y disolucin del frmaco por el aumento del volumen de disolucin, por una parte, y como consecuencia de la disminucin de la viscosidad del medio. Estos dos factores aceleran el vaciamiento gstrico. La presencia de alimentos en el estmago disminuye el vaciamiento gstrico. La temperatura, viscosidad y composicin de la dieta pueden modificar la velocidad de vaciamiento; por ejemplo, los slidos duplican el tiempo de vaciamiento con respecto a los lquidos. La ingestin de algunos medicamentos (anticolinrgicos, alcohol, analgsicos, narcticos) reduce el vaciamiento gstrico y la metoclopramida lo aumenta.

Material Estuche de diseccin Varilla de vidrio Jeringas de 3 y 5mL Vaso de precipitado 500mL Espectrofotmetro y celdas de lectura Bao de temperatura controlada a 37C Pipetas graduadas de 1 y 5mL Tubos de ensaye

Reactivos Salicilato de sodio Solucin de HCl 0.01N y 0.1N Solucin Tyrode (2L por equipo) Reactivo de Trinder

RESULTADOS Equipo 9 Concentracin 0 20 40 60 80 100 Absorbancia 0 0.036 0.113 0.166 0.227 0.267 A 0.3 b 0.25 s 0.2 o 0.15 r b 0.1 a 0.05 n 0
0

CURVA DE CALIBRACION

Concentracion

50

100

150

Concentraciones de Salicilato Absorbido en la regin Duodenal a pH=7 Tiempo 0 10 20 40 60 Absorbancia 0.083 0.098 0.102 0.112 0.115 Concentracin 31.5 36.85714286 38.28571429 41.85714286 42.92857143 Conc. Acumulada 31.5 68.35714286 106.6428571 148.5 191.4285714

Concentraciones de Salicilato Absorbido en la regin Duodenal a pH=2 Tiempo 0 10 20 40 60 A. pH 2 0 0.036 0.113 0.166 0.227 Concentracin 0 14.71428571 42.21428571 61.14285714 82.92857143 Conc.Acumulada 0 56.92857143 99.14285714 160.2857143 243.2142857

Grafica Concentracin acumulada vs Tiempo a pH7 Absorcin de Salicilato en el intestino

250

C O N C A C U M U L A D

200 150 100 50 0 0 20

y = 3.5513x R = 0.7597

Conc. Acumulada Linear (Conc. Acumulada)

40

60

80

TIEMPO

min

Grafica concentracin acumulada vs tiempo a pH 2

Absorcin de Salicilato en el intestino

300 Concentracion acumulada (g/mL) 250 200 150 100 50 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Tiempo (min)

y = 3.8825x + 10.964 R = 0.991

EQUIPO NUM 1 TIEMPO (min) 0 10 20 40 60 CONCENTRACION ABSORBIDA ACUMULADA (ug/mL) 5.8 17.5 37.8 70.5 75.5

C O N C E N T R A C I O N

80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 20 40 60 80

TIEMPO

EUIPO NUM 2 CONCENTRACIN(g/ml) 100 80 60 40 20 0 ABSORBANCIA 0.682 0.482 0.43 0.262 0.2 0

Tiempo 0 10 20 40 60

Absorbancia 0 0.35 0.458 0.55 0.677

Concentracion 0 54 72 87.33 108.5

Concentracion Acumulada 0 54 126 213.33 321.83

EQUIPO 3

TIEMPO (min) 0 10 20 40 60

CONCENTRACION (ug/mL) 8 43.9 33 46 52.5

Conc. Acum 8 51.9 84.9 130.9 183.4

C O N C A C U M

250 200 150 100 50 0 0 10 20 30 40 50 60 70 y = 3.2381x R = 0.9477

TIEMPO

EQUIPO NUM 4 Curva Cal Conc 20 40 60 80 100

Absorbancia 0.129 0.256 0.395 0.509 0.63

Tiempo 0 10 20 40 60

Absorbancia 0.01 0.365 0.57 0.989 1.118

Concentracion 0.428571429 56.77777778 89.31746032 155.8253968 176.3015873

Conc. Acumulada 0.428571429 57.20634921 146.5238095 302.3492063 478.6507937

EQUIPO NUM 5 CONCENTRACIN(g/ml) 100 80 60 40 20 ABSORBANCIA 0.658 0.053 0.038 0.02 0.012

CURVA DE CALIBRACION

Tiempo 0 10 20 40 60

Absorbancia 0.001 0.012 0.021 0.034

Concentracion 0 42.16666667 43.66666667 45.83333333

Conc. Acumulada 0 42.16666667 85.83333333 131.6666667

EQUIPO NUM 6 Tiempo (min) 0 10 20 40 60 Absorbancia 0 0.475 0.672 0.892 Concentracin (g/mL) 0 52.08 73.73 97.91 ----

1 0.8 0.6 Absorbancia Series1 0.4 0.2 0 0 -0.2 20 40 60 80 100 120 Linear (Series1) Linear (Series1)

Concentracin (g/mL)

EQUIPO 7 Tiempo (minutos) 0 10 20 40 60 Absorbancia 0.018 0.052 0.054 0.057 0.069 Concentracin (g/mL) 5.875 10.125 10.375 10.75 12.25 Cantidad absorbida acumulada (mg) 29.375 50.625 51.875 53.75 61.25

EQUIPO 8 Tiempo de absorcin (min) 0 10 20 40 60 Absorbancia de la muestra Concentracin de la muestra /mL 0 52.375 76.125 78.265 ---------Concentracin acumulada /mL 0 52.375 128.5 206.765 ----------

0 0.39 0.58 0.6 No se realiz

EQUIPO 10 Tiempo 0 10 20 40 60 Concentracin 0 10 19 25 32 Cantidad absorbida acumulada 0 10 29 54 86

DISCUSIN DE RESULTADOS

CONCLUSIONES Los factores que condicionan el grado de ionizacin del frmaco y por lo tanto su absorcin son el peso molecular, la liposolubilidad y el carcter cido o alcalino, as como el pKa y pH. El Acido acetil saliclico presenta ligeramente mejor absorcin a pH=2. Los fluidos gstricos cidos tienden a retardar la absorcin de bases dbiles, pero promueven la absorcin de frmacos dbilmente cidos. El intestino delgado es la zona del tracto gastrointestinal que presenta las mejores condiciones fisiolgicas para la absorcin tanto de bases como de cidos.

CUESTIONARIO 1. Explique como influyen en la absorcin gastrointestinal los siguientes factores: pH del contenido luminal y concentracin del frmaco y contraste lo descrito en la literatura con los resultados obtenidos en este estudio. pH: los frmacos que son cidos o bases dbiles se absorben mejor en su forma no ionizada debido a su capacidad de difundir a travs de las membranas biolgicas. A pH acido estarn no ionizados los cidos dbiles; a pH ligeramente cido casi neutro sern las bases dbiles las que estn no ionizadas. Los rangos de pH en los segmentos del tracto gastrointestinal son: estmago, pH 1 a 3; intestino delgado, pH 5 a 7, e intestino grueso, pH 8. Conociendo los valores de pH se espera que los cidos dbiles sean absorbidos en el estomago y las bases dbiles en el intestino delgado; si es modificado el pH del intestino se podrn absorber cidos dbiles. El salicilato de sodio es un cido dbil y se espera que sea absorbido mayormente a pH=2, sin embargo los resultados globales muestran una absorcin similar para pH=2 y pH=7, ay un par de tablas donde se observa una mayor absorcin a pH=2. Concentracin: se espera que a mayor concentracin la absorcin sea mayor; este factor no se pudo determinar ya que no ay datos suficientes, en varios casos el intestino se rompi y las determinaciones fueron errneas. Se observa que a mayor tiempo aumenta la absorcin. 2.- Qu otros factores influyen en la absorcin de un frmaco a travs de esta va - Vaciamiento gstrico (es recomendable un vaciamiento rpido en el caso de formas farmacuticas entricas o de accin sostenida que deben liberar el frmaco en el intestino; aquellas que contienen un frmaco que se disuelve solamente en el medio intestinal; frmacos inestables en el medio gstrico) - Motilidad (a mayor motilidad menor tiempo de permanencia y por lo tanto menor absorcin) - Metabolismo de frmacos en el tubo gastrointestinal (enzimas presentes en el tracto gastrointestinal, sean de origen endgeno o de la flora entrica, pueden degradar ciertos frmacos, por ejemplo, peptdicos (insulina, oxitocina)) - Alimentos y frmacos estimulan el flujo y secrecin biliares. Las sales biliares por su carcter tensoactivo, pueden aumentar la velocidad de disolucin de frmacos liposolubles y por lo tanto favorecer su absorcin intestinal. Por otra parte las sales biliares forman complejos insolubles y no absorbibles con la neomicina, kanamicina y estreptomicina. Tambin se ha encontrado que estas sales inactivan a nistatina, polimixina y tubocurarina. - Metabolismo heptico (el frmaco absorbido pasa primero por el hgado donde pueden experimentar procesos de metabolizacin y/o excrecin biliar, puede haber una prdida de una fraccin de la dosis administrada o producir un metabolito activo). 3. Se puede determinar el mecanismo de transporte del frmaco evaluado? Si es as proponga, con base en sus resultados el mecanismo de transporte, en caso de que considere que esto no es posible proponga las modificaciones que seran necesarias realizar al experimento para determinar este mecanismo. No se puede determinar el mecanismo de transporte especfico. Se sospecha de una difusin pero no se sabe si es simple o facilitada, una manera de diferenciarlas es realizar un grafica de concentracin vs velocidad de transporte y observar el comportamiento de la misma; una grafica lineal nos indica difusin pasiva, mientras que una tendencia asinttica indica que es una difusin facilitada. 4. A qu conclusiones llega con los resultados obtenidos? El salicilato de sodio presenta una ligera mejor absorcin a pH=2. El intestino es un rgano delicado y debe manejarse con cuidado para no daarlo.

ARTICULO ADME Evaluation in Drug Discovery. 8. The Prediction of Human Intestinal Absorption by a Support Vector Machine El presente artculo, habla de que la absorcin intestinal humana es un factor importante en la formulacin de sustancias farmacolgicas nuevas. En modelos de silco para predecir el porcentaje de absorcin intestinal calculados a base de descriptores moleculares son muy necesarios por la rpida estimacin de esta propiedad. En el presente se estudio el rendimiento de una maquina de vector de soporte (SMV) para clasificar los componentes con altos o bajas fracciones de absorcin (mayor o menor de un 30%) El conjunto de datos analizados consistan en 578 diversas estructuras moleculares farmacuticas que fueron divididas en 480 molculas de entrenamiento, y 98 molculas de prueba. Diez modelos de clasificacin en la mquina de vector de soporte fueron generados para investigar el impacto en las diferentes propiedades moleculares individuales. Entre estos estudios descriptores de importantes molculas, en la zona de superficie polar topolgica se predijo un coeficiente aparente de de distribucin de octanol-agua a un ph de 6.5 mostrando un mejor rendimiento de clasificacin que otros. Para obtener el mejor clasificador de SVM, las influencias de las diferentes funciones del kerel y diferentes combinaciones de descripciones moleculares, fueron investigados usando un riguroso procedimiento de validacin. El mejor clasificador SVM puede dar predicciones satisfactorias para el conjunto de entrenamiento (97,8% para la clase de mala absorcin y el 94,5% para la clase de buena absorcin). Adems, 100% de la clase de mala absorcin y 97,8% de la clase de buena absorcin en el equipo de prueba externo podra ser clasificado correctamente. Por ltimo, la influencia del tamao del conjunto de entrenamiento y el desequilibrio del conjunto de datos se han estudiado. El anlisis demuestra que gran conjunto de datos es necesario para la estabilidad de los modelos de clasificacin. Por otra parte, los pesos de la categora de mala absorcin y la buena clase de absorcin deben hacerse de manera armoniosa para generar modelos recomendaciones clasificacin. El trabajo demuestra que las SVM utilizadas en combinacin con simples descriptores moleculares puede proporcionar una evaluacin muy fiable de la absorcin intestinal en una de los primeras proceso de filtrado de silico.
REFERENCIA: ADME Evaluation in Drug Discovery. 8. The Prediction of Human Intestinal Absorption by a Support Vector Machine Tingjun Hou* Department of Chemistry and Biochemistry, Center for Theoretical Biological Physics, University of California at San Diego, La Jolla, California 92093, Junmei Wang Encysive Pharmaceuticals, Inc., 7000 Fannin St., Houston, Texas 77030, Youyong Li Materials and Process Simulation Center, California Institute of Technology, Pasadena, California 91125 Received June 12, 2007

ACTIVIDADES PREVIAS 1. Investigue y elabore un diagrama del mecanismo de accin del carbacol y la atropina Carbacol El carbacol presenta una importante actividad nicotnica tanto sobre ganglios autnomos como sobre placa motora del msculo esqueltico. La activacin de los receptores nicotnicos ganglionares origina un potencial sinptico excitador rpido que dispara potenciales de accin en las neuronas posganglionares. Los efectos resultantes reproducen a los de la activacin de sistemas nerviosos simpticos y parasimpticos, con predominio de efectos del simptico sobre aparato cardiovascular, y del parasimptico sobre el aparato digestivo y el tracto genitourinario. En msculo esqueltico, origina un potencial en la placa motora que promueve la contraccin muscular.

Atropina Un antagonista muscarnico, afn a todos los subtipos de receptores muscarnicos, comportandose como agonista competitivo de estos. En concentraciones superiores a su constante de afinidad, adopta otros mecanismos.

1. Investigue y documente los frmacos agonistas y antagonistas colinrgicos actualmente en uso y las enfermedades a los cuales estn dirigidos.

Clasificacion de Drogas Parasimpaticomimeticas o Colinergicas. 1. Esteres de Colina: Son colinrgicos de accin directa sobre los receptores de clulas efectoras y algunos ejemplos son la acetilcolina, metacolina, carbacol y el betancol. 2. Inhibidores de la Acetilcolinesterasa o agentes anticolinesterasas: Son colinrgicos de accin indirecta que potencian la acetilcolina endgena y se clasifican en dos: De accin reversible: Neostigmia (Prostigmin), Fisostigmina (Eserina), Piridostigmina (Mestinon), Edrofonio (Tensilon) y Ambenomium (Mytelase). De accin irreversible, (compuestos organofosforados): Ecotiofato (Fosfolina), Malathion, Parathion, Paraoxon, Diisopropilfluorofosfato (DFP), Tetraetilpirofosfato (TEPP), Tabun, Sarin y Soman. 3. Alcaloides Colinomimeticos: Son de accin directa en receptores colinrgicos de clulas efectoras y algunos ejemplos son la pilocarpina, muscarina y la arecolina. Usos Teraputicos de los Agentes Parasimpaticomimeticos. 1. Glaucoma: Los agentes colinrgicos son tiles para reducir la presin intraocular del glaucoma primario, de ngulo estrecho o amplio. El tratamiento farmacolgico se realiza para evitar ataques profilcticos agudos, para disminuir la presin intraocular. Los frmacos colinrgicos usados son los agentes anticolinesterasa como la fisostigmina, el ecotiofato, la pilocarpina y en casos de resistencia o tolerancia a estos agentes, se usa carbacol o una mezcla de pilocarpina y fisostigmina. 2. Miastenia gravis: Es una enfermedad autoinmune causada por la produccin de anticuerpos y antireceptores nicotnicos de la placa neuromuscular. La reaccin autoinmune produce un incremento de la degradacin de los receptores y una reduccin

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marcada de los mismos. La enfermedad produce debilidad muscular, fatigabilidad, y alteraciones de la funcin muscular estriada. La administracin de agentes anticolinesterasas como la neostigmina y la piridostigmina, al incrementar la concentracin de acetilcolina en la placa neuromuscular, mejora ostensiblemente el cuadro clnico. Atona e leo paraltico de la vejiga urinaria y del intestino: Estos cuadros aparecen en el periodo postoperatorio o en el postparto. La vejiga hipotnica o neurognica ocurre en casos de traumatismo e injuria de la mdula espinal. Los agentes colinrgicos son usados para incrementar el tono, la motilidad y el peristaltismo del estmago, intestino y vejiga. El betancol es el ster de la colina de mayor uso (va oral o parenteral) y la neostigmina, va parenteral. Aparato cardiovascular: Anteriormente los agentes colinrgicos, sobre todo el edrofonio, fueron utilizados para el tratamiento de taquiarritmias supraventriculares, taquicardia paroxstica supraventricular y fibrilacin auricular. Intoxicacin por agentes anticolinrgicos: En casos de intoxicacin atropnica o con antidepresivos tricclicos o algunos antihistamnicos, se utilizan agentes anticolinesterasa como la neostigmina. El bloqueo de los receptores muscarnicos puede ser anulado aumentando la concentracin de acetilcolina en la terminal colinrgica (antagonismo es competitivo). Si la intoxicacin cursa con efectos centrales, delirio atropnico, es conveniente el uso de fisostigmina por su mayor penetracin a travs de la barrera hematoenceflica. Recuperacin del bloqueo neuromuscular por drogas tipo curare: La d-tubocurarina y derivados se usan en el acto quirrgico para obtener relajacin muscular, como complemento de la anestesia general. La relajacin muscular es necesaria frecuentemente en cirugas complejas, sobre todo digestivas, con tironeamiento de mesos y accesos profundos, para ello se usa el curare u otros bloqueadores neuromusculares antidespolarizantes como el pancuronio, la administracin de neostigmina, al final de la ciruga, eleva la concentracin de acetilcolina en la placa neuromuscular y por antagonismo competitivo desaloja al bloqueador con recuperacin de la actividad muscular. Enfermedad de Alzheimer: Es una demencia progresiva, con afectacin marcada de la memoria, en la que se observ un dficit funcional de las neuronas colinrgicas en ciertas estructuras del SNC. La administracin de fisostigmina y un nuevo anticolinesterasa de buen pasaje al cerebro, llamado tacrina, incrementando la disponibilidad de acetilcolina central, ha producido algunos resultados favorables, sobre todo si se administran al comienzo de la enfermedad. La enfermedad de Alzheimer es un cuadro muy complejo con intervencin de mltiples factores, no solamente con dficit colinrgico, por lo que los resultados son adems variables.

Referencias: Lorenzo Fernandez Pedro. Velazquez: Farmacologa Bsica y Clnica. Mdica panamericana. 2008. Pp. 124-126, 135-136 http://www.uam.es/departamentos/medicina/farmacologia/especifica/F_General/FG_T14.pdf