FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS DIVISION DE ESTUDIOS SUPERIORES

"ANALISIS DE ALGUNAS CARACTERISTICAS FISICAS Y QUIMICAS DE UN BIOPOLIMERO PRODUCIDO POR Klebsiella pneumoniae EN UN PROCESO DE FERMENTACION SIMPLE."

m w m m m m m .

COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRIA EN CIENCIAS CON ESPECIALIDAD EN INGENIERIA CERAMICA

MONTERREY, N. L, MEXICO DE 1999

TM Z5521 FCQ 1 999 07

1020126079

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEN FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

DIVISIN DE ESTUDIOS SUPERIORES

" ANLISIS DE ALGUNAS CARACTERSTICAS FSICAS Y QUMICAS DE UN BIOPOLMERO PRODUCIDO POR Klebsiella pneumoniae EN UN PROCESO DE FERMENTACIN SIMPLE."

POR CARLOS EMILIO OROZCO MAGDALENO

Como requisito parcial para obtener el grado de MAESTRA EN CIENCIAS con Especialidad en Ingeniera Cermica

FEBRERO DE 1999

FONDO TESIS

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE NUEVO LEN

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS
DIVISIN DE ESTUDIOS SUPERIORES

LA TESIS PRESENTADA POR EL Sr. CARLOS EMILIO OROZCO MAGDALENO, TITULADA : " ANLISIS DE ALGUNAS CARACTERSTICAS FSICAS Y QUMICAS DE UN BIOPOLMERO PRODUCIDO POR Klebsiella pneumoniae EN UN PROCESO DE FERMENTACIN SIMPLE "

HA SIDO ACEPTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OPTAR AL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS CON ESPECIALIDAD EN INGENIERIA CERMICA

c
MC. SERGIO FE
ASESOR

NDZ DELGADILLO NODAL

Dr. JAVIER MACO^SAY TORRES

CO-ASESOR Y SINODAL

Dr. ERNESTO URETA BARRON

REVISOR Y SINODAL

Dr. A R M A N D O D^RCA L U N A REVISOR Y SINODAL

COORDINADO? DE LA ESCUELA DE GRADUADOS EN CIENCIAS

MARTH/

JUAREZ/HERR E RA

CONTENIDO
NDICE DE ESQUEMAS NDICE DE FIGURAS NDICE DE TABLAS ABREVIATURAS CAPITULO 1 1.1 Introduccin 1.2 Objetivos CAPITULO 2 MATERIALES Y MTODOS. 2.1 Descripcin de equipos y reactivos 2.1.1 Reactivos 2.1.2 Equipos 2.2 Obtencin del microorganismo 2.3 Diseo del medio de cultivo empleado 2.4 Funcin de los micronutrientes 2.5 Composicin del medio empleado 2.6 Composicin de los micronutrientes 2.7 Escalamiento 2.8 Proceso de fermentacin 2.9 Curva de crecimiento 2.10 Determinacin de azcares reductores (3,5 DNS) 2.10.1 Preparacin de los reactivos 2.10.2 Preparacin de la curva de calibracin 2.10.3 Preparacin de las muestras 2.11 Determinacin del pH 2.12 Obtencin del exopolisacrido 2.13 Tcnicas instrumentales de caracterizacin 2.13.1 Anlisis del EPS por FT-IR 2.13.2 Anlisis del EPS por RMN 2.13.3 Anlisis trmico de EPS 2.13.3.1 Anlisis trmogravimetrico (TGA) 2.13.3.2 Anlisis trmico diferencial (DTA) 2.13.4 Espectroscopia de absorcin atmica 2.13.5 Cromatografa 2.13.6 Propiedades reolgicas del EPS pgina ii jjj iv v

1 16

17 17 19 20 20 22 22 23 23 25 27 29 30 30 31 31 32 34 34 36 40 41 42 44 45 49

CAPITULO 3 RESULTADOS. 3.1 Identificacin del microorganismo 3.2 Curva de calibracin 3.3 Parmetros de la fermentacin 3.4 Resultados de obtencin de exopolisacrido 3.5 Resultados de FT-IR 3.6 Anlisis trmico de exopolisacrido 3.7 Anlisis del agente polimerizante por absorcin atmica 3.8 Anlisis del exopolisacrido por RMN 3.9 Anlisis de la viscosidad del exopolisacrido 3.10 Cromatografa CONCLUSIONES APENDICE Figuras Figuras Figuras Figuras Figuras del microorganismo de la fermentacin del proceso de separacin del exopolisacrido del biopolmero en pelcula del biopolmero hmedo y seco

51 52 53 57 59 62 65 66 69 70 72

73 74 75 76 77 78

REFERENCIAS

NDICE DE ESQUEMAS 1.1 Amilosa 1.2 Amilopectina 1.3 Celulosa 1.4 Quitina 1.5 Polister 1.6 Xantano 1.7 Gelano NDICE DE FIGURAS 2.1 Diagrama de flujo de la fermentacin batch para la obtencin de exopolisacrido 2.2 Curva de crecimiento tpica de un proceso fermentativo de los microorganismos 2.3 Diagrama de flujo de la obtencin del exopolisacrido 2.4 Termograma tpico de una reaccin de descomposicin 2.5 Curva tpica de un anlisis trmico diferencial 2.6 Diagrama de flujo para la identificacin de azcares reductores 3.1 Curva de calibracin de azcares reductores 3.2 Curva de crecimiento y determinacin de azcares reductores 3.3 Curva de crecimiento y determinacin del pH 3.4 Evolucin de la produccin del exopolisacrido 3.5 pH y concentracin de EPS en funcin del tiempo 3.6 Espectro de FT-IR del exopolisacrido 3.7 Espectro de FT-IR del exopolisacrido hidrolizado con NaOH al 3 % 3.8 Espectros del EPS hidrolizado y sin hidrolizar 3.9 Anlisis trmico del exopolisacrido a las 3 hrs 3.10 Anlisis trmico del exopolisacrido a las 15 hrs 3.11 Anlisis trmico del exopolisacrido a las 24 hrs 3.12 Espectro de RMN del blanco l 3.13 Espectro de RMN H de la muestra 3.14 Viscosidad del exopolisacrido en funcin de la velocidad de rotacin del viscosimetro 3.15 Resultados de la cromatografa en papel

pagine 2 3 4 5 8 12 13

24 29 33 42 43 48 53 55 56 57 59 60 61 62 64 64 64 67 68 69 70

NDICE DE TABLAS 2.1 Parmetros al inicio de la fermentacin 2.2 Estndares para azcares reductores mediante el mtodo cido 3,5-DNS 2.3 Tiempos de toma de muestras 2.4 Ncleos adecuados para el estudio de RMN 2.5 Solubilidad del exopolisacrido en diferentes solventes 3.1 Pruebas bioqumicas 3.2 Resultados de los estndares de azcares reductores 3.3 Cambios fsicos ocurridos durante la fermentacin 3.4 Resultados de los pesos obtenidos del exopolisacrido a diferentes tiempos 3.5 Comparacin de resultados de obtencin de exopolisacrido con otros microorganismos 3.6 Comparacin de temperaturas de descomposicin de exopolisacridos 3.7 Concentracin de iones metlicos divalentes 3.8 Comparacin de los elementos encontrados en % en peso con la goma de xantano 3.9 Resultados de las viscosidades obtenidas con diferentes velocidades de rotacin con 3 diferentes rotores 3.10 Comparacin de los Rf de la muestra y estndares de azcares

26 30 32 38 39 51 52 56 57 58 61 65 65 66 70 71

ABREVIATURAS

c EPS

TGA DTA R.P.M. RMN FT-IR PHA PHB CMC D.O pH

X

nm Um Ug a gfl mi 11

Grados centgrados ExopoHsacrido Anlisis termogravimetrico Anlisis termodiferencial Revoluciones por minuto Resonancia magntica nuclear Transformada de Fourier-Infrarrojo Polihidroxialkanoatos Pohidroxobutiratos Carboximetilcelulosa Densidad ptica Potencial de hidrogeno Longitud de onda Nanometros Micromoles Microgramos Infinito Gramos sobre litro
K A iv j n11114" i ii i r va o

Litro

CAPITULO 1

INTRODUCCIN.

Los biopolmeros son macromolculas naturales cuyas propiedades fsicas y qumicas dependen de sus propiedades estructurales y de sus funciones metablicas. Entre las macromolculas que se incluyen en esta clase se encuentran los polinucletidos, las protenas, los polipptidos y polisacridos. Estos biopolmeros se derivan de fuentes los

biolgicas

naturales en los cuales desarrollan funciones especiales tales como: El transporte de la informacin gentica que replicacin y sntesis de protenas, el cual conlleva el proceso de por los

es efectuado

polinucletidos; Los polipptidos y protenas, que son molculas que catalizan todas las reacciones qumicas de origen biolgico como por ejemplo ; las realizadas durante el transporte de oxgeno, el movimiento muscular, la respuesta nerviosa, el almacenamiento de nutrientes, la regulacin estructural, hormonal, etc. Los y tambin participan son en la conformacin de origen

polisacridos

macromolculas

natural que se pueden encontrar tanto en plantas, caparazones de crustceos y microorganismos, teniendo funciones como la de almacenar informacin en su molcula, servir como soporte estructural por lo Ms como

confirindoles resistencia mecnica y servir como reservoro etc.,

que son la categora ms grande de la familia de los biopolmeros. de 100 azcares y derivados de los azcares son viables

monmeros para la sntesis de polisacridos.

El trmino polsacrido es aplicable a los polmeros que pueden o no contener estructuras que se repiten peridicamente en el cual el grupo dominante, pero no necesariamente exclusivo, est unido por enlaces tipo glucosdicos, que son formados mediante una condensacin entre el grupo hidroxilo del carbono anomrico de un monosacrido o un residuo de monosacrido y un segundo compuesto que puede ser o no otro

monosacrido con la consecuente eliminacin de agua.[30> 321

n C6 H 1 2 0 6

(C 6 H 1 0 O 5 ) n + (n-1) H 2 0

Los enlaces covalentes que unen a las unidades monomricas pueden presentarse en diferentes posiciones del anillo glucosdico formndose cadenas lineares como las amilosas (esquema. 1.1), y ramificadas como las amilopectinas (esquema 1.2)t30-32] encontrndose ambos tipos en el almidn. lllli'" ^

HO

Esquema

l.l.Amilosa

Existen varios tipos de polisacridos, entre los cuales encontramos a los homopolmeros estructura que estn formados por subunidades de la misma

monomrica, as como los estn formados de diferentes

subunidades estructurales monomricas llamadas heteropolmeros. [3] Entre los homopolmeros encontramos al almidn que contiene

unidades de a-glucosa, y la celulosa que contiene unidades de p-glucosa (esquema 1.3), ambas estructuras estn hechas de ismeros de glucosa que difieren solamente en la posicin de el enlace en el C-l .t30-32.21.2) Entre los heteropolisacridos podemos mencionar las galactomanosas (compuesto de galactosa y maosa), arabinoxilanos (compuesto de

arabinosa y xilanosa), peptidoglucanos, etc.

El desarrollo de los materiales

basados en la ciencia y la tecnologa ha

resultado en grandes logros en beneficio de la humanidad, teniendo como consecuencia diversas y nuevas alternativas en el campo de los materiales. Una de estas nuevas alternativas se desarrolla en el campo

de la ciencia de los polmeros naturales, esto se debe a que en las ultimas seis dcadas del siglo XX, los materiales polimricos industriales han sido basados en polmeros sintticos de origen petroqumico.181 Sin embargo, a partir de los aos setentas la preocupacin por el medio ambiente y su progresivo deterioro da paso a la bsqueda de nuevas alternativas, principalmente en la ciencia y tecnologa de los polmeros de origen natural, en la cual se desea que contenga la misma capacidad de sintticos pero

resistencia y facilidad de elaboracin que los polmeros

con una tendencia a la biocompatibilidad con el medio ambiente. Ante este reto surge la industria qumica de los materiales, en especial aquellos que se derivan de procesos biolgicos naturales como por ejemplo los de las plantas, animales y microbiolgicos, obtenindose la formacin de biopolmeros .

Entre

los

polmeros

naturales

de

mayor

importancia

industrial

encontramos a la celulosa (esquema 1.3), el cual es el componente ms abundante de las fibras de las maderas y de las plantas, encontrndose

casi pura en las fibras de algodn siendo constituido este biopolmero por unidades monomricas de p-D-(+)-glucopiranosa (l-4).
t30,32,28]

Los derivados de la celulosa son ampliamente utilizados comercialmente, por ejemplo, el acetato de celulosa es ampliamente utilizado en la El glucgeno es un polisacrido

industria del plstico, fibra, papel, etc.

de origen animal que ejemplifica a los carbohidratos que se almacenan para su posterior liberacin cuando el metabolismo lo exige.[28,32] quitina (esquema 1.4) es el segundo polisacrido ms abundante naturaleza y esta formado por La

en la

unidades de N-acetil-D-glucosamina

unidas por enlaces p(l-4) glucosdicos, presentndose principalmente como constituyente de los caparazones de crustceos, insectos, hongosy algunas levaduras.[28,32]

NHCOCH 3

~ Esquema 1. 4 Quitina

HO

HoN

Desde el inicio del presente siglo ya se mencionaba en la literatura la formacin de materiales polimricos a partir de microorganismos,

encontrados muchas de las veces como resultado de experimentos y en los cuales, al final se evaluaban las propiedades fisicoqumicas de los biopolmeros.t81 Estos polisacridos de origen microbiano se pueden encontrar: como inclusiones intracelulares que actan como material de reserva o reguladores, como y por otros ejemplo; el glucgeno, el

polihidroxibutirato

(PHB),

materiales

relacionados

(polihidroxialkanoatos), los cuales mantienen a los sustratos en una forma inaccesible a las enzimas metablicas y ejercen muy poca presin osmtica, en ellos se puede encontrar que la secuencia de monmeros se representa por un grupo repetitivo de subunidades; como y como

polisacridos extracelulares, que podemos encontrar

material las

mucilaginoso extracelular en forma de cpsulas o limos en donde

subunidades pueden ser desde disacridos hasta hexasacridos. Esta formacin de material mucilaginoso extracelular por parte de los

microorganismos, gener un amplio inters ya que reflejan su respuesta inmediata a cambios en su medio ambiente, y se refleja en la

acumulacin de exopolisacridos que le permiten una fuerte adhesin a superficies slidas as, como tambin genera cambios en soluciones microbianos acuosas son cuando este lo contiene.117,9]Estos reacciones los flujos de polisacridos

sintetizados

mediante

multienzimticas

dentro de la clula. Aunque no han sido totalmente elucidadas las rutas biosintticas , el proceso en general es el siguiente; las unidades

oligosacridas se sintetizan a partir de precursores, azcares activados

en

la

forma

de

azcar-nucletidos-fosfatados,

los cuales

se

unen

secuencialmente a un lpido isoprenoide conocido tambin como Kpido portador de antgeno (LPA) en donde se sintetizan las unidades

monomcas

que son transferidas a otro lpido isoprenoide para iniciar El lpido tambin sirve como transportador del

la polimerizacin.

polmero formado a travs de la membrana celular de donde es liberado. En este procedimiento existen varias posibilidades de control biosinttico; la forma de incorporacin del sustrato, y la disponibilidad de precursores como la UDP-glucosa o el lpido isoprenoide. Existe otra sntesis de polisacridos, la cual consiste de procesos de acoplamiento de unidades repetitivas utilizando un lpido intermediario. Este mecanismo parece ser utilizado en la sntesis de polmeros extracelulares. Todava no se tiene completamente polimerizacin, substituyentes establecido y en o el mecanismo casos que el dan de terminacin de la

algunos cetlicos

polisacrido ciertas

contiene

cidos

caractersticas

reolgicas especiales al polisacrido en solucin. El mecanismo exacto de excrecin tambin no es conocido totalmente y puede nivel de constituir otro

control dla biosntesis de polisacridos.126,6,331

Entre los polisacridos de origen microbiano podemos encontrar una gran variedad de biopolmeros, los cules podemos clasificar en :

a)-. Inclusiones intracelulares b)-. Polisacridos extracelulares.

Entre los polisacridos intracelulares se encuentran algunos que tienen inters industrial como los poliliidroxialkanoatos (PHA),

polihidroxibutiratos (PHB), poli(hidroxibutirato-co-hidroxivalerato) etc., los cuales tienen la caracterstica comn de ser polisteres (esquema 1.5)
[3,8.33]

CH R

CH 2
-

Esquema 1.5 Poliester

Estos polisteres

se encuentran

como

reservoro intracelular en una

gran variedad de bacterias, entre las cuales podemos citar a Alcaligenes

eutrophus, Azotobacter methyotrophs,[3*] etc.

Los primeros polisteres fueron observados primeramente por Lemoigne en 1925 [3,35] en donde los trabajos en esta rea en la dcada de los 6 0 ' s y 70 's a travs de varios laboratorios, llev al entendimiento de su

sntesis, rutas metablicas y regulacin metablica de PHB y PHA. Estos polisteres han sido producidos desde 1982 [19] como biodegradables que han venido a ser utilizados como polisteres

substituyentes

de los plsticos derivados

del petrleo, exhibiendo un amplio rango de

propiedades termomcancas.[19,3,34'35]

Existen reportes acerca

de que bacterias, algas, hongos y levaduras

suelen producir polisacridos extracelulares con diferentes estructuras qumicas y propiedades fsicas.126,61 Estos exopolisacridos producidos por microorganismos presentan un carcter hidroflico predominante, esto es debido a que su estructura esta compuesta por grupos -OH, -NH2,COOH, -O-, -5H, etc. Como consecuencia, su uso industrial esta ms extendido en su capacidad para modificar las propiedades reolgicas de sistemas acuosos16'8'261, adicionalmente estos microorganismos son

capaces de sobrevivir en condiciones extremas adversas, ya que su presencia ha sido encontrada en altas concentraciones de sales, aguas alcalinas y acidas en donde ellos proliferan. [17] todava no es completamente clara la sntesis, pero es aceptado que la sntesis de exopolisacrido juega un rol importante en la supervivencia y crecimiento de los microorganismos en un amplio rango de

condiciones/6,26,51 en donde las funciones que presentan la formacin de exopolisacridos por los microorganismos son las siguientes;

autoproteccin contra la desecacin, proteccin contra depredadores, barrera para la difusin envolviendo o uniendo los iones adhesin a superficies slidas.
[5,17]

metlicos,

Algunas de las caractersticas intrnsecas de los polisacridos microbianos son : [2D'51 1-. Alta viscosidad a bajas concentraciones. 2-. Propiedades gelantes. 3-, Compatibilidad con altas concentraciones de sales. 4-. Alta solubilidad en agua y conducta anticongelante. 5-. Polielectrolitoy potencial de intercambio inico. 6-. Capacidad floculante, dispersante y versatilidad de adhesin. 7-. Biodegradabilidad.

En general, podemos decir que las propiedades

de los exopolisacridos

dependen principalmente de la rigidez de la estructura molecular que pueda adoptar el biopolmero.[2,610] Adiconalmente podemos mencionar que se encuentran microorganismos extracelulares; las que forman que producen dos tipos de gomas una que capa se alrededor solubilizan en del el

microorganismo o capsulares, y aquellas medio de cultivo

incrementando, sustancialmente, la viscosidad del

caldo de fermentacin.t26,21 Definida de manera convencional una goma es un material polimrico

que puede disolverse o dispersarse en agua para formar soluciones, suspensiones de alta viscosidad o geles.

Las gomas las podemos clasificar en tres grupos : Gomas naturales : Provenientes de exudados de arboles (arbiga,

tragacanto, etc.), extractos de semillas (guar, algarrobo), algas marinas (agar, alginatos, carragenina), protenas animales (gelatina, casena), protenas vegetales (soya), y gomas microbianas (dextrana, xantana). U61 Gomas modificadas o semisintticas: Derivados de las celulosa

(carboximetilcelulosa, metilcelulosa), almidones (acetatos de almidn, dextrinas). Gomas sintticas : Derivados petroqumicos tales como , sales del cido poliacrlico, polietilenglicol, polivinilpirrolidina. Su uso industrialmente se debe principalmente a su capacidad de alterar las propiedades de flujo de sistemas acuosos, ya sea como viscosificante, gelificante agentes de suspensin/20,26,301 Tambin se ha encontrado

que algunos microorganismos (bacterias de silicato), productores de exopolisacridos (principalmente heteropolisacridos), mejoran las

propiedades de las arcillas

debido a que el exopolisacrido unido a la

arcilla acta como resina durante el quemado[18]. El primer exopolisacrido producido comercialmente fue xantano, la cual es obtenida de Xanthomonas campestr la goma de siendo un

polmero ramificado con unidades monomricas de glucosa, maosa y cido glucurnico12-9-261 (esquema 1.6).

Este es quizs el polisacrdo

que ha sido sujeto a mayor cantidad de

estudios relacionados con sus propiedades fsicas y estructura qumica, siendo producido a escala industrial y utilizada como aditivo espesante y gelificante en los alimentos, en cermica para suspender los

componentes de los barnices, en la industria textil para evitar que se corran los colorantes, y en la industria farmacutica y cosmtica como

agente estabilizante de medicamentos y texturizador de cosmticos.120,

21,26]

CH 2 OH

COOH

oc

H2 HO

Esquema. 1.6 Xantano

Entre otros exopolisacridos producidos por microorganismos mencionar a la goma de gelano[16] (esquema Pseudomona elodea,
[2,61

podemos por

1.8) producido

el cual es un exopolisacrido

inico de gran

inters industrial

debido a

las propiedades reolgicas que presenta

en soluciones acuosas. El pululan es un polisacrido producido a partir del almidn por una levadura llamada Aureobasidium
faecalis

pullulans,
varmyxogenes

mientras que el microorganismo Alcaligenes

produce una goma llamada curdlano .[2,6]

Todos los polisacridos producidos por microorganismo tienen tambin otras aplicaciones futuristas en el rea medica tales como ser utilizados para la formacin de injertos vasculares.C3,6] Otro rol importante que juegan los biopolmeros es el de actuar como depresante ya que separa selectivamente minerales de otros minerales. Hay numerosos reportes como depresante

sobre la aplicacin de carboximetilcelulosa ( CMC )

para talco y otros minerales de magnesia presentes como impurezas en varios minerales de sulfito, lll]

El presente trabajo tiene como objetivo la obtencin de exopolisacridos a partir de fuentes microbianas, debido a que se ha observado que los exopolisacridos dentro de sus caractersticas intrnsecas tienen gran adhesividad a sustratos slidos, gracias a que contiene grupos hidroflicos que forman parte de su estructura, resultando por lo tanto atractiva y concebible su utilizacin en ciertos materiales slidos con la finalidad de mejorar ciertas propiedades o de protegerlos contra condiciones

naturales adversas. Adicionalmente su estructura esta compuesta de grupos glucosdicos principalmente, permitindole a los exopolisacridos modificar las propiedades reolgicas de ciertas soluciones acuosas ya

sea por gelacin o por cambios en su flujo caracterstico, adicionalmente, el de saber cuanto calcio y magnesio se llega a incorporar en la red del biopolmero ya que algunos reportes de investigadores dan por hecho que la gelacin de algunos biopolmeros se debe a la atraccin

electrosttica que se genera entre los grupos funcionales carboxilatos sobre el polisacrido y los iones divalentes resultando en un efecto de puenteos y entrecruzamientos entre las cadenas de polmeros,

impartiendo mayor estabilidad a la pelcula y mayor resistencia al corte; estas caractersticas permiten la utilizacin en diferentes reas, como, por ejemplo, el de ser un agente que mejora el recubrimientos de aceites, y en control en el

la industria petrolera para mejorar la tiene el objetivo de

extraccin de aceites, en los fluidos de perforacin

reducir la viscosidad a altas velocidades de corte necesarias para lubricar la barrena durante la perforacin.120,21,261

Todo esto constituye un buen ejemplo de como una sustancia de origen biolgico puede ser producida y El fin de utilizar manipulada para su utilizacin de origen

industrial/121

y producir biopolmeros

microbiano radica en la ventaja de que su produccin no depende de condiciones climticas ni de recoleccin, y si en la factibilidad de utilizar varias materias primas para su produccin. mayor uniformidad en sus propiedades, Adems de contar con pureza y caractersticas

intrnsecas, puesto que su biosntesis es en general muy especifica. Todo esto aunado a que los biopolmeros de origen animal y vegetal son fuentes agotables y su recuperacin tardara mas tiempo en

comparacin de los producidos y obtenidos por los microorganismos, los cuales son fuentes renovables, sin embargo, hasta este momento la

mayor desventaja que tiene la produccin de biopolmeros mediante microorganismos es el alto costo de obtencin. Nuestro principal inters en este trabajo es estudiar las caractersticas de un polmero encontrado en la industria de alimentos como contaminante de los equipos usados en la produccin o envasado de alimentos, que es producido durante la formacin de un biofilm por el crecimiento de microorganismos contaminantes, que presenta problemas de disolucin o destruccin por parte de las sustancias qumicas que regularmente son utilizadas como detergentes o desinfectantes en este tipo de industria.

1.1 OBJETIVOS.

1-. Obtener exopolisacrido mediante una fermentacin simple. 2-. Seguir algunos parmetros fsicos y qumicos de la formacin del exopolisacrido. 3-. Estudiar el exopolisacrido mediante diferentes tcnicas de caracterizacin. 4-. Estudiar sus propiedades reolgicas del exopolisacrido

CAPITULO 2

2.- MATERIALES Y METODOS. 2.1 DESCRIPCIN DE EQUIPOS Y REACTIVOS.

2.1.1 REACTIVOS.

HOCH 2 CH(CHOH)O

Dextrosa anhidra. Molibdato de sodio dihidratado

Baker Analyzed Mallinckrodt Chemical PQM 97.3 99-102

Na 2 Mo0 4 .2H 2 0

CaCl2 .2H 2 0

Cloruro de calcio dihidratado

FeS0 4 .7H 2 0

Sulfato de fierro hepta hidratado

CTR

99

MnS0 4 .H20

Sulfato de manganeso PQM hidratado

98-100

CaS0 4 .2H 2 0

Sulfato de calcio dihidratado

Mallinckrodt Chemical PQM

99.2

ZnS0 4 .7H 2 0

Sulfato de zinc heptahidrat ado

99

MgS0 4 .7H 2 0

Sulfato de magnesio heptahidratado

Baker Analyzed J.T. Baker

100

KNaC 4 H 4 0 6 .4 H 2 0

Tartrato de sodio y potasio heptahidratado

100

NaOH C7H4N207

Hidrxido de sodio cido 3,5 DNS

Baker Analyzed 97.1 Sigma

K 2 HPO 4 CH 3 CH 2 OH

CaCl2
CH 3 CN C 3 H 7 NO
1

Tetra h i d r ofu r a n o Medio MRVP

Hidrxido de amonio Aceton itri lo Dimetilsulfoxido NN-dimetilformamida

Fosfato cido de di potas io Et noi Cloruro de calcio

P .Q .M
C .T .R

98.6 99.5 99 28.9 99.9

R

P .Q .M Merck Aldrich Bioxon Bioxon Difco Difco Difco Bioxon

Baker Analyzed Baker Analyzed Aldrich

99.8 99 99.1

Agar citrato de simmons Agar para Pseudomonas

Extracto de levadura Caldo nutritivo

Agar doble azcar russell

2.1.2 EQUIPOS.

pH-metro Centrfuga Agitador

Beckman 50pH meter Baxter Medifuge 3632 Lab-line Instruments 3518

Microscopio Espectrofotmetro UV-VIS

Leitz Perkin-Elmer Lambda 12

Balanza analtica

Sartorius basic BA 160p

Espectrfotometro de A.A. Viscosimetro MicrofermFermentor Espectrofotmetro de RMN Analizador trmico TGA/DTA Espectrofotmetro FT-IR.

Varian SpectrAA Brookfield THA New Brunswick Bruker amx serie 400 TA Instruments 2100 Perkin-Elmer
1000 c

Paragon

Espectrofotmetro UV/VlS

Coleman
6 {20

junior

II

2.2 OBTENCIN DEL MICROORGANISMO.

El cultivo se obtuvo

a raz de un

problema industrial, en el cual se desarrollada una fuente a partir

observaba la produccin de una alta viscosidad, del crecimiento de microorganismos sobre esta

carbonada sugiere una

residual y en perodos cortos de tiempo ; alta acumulacin de exopolisacridos,

viscosidad

los cuales son

producidos y

excretados por los microorganismos como mecanismo de supervivencia y destoxificacin, ya que ste es expuesto a diferentes concentraciones de cidos y bases para disolverlo durante los procesos de saneamiento, lo de

cual no es logrado totalmente, por este motivo se gener el inters

producirlo a nivel laboratorio para evaluar sus propiedades reolgicas y posible aplicacin en materiales cermicos. Los microorganismos se aislaron y se identificaron como un bacilo gram negativo del genero
Klebsiella pneumonas.

2.3 DISEO DEL MEDIO DE CULTIVO EMPLEADO.

El diseo

del medio

de cultivo

lquido

se llevo a cabo buscando la

acumulacin de exopolisacrido y no de crecimiento celular, logrndose este objetivo mediante una relacin de fuente carbonada mayor que la fuente nitrogenada, debido a que es bien conocido que muchos

microorganismos aerobios y anaerobios acumulan exopolisacrido bajo condiciones de limitacin de nutrientes y con una adecuada fuente de carbono.[2'6,101

Este afecta

efecto se debe a una seria limitacin de material nutritivo los procesos fisiolgicos y bioqumicos normales

que del

microorganismo, el cual se ve obligado a secretar exopolisacrido como medio de supervivencia proteccin contra a fluctuaciones de temperatura, desecacin, resistencia a

compuestos txicos, depredacin y otro efecto que

ataques qumicos y fsicos.12,6:1 Asimismo,

se observa

por la limitacin de fuente de nitrgeno en el medio de cultivo es que la enzima depolimerasa esta ausente, esto biosintticas de aminocidos se ven afectadas supresin estuviera debido a que las vas con la consecuente si

de la actividad de la enzima depolimerasa, la cual, presente,

rompera los enlaces de polisacridos evitando la

formacin y acumulacin de exopolisacrido.C3,5,6] El medio de cultivo contiene otros nutrientes como fosfatos, los cules son una fuente de energa celular. por lo que tiene un de marcado efecto en el crecimiento a bajas

La produccin

exopolisacridos

se da

concentraciones de fosfatos, ya que, un alto contenido originara que la produccin de exopolisacrido decreciera considerablemente1-101 ; tambin se tiene reportado que medios con bajas concentraciones o deficiencias de fosfatos poseen la particularidad de originar soluciones ligeramente acidas (pH 5.6-4.5), en algunas fermentaciones, pero en general la acidificacin de las soluciones originaria una disminucin de la

viscosidad.[12] Adicionalmente, se Via observado que el contenido de Mgso4.7H20 tiene un marcado incremento en la produccin de

exopolisacrido en concentraciones que van de 0.1-0.3 g/1 de acuerdo con lo reportado en bibliografa. [10]

2.4 FUNCIN DE LOS MICRONUTRIENTES.

Se ha

observado

que la funcin

de los micronutrientes

sobre el

crecimiento bacterial y la formacin de exopolisacrido tiene un efecto marcado. Altas concentraciones de las sales inorgnicas incrementan el crecimiento celular disminuyendo simultneamente la formacin de

exopolisacrido1101 ; por otro lado, se ha observado que la adicin de sales inorgnicas divalentes tienen un efecto marcado en la gelacin de los biopolmeros, ya que la atraccin electrosttica interaccin que se genera por la

entre los grupos funcionales y los cationes divalentes da

como resultado un efecto de puenteo entre las cadenas polimricas generando entrecruzamientos, dando ambos efectos: que la pelcula

biopolimrica se estabilice hacindola ms resistente al corte; y a los ataques qumicos y fsicos.[26] Por esta razn se genero el inters de

conocer cuanto calcio y magnesio se integra a la red polimrica.

2.5 COMPOSICIN DEL MEDIO EMPLEADO/ 121

Glucosa Extracto de levadura Fosfato cido de dipotasio Sulfato de magnesio heptahidratado Solucin trazas (micronutrientes) Agua desionizada

25 g 3g 2g 0.1 g 3.5 mi 1000 mi

2.6 COMPOSICIN DE LOS MICRONUTRIENTES. [12]

Sulfato de zinc heptahidratado Cloruro de calcio dihidratado Molibdato de sodio dihidratado Sulfato ferroso heptahidratado Sulfato de manganeso hidratado Sulfato de calcio dihidratado

0.718 g 0.368 g 0.554 g 0.696 g 0.422 g 0.494 g

2.7 ESCALAMIENTO.

En trminos comunes, podemos

decir

que

el

escalamiento

es

una

tcnica y metodologa compleja empleada para transferir la produccin a gran escala en la cual varios parmetros fsicos, y biolgicos se ven un proceso de fermentacin desarrollado en

afectados a partir de

pequeo dentro del sistema como por ejemplo ; transferencia de masa y calor, caractersticas de mezclado, requerimientos de la potencia de

agitacin, respuesta de! microorganismo etc., por lo que hace que el escalamiento sea altamente interdisciplinario requiriendo la combinacin y el uso integrado de conceptos y metodologas de ingeniera qumica y fisiologa celular los cuales son crticos al realizar un escalamiento , de esta manera e estudio sobre la fisiologa de las fermentaciones dar ms respuestas

y bioqumica celular.[21,22,23'26]

El escalamiento que se llevo a cabo en este trabajo de investigacin se ilustra en la figura 2.1, mientras que los parmetros que se controlaron al inicio de la fermentacin se ilustra en la tabla 2.1

CULTIVO PURO
AGITACIN A 2 0 0 RPM POR 18-24 HRS.

100 M L D E MEDIO DE C U L T I V O

INCREMENTO EN E L TAMAO D E L INOCULO

AGITACION A 2 0 0 RPM POR 1 8 - 2 4 HRS

AGITACIN A 2 0 0 R P M POR 18-24 HRS.

t
1 L T Dt MEDIO D E CULTIVO

FERMENTADOR DE 10 L T A 2 0 0 R.P.M.

Fig 2.1 Diagrama de flujo de la fermentacin batch para la produccin de exopolisacrido.

2.8 PROCESO DE FERMENTACIN.

La

fermentacin para la produccin de exopolisacridos envuelve un

estricto balance del proceso metablico para la generacin de ATP en la cual los compuestos (oxidndose) y como orgnicos sirven como donadores de electrones aceptores de electrones (reducindose) ; los

compuestos que desarrollan estas dos funciones son por lo regular dos compuestos diferentes que provienen de un solo substrato fermentable (como un azcar). Por lo que hace a los carbohidratos los principales

substratos de las fermentaciones, as como tambin pueden ser cidos orgnicos, aminocidos, etc.
121,221

El equipo de fermentacin tipo

batch

que se utilizo para llevar a cabo la produccin de exopolisacrido se realiz en un recipiente de vidrio equipado con suministro de aire

estril, agitacin mecnica, medicin de pH y con una capacidad de volumen total de 14 lts. Estudios realizados por investigadores afirman en el

que su caracterstica ms importante, es el cambio sustancial comportamiento

reolgico del caldo durante el cultivo, cambio muy

importante ya que afecta parmetros crticos de la fermentacin.126,121 El proceso fermentativo llevado a cabo se realiz con un volumen de 10 lts de medio de cultivo, seguido de esterilizacin en autoclave a 121C por 15 minutos ; seguido por una fase de enfriamiento lento (12-24 hrs). La inoculacin fue realizada a partir de un cultivo puro y joven, el cual misma

proviene de un proceso de escalamientos sucesivos con la composicin del medio de cultivo como se seala en la figura 2.1

En

donde

al final el inoculo

es

aadido en de se asepsia

el para

medio de cultivo evitar a posibles las

final con

todas las precauciones Posteriormente,

contaminaciones.

procedi

establecer

condiciones de la fermentacin, las cuales se presentan en la tabla 2.1 Durante el tiempo de fermentacin se siguieron parmetros como crecimiento celular, concentracin
l21,22,23 1

de

azcares

reductores,

pH

obtencin de exopolisacridos.

La obtencin de los resultados de tomando muestras

los parmetros abajo mencionados se obtuvieron

de 200 mi del fermentador en condiciones de asepsia total mediante la introduccin de aire estril al fermentador (el aire pasa a travs de un filtro relleno con algodn y fibra de vidrio previamente esterilizado), mayor de entrada de aire al interior del

realizando una presin

fermentador para poder obtener la muestra, recogindolas en matraces Erlenmeyer con capacidad de 250 mi en un tiempo menor de 1 minuto.

Tabla 2.1 parmetros al inicio de la fermentacin.

Aireacin

Volumen del medio Agitacin Temperatura

10 Its 200 r.p.m. Constante No

En la fase exponencial ( A ), tambin conocida como crecimiento continuo, las clulas estn en una reproduccin o fisin mxima

constante en donde se sintetiza nuevo material celular a velocidad mxima, y en donde el nmero de clulas se incrementa en relacin linear con el tiempo. En esta fase, el conteo de clulas viables equivale al conteo total de clulas jvenes debido a que relativamente se encuentran pocas clulas muertas. La fase de desaceleracin ( B ) se caracteriza debido a que el nmero de clulas vivas generadas por escisin ya no es linear debido a que el microorganismo empieza a encontrar dificultades como lo son escasez de nutrientes, acumulacin de sustancias txicas para el microorganismo y cambios de pH, simultneamente, la

transferencia

de energa empieza

a decrecer por lo que el rango

sostenido de multiplicacin empieza a decaer. En la fase estacionaria ( C ), se observa una lnea horizontal en la cual se puede decir que el muertas estn balanceadas, debido al

nmero

de clulas vivas y

agotamiento de nutrientes y mayor aparicin de sustancias txicas para el microorganismo. La fase de muerte ( D ) se presenta como una lnea exponencial a la inversa de lo que sucede durante la fase logartmica de desarrollo en donde gran variedad de condiciones contribuyen a la

muerte de las clulas, siendo una de las ms importantes el agotamiento de las sustancias nutritivas esenciales, y la acumulacin de productos inhibidores. En este periodo las bacterias mueren a diferentes tiempos

de la misma manera que lo hacen al desarrollarse.[21,23]

2.9 CURVA DE CRECIMIENTO.

Si se inocula un medio lquido con clulas microbianas jvenes tomadas de una cepa, y se toman muestras a diferentes intervalos de tiempo midiendo su crecimiento celular mediante tcnicas espectrofotomtricas (turbidez) una curva y se traza una grfica a los diferentes tiempos, se obtiene de crecimiento. Los mtodo utilizados para medir un

crecimiento celular en un medio lquido se pueden realizar por mtodos directos e indirectos. El mtodo directo es aquel que puede estimar el

nmero de clulas en un volumen definido. Mientras que el mtodo indirecto (turbidimtrico), utilizado en la realizacin de este trabajo,

mide ta turbidez generada en el medio de cultivo por la acumulacin crecimiento celular. Este mtodo se utiliz por ser rpido y simple,

aunque esta sujeto a errores debido a la variacin en tamao y forma de la clula . En este trabajo se midi la turbidez que se genera en el medio de cultivo por el crecimiento celular y se midi como porcentaje de transmitancia en un espectrofotmetro UV/VIS Coleman Jnior II

modelo 6/20 a ^=540 nm calibrando a 0 y 100 % de transmitancia utilizando medio de cultivo estril como blanco. Una grfica de una curva de crecimiento se presenta en la figura 2.2 La curva de crecimiento no

presenta fase "lag" logartmica de desarrollo debido a que procede de un escalamiento en el cual las clulas ya se adaptaron al medio de cultivo, y por lo tanto Viay acumulacin de enzimas y secundarios que permiten una fase sostenida de crecimiento. metabolitos

Fig. 2.2 Curva de crecimiento tpica de un proceso fermentativo de los microorganismos.

2.10 DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES (METODO ACID 3,5-DINITROSALICLICO ).

Este mtodo analtico

empleado

es de suma utilidad en el proceso esta

fermentativo ya que nos da la concentracin de azcar que se

consumiendo (azcar reductor) ; esto es, conociendo la concentracin inicial de azcar que hay en el medio de cultivo y conforme sigue la fermentacin se toman muestras a determinados tiempos y se realiza

una grfica de absorbancia contra tiempo, monitoreando el consumo de azcar por el microorganismo. La metodologa empleada es la siguiente : 1-. Las muestras lquidas se centrifugan a 3000 rpm/15 min. para separar el paquete celular del sobrenadante. 2-. Del sobrenadante obtenido se toma 1 mi para determinar azcares reductores.

2.10.1 PREPARACIN DE LOS REACTIVOS.

SOLUCIN A-, Diluir por calentamiento 150g de tartrato de sodio y potasio en 250 mi de agua destilada. SOLUCIN B-, Preparar una solucin de NaOH 2N, agregar posteriormente 5 g de cido 3,5-dinitrosaliclico y diluir mediante calor constante. Mezclar las soluciones A y B y aforar a 500 mi con agua destilada. 2.10.2 PREPARACIN DE LA CURVA DE CALIBRACIN.

A-. De una solucin patrn de dextrosa anhidra 0.01 M (180mg/100 mi de agua destilada), preparar los siguientes estndares :

Tabla.2.2 Estndares para azcares reductores mediante el mtodo cido 3,5-DNS.

1 2 3 4 5 6 7

9 8 7 6 5 4 2 1 1 3

1 2 3

4 5 6 7

720 900

360 540

180

8 9 BCO

1080 1260 1440

1620 0

B-. Tomar 1 mi de cada concentracin y pasar a un tubo de 13x100 y aadir 1 mi del reactivo 3,5-DNS calentar los tubos a ebullicin en bao de temperatura por 5 minutos e inmediatamente pasar a bao de agua helada, aadir 2 mi de agua destilada y agitar. C-. Leer en espectrofotmetro UV-VIS Ferkin-Elmer a X= 540 nm. D-. Graficar absorbancia contra concentracin. 2.10.3 PREPARACIN DE LAS MUESTRAS.

I-. De los sobrenadantes se tom 1 mi de cada muestra y se aforo a 50 mi con agua desionizada. II-. Posteriormente se prosigui la metodologa igual que los estndares. III-. Interpolar y obtener las concentraciones ya sea en \\m(rr\l o ng /mi.

2.11 DETERMINACIN DEL pH.

Las mediciones de pH se llevaron a cabo con un pH-metro Beckman con electrodo de calomel ajustando el pHmetro a pH 4 y 7 con soluciones standares. A las muestras tomadas a diferentes intervalos de tiempo se inmediatamente desde el inicio de la fermentacin as como tambin al medio de cultivo sin

les determin el pH

hasta el final de la misma ;

inocular. Cabe sealar que la produccin de exopolisacrido en el medio de cultivo no estuvo bajo control de pH, pero, reportes de algunos investigadores indican que existe mayor produccin cuando se controla el pH.[12] Los datos obtenidos a los diferentes intervalos de tiempo se

graficaron a los diferentes tiempos de las de las muestras obtenidas.

2.12 OBTENCIN DEL EXOPOLISACRIDO.

Durante el seguimiento de la fermentacin se tomaron 3 volmenes grandes de muestras de medio de cultivo a diferentes tiempos como se indica en la tabla 2.3 As como tambin volmenes pequeos (100 mi),

esto se realizo para observar si haba un aumento en la acumulacin de exopolisacrido.

Tabla 2.3 Tiempos de toma de muestras(vol.)

rrawi
3

"

24 Estas muestras se obtuvieron

15

2 1 introduciendo aire (el cual pasa por un

filtro relleno con fibra de vidrio y algodn estril) al tanque fermentador y recogiendo las muestras en un matraz de 5 litros de capacidad. Posteriormente, se coloc en un recipiente etanol fro al 99.5 % en una relacin de tres veces mayor que el volumen del medio de cultivo, el etanol,

seguido de la transferencia de el medio de cultivo en observndose en poco tiempo en forma de nata de color

precipitacin (flotacin) del biopolmero blanco. Inmediatamente se procedi a

obtener el biopolmero ayudndose de pinzas, e inmediatamente se puso a secar a vaco por 24 hrs, a temperatura ambiente. El material obtenido se reflujo con etanol al 99.5 % por 72 hrs.

Este paso se diseo para purificar el biopolmero ya que en bibliografa el paso de purificacin del biopolmero es mediante dilisis con un cierto tamao de poro y de cierto peso molecular pero no contamos con esta tcnica y procedimos a utilizar la arriba mencionada. La fermentacin se llevo a cabo utilizando un fermentador

MicrofermFermentor modelo New Brunwick en las instalaciones de la Facultad de Ciencias Qumicas en el Departamento de Microbiologa.

Despus de cumplir el tiempo de reflujo se procedi a secar a vaco por 24 hrs como se muestra en el diagrama de flujo figura 2.2

Fig. 2.3 Diagrama de flujo de la obtencin del exopolisacrido.

2.13 TECNICAS INSTRUMENTALES DE CARACTERIZACIN.

La caracterizacin estructural de los polmeros usualmente requiere de una combinacin de diferentes tcnicas y mtodos analticos tales como TGA, DTA, RMN de H 1 Y C 1 3 , COSY, HPLC, GC, Difraccin de Rayos-X polvos, TMA, elemental, viscosidad intrnseca, electrnica, propiedades absorcin reolgicas, etc.. en

anlisis Estos

microscopa

atmica,

mtodos pueden proporcionar informacin ms detallada

sobre la

estructura y conformacin de los polmeros de gran valor para la investigacin.1201

2.13.1 ANLISIS DEL EXOPOLISACRIDO POR FT-IR.

La

radiacin

de

infrarrojo

se refiere

una

regin

del

espectro

electromagntico entre el visible y la regin de microondas. El espectro de IR permite a los qumicos obtener informacin estructural grupos funcionales que lo componen. La teora de la radiacin de infrarrojo nos dice que frecuencias entre 10000-400 c m 1 es absorbida y convertida por una molcula orgnica en energa de vibracin molecular en donde esta absorcin es cuantizada ; lo cual genera un espectro de bandas, por lo que la frecuencia o longitud de los

de onda de absorcin depender de las masas relativas de los tomos, las constantes de fuerza de los enlaces y de la geometra del tomo .

La posicin de las bandas en el espectro de IR es presentada como numero de onda (v) cuyas unidades es el recproco del centmetro (cm' 1 ), siendo esta unidad proporcional a la energa de vibracin. La intensidad de las bandas puede se expresada como transmitancia ( T ) o absorbancia (A) en donde la transmitancia es la la fraccin de la energa radiante muestra, a menudo se expresa

incidente que transmite

o emite

como % T y , la absorbancia es el logaritmo de base 10 de el recproco de la transmitancia A=log10 (1/T). Dependiendo de la regin del espectro en que estemos trabajando, es factible caracterizar una sustancia tomando los siguientes parmetros: - En la regin del infrarrojo cercano (12500 hasta los 4000cm' 1 ) se encuentran diferentes bandas de absorcin resultantes de sobretonos armnicos de bandas fundamentales y combinadas que se relacionan con tomos de hidrogeno. - En la regin del infrarrojo medio de 4000-1300 cm' 1 existen dos tipos principales de bandas, la primera corresponde de a interacciones se ven

ditomicas, esto se refiere a que las bandas

absorcin

afectadas debido a otras influencias estructurales. - La segunda regin dactilares se encuentra es en conocida la como de la regin de huellas esta

regin

1300-650 cm' 1 , en

zona es factible identificar enlace tipo S=0, C=C, C=0, C=N, etc.. - La regin del infrarrojo lejano (667-10 cm'1) es adecuada para el estudio de compuestos inorgnicos y organometlicos cuyos tomos sean pesados y con enlaces dbiles.1241

En

el

presente

trabajo

se utiliz

la

espectroscopia

de

infrarrojo

utilizando un Paragon FT-IR 1000 PC de Perkin Elmer para seguir cualitativamente la formacin del biopolmero y realizar comparaciones con standares de una base de datos de polmeros. Este mtodo analtico se utiliz para obtener los posibles grupos funcionales con los que cuenta la estructura y compararlos con otros exopolisacrido ya reportadas en literatura. Se realizaron pastillas de KBr exopolisacrido con el material seco de

colocando ambas sustancias en un mortero de gata y

procediendo a moler y uniformizar, posteriormente se coloc el polvo en un dado para hacer las pastillas y se le aplico presin (1700 psi) y vaco dejndolo por 7-10 min. La pastilla se coloc en un portamuestra y se procedi a correr la muestra.

2.13.2 ANLISIS DEL EXOPOLISACRIDO POR RMN.

La

resonancia

magntica

nuclear

es

bsicamente

otra

forma

de

espectrofotometra de absorcin similar a IR o UV. condiciones apropiadas en un campo magntico

Una muestra bajo puede absorber

radiacin electromagntica en la regin de radiofrecuencia gobernada por las caractersticas de la muestra en donde las propiedades

fundamentales de un tomo son : la masa, la carga, y el giro del electrn. Siendo esta ltima representada con el smbolo I, el cual puede tener valores de 0,1/2, 1,3/2, en donde el valor real de I depende del ncleo en particular.

Una caracterstica de los ncleos es que poseen carga positiva, esta carga da vueltas sobre el eje nuclear generando ncleos que tienen un giro de I * 0 magntico 00, un campo magntico. Los un momento dipolar de un

poseern

cuando estos ncleos se colocan entre los polos

magneto externo, la energa de interaccin est dada por : E = -nH eos 9 Donde H es el campo magntico externo y 9 el ngulo entre los vectores \iy H. El signo menos indica que la interaccin es de atraccin. El ngulo 6 puede tener cualquier valor, por lo tanto E vara continuamente. mecnica cuntica limita a f! en el campo magntico a La

ciertas

orientaciones permitidas que se caracterizan por el nmero cuntico del giro nuclear M = Vi por lo tanto la energa est dada por : E = - \xfl H M En ausencia del campo magntico, esto es H = O, estas dos orientaciones son equivalentes en energa. En la siguiente representacin se ve la separacin de los niveles (a) y su anlogo bsico (b).

Energa

H=0

(a)

(b)

Ahora bien, si el ncleo se irradia con la frecuencia adecuada tal que puede inducirse la transicin del nivel inferior al superior, se obtiene el fenmeno que se conoce con el nombre de resonancia magntica

nuclear (RMN).1241 En la tabla 2.4 se da una lista de algunos ncleos en los que es aplicable la tcnica de RMN.

Tabla 2.4 Ncleos adecuados para estudio de RMN.

8.1 .Vr

S -

99.985 1.5x10 2 99.63 0.37 3.7x10 2

13

c
Vi

15

17Q

Yz 5(2 Vz Vz

19r
311

100 100

En este trabajo el exopolisacrido

se prob con distintos solventes como inorgnicos para ver la cidos y

polares y no polares tanto orgnicos

mejor solubilidad posible, as como tambin con

diferentes

bases a diferentes concentraciones como se muestra en la tabla 2.5

Tabla 2.5 Solubilidad del exopolisacrido en diferentes solventes.

Agua DMS DMF

-*.SW.i i.; 10 0 100 100 100

L iJTTJ 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 Parcialmente I Parcialmente I Negativo

DMS/AGUA AGUA (A) AAG AFG

DMS (A)

(A 0 )

AAG (AFG (A) Hexano THF

100 50 :50 100 100 100 100 100 100 100

50:50 100 100

Parcialmente I Parcialmente I Parcialmente I Negativo Negativo Negativo Negativo

Metanol Cloroformo

Acetonitrilo NH^OH (A) NaOH 3% (A)

(A) = Calentamiento en bao mara a

Negativo Negativo Negativo Parcialmente I I Parcialmente I I I Negativo

95c/20 rain. DMS = Dimetil sulfoxido DMF = Dimetil formamida AAG = Acido actico glacial AFG = Acido frmico glacial THF = Tetrahidrofurano

Parcialmente I = Hinchado Parcialmente II = Hinchado y algo disuelto Parcialmente III = Hinchado y ms disuelto

Despus de encontrar el solvente en el cual se obtena una mejor disolucin parcial (NaOH al 3% con agua deuterada), se procedi a al para

enviar una muestra en una concentracin de 6 ppm (6 mg/ml) Departamento resonancia de de Farmacologa
13C

de

la

Facultad

de

Medicina

y de

en un espectrfotometro de RMN de 400 MHz

marca Bruker amx serie avance dpx 400 con sonda multinuclear.

2.13.3 ANLISIS TRMICO DEL EXOPOLISACRIDO.

El anlisis trmico permite medir algunas propiedades fisicoqumicas de ciertos materiales cuando estos se programan a una medicin continua en funcin de la temperatura en una atmsfera determinada , esto es cuando la muestra esta sujeta a cambios de temperatura controlado, el programa puede envolver calentamientos o enfriamientos en un rango fijo de cambios de temperaturas o a temperaturas constantes. El conocimiento de las propiedades trmicas de los polmeros es siempre importante y crtico de conocer para determinar las transiciones

trmicas que pueden ocurrir cuando estos son expuestos a cambios de temperatura, temperaturas esta herramienta proveen de informacin de tal como

descomposicin, temperaturas
[25, 15]

fundicin,

temperaturas de transicin vitrea, etc.

estos efectos variarn de

acuerdo a la naturaleza del polmero como por ejemplo la celulosa la cual su temperatura de descomposicin empieza abajo de los 100C, mientras que las poliamidas son estables arriba de los 400C.[251

Entre las principales tcnicas termoanliticas podemos mencionar ;

a-. Anlisis termogravimtrico (TGA) b-. Anlisis trmico diferencial (DTA)

2.13.3.1 ANLISIS TERMOGRAVIMTRICO (TGA).

El anlisis termogravimtrico

es una tcnica que mide los cambios de

peso de una substancia en funcin de la temperatura o tiempo en un determinado rango, en donde su equilibrio termodinmico se ve afectado resultando una serie de cambios (fsicos y (o qumicos) en la que se ve involucrada la liberacin o absorcin de energa en forma de calor, estos datos son representados de manera grfica como el de la figura 2.4, en donde el peso se grfica en el eje de las Y y la temperatura en el eje de

las X . La metodologa que se sigue es la siguiente : muestra en pequeas cantidades (mg) es calentada en un rango constante (l-20c/min)

teniendo un peso constante hasta empezar a descomponerse a una temperatura T1 llegando T 2 , una hasta segunda una temperatura constante la de cual

descomposicin

constante

es observada

corresponde a el peso del residuo W 2 , la diferencia entre

y W 2 (AW)

son datos fundamentales de la muestra y pueden ser utilizados para clculos cuantitativos de cualquier proceso fisicoqumico involucrado, en el que haya una disminucin o cambio de masa. Las variables que se pueden presentar durante la corrida de una muestra son : rangos de calentamiento, naturaleza del slido, atmsfera del horno.
125,151

% DE PERDIDA DE PESO W,

AW

T2

I I I

TEMPERATURA Fig. 2.4 Termograma tpico de una reaccin de descomposicin.

2.13.3.2

ANLISIS T R M I C O DIFERENCIAL ( D T A ) .

El anlisis trmico diferencial es una tcnica en la cual los cambios de calor dentro de un material son monitoreados y comparados con la de un material inerte de referencia en el rango de trabajo, de tal manera que podremos tener una relacin de las diferencias de temperatura (la de la muestra con respecto a la referencia) en funcin de la rampa de

temperatura que a la que se realice el anlisis esto nos dan resultados en forma de grficas que nos permiten detectar, por medio de picos, las temperaturas a las cuales se dan transformaciones fisicoqumicas de la muestra, dependiendo de la forma y orientacin del pico se puede determinar si el evento observado es endotrmico (absorcin de

energa) o exotrmico (liberacin de energa).

Las aplicaciones del DTA nos permite evaluar mediciones fsicas (cambios de fase cristalina, fusiones, diagrama de fases, cambios de estado lquido y lquidos cristalinos, capacidades calorficas y transiciones vitreas), y qumicas (descomposiciones, deshidrataciones y formacin vitrea de los materiales). [25]
EXOTRMICO

ENDOTRMICO

TEMPERATURA (C) Fig. 2.5 Curva tpica de DTA

A las 3 muestras de exopolisacrido obtenidas por precipitacin con etanol y purificadas por reflujo con etanol al 99.5 % durante la

fermentacin, se les realizaron TGA corrindose

pruebas de anlisis trmico de DTA y

en una rampa de calentamiento de 5C/min. que va

desde temperatura ambiente hasta 400C en una atmsfera de aire con un flujo de 100 ml/Ynin utilizando un termoanalizador DTA/TGA TA Instruments 2100, las muestras se colocaron en un crisol de platino con un promedio de peso paralelamente por cada muestra de 10 mg corrindose (Al 2 0 3 ) en

un standard de referencia

de alumina

atmsfera de aire.

2.13.4 ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIN ATMICA.

La absorcin atmica es una tcnica que envuelve la absorcin de luz por tomos libres, siendo este principio metales. Los tomos consisten en un ncleo central, compuesto de protones y la base para la determinacin de

neutrones el cual esta rodeado de orbitales en los cuales se localizan los electrones, los tomos son capaces de absorber luz o calor excitando a los electrones de valencia (electrones ubicados en las ltimos orbitales del tomo) transfirindolos a niveles de mayor energa en donde la longitud de onda absorbida es proporcional al espacio entre los niveles energticos .Como cada elemento tiene un cierto arreglo de longitudes

de onda de absorcin tendr un patrn definido para cada elemento. La determinacin de calcio y magnesio en el EPS es la de ver el

porcentaje de estos elementos que se incorporan a la red del biopolmero ya que reportes de otros investigadores121 dan por hecho la

incorporacin de ambos elementos ayudando a la red polmerica

a ser

ms resistente al corte debido a puenteos y entrecruzamientos que se generan internamente.

2.13.5 CROMATOGRAFA.

Los mtodo cromatogrficos son procesos de migracin diferencial en el cual se caracteriza por el paso uniforme de una mezcla fluida (gas o lquida) a travs de otra sustancia relativamente inmovilizada (lquida o slida ). la cual por diferencias de polaridad migran los componentes de una mezcla.[29] La caracterstica que distingue un proceso

cromatogrfico es la interaccin entre la fase mvil y la fase estacionaria, esta interaccin se basa en una combinacin de factores como

solubilidad, intercambio inico, adsorcin y filtracin . cromatogrfico empleado

El mtodo

es la cromatografa en papel, el cual es un

procedimiento simple y se basa en la particin de los componentes de una mezcla entre dos fases lquidas debido a diferencias de

solubilidades de los componentes de cada fase.

La funcin principal del

papel es de servir de soporte inmvil para el agua absorbida en este soporte, que a su vez sirve como fase estacionaria. La fase mvil es una mezcla lquida homognea, que consiste en un solvente orgnico

saturado de agua . EL procedimiento utilizado es el siguiente, un volumen de la muestra se aplica en una regin determinada cerca del extremo del papel cromatogrfico, el punto de aplicacin, llamado

origen, es secado. Mientras tanto el solvente (fase mvil), se coloca en una cmara cerrada dejndolo un tiempo para que el interior de la

cmara se sature con los vapores del solvente.

Despus del equilibrio se pone en contacto el extremo del papel con el solvente y este comenzar a subir o bajar dependiendo de la tcnica por capilaridad. Cuando el solvente de diferencialmente

(ascendente o descendente) desarrollo alcanza el origen,

la muestra se disolver

en las dos fases habiendo una distribucin de la muestra entre la fase estacionaria acuosa (polar), aportada por el papel y principalmente gobernada por orgnica (nopolar) en donde la la fase mvil, esta

distribucin

las diferencias

de solubilidades de cada soluto en las se encuentran

fases. Despus de que los solutos de la muestra distribuidos a diferentes distancias del origen,

esta se relaciona con el

recorrido total del solvente de desarrollo de la siguiente manera :

o _ ^ ~ Distancia recorrida por el compuesto Distancia recorrida por el solvente

El Rf es caracterstico de cada compuesto orgnico

inorgnico

dependiendo del solvente y la fase estacionaria. Despus de que el solvente ha migrado la fase estacionaria se retira y se seca. La fase final es detectar la ubicacin de cada compuesto ya sea por luz

ultravioleta o tratando el papel con un reactivo qumico que interactua con los compuestos ya resueltos para producir un producto

coloreado.128,29,301 La cromatografa en papel para carbohidratos se puede considerar como un proceso de particin, aunque la adsorcin puede estar presente en algunos casos.

La movilidad de los azcares depende de la forma del anillo y de la configuracin de los grupos hidroxilos[291, tambin cabe sealar que el

tipo de enlace tiene gran influencia en la migracin ya que se conoce que las uniones disacridos (l->4) migran ms rpido que las uniones (l->6) [29] . La identificacin de los polisacridos por cromatografa es complicada por lo que se tienen que hidrolizar para separar los mo nmeros los oligosacridos presentes; la hidrlisis llevada a cabo se realiz con cido clorhdrico 3 N por 6 hr/95 C en bao Mara seguido de una

neutralizacin con carbonato cido de sodio. El sistema desarrollador utilizado es acetato de etilo- agua- cido actico glacial- Metanol (65 :10 :7.5 ;20) . El sistema revelador es ftalato

cido de potasio- anilina- nbutanol (1.5 g : 1 m i : 100 mi). A continuacin cromatografa se presenta de el diagrama de flujo de la tcnica de

papel (figura. 2.6 ).

Fig. 2.6 Diagrama de flujo para la identificacin de azcares por cromatografa.

2.13.6 PROPIEDADES REOLGICAS DEL EXOPOLISACRIDO.

La determinacin de las propiedades reolgicas de los polmeros es un aspecto importante en su caracterizacin qumica, ya que nos da una

amplia informacin de su peso moleculary el tipo de flujo que presenta el cual nos ayuda a entender mejor sus propiedades. Una forma de definir la viscosidad sera como la medida de la friccin interna de un fluido causado por la atraccin molecular, la cual genera esta resistencia a fluir
31]

. La tcnica empleada para determinar la

viscosidad en soluciones es un mtodo simple y rpido capaz de darnos una amplia informacin acerca de la conducta que presentan los

polmeros

bajo presencia de fuerzas externas, en donde su viscosidad

variar con el rango de deformacin presentando diferentes tipos de flujo, como por ejemplo: Newtoniano (donde la viscosidad es

independiente del rango de corte) y

no-newtonianos el cual posee una mencionaremos a los

amplia gama de comportamientos en el que

pseudoplasticos (donde la viscosidad decrece con el incremento del rango de corte), dilatante (donde la viscosidad aumenta con el rango de mencionaremos podemos los

corte). [30,311 Entre los ejemplos de fluidos newtonianos al agua y mencionar

los aceites de motores y, de no-newtonianos de acuerdo al grupo que corresponde

como;

pseudoplasticos en la cual encontramos a las pinturas, las emulsiones y dispersiones, mientras que el de comportamiento dilatante es presentado por fluidos con slidos defloculados como pastas cermicas, gomas en agua, etc.

En este trabajo se utilizo un viscosimetro

Brookfield modelo H A T ; la

solucin se realiz colocando un gramo de exopolisacrido en 300 mi de NaOH 3 % y se calent a bao Mara por 3 hr[90 C, se dej reposar por 12 h r s y se filtr la solucin ajustndolo a 300 mi con NaOH al 3 %.

CAPITULO 3

1020126079

3 RESULTADOS.
3.1 IDENTIFICACIN DEL MICROORGANISMO. La muestra proporcionada fue sembrada en agar nutritivo para posteriormente realizar pruebas bioqumicas ; inmediatamente despus se realiz una fermentacin al cual se le tomo muestras de la misma y se sembr en EMB (agar eosina azul de metileno) realizndole pruebas bioqumicas , dndonos los siguientes resultados (tabla 3.1).

Tabla 3.1 pruebas bioqumicas

Indol Rojo de metilo

Vogues-Proskauer

+ + + + +
-

Citrato de simmons Sucrosa Glucosa Inositol H2S (gas) Oxidasa

Arabinosa Arginina

Con los resultados de las pruebas bioqumicas y observaciones microscpicas se realizo la identificacin del microorganismo productor de exopolisacrido (EPS) siendo un bacilo Gram negativo del gnero Klebsiella pneumoniae el cual por antecedentes se sabe que es capaz de secretar exopolisacrido al medio y con estructura variada dependiendo de la fuente de carbono y los flujos de energa t6 2]

3.2 CURVA DE CALIBRACIN. Los resultados obtenidos de la curva de calibracin para azcares reductores se presentan en la figura 3.1, asi como tambin se presenta la tabla 3.2 en la cual se localizan las concentraciones de los estndares empleados para la curva. La curva de calibracin presenta una regresin lineal de 0.999, lo cual nos determina que el mtodo es confiable para poder utilizarla y determinar la concentracin de azcares reductores presentes en el medio de cultivo en el cual durante el transcurso de la transformacin nos da el azcar residual presente y de esta manera se obtiene informacin concerniente a la formacin del exopolisacrido a partir de los azcares presentes.

Tabla 3.2 Resultados de los estndares de azcares reductores.

0 360 540 720 900 180

0.3233 0.58

0.8811 1.2149 1.5457 1.8802

1080 1260 1440

2.1907 2.4601

CURVA DE CALIBRACIN DE AZCARES REDUCTORES MEDIANTE EL MTODO DEL CIDO 3,5-DINITROSALICLICO

CONCENTRACIN(ugArll)

Fig. 3 . 1 C u r v a de c a l i b r a c i n de a z c a r e s r e d u c t o r e s

3.3 PARMETROS DE LA FERMENTACIN. Los resultados de los parmetros seguidos durante la fermentacin fueron reproducibles y se representan en las figuras 3.2 y 3.3. En la figura 3.2 se reporta el crecimiento del microorganismo expresado como logaritmo de la densidad ptica contra el tiempo, as como tambin la concentracin de azcares reductores (ng/ml) contra el tiempo. Se puede apreciar que a medida que los microorganismos se van desarrollando en funcin del tiempo, la tendencia de la concentracin de azcares reductores es a la inversa (disminuyendo), debido a que los microorganismos estn utilizando la fuente de azcares para sintetizar exopolisacrido el cual es excretado, y esta excrecin se aprecia visualmente en el medio ya que va cambiando la caractersticas intrnsecas del caldo de la siguiente manera :

la solubilizacin del exopolisacrido define el comportamiento reolgico del medio de cultivo lquido, ya que durante la fase inicial de la fermentacin (0-1 hr) el fluido es prcticamente Newtoniano esto es ,1a viscosidad es independiente de la rapidez de deformacin pero, conforme avanza la fermentacin (2-26 hrs) se incrementa la viscosidad del medio gradualmente y se convierte en un fluido dilatante espesante. En esta etapa es en donde se alcanza la mayor produccin del exopolisacrido y la mayor estabilidad de la red polimrica ya que en la fase final de la fermentacin (26^-46 hrs) la viscosidad decrece (tipo pseudoplasticos). Adems, con los datos obtenidos de la curva de crecimiento (figura 3.2 y .3.3), podemos precisar que la fase exponencial mxima de los microorganismos se encuentra entre las 12 y 15 hrs, posteriores al inicio de la fermentacin y es en esta fase en donde se aprecia la mayor produccin de exopolisacrido y por consiguiente un aumento de la viscosidad (ver tabla 3.4 y figura 3.4) ; la fase estacionaria empieza a las 18 hrs, entre las 18 y 26 hrs se pudo apreciar que la viscosidad del medio se mantiene y se puede establecer que en este tiempo es en donde se alcanza la mayor estabilidad de la red polimrica del exopolisacrido esto corroborndose con los resultados de termogravimetra obtenidas a las 24 horas en la cual se aprecia que la temperatura mxima de descomposicin se alcanza a una temperatura de 306.8C (ver figura 3.10) tambin, a que al obtener el exopolisacrido mediante pinzas se apreciaba una consistencia mayor que las muestras tomadas a tiempos posteriores y anteriores a las 24 horas. A partir de las 26 horas y mantenindose hasta las 46 horas la viscosidad del medio empieza a decaer en donde empieza un declive o muerte de los microorganismos y en donde tambin se aprecia que la consistencia del exopolisacrido disminuye considerablemente. Con los datos anteriores podemos decir que la caracterstica principal de la fermentacin consiste en que el producto principal que es el exopolisacrido (EPS), es el responsable directo de los cambio ocurridos en las propiedades reolgicas del medio y que es necesario analizarle para poder encontrar con ms detalle los cambios de los parmetros ocurridos en la fermentacin durante la solubilizacin del exopolisacrido en el medio.

1.9 r

-i 22

10

20

30
T I E M P O (Hr)

40

Fig. 3.2 Curva de crecimiento y determinacin de azcares reductores durante la fermentacin y formacin del exopolisacrido por Klebsiella pneumoniae.

En la figura 3.3 se reporta el crecimiento de los microorganismos como logaritmo de la densidad ptica contra tiempo y el potencial de hidrgeno contra el tiempo, se observa que a medida que el crecimiento de los microorganismos avanza, el pH va disminuyendo debido a que los microorganismos al utilizar los carbohidratos del medio de cultivo aparte de formar exopolisacrido, tambin llegan a formar cidos orgnicos por lo consiguiente, el pH del medio disminuye conforme avanza la fermentacin (figura 3.4) aunque esta disminucin de pH, no llego a afectar la viscosidad del medio durante el tiempo que transcurre de las 2-26 hrs ms, no podemos precisar su efecto posteriormente de las 2646 hrs. Estudios realizados sugieren que manteniendo un pH ptimo del medio se puede obtener una mayor produccin de exopolisacrido y una mayor estabilidad de la red esto debido a que se sabe que manteniendo un pH predominantemente entre 5.2-5.8 y, este confiere identidad inica especfica a las molculas y que es importante para su estructura final y sus funciones.117,121

Fig. 3.3 Curva de crecimiento y determinacin de su pH durante la fermentacin por Klebsiella pneumoniae.

T I E M P O (Hr)

Cabe sealar que el comportamiento del medio de fermentacin es de un fluido No-newtoniano durante el mezclado y, en donde la agitacin solo es eficiente en las fases iniciales de la fermentacin, ya que una vez avanzada sta solo lo es en la vecindad de los impulsores. Esto se puede establecer ya que la fuerza de propulsin de los impulsores bajo de 200 r.p.m. a 160 r.p.m., debido a la solubilizacin del exopolisacrido en el medio, en la tabla 3.3 se presentan los cambios que sucedieron durante el transcurso de la fermentacin.
Tabla 3.3 Cambios fsicos que ocurrieron durante la fermentacin

F E R M E N T A C I O N
l l l l i s i i l g i s i f i BiiMffnij Agitacin (r.p.m.) Tipo de viscosidad iHiiSMiitijiS

pH

5.6 200

5.14 180
Dilatante

4.65 160

Newtoniano

Pseudoplastico

3.4 RESULTADOS DE OBTENCION DE EXOPOLISACARIDO. De las muestras de 100 mi obtenidas a diferentes tiempos se obtuvieron los siguientes resultados (tabla 3.4)
Tabla 3.4 Resultados de los pesos obtenidos del exopolisacrido a diferentes tiempos de obtencin. 3 6 12 15 18 0.0595 0.0652 0.0976 0.0987 0.0749

Estos resultados se graficaron para poder obtener una mayor apreciacin de los cambios ocurridos durante la produccin del exopolisacrido (figura 3 . 4 )

0.0976

0.0987

0.0749

0.0595

_i

10
TIEMPO ( H r )

12

14

16

18

20

3.4 Evolucin de la produccin de) exopolisacrido.

Con estos datos se observa que la formacin de EPS va aumentando en forma gradual hasta llegar a una fase constante (12-15 hrs), esta evolucin de constante produccin o aumento en la formacin del biopolmero nos demuestra que el microorganismo es capaz de sostener un ritmo de formacin de biopolmero sostenible de acuerdo al flujo de la fuente de carbono y energa disponible; pero posteriormente este ritmo de produccin se desacelera y empieza a decrecer, que es algo caracterstico de los polmeros de origen microbiano, ya que se pueden sintetizar y degradar con gran rapidez debido a que se encuentran en un estado dinmico en el cul actan simultneamente, mas la degradacin se puede llegar a controlar esto es, regulando las enzimas que realizan esta accin de manera que solo acten en ciertas condiciones. Adems la media del peso promedio de exopolisacrido obtenido por litro de medio de cultivo es de 0.95 g/L comparando este resultado con otros exopolisacridos obtenidos de otras investigaciones16,7,91. Podemos determinar que el rendimiento es bajo, pero cabe aclarar que en este trabajo no se mantuvo un pH adecuado ya que no era el objetivo, y en las referencias de los microorganismos productores (tabla 3.5) si se establecen parmetros de pH adecuados para la produccin de exopolisacrido. En general, podemos establecer que para la produccin de exopolisacrido se deben establecer ms parmetros de control para poder obtener un mximo rendimiento del mismo.

Tabla 3.5 Comparacin de resultados de peso seco de exopolisacridos obtenidos con otros microorganismos y Klebsiella pneumoniae.

Cyanosplra Methylophilus Agrobacterium Klebsiella

capsulata sp. radiobacter pneumoniae

0.95

5.4 9

9y 7 6 6

En la figura 3.5 se grfica el pH y la concentracin de exopolisacrido (seco) en funcin del tiempo de la obtencin de muestras durante el transcurso de la fermentacin.

Aqu se puede observar ms detalladamente la forma en que el exopolisacrido se acumulaba gradualmente as como los cambios de pH que se generaban en el transcurso del tiempo llegando a ser una relacin dinmica en la cual el exopolisacrido se sintetiza y se degradada simultneamente.

5.7

0.00-i
0

10

12

14

16

5.0

Fig. 3.5 pH y concentracin de exopolisacrido en funcin del tiempo.

TIEMPO ( Hr)

3.5 RESULTADOS DE FT-IR Se caracteriz por IR el exopolisacrido (EPS) obtenido para intentar comprender la naturaleza de los productos a travs de los grupos funcionales presentes en su estructura. Los resultados indican los siguientes datos : las bandas de mayor intensidad y anchura se presentan a 3307 cm'1, el cual corresponde a un estiramiento de un grupo O-H antisimtrico caracterstico en la mayor parte de las gomas procedentes de microorganismos ; a 1709 cm' 1 se presenta una banda de estiramiento C=0 de esteres ; a 1648 cm'1 se presenta una banda de estiramiento por el enlace C=0 de amidas ;

a 1082 c m 1 se presenta un estiramiento asimtrico del enlace C-O-C. Bandas adicionales son indicadas en la figura 3.7

Transmittance / Wavenurnber cm-1)

Nurnber of Scans= 15

Aoodization=

Fig. 3.6 Espectro de infrarrojo del EPS. 3307 cm' 1 banda de estiramiento antisimtrico del OH ; 2962 cm"1 banda de estiramiento antisimtrico del CH 3 ; 2932 cm'1 banda de estiramiento antisimtrico del C H 2 ; 1708 cm' 1 banda de estiramiento C=0 de esteres ; 1648cm' 1 banda de estiramiento de C=0 de amidas ; 1365 cm' 1 banda de grupo CH3 de acetilos; 1227 cm' 1 banda de estiramiento 0-C-(0)-C ; 1082 c m 1 Estiramiento antisimtrico de C-O-C ; 781 c m 1 banda de -(CH2)n en cadena ; 535 cm' 1 banda de estiramiento de O-H.

Para determinar si la banda a 1708 y 1648 cm' 1 corresponden a un grupo ester y amida, el exopolisacrido se trat con NaOH al 3 % y se calent a bao Mara por Shf95 C y, permitindose enfriar a temperatura ambiente por una hora y media para posteriormente introducirlo a la estufa por 24 h/100 C; al trmino de este tiempo se realizaron pastillas de K B r y se obtuvo su espectro (figura. 3.7).

En este espectro cual observamos la obtencin de seales de bandas anchas a 3420 cm' 1 debido al grupo COO' Na+ y, a 1654 cm' 1 que corresponde a un estiramiento de carbonilo C-0 de amida ; 1438 cm' 1 que corresponde a un estiramiento simtrico C-H.

Fig. 3.7 Espectro de infrarrojo del EPS tratado con NaOH al 3%. 3420 cm' 1 banda de estiramiento de O-H ; 1654 cm' 1 banda de estiramiento de carbonilo C-O-C, C=0 ; 1438 cm"1 banda de flexin C-H ; 874 cm' 1 Substitucin de aromticos C-H.

Los cambios ocurridos en las seales del espectro despus de hidrolizar la muestra nos confirman la presencia de los enlaces esteres presentes en la estructura del EPS ya que desapareci la seal a 1708 cm' 1 que corresponde a este grupo, y adems la seal de amida que esta a 1654 cm' 1 disminuyo la cual se presentaba como un pico de mayor intensidad debido a que la hidrlisis provoc la ruptura del enlace amida obteniendo un enlace de baja energa. Aun con la ayuda de los espectros de infrarrojos no podemos precisar la posicin que ocupan los grupos funcionales en la estructura.

Lo que si podemos confirmar es que la seales del espectro de FT-IR del exopolisacrido fueron siempre repetitivas, lo que nos confirma que el proceso de produccin es confiable y que el microorganismo se mantuvo puro durante todos las fermentaciones realizadas. La figura 3.8 representa la comparacin de ambos espectros en donde se puede observar ms detalladamente los cambios ocurridos.

Transrnttance / Wavenurnber (cm-1)

Nurnber of Scans= 15

Apodizatmn=

Fig. 3.8 Espectros del exopolisacrido hidrolizado y sin hidrolizar.

3.6 ANLISIS TRMICO DEL EXOPOLISACRIDO Los resultados de los anlisis trmicos realizados a las muestras de biopolmero obtenidas por precipitacin con etanol al 99.5 % a los tiempos de 3, 15 y 24 horas se presentan en las figuras 3.9, 3.10 y 3.11 La figura 3.9 que representa la muestra de exopolisacrido obtenida a las 3 hrs de la fermentacin presenta 4 prdidas de peso; la primera se presenta a 50.96C (A) con una prdida de peso del 3.1%, la cual se le atribuye a restos de sustancias voltiles o agua adsorbida (humedad) ;

la segunda se presenta a 158.65C ( B ) con una prdida de peso del 11.7%, la cual se le atribuye a agua de hidratacin ; la tercera se presenta a 223.80C (C) con una prdida de peso del 22.38%, la cual se debe a la descarbonizacin del material; la cuarta se presenta a 306.7C (D) con una prdida de peso del 36.7%, la cual se debe a descomposicin del material. Los primeros dos eventos son picos endotrmicos debido a la perdida de agua; esto se concluyo con la ayuda de la primera derivada que se realiz al anlisis trmico diferencial, mientras que los ltimos dos eventos son exotrmicos esto tambin ayudado por la primera derivada la cual nos permite resaltar o afinar un evento qumico o fsico que esta pasandoCver apndice XX). La figura 3.10 representa la muestra de exopolisacrido obtenida a las 15 hrs, en donde se observan cinco prdidas de peso ,el primero se presenta a los 51C (A) la cual se debe a restos de sustancias voltiles o agua adsorbida con una perdida del 4.95%, la segunda se presenta a 13 7.5C ( B ) debido a la desincorporacin de agua de hidratacin y con una perdida de peso del 10.3% ; la tercera y la cuarta se presentan a 236.5 C ( C ) y 258.65C (D) con una perdida de peso del 23.62 y 28.57% debido a carbonizacin del material; la quinta se presenta a 300.96C (E) debido a descomposicin del material con una perdida de peso del 43.8%, los primeros dos eventos son endotrmicos debido a la liberacin del agua y los ltimos tres son exotrmicos, esto se visualizo ayudado con la primera derivada realizada al anlisis trmico diferencial. La figura 3.11 representa la muestra de exopolisacrido obtenida a las 24 hrs, esta presenta 4 prdidas de peso; la primera se presenta a 51C (A) con una prdida de peso del 4.65% la cual se le atribuye a restos de sustancias voltiles o prdida de agua adsorbida ; la segunda se presenta a 210.58C ( B ) con una perdida de peso del 13.41% la cual se le atribuye a la perdida de agua de hidratacin; la tercera se presenta a 267.3C (C) con una perdida de peso del 27.51% la cual se debe a carbonizacin del material; la cuarta se presenta a 306.73C (D) con una prdida de peso del 44.12% la cual se debe a la descomposicin del material residual o degradacin de la columna principal del exopolisacrido (EPS), los primeros dos eventos son endotrmicos y los ltimos dos son exotrmicos, en donde se concluye que todos los cambios son debidos a descomposiciones o volatilizaciones debido a que los cambios de peso que se generan van acompaados de picos exotrmicosy endotrmicos lo cual nos indica que no se presenta fusin alguna del material.

ANALSIS

Tz

TER

MO

GRA

VIM

ETRICO

DTA/TGA

A LAS

HR

150

TEMPERATURA (C)

200

250

350

Fig. 3.9 Anlisis trmico del EPS a las 3 Hrs

WALSIS TERMOGRAVIM 1 0 0
90 80

ETRJCO

DTA/TGA

LAS

15HR
5 T O; 3 3

< a:
UJ G. 5 UJ K UJ O

70
1

60 50 40 30 150

X
O W

.1

ce
UJ 14. O

2
-3

TEMPERATURA (C)

200

250

Fig. 3.10 Anlisis trmico del EPS a las 15 Hrs

ANALSIS

TERMOGRAV1METRJCO

DTA/TGA

A LAS

24

HR

100

150

TEMPERATURA (C)

200

250

350

Fig. 3.11 Anlisis trmico del EPS a las 24 Hrs

Estos cambios graduales de temperaturas de descomposicin nos da informacin acerca de la relacin que existe entre la estructura y sus propiedades fsicas establecindose que a medida que transcurre el tiempo de fermentacin hay una formacin de exopolisacrido. Esta formacin, da como consecuencia que la red polimrica se haga ms estable. El ultimo resultado de temperatura de descomposicin (24 hrs) se comparo con los resultados de biopolmeros de otros investigadores (tabla 3.6).[30] En donde podemos establecer que el biopolmero de nuestra muestra tiene cualidades de alta resistencia a temperaturas de descomposicin
Tabla 3.6 Comparacin de temperaturas de descomposicin de diferentes biopolmeros.

celulosa[36] EPS

Quitosan [30] Hidroxibutil quitosan [30]

332.3 340.1 260 306.73

47.7

71.3

43.1

3.7 ANALISIS DEL AGENTE POLIMERIZANTE POR ABSORCION ATOMICA De las muestras de exopolisacrido obtenidas y analizadas por absorcin atmica se obtuvieron los siguientes resultados :
Tabla 3.7 Concentracin de iones metlicos divalentes en el EPS.

Calcio Magnesio

2.52 0.83

Estos resultados nos confirman la presencia de que ambos elementos estn unidos al polmero ya que despus de obtener el exopolisacrido por precipitacin este se seco y se limpio con etanol mediante reflujo para eliminar protenas y constituyentes inorgnicos no unidos a la red, lo cual sugiere que estos elementos inorgnicos forman parte integral de la red en mayor cantidad y, puede ayudar a que el exopolisacrido sea

ms estable trmicamente y presente propiedades fsicas de mayor inters como agente polimerizante. Este breve estudio se compar con otro biopolmero reportado en literatura 121

Tabla 3.8 Comparacin de los elementos encontrados en % en peso con la goma de xantano.

Xantana (2] BPS Kp

0.1-0.15 2.52

0.83

3.8 ANLISIS DEL EXOPOLISACRIDO POR RMN. De las muestras enviadas (blanco y muestra), para resonancia magntica nuclear solo se pudo obtener resultados de RMN. El resultado (figura 3.13) nos muestra 2 regiones principalmente de carbohidratos, la primera esta entre 0 a 3 ppm y la segunda se encuentra de 3 a 4.5 ppm esto se establece por la conjuncin o agrupacin de las seales de los protones pero, no se puede establecer a que estructura y a que monosacridos se deba se encuentren presentes., ms si podemos decir que los espectros mantuvieron siempre una concordancia en sus seales de RMN .

Fig. 3.12 Espectro de 1 H RMN del blanco (agua deuterada/'NaOH)

LCO f C-J-i 55 '/ci a y 6S P \ IgG /./ c~P ?60v

i - '0

0 0 i }

I i '. f!Ec8 I
l

\ W
\ \ '

\ V
\

\
'

cb'9 > i Z .-.50W ^r S t L ;c: r - V I V z

j >

'r.Z
S C iC3 L/C.: 5/ -JC see "X ' o . -r;
7 '

r
C

f-v

e E t i.
/
-

X
?

=<.

77 "J b K J'J c Si, i -it: -J

_t

t -

i E L

C. L J r

< _ ?! ^
-i u

lr

1i"L
lv !E F

u O C Fig. 3.13 Espectro de 1 H RMN de la muestra.

3.9 ANLISIS DE LA VISCOSIDAD DEL EXOPOLISACRIDO. Los resultados obtenidos de las viscosidades del exopolisacrido con diferentes rotores y, velocidades de rotacin se presentan en la tabla 3.1.3 y, en la figura XX. La curva resultante nos indica la conducta y el tipo de flujo que exhibe el exopolisacrido, en la cual se aprecia que la viscosidad se incrementa conforme aumenta la velocidad de rotacin de los 3 diferentes rotores empleados. Este tipo de conducta se conoce como dilatante o "shear-thickening" siendo frecuentemente observado en fluidos que contienen altos niveles de slidos defloculados tales como pastas cermicas, gomas en agua etc.1311

Fig. 3.14 Viscosidad del exopolisacrido en funcin de la velocidad de rotacin del viscosimetro.

TABLA 3.9 Resultados de las viscosidades obtenidas con diferentes velocidades de rotacin con 3 diferentes rotores. m 1H 10 20 50 100 2H 3H 50 100 50 100 0.3010 0.6989 0.8573 1.0170 0.9031 1.0791 0.6020 1.0791

3 . 1 0 CROMATOGRAFA

los resultados de la cromatografa de papel realizado en silica gel son os siguientes:

Distancia recorrida por el solvente^ 13 cm

Mta.

Man.

Glu.

fig. 3.15 Resultados de la cromatografa en papel.

Tabla 3.10 Comparacin de los Rf de la muestray estndares de azcares.

Muestra manosa Glucosa Galactosa Ac. glucuronico

0.58 y 0.36 0.61 0.59

-

0.76[291 0.70[29] 0.601291 0.32[29]

Con los datos experimentales de R f de la muestra y de los standares podemos predecir que en nuestro biopolmero se encuentran grupos de glucosa y maosa principalmente, la mancha inferior que nuestra muestra arrastr se comparo con bibliografa y se encontr cierta concordancia con el Rf experimental de cido glucuronico por lo que cabra la posibilidad de que estuviese presente
CONCLUSIONES

Los resultados reportados del exopolisacrido a partir de microorganismo Klebsiella pneumoniae pueden ser considerados como un significativo avance en sus estudios fsicos y qumicos. Esta afirmacin se basa en las siguientes observaciones: El exopolisacrido es producido con una cintica constantey aunque la produccin de EPS no llego a ser la ptima esto da paso a estudios posteriores para que se incremente la produccin. II-. El polisacrido posee caractersticas qumicas estables, una gran ventaja si este se llega a producir en masa para aplicacin industrial. I I I - . El polisacrido presenta una viscosidad de fluido dilatante similar al comportamiento de la goma de xantano {2] IV-. El polisacrido posee una temperatura de descomposicin alta, la cual es comparable con otros para biopolmeros a partir de microorganismos. Se obtuvieron espectros de FT-IR que ayudaran a la elucidacin de su estructura ya que se pueden tomar como huellas dactilares. I-.

V-.

VI-.

Estas observaciones no toman en cuenta el hecho de que para el crecimiento de los microorganismos y produccin de exopolisacrido requiere fuentes de carbn y energa que son fuentes renovables y la factibilidad de utilizar materias primas diferentes para su produccin . V I I - . Estos datos experimentales dan la pauta para proseguiry conocer ms sobre e comportamiento y la formacin del exopolisacrido ya que es indiscutible que el desarrollo tecnolgico de vanguardia lo exige.

APENDICE

Figura la-.Crecimiento caracterstico de Klehsiella pneumoniae agar nutritivo.

en

Figura 2a-.Medio de cultivo estril.

Figura 3a-.Inoculacin del medio de cultivo.

Figura 4a-.Medio de cultivo con alta viscosidad.

Figura 5a-.Proceso inicial de separacin del exopolisacrido.

Figura 6a-.Proceso intermedio de separaci del exooolisacrido.

gura 7a-.Proceso final de separacin del exopolisacrido.

Figura 8a-.Observacin microscpica de la pelcula (objetivo 100X).

Figura 9a-.Pelcula diferente rea de exposicin (objetivo OOX).

Figura 10a-.Pelcula diferente ngulo (objetivo 100X).

Figura lla-.Separacin del exopolisacrido en fase alcohlica.

rigura 12a-,Exopolisacrido seco

1. Petersen, G.R.; Nelson, G :A.; Cathey, C.A.; Fuller, G.G. "Rheologicall Interesting Polysaccharides From Yeast." Applied Biochem. And biotechnol, (1989) Vol.20/21 pp.845-867. 2. Sutherland,I.W.; "Structure-Function Relationships In Microbial Exopolysaccharides" Biotech.Adv. (1994) Vol.12, pp. 393-448. 3. Hocking, P.J. ; Marchessault,R.H. "Biopolyesters"l Chemical And Technolpgy of Biodegradable Polymers. (1994) Blackie academic and profesional an imprint chaphall pp.48-91. 4. Chum,H.L. ; "Polymer From Biobased Corporation. (1991) pp. 81- 127. Materials" Noyes Data

5. Reuber,T.L. ; Urzainqui, J.A. ; Glazebrook, W.J. ; Reed, J . W and Walker, G.C. "Genetic Analyses and Manipulatons of Rhizobium meliloti Exopolisaccharides. Novel Biodegradable Microbial Polymers. (1990) pp. 285-294. 6. Linton, J.D. ; "Physiology of Exopolysaccharides Production" Biodegrable Microbial Polymers. (1990) pp. 311-330. Novel

7. Zevenhuizen, L.P.T.M. ; "Recent Developments in Rhizobium Polysaccharides" Novel Biodegradable Microbial Polymers. (1990) pp. 387-402. 8. Dawes, E.A. ; "Novel Microbial Polymers : Introduction Overview Novel Biodegradable Microbial Polymers. (1990) pp. 3-16. 9. Ian W.Sutherland '"Commercialised Microbial Exopolysaccharidescurrent polymers and future products". Institute of cell molecular biology, Edimburg university. 10. Soraya A.Sabry/, Khaled M.ghanem, Wael A.Sabra. "Effect of nutrients on alginate synthesis in Azobacter vinelandii and characterization of the produced alginate". Microbiogia SEM (1996) pp.1-6.

11.Rajendra Kumar Rath, S.Subramanian, and J .S.Laskowski "Adsortion of dextrin and guar gum onto talc. A comparative study Langmuir" (1997) ,13, 6260-6266. 12.Fernando Martnez-Checa, Concepcin Calvo, M.Angeles Caba, M.Rita Ferrer, Victoria Bejr, Emilia Quesada. "Efecto de las condiciones nutricionales sobre la viscocidad y capacidad emulgente del biopolmero V2-7 de Volcaniella eurihalina. Microbiologa SEM 12(1996) pp.55-60. 13. Magali C.Cammarota and Geraldo L. Sant'anna Jr. " Metabolic blocking of Exopolysaccharides synthesis: efeccts on microbial adhesion and biofilm accumulation". Biotechnology Letters.Vo 20, No 1, 1998 pp. 1-4. 14. Jacqueline I : Kroschwitz " Encyclopedia of polymer science and engineering" A.Wiley-Interscience Publication 1990 pp.1299-1306 15. West, Anthony R. "solid state chemistry and its aplications" Ed. john wiley and sons (1984) pp.102-115 16. V.Crescenci, M.Rentini, T.Coviello "solution and gelling properties of microbial polysaccharides of industrial interest: The case of gellan." novel Biodegradable microbial polymers(1990) pp.277-284.

17. M.Vincenzini, R.de philipps, C. Sili snd R. Materassi "A novel EPS from a filamentous cyanobacterium : Production, chemical characterization and rheological properties" Novel biodegradable microbial polymers(1990) pp.295-310 18.Veneta I.Groudeva, Stoyan N.Groundev "Microorganisms improve kaolin properties" American Ceramic Society (1995) vol.74 N.6 pp.85-89, 19. Giles Lefebvre,Magali Rocher and Gerhart Braunegg. "Effects of low dissolved-oxigen concentrations on poly-(3-hidroxibutyrate-co3-hydroxyvalerate) production by alcaligenes eutrophus.

20. D.Lohman "Structural diversity and funcional versatility of polisaccharides" Novel Biodegradable Microbial Polymers (1990) pp.333-348 21. Frobisher ; Hinsdill, Crabtree ; Goodheart. "Fundamentals of Microbilogy" 9 th edition (1974 ) W .B Saunders company pp.770-772 22. Arnold L. Demain and Nadine A. Solomon (Editors) " Manual of Industrial Microbiology and biotechnology". American society for microbiology (1986) 23. Pelczar M.J ; Reid R.G ; Chan E.C.S "Microbiologa " 4ta edicin (1982) Editorial McGraw-Hill pp. 102-117 24. R.M Silverstein ; G.clayton Bassler ;Terence V. Morril "Spectrometry Identification of Organic Compounds" fifth edition John Wiley and Sons Inc. 1991 25. P.J.Haines "Thermal Methods of Analysis" principles, aplications and problems Chapman Hall 1995. 26. Quintero R. Rodolfo "Prospectiva de la biotecnologa en mxico" fundacin javier barros sierra, conacyt 1985 pag. 61-95 27. James S. Swnehart "Organic chemistry an experimental approach Meredith corporation 1969 USA pag.484-487 28. Bohinski Robert C. "Bioqumica" fondo educativo interamericano 1986 pag. 12-32, 29. Gunter Zweig, Joseph Sherma Vol I I "paper chromatography" Academic press 1971 pag.6-27, 30-84, 152-169. 30. Macossay T.Javier " synthesis and characterization of water soluble chitosan derivates Louisiana state university and agricultural and mechanical college (1995)

31. Brookfield Engineering laboratories " More solution to sticky problems" 32. Robert R. Murray, R .A.Mayes ;D.K. Granner ;V.W.Rodweli Bioquimica de Harper" 13ava edt. Editorial manual moderno 1994 pag. 162-168. 33. R.C.Fuller "Bacterial polyester :past, present and future" Novel Biodegradable Microbial Polymers ; .K.Academic Press. 1990 ;pag 19-21 34. D.Byron " Industrial Production Of Copolymer From Alcaligenes Eutrophus" Novel Biodegradable Microbial Polymer Kluber Academic Publisher 1990, pag. 137-190. 35. B.Withoit; G.W.Huisman "Bacterial Poly(3-hidroxialkanoates)" Novel BiodegradableMicrobialPolymer ; kluber Acad. Publisher 1990. Pag 161-170. 36. David R. Lide "Hanbook Of Chemystri and Physics " 71 edition 1990-1991 pag 3-170