1

I
I U U N N I I D D A A D D




Bacteriologa
General











2

P PR R C CT TI IC CA A 1 1
R Re ec co on no oc ci im mi ie en nt to o d de e l lo os s t tr re es s a am mb bi ie en nt te es s d de el l l la ab bo or ra at to or ri io o d de e M Mi ic cr ro ob bi io ol lo og g a a y y
P Pa ar ra as si it to ol lo og g a a. .
U Us so o d de el l m mi ic cr ro os sc co op pi io o. . B Bi io os se eg gu ur ri id da ad d


1.- Con qu finalidad se utiliza la solucin salina o suero fisiolgico?

La adicin del suero es para promover el crecimiento de microorganismos menos
resistentes. Los sueros ms empleados son: suero de ternera, suero de bovino y algunas
veces el suero humano.


2.- Qu es agar?

Es un coloide hidroflico obtenido de varias especies de algas rojas. Es utilizado para el
cultivo solido de bacterias y otros microorganismos emulsificadores y como medio de
soporte para inmunodifusin e inmunoelectroforesis.


3.- Diga en qu momento se requiere el uso de los indicadores y amortiguadores?

Un amortiguador se usa cuando se necesita infundir algn cambio en la [H
+
]. El indicador
se usa para dar a conocer la aparicin y desaparicin de un compuesto qumico por un
cambio de color o logro de un determinado pH.


3

Partes del Microscopio














































4

P PR R C CT TI IC CA A 2 2
P Pr re es se en nc ci ia a d de e m mi ic cr ro oo or rg ga an ni is sm mo os s e en n e el l m me ed di io o a am mb bi ie en nt te e. . T T c cn ni ic ca as s p pa ar ra a e el l a ai is sl la am mi ie en nt to o d de e
m mi ic cr ro oo or rg ga an ni is sm mo os s. . N Ne ec ce es si id da ad d d de e p pr ra ac ct ti ic ca ar r l la as s t t c cn ni ic ca as s a as s p pt ti ic ca am me en nt te e. . C Cu ul lt ti iv vo o d de e
o or rg ga an ni is sm mo os s a an na ae er ro ob bi io os s. .

I. EXPERIMENTO N 1:

Presencia de microorganismos en el medio ambiente

Fundamentacin:
Confirmar la presencia de microorganismos en el medio ambiente, mediante un
procedimiento llamado siembra que consiste en acondicionar el microorganismo a un
medio de cultivo frtil, para que en condiciones ptimas de temperatura y tiempo de
incubacin, pueda desarrollarse y multiplicarse.

Materiales
_ 1 placa petri con agar nutritivo, agar sangre.
_ Suero salino.
_ Asa de Kolle

Procedimiento
_ Tomar la placa con agar nutritivo y dividirlo en 4 cuadrantes con un plumn
indeleble.
_ Dibujar estrias en medio de cultivo.
_ 1 cuadrante: agua de cao.
_ 2 cuadrante: Saliva.
_ 3 Cuadrante: Agua de piso.
_ 4 cuadrante: Agua de Piel.
_ Tomar la placa de agar sangre y tosa en el.
_ Incubar a 37C por 24h.

Resultados y conclusiones:
_ En el sector con agua de cao no se observa crecimiento de
microorganismo. El sector con saliva presenta crecimiento
pero no por la saliva porque no contiene microorganismos;
esto demuestra que nuestra boca contiene gran cantidad de
microorganismos como el Estreptococo mutans.
_ El sector con agua de piso y de piel tambin mostro
crecimiento debido a la presencia de microorganismos en el
medio ambiente.
_ En el agar sangre se observo la presencia de
microorganismos pero ninguno realizo hemolisis, por lo cual
no era un Estreptococo B hemoltico.





5

II. EXPERIMENTO N2:

Tcnicas para el aislamiento de microorganismos. Necesidad de practicar las tcnicas
spticamente.

Fundamento
En todos los ambientes habitan multiples microorganismos de diversos tipos y actividd
fisiolgica. Para efectuar el estuio de un organismo en particular es necesario separarlo de
la poblacin mixta en la que se encuantra. Para tal fin se emplean tcnicas de aislamiento
que conduzcan a la obtencin de un cultivo puro. Los mtodos usados son: diluciones
seriadas y siembra por vertido en placa, siembra por agotamiento.

Material
1 Placa Petri Estril con Agar Nutritivo
1 Placa Petri No Estril con Agar Nutritivo.
2 Tubos de prueba con caldo Nutritivo
1 Pipeta estril de 1 ml.
1 Tubo con caldo de cultivo mixto de bacterias
Procedimiento:
Aislamiento por mtodo de sembrado de estras.
Estra Simple
Estra por Agotamiento
Siguiendo estrictamente las reglas de asepsia aprendidas en experimento 1, con el
asa de Kolle, tome una muestra del tubo con caldo de cultivo mixto y dibuje, estras
sobre la superficie del medio de cultivo en la placa Petri estril con agar nutritivo.
Marque la placa con lpiz de vidrio y lleve a la estufa a 37C por 24 h.
Tome la placa Petri no estril y mrquela en su parte posterior colocando No
estril, llvela a la estufa a 37C por 24h.
Tome los dos tubos de caldo nutritivo y con la pipeta estril transfiera 1 ml de caldo
de un tubo a otro y viceversa por 5 veces, usando la misma pipeta, tapone los tubos
y llvelos a la estufa a 37C por 24 a 48 h.

Resultados
En las placas con estras simples, se observa que hay crecimiento pero de un solo
tipo de colonia.
En las placas de agotamiento por estras, se trata de un mtodo rpido y simple de
agotamiento y continuo de inoculo sobre un medio solido contenido en una placa
petri. El objetivo es obtener, a partir de un elevado nmero de bacterias, un nmero
reducido de ellas distribuidas individualmente sobre la superficie de la placa. Cada
una de estas bacterias originara una colonia. Se obtiene diferentes colonias.








6

III. EXPERIMENTO N 3:

Cultivo de Organismos Anaerobios.

Fundamentos
Los microorganismos anaerobios constituyen la flora bacteriana predominante en el
ser humano y se hallan constantemente en el ser humano y en el tracto intestinal,
vas respiratorias y aparatos genitourinarios. Aun cuando los anaerobios se
encuentran en heridas y abcesos, hay que tener presente que pueden participar en
cualquier tipo de infeccin. Para trabajos de laboratorio con estos microorganismos
es preciso obtener condiciones de anaerobiosis; esta atmosfera tiene doble finalidad:
eliminar o reducir la tensin de oxigeno y mantener el ambiente sin este o la menor
concentracin posible. Algunos procedimientos son ms sofisticados otros ms
sencillos.
La va metablica utilizada por estos grmenes permite la liberacin de sustancias
de metabolismo intermediario, como cidos grasos voltiles de cadena corta como
el acido butrico, valrico, etc., de olor desagradable y fcilmente detectable, que
facilitan el diagnostico.
Material :
2 Tubos con Agar Nutritivos vertical
2 Tubos con Agar Nutritivos inclinado
2 Tubos con Caldo de Tioglicolato o caldo carne
Campaa de Durham o Jarra Gaspack
Cepas de Clostridium sporgenos y Bacillus subtilis

Procedimiento:
Siembre cada cepa en uno de cada par de tubos, por puntura en el agar vertical, por
estra en el inclinado y asada en el caldo. Tapone los tubos y lleve a la Campaa de
Durham. Incube a 37C por 24 h.
Resultados
El Clostridium sporogenos es un microorganismo anaerobio, por lo tanto al obtener
los resultados no se observo crecimiento alguno en el AGAR VERTICAL (falla en
el cultivo) pero se debi observar en la base por ser zona anaerobia, en el AGAR
DIAGONAL se observo crecimiento en la zona anaerobia y tambin hubo
crecimiento en el caldo de TIOGLICOLATO.
El Bacillus subtilis es un microorganismo aerobio y presento crecimiento en el
AGAR DIAGONAL (zona aerobia), pero tambin hubo crecimiento en el AGAR
VERTICAL en la zona aerobia y en anaerobia porque el Bacillus es un anaerobio
facultativo. Tambin hubo crecimiento en el caldo de TIOGLICOLATO.









7

P PR R C CT TI IC CA A 3 3
M Me et ta ab bo ol li is sm mo o B Ba ac ct te er ri ia an no o. . E En nz zi im ma as s d de e l lo os s m mi ic cr ro oo or rg ga an ni is sm mo os s. . F Fe er rm me en nt ta ac ci i n n b ba ac ct te er ri ia an na a. .

I. EXPERIMENTO N 1:

Hidrlisis del Almidn

Objetivo: Hacer conocer al alumno que existen microorganismos que producen
exoenzimas y que atacan substratos importantes como Carbohidratos y Protenas.

El almidn es un polmero de glucosa, se encuentra como material de reserva. Es
hidrolizado por las enzimas: Alfa Amilasa y Beta Amilasa. Tambin puede ser hidrolizado
por los Acidos Minerales.

ALFA AMILASA + ALMIDON = DEXTRINA + ALFA MALTOSA
BETA AMILASA + ALMIDON = ALFA MALTOSA

Las Amilasas son enzimas extracelulares

Materiales:
Solucin de Yodo (Lugol)
Cepas de Bacillus subtilis y Escherichia coli.
1 Placa de Agar Almidn

Procedimiento:
Dividir en dos sectores la placa de Agar almidn
Inocular en estras cada sector con las capas de B. subtilis y E. coli.
Incubarlo a 37C por 24 h.
R Re es su ul lt ta ad do os s

O Or rg ga an ni is sm mo o C Cr re ec ci im mi ie en nt to o H Hi id dr r l li is si is s
B Ba ac ci il ll lu us s s su ub bt ti il li is s D De e b bu ue en no o a a e ex xc ce el le en nt te e + +
E Es sc ch he er rc ci ih hi ia a c co ol li i D De e b bu ue en no o a a e ex xc ce el le en nt te e - -

Luego de agregar el lugol:












8

II. EXPERIMENTO N 2:

Hidrlisis de la Gelatina

La gelatina es una protena dotada de la propiedad de tomar GEL cuando se disuelve en
agua caliente Por tratarse de una protena puede ser atacada por alguna bacterias que la
priven de su propiedad gelitificante.
La hidrlisis de la gelatina es una reaccin enzimtica y se conoce por GELATINASA la
enzima causante de esta transformacin.

Materiales:
Cepas de S. Aureus, B. subtilis y E. coli.
Tres tubos de Gelatina Nutriente estril
Asa de Kolle en aguja


Procedimiento:
Inocule cada uno de los organismos en un tubo de Gelatina Nutriente por puntura
hasta el fondo del tubo, una sola vez.
Incube a temperatura ambiente por 2 a 7 das, no en incubadora porque derrite la
gelatina.


R Re es su ul lt ta ad do os s

O Or rg ga an ni is sm mo o C Cr re ec ci im mi ie en nt to o H Hi id dr r l li is si is s d de e G Ge el la at ti in na a
S S. . a au ur re eu us s D De e b bu ue en no o a a e ex xc ce el le en nt te e + +
B B. . s su ub bt ti il li is s D De e b bu ue en no o a a e ex xc ce el le en nt te e + +
E E. . c co ol li i D De e b bu ue en no o a a e ex xc ce el le en nt te e - -


I In nt te er rp pr re et ta ac ci i n n

H Hi id dr r l li is si is s d de e l la a g ge el la at ti in na a
P Po os si it ti iv vo o ( (+ +) ): : c cu ua an nd do o e el l m me ed di io o e en n e el l t tu ub bo o n no o e es st t g ge el li if fi ic ca ad do o. .
N Ne eg ga at ti iv va a ( (- -) ): : c cu ua an nd do o e el l m me ed di io o e en n e el l t tu ub bo o e es st ta a g ge el li if fi ic ca ad do o. .











9












10

III. EXPERIMENTO N 3:

Produccin de Hemolisinas

Objetivo: Conocer y estudiar las exoenzimas que tienen efectos destructivos sobre los
glbulos rojos.

Hemolisina Beta: Destruye y decolora la Hemoglobina. Esto se observa como reas
claras alrededor de la colonia.

Hemolisina Alfa: No decolora la Hemoglobina, pero la cambia a un color verdoso.
(Biliverdina)

Materiales:
Cepa de Staphylococcus aureus (o B. subtilis) y Streptococcus pneumonias o
Streptococo Lact.
Agar sangre (1 2)

Procedimiento:
Dividir en dos placas petri.
Inocular en estras las cepas en cada uno de los lados.
Incubar a 37 C por 24-48 h.
Observar si ha habido hemlisis

R Re es su ul lt ta ad do os s: :
E En n e el l E Es st ta af fi il li ic co oc co o a au ur re eu us s s se e p pu ud do o o ob bs se er rv va ar r p pq qu ue e o os s h ha al lo os s e en n l lo os s b bo or rd de es s, , p pe er ro o s so ol lo o
e en n u un n l la ad do o ( (h hu ub bo o h he em mo ol li is si is s p pe er ro o p po oc ca a) ), , p po os si ib bl le e f fa al ll lo o e en n l la a s si ie em mb br ra a. .
E En n e el l d de e E E. . c co ol li i d de eb bi id do o a a q qu ue e p pr ro od du uc ce e h he em mo ol li is si in na a a al lf fa a p po or r e el ll lo o p pr ro od du uc ce e h he em mo ol li is si is s
i in nc co om mp pl le et ta a n no o d de ec co ol lo or ra a t to ot ta al lm me en nt te e l la a h he em mo og gl lo ob bi in na a. .



















11

IV. EXPERIMENTO N 4:

Demostracin de la Produccin de Coagulasa N.

La Coagulasa es una exoenzima elaborada por el Staphylococcus aureus y que coagula el
plasma humano o de cobayo.

Materiales:
Cepa de S. Aureus
Plasma humano o de cobayo citratados en tubo.

Procedimiento:
Tomar una azada de la cepa e inocular en el tubo que contiene el plasma citratado.
Incubar por 2-3 horas. Revisar cada 30 el tubo para ver si han empezado a formar
cogulos. Para esto incline el tubo para ver que tan lquido est el plasma.
Resultados
Se produjo coagulacin del debido a la coagulasas del Estafilococo aureus.











Plasma citratado formacin de cogulos, (+) turbio



















12

V. EXPERIMENTO N 5:

Fermentacin de Carbohidratos

Fermentacin se refiere a la degradacin anaerbica de los carbohidratos. La capacidad
para fermentar los carbohidratos depende de las enzimas que contenga cada bacteria. La
degradacin de los carbohidratos conduce a la formacin de productos lcteos, por lo tanto
se utilizar un indicador de ph: Rojo Fenol.

En la prctica se utilizar el medio TSI en tubo. Si la bacteria no tiene las enzimas
necesarias para atacar los carbohidratos, no cambiar el ph.

La prueba contendr lo siguiente:
Agar TSI (3 azcares y hierro) favorece el desarrollo de la mayora de bacterias.
Azcares qumicamente definidos: Lactosa, sacarosa y glucosa.
Un indicador de ph.

NC no cambio de ph
A cido
AG cido y gas
b bsico

Cuando no hay carbohidratos utilizables en el medio la energa necesaria la obtiene la
bacteria de protenas y su producto final es gas amoniaco.

Materiales:
Cultivo de Escherichia coli , Alcaligenes faecalis y Staphylococcus aureus
3 tubos con TSI en plano inclinado

Procedimiento:
Sembrar por estra y puntura:
a) E. Coli - TSI
b) Alcaligenes - TSI
c) Staphylococcus - TSI
Incubar por 24 h. A 37C

Resultados:
El tubo correspondiente a la E. coli evidenciamos un cambio de color de rojo a amarillo (un
medio acido); y esto evidencia la existencia de una fermentacin. En funcin a la posicin
de los azucares observamos una prueba de lactosa + sacarosa + glucosa.







13

Hubo fermentacin en E. coli












En el tubo correspondiente a la siembra con alcaligenes se mantiene la coloracin roja
(medio bsico), no hubo fermentacin.

Alcaligenes, no hay fermentacin












En el tubo con siembra de S. aureus, se observ una fermentacin casi completa. Se
muestra que este organismo es ayudado por el oxgeno.

Fermentacion en siembra de Staphylococcus















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Conclusiones:
La capacidad de fermentar al CHO depende de la presencia enzimtica del
microorganismo
El cambio de pH est en relacin a la capacidad fermentativa
Los alcaligenes al no poder fermentar; esto se debe a la no presencia del material
enzimtico correspondiente.

VI. EXPERIMENTO N 6:

Reduccin de Nitratos a Nitritos

En la respiracin anaerbica, las bacterias utilizan al nitrato como aceptor final de H +, este
fenmeno lo pueden realizar algunos grmenes aerobios, anaerobios, y anaerobios
facultativos.
Se observa al final de la reaccin la presencia de gas nitrgeno libre.



Nitrato de Potasio KNO3 Nitrato de Potasio
2H + NO3 H2O + NO2

Materiales:
Cultivo de E. coli, Pseudomona areuginosa
Caldo nutritivo con nitrato 6cc.
Sol. Dimetil - alfa - naftilamina
Sol. de cido sulfanlico
Tubos de pruebas estriles (3)

Procedimiento:

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3

2cc caldo de 2cc caldo de 2cc de caldo
nitrato + E. coli nitrato + Pseudomona nitrato + Bacillus

Incubar por 24 hrs. a 37C.
Agregar a cada tubo 3 gotas de cido Sulfanilico y 2 gotas de alfanaftilamina
Observa cambio de color, color rosado o rojo: Prueba positiva.









15













(+) (-) (+)

VII. EXPERIMIENTO N 7:

Reduccin de cido Sulfhdrico

Cuando se realiza la fermentacin de las protenas se obtiene como producto el cido
Sulfhdrico, ya que las protenas contienen aminocidos sulfurados. Algunas bacterias
tienen enzimas que desprenden al cido de azufre de estos aminocidos, el cual es reducido
con hidrgeno del substrato para formar cido sulfhdrico. Por lo tanto el azufre funciona
como aceptor de H +.

H2S + FeSO4 FeS + H2SO4
(negro)

Materiales:
Cultivo de E. coli y Proteus vulgaris
Tubos con TSI, con superficie inclinada (2)

Procedimiento:
Inocular a cada tubo de TSI, las cepas de E. coli y Proteus respectivamente, por
estra y puntura.
Incubar a 37C por 24 hrs. Observar la formacin de FeS color negro.

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Resultado:
El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce cido sulfhdrico.















Conclusin

El tomo de azufre liberada por los organismo atreves de la accin con los H+ para
formar cido sulfhdrico.
Para detectar la formacin del gas cido sulfhdrico se requiere la incorporacin de
aditivos al medio, tales como hierro ya que reacciona con el ac. Sulfhdrico
formando sulfuro insoluble (color negro).
La presencia de cido Sulfhdrico se evidencia por el ennegrecimiento de los tubos de TSI.













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VIII. EXPERIMENTO N 8:

Demostracin de la produccin de Indol

Algunas bacterias degradan el aminocido triptfano formando INDOL.

Materiales:
Cultivo de E. coli y Bucillus subtilis
Caldo Triptona 2 tubos con 3cc cada uno)
Solucin de Kovacs
Pipetas de 1cc

Procedimiento:
Inocular un tubo de caldo Triptona con E. coli y otro con Bacillus, Incubar a 37C
por 24 horas.
Agregar a cada tubo y en zona el reactivo de Kovacs. Si el Indol est presente, al
agregar el reactivo de Kovac aparecer un color rojo cereza.

Resultados:
El tubo con E. coli se evidencia la presencia de indol. (1)
El tubo de Bacillus subtilis no hubo presencia de indol. (2)

1 2

























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IX. EXPERIMENTO N 9:

Deteccin de la Catalasa

La Catalasa es una enzima que est relacionada con la capacidad de una bacteria para
utilizar el oxgeno. La falta de esta enzima en los organismos anaerobios es la causa de que
el O2 les sea perjudicial. Cuando hay Oxgeno estos organismos lo emplean como aceptor
final de Hidrgeno para formar Agua Oxigenada, pero sta no puede desdoblarse en H2O y
O2 porque falta la Catalasa; por lo tanto el agua oxigenada se acumula y mata a la bacteria.

Catalasa
2H2O2 2H2O + O2 (gas)
Agua Oxigenada

Materiales:
Cultivo de E. coli y Stafilococo aureus.
Tubos con Triptosa Caldo (2)
Agua Oxigenada 3.0%

Procedimiento:
Inocular en cada tubo una de las cepas
Incubar a 37C por 24 hrs.
Cubrir la superficie del caldo con Agua Oxigenada y observar la presencia de
burbujas en el tubo donde hay catalasa.
Resultados:

Funcion de catalasa (Efervescencia)
Estafilococo aureus +
Clostridium -

En la prueba de E. coli (gram -) con perxido de hidrogeno, no observamos las
burbujas de oxgeno. Esto nos indica que la E. coli es CATALASA NEGATIVA; es
decir, no presenta la enzima catalasa. (1)
En el caso de la bacteria Estafilococo aureus (gram +) con el H
2
O
2
se observar la
formacin de burbujas por presentar la enzima catalasa que actu con H
2
O
2
para
liberar oxgeno. El Estafilococo es CATALASA POSITIVA (2)



(1) (2)






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X. EXPERIMENTO N 10:

Reduccin de Azul de Metileno

Se trata de demostrar la oxidacin en los procesos fermentativos, realizada por los
grmenes anaerbicos, llamada oxidacin anaerbica, donde el sustrato cede un H +, para
lo cual se necesitan aceptores de H +, el azul de metileno acta como aceptor.

Azul de Metileno + 2H Azul de etileno - 2 H
(azul) (Incoloro)
Reduccin del azul de Metileno.

Materiales:
Cultivo de E. coli 7.5cc.
Tubo de Prueba (3)
Pipetas estriles
Azul de Metileno de Loeffer
Caldo nutritivo 7.5cc

Procedimiento:
Rotular los tubos con 1,2,3.

Tubo 1 Tubo 2 Tubo3
4cc cultivo 2.5 cultivo 1cc. cultivo
1cc de caldo 2.5 caldo 4cc de caldo

Mezclar y agregar 1 gota de azul de Metileno a cada tubo.
Incubar a 37C. Observar cada 10 minutos hasta los 20 minutos y anotar los
cambios de color.
R Re es su ul lt ta ad do os s
El azul de metileno es un aceptor de H, posee la propiedad de cambiar de color al pasar de
oxidado (azul) a reducido (incoloro). La E. coli reduce el azul de metileno por eso es
observa que se muestra incoloro. Por eso el tubo 1 se ve ms incoloro.















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P PR R C CT TI IC CA A 4 4
D De et te er rm mi in na ac ci i n n d de e l lo os s r re eq qu ue er ri im mi ie en nt to os s m m n ni im mo os s p pa ar ra a e el l c cr re ec ci im mi ie en nt to o b ba ac ct te er ri ia an no o. . M Me ed di io os s
d de e c cu ul lt ti iv vo os s s se el le ec ct ti iv vo os s y y d di if fe er re en nc ci ia al le es s. .

I. EXPERIMENTO N 1

Objetivo: Conocer los diferentes nutrientes necesarios para el crecimiento bacteriano.

Materiales:

Ingredientes necesarios para la preparacin de diferentes medios de cultivo.
a) Unicamente Agar (lavado y purificado antes de disolverlo)
b) Agar + Minerales (NH4 H2 PO4; Mg SO4; KCl)
c) Agar + Minerales + Glucosa
d) Agar + Minerales + Glucosa + Fuente de Nitrgeno Orgnico (Peptona)
4 placas Petri estriles.conteniendo los medios de cultivo de a,b,c,y d.
Cultivo Escherichia coli. (Sector1), Stafilococcus aureus (Sector2) y candida
Albicans (Sector 3).

Procedimiento:

Con un lpiz de cera, trace sobre el fondo de vidrio de cada placa petri para
dividirlo en cuatro sectores y enumera cada sector. Inocule los sectores
correspondientes de cada placa con uno de los tres organismos.
Deje el cuarto sector de cada placa sin inocular. Vierta las placas, incbelas a
38C por 48 horas y observe el crecimiento en cada uno de los sectores
inoculados.

Resultado:

No hay crecimiento en las 3 primeras placas petri debido a que los requerimientos de las
bacterias son importantes para su crecimiento y estas 3 placas no cumplen con ello. En la
cuarta placa petri si hay presencia de crecimiento porque si cumple con los requerimiento
nutricionales bacterianos permitiendo su desarrollo.














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II. EXPERIMIENTO N 2:

Medios selectivos y diferenciales

Objetivo: Conocer los diferentes medios de cultivo, que permitan el aislamiento e
identificacin de bacterias.

Materiales:

[ Agar nutriente
[ Porcin de Agar-Cloruro de sodio
[ Porcin de rojo fenol-Agar
[ Cultivo de Staphylococcus epidermidis y Alcaligenes (Pseudomona).

Procedimiento:

[ Con el lpiz de cera dividida cada placa en tres sectores: el primero etiqutelo
Alcaligenes faecalis el segundo S. Epidermidis y el tercero djelo sin rotular.
[ Use el asa de Kolle para sembrar en estras cada sector de la placa con el cultivo
correspondiente. Invierta las placas Petri e incbelas por 24 horas a 37C.

Resultados:

En el AGAR NUTRIENTE la seudomona crece y libera tiocianina.
En el AGAR CLORURO DE SODIO la gran concentracin de sal limita el crecimiento
bacteriano.
En AGAR FENOL-AGAR toma un color rojizo.





















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P PR R C CT TI IC CA A 5 5
C Ci it to ol lo og g a a d de e l lo os s m mi ic cr ro oo or rg ga an ni is sm mo os s. . P Pr re ep pa ar ra ac ci i n n d de el l f fr ro ot ti is s y y f fi ij ja ad do o. . T Ti in nc ci i n n s si im mp pl le e. .
T Ti in nc ci i n n d di if fe er re en nc ci ia al l: : c co ol lo or ra ac ci i n n g gr ra am m, , c ci id do o a al lc co oh ho ol l r re es si is st te en nt te es s. . T Ti in nc ci i n n n ne eg ga at ti iv va a. .
D De em mo os st tr ra ac ci i n n d de e l lo os s g gr r n nu ul lo os s m me et ta ac cr ro om m t ti ic co os s. .

III. TINCIN DIFERENCIAL

Se denomina Coloracin Diferencial cuando se emplean dos o ms reactivos. La ms
empleada en la bacteriologa es la coloracin Gram y la coloracin para bacilos cido
alcohol resistentes.


Coloracin Gram

La tincin Gram se compone de cuatro reactivos diferentes: El Cristal Violeta que es el
colorante bsico inicial que tie todas las bacterias, el segundo reactivo es el lugol que
acta como mordiente (sustancia que aumenta la unin del colorante y el substrato). El
tercer reactivo es el alcohol-acetona que acta como decolorante. Mucho microorganismos
retienen el cristal violeta permaneciendo teidos y tomando el nombre de bacterias Gram
positivas; otro grupo de mircroorganismos pierde el color fcilmente por accin del
decolorante, al aadirse la safranina que es de color rojo, toman este segundo colorante,
denominndose microorganismos Gram negativos.

Materiales:
Solucin Cristal Violeta de Genciana
Solucin de Lugol
Alcohol Acetona
Fucciana bsica o Safranina
Lmina portaobjeto, Asa de Kolle, Solucin salina.
Cepas de Estafilococos aureus y Eschericha coli.

Procedimiento:
Frotis y fijado de la muestra
Cubrir la muestra con solucin de cristal violeta durante 1 minuto
Lavar ligeramente con agua de cao
Cubrir la muestra con solucin de lugol durante 1 minuto
Lavar con agua de cao
Decolorar con alcohol-acetona hasta que el alcohol-acetona no arrastre color.
Lavar con agua de cao.
Colorear con safranina por 30 segundos
Lavar, secar y observar

Examinar el preparado al microscopio con objetivo 100x de inmersin (aceite). Las
bacterias Gram positivas se tien de azul oscuro; las bacterias Gram negativas aparecen
rojo rosadas.



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Resultados:
Se realizo la prueba de acuerdo al procedimiento indicado. Luego se hizo una toma
de muestra del agar sangre y del agar simple y se los tio con Gram: Estafilococo
aureus y E. coli.
























Microscpicamente





E. coli








S. aureus




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P PR R C CT TI IC CA A 6 6
E Ev va al lu ua ac ci i n n d de e a an nt ti ib bi i t ti ic co os s p po or r e el l m m t to od do o d di is sc co o d di if fu us si i n n. .

I. EXPERIMENTO N1:

Evaluacin de antibiticos por el mtodo disco difusin.

Materiales:
Cultivo de S. aureus, E. coli.
Disco de antibiograma para gram + y gram -.
Placas petri con agar nutritivo TSA.

Mechero, asa de kolle, hisopo estril.

Procedimiento:
Sembrar con hisopo estril en la superficie de las placas cada sp.
Aspticamente colocar con pinzas los discos de antibiograma en cada placa.
Incubar por 24 hrs. a 37C y dibujar los resultados.

Resultados:
Se pudo observar mediante el tamao del halo:
E. coli resistente a ciprofloxacina, gentamicina. Parcialmente resistente a
amikacina.
S. aureus resistente a oxacilina, ampicilina. Sensible a nitrofurantoina.











25

















































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P PR R C CT TI IC CA A 7 7
D De es st tr ru uc cc ci i n n e e i in nh hi ib bi ic ci i n n d de e m mi ic cr ro oo or rg ga an ni is sm mo os s. . E Ef fe ec ct to o d de e l la a c co on nc ce en nt tr ra ac ci i n n d de e i io on ne es s H H+ +, ,
P PH H. . E Ef fe ec ct to o d de el l c ca al lo or r. . A Ac cc ci i n n o ol li ig go od di in n m mi ic ca a d de e m me et ta al le es s p pe es sa ad do os s. .

I. EXPERIMENTO N 1:

Efecto de la Concentracin de iones H+
El pH de una solucin es el valor negativo del logaritmo en base 10 de su concentracin de
iones hidrgeno en mol x lt.

pH = - log H +

Segn Bronsted y Lowry (1923), un cido se caracteriza por su tendencia a perder H+,
mientras que una base se caracteriza por su tendencia a asociarse con H+. Por lo tanto, los
cidos aportan con una concentracin determinada de H+.
Aplicando la frmula encontraremos que a mayor concentracin de H +, menor pH (mayor
acidez).

El pH puede ejercer una accin bactericida segn la concentracin de hidrgenos y la
especie de la bacteria sometida a dicho pH.

Materiales:
Cepas de E.coli o Estafilococo en suspensin
Reactivos: HCL 1.0N y NAOH 1.ON
Medio de Cultivo: Caldo Peptonado.
Procedimiento:
Es tres tubos con caldo de cultivo estriles, realizar la siembra de E. coli en asadas.
A cada tubo agregarle gota HCL 1.0N, NAOH 1.0 N hasta que en los tubos se
obtengan los siguientes pH: 2 y 9 respectivamente. El tercer tubo servir de control.
Volver a taponar los tubos e incubar a 37C por 24 hrs. Despus de este tiempo, leer
por turbidez.
Resultados:
Tubo1: sin crecimiento de E. coli en medio cido. Caldo peptonado trasparente.
Tubo2: crecimiento de E. coli en medio alcalino. Caldo peptonado turbio.
Tubo3: por fallas de procedimiento tambin se observo crecimiento de E. coli.
Debi haber sido trasparente el caldo peptonado.












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II. EXPERIMENTO 2:

Efecto del calor

Materiales:

Cepas de E.coli o Estafilococo
Equipo: Bao Mara y estufa
Medios de cultivo: caldo peptonado

Procedimiento:

Empleando tres tubos de caldo peptonado, realizar la siembra de E.coli.
Someter a dos de los tubos a la accin del calor por bao Mara, graduando en 40C
y 100C por 10 minutos respectivamente. El tercer tubo no se somete a la accin del
calor para que sirva de control.
Retirar los tubos del bao Mara e incubar los tres tubos a 37C por 24 horas.
Realizar la lectura por turbidez.

Resultados:

Tubo 1 (Experimental) 40C Tubo 2 (Experimental) 100C Tubo 3 (Control)
Turbidez Si ++ No. Trasparencia Si +

La E. coli presenta temperatura optima de crecimiento 40C pero puede presentar
crecimiento a temperatura ambiente porque su lmite de temperatura va de 8-47C









A mayor turbidez, indica que hubo mayor
proliferacin bacteriana, es decir, que el medio
acido es el adecuado para estas bacterias.








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III. EXPERIMENTO N 3:

Accin oligodinmica de los metales pesados.

Las sales solubles de mercurio, arsnico, plata, cobre y otros metales pesados, alteran la
actividad enzimtica formando mercptidos con grupos sulfhidrilo de residuos de cistena.
La reaccin inicial es reversible, y si se agregan grupos SH extraos en forma de glutation
o tioglicolato de na, muchas de las clulas se recuperan. La capacidad de unin de los
mercuriales se extiende en un amplio rango de ligandos a dems de los grupos que
contienen SH, por ejemplo carboxilados, fosfatos y aminas.

Materiales:

Cepas de E. coli Estafilococo
Reactivo: Mercurio Cromo. No3Ag al 1%
Medios de cultivo: caldo peptonado
Equipo: Estufa

Procedimiento:

Realizar la siembra de una cepa de E. coli en dos tubos de caldo y en dos placas con
Agar nutritivo hacer la siembra en toda la superficie del agar.
A uno de los tubos, agregarle 5 a 10 gotas de mercurio cromo o nitrato de plata. El
otro constituye el control.
Incubar a 37C por 24 horas. La lectura se hace por turbidez en la siembra en caldo
y por halo de inhibicin en agar.

Resultados:

Tubo Problema Tubo Control
AgNO3 1% Si No
Crecimiento (Turbidez) No Si
Precipitacin Si No

Tubo problema: no hay crecimiento bacteriano = accin oligodinamica de los
metales.
Tubo control: si hay crecimiento bacteriano.










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P PR R C CT TI IC CA A 8 8
L Li im mp pi ie ez za a d de e l la a p pi ie el l y y a an nt ti is se ep ps si ia a c cu ut t n ne ea a. .

I. EXPERIMENTO N 1:

Materiales (Observacin del crecimiento):

Placa petri (3) con agar nutritivo o TSA dividido en 2 sectores cada uno
Isopos de algodn estril (3)
Solucin antisptica, alcohol yodado
Un tubo con caldo nutritivo estril

Procedimiento:

En el sector 1 toque con sus dedos varias zonas, lavase las manos con agua y jabn
squese y toque con sus el sector 2, lavase las manos por segunda vez y toque el
sector 3 lavase las manos por tercera vez y toque el sector 4.
En otra zona de su piel aplique el desinfectante por 2 minutos sobre esta zona
humedezca con caldo nutritivo y siembra esta con el hisopo estril en la zona 5.
Aplique el desinfectante por dos minutos ms y repita lo anterior para sembrar en el
sector 6.
Incube a 37C por 24 hrs. observe y comente los resultados.

Resultados:

1 placa petri: en el 1 sector hay crecimiento bacteriano debido a que no hubo una
buena asepsia, en el sector 2 gracias al lavado de manos hubo disminucin del
crecimiento bacteriano.
2 placa petri: sector 3 y 4 gracias al lavado de manos varias veces hubo un menor
crecimiento bacteriano.
3 placa petri: no hubo crecimiento bacteriano porque se hizo una asepsia con
desinfectante y alcohol yodado.
















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CUESTI ONARI O

Qu es SIEMBRA POR ESTRA?
Se siembra el material en la superficie de el agar inclinado en un tubo de ensayo, all se
extiende por toda la superficie con el asa bacteriolgica, previamente esterilizada y cargada
con el material a sembrar, haciendo estras no muy amplias, pero tampoco muy estrechas.
Se inicia por la parte ms profunda de la superficie inclinada y se termina la estra en la
parte ms cerca de la boca del tubo.
Medio de cultivo: agar base inclinado.
Instrumento: asa o aguja bacteriolgica.

Qu es SIEMBRA POR AGOTAMIENTO?
Con ste procedimiento se puede conseguir una buena separacin de las colonias y
aislarlas fcilmente. Para ello se funde el medio de cultivo, se vuelca en caja de Petri y se
deja solidificar. Con el asa previamente esterilizada se toma material de un cultivo
heterogneo y se descarga sobre la superficie del medio formando estras. Esto puede
realizarse de varias formas:
a- Al comienzo se coloca el inoculo, luego se contina con las estras. Cuando se quiere
obtener colonias muy separadas se puede utilizar dos o tres placas de Petri, para lo cual se
repite la operacin sin tomar con el asa nuevo material.
b- Se puede dividir la placa de Petri en cuatro cuadrantes; una vez depositado el material en
el primero, siguiendo el sentido de las agujas del reloj, se hace una estra luego en el
segundo, tercero y cuarto cuadrante sin cargar nuevamente el asa; en el ltimo cuadrante
aparecern las colonias aisladas
c- El inculo se extiende sobre una pequea zona de la placa, prxima al borde, se esteriliza
el asa y se traza otra estra a partir del depsito y as sucesivamente.
Medio de cultivo: solido en placa de Petri.
Instrumento: Asa Kolle.
Finalidad: Obtener colonias aisladas

Qu es AGAR NUTRITIVO?
Es un medio para fines generales utilizado en el examen de agua y productos lcteos;
tambin para el cultivo de la mayora de microorganismos menos fastidiosos; de la misma
manera para el transporte de cepas; para el cultivo preliminar de muestras sometidas a
exmenes bacteriolgicos y para aislar organismos en cultivos puros.
Composicin
Extracto de carne 3g
Peptona 5g
Agar 15g
pH final 6.8








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Qu es AGAR SANGRE?
Se prepara a partir de un medio base al cual se le aade sangre, lo que permite aislar y
cultivar organismos fastidiosos y exigentes. El pH ligeramente cido, del medio base
favoreces reacciones hemolticas precisas.
Composicin
Infusin de corazn vacuno 500g.
Triptosa 10g
pH 6.8
Cloruro sdico 5g
Agar 15g

Qu es AGAR ALMIDN?
Es un medio para cultivos de organismos que se analizan para determinacin de hidrlisis
del almidn o para estudios comparativos.
Composicin
Extracto de carne 3g
Almidn soluble 10g
Bacto Agar 12g
pH final 7.5 +/- a.2 a 25C

Qu es AGAR GELATINA?
Se utiliza para determinar la licuefaccin de la gelatina por organismos proteolticos,
facilitando el recuento directo en la placa, para la determinacin de poblaciones bacterianas
y para el aislamiento de cultivos puros. Sin embargo su uso es limitado en procedimientos
de siembra y aislamiento, ya que, la incubacin tiene que realizarse a 20C (temperatura
ms baja que la optima para mucho microorganismos), adems muchos organismos tienen
la capacidad de licuar y atacar a la gelatina.
Composicin
Extracto de carne 3g
Peptona 5g
Gelatina 120g
pH final 6.8 +/- 0.2 a 25C.

Qu es AGAR TSI?
Medio universalmente empleado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la
fermentacin de glucosa, lactosa, sacarosa y a la produccin de cido sulfhdrico.

Fundamento
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes
adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de
carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de
cido sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe
3+
, los cuales se
combinan con el cido sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de
fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico.
Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por medio del indicador
rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio cido. El tiosulfato de sodio se reduce

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a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el
tpico sulfuro de hierro de color negro.

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones
Extracto de carne 3.0
Suspender 62,5 g del polvo por litro de
agua destilada. Mezclar bien y calentar
con agitacin frecuente, hervir 1 o 2
minutos hasta disolucin total. Llenar
hasta la tercera parte de los tubos de
ensayo. Esterilizar a 121C por 15
minutos. Enfriar en pico de flauta
profundo.

Pluripeptona 20.0
Cloruro de sodio 5.0
Lactosa 10.0
Sacarosa 10.0
Glucosa 1.0
Sulfato de hierro y amonio 0.2
Tiosulfato de sodio 0.2
Rojo de fenol 0.025
Agar 13.0
pH final: 7.3 0.2

Qu es CALDO TRIPTONA?
Es un medio de cultivo microbiolgico que presenta abundante triptfano, se utiliza para la
reaccin del indol (liberacin de triptfano). Dicha liberacin se debe a la degradacin del
aminocido triptfano mediante la enzima triptofanasa.

Qu significa CALDO MIXTO?
Es decir tiene como finalidad ser un medio selectivo y un medio diferencial.

Qu significa CALDO TIOGLICOLATO?
Se utiliza para pruebas de esterilidad para ciertos productos biolgicos que estn turbios.
Contienen tioglicolato para neutralizar el efecto bacteriosttico de preservantes mercuriales.
No contiene agar, lo que le hace adecuado para probar materiales viscosos y aparatos que
tengan tubos con pequeas aberturas.
Composicin
Extracto de levadura 5g
Casitona 10g
L-cistina 12g
Tioglicolato sdico 0.5g
Cloruro sdico 2.5g
Dextrosa 5.5g

Qu es un MEDIO SELECTIVO?
El medio de cultivo selectivo favorece el crecimiento de organismos pero tambin inhibe el
crecimiento de otros. Este medio contiene compuestos qumicos que favorece e inhibe el
crecimiento de ciertos microorganismos, este medio tambin tiene ciertos tintes que
provoca que ciertas bacterias fermentadoras de lactosa crezcan y se tie de dicho color
caracterstico del tinte.



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Qu es un MEDIO DIFERENCIAL?
El medio de cultivo diferencial es el que facilita la deteccin de diferentes clases de
bacterias a base de cambios visibles en el medio de cultivo o diferencias en la apariencia de
las colonias, este medio tambin utiliza ciertos tipos de tintes que tien ciertos tipos de
bacterias.

DIFERENCIAS ENTRE MEDIO SELECTIVO Y DIFERENCIAL.
La diferencia de este medio con el medio selectivo es que el selectivo solo provoca que
algunas bacterias en especfico se tian mientras que el diferencial tie todas las bacterias
para as poder diferencias una de otras.

Qu es el ANTIBIOGRAMA?
Se entiende por antibiograma el estudio de la sensibilidad "in vitro" de las bacterias a los
antibiticos. Por extensin, se suele incluir el estudio de la sensibilidad a las sulfamidas y
otros quimioterpicos.
Utilidad: La razn por la cual es conveniente el estudio del antibiograma de una bacteria
determinada radica en el hecho de la diferente sensibilidad a los antibiticos de las distintas
especies bacterianas y, ms an, en el hecho de que en numerosas especies existen grandes
diferencias de sensibilidad a un determinado antibitico entre unas y otras cepas.
El antibiograma es un mtodo de diagnstico rpido y preciso
Con ayuda del antibiograma se puede escoger el antibitico ms adecuado para el
tratamiento de una enfermedad.

Mtodo de la difusin en medio slido
Se siembra, con el germen a estudiar, una placa de un medio de cultivo adecuado. Sobre la
superficie del medio se colocan discos de papel impregnados con el antibitico o
quimioterpico a ensayar. Si el germen estudiado es sensible, en torno al disco se observar
un halo, en el cual no hay proliferacin de bacterias. Si el germen es resistente al
antibitico, crecer uniformemente y no habr ningn halo de inhibicin en torno al disco
de papel.


















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Para un determinado antibitico, una cepa bacteriana es, segn la NCCLS:
Sensible, si existe una buena probabilidad de xito teraputico en el caso de un
tratamiento a la dosis habitual.
Resistente, si la probabilidad de xito teraputico es nula o muy reducida. No es de
esperar ningn efecto teraputico sea cual fuere el tipo de tratamiento.
Intermedia, cuando el xito teraputico es imprevisible. Se puede conseguir efecto
teraputico en ciertas condiciones (fuertes concentraciones locales o aumento de la
posologa).
TIPOS DE HEMLISIS
Fundamento
Muchos microorganismos son capaces de crecer en agar sangre y cuando lo hacen
responden de diferente manera segn realicen o no la lisis de los glbulos rojos
(hemlisis) producida por la accin de una enzima llamada hemolisina
Podemos diferenciar tres tipos de hemlisis:

Hemlisis alfa: es una hemlisis parcial y la zona de crecimiento aparece rodeada de un
halo de color verdoso.









Hemlisis beta: en este caso la hemlisis es total y el halo que rodea a las colonias es
totalmente transparente.















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Hemlisis gamma (no hemlisis): el microorganismo en cuestin no es capaz de realizar
la hemlisis y por tanto no existe halo alrededor de la colonia.












EXPLIQUE EL USO DE TINTES EN TINCIN GRAM


Alcohol - acido en la coloracin de Ziehl Neelsen.


El alcohol-acido se usa para decolorar la muestra en una tincin de Ziehl Neelsen, la
cual es una tcnica de tincin diferencial que se basa en que las paredes celulares de
ciertos paracitos y bacterias contienen cidos grasos de cadena larga que les confiere la
propiedad de resistir la decoloracin con alcohol-acido, despus de la tincin con
colorantes bsicos.

Sol uci n de Lugol y alcohol acetona en la coloracin Gram.


Solucin de Lugol: El Lugol se aplica como mordiente, el lugol est formado por
yodo (I
2
) en equilibrio con yoduro de potasio (KI), el cual est presente para
solubilizar el yodo. El yodo entra en las clulas y forma un complejo insoluble en
solucin acuosa con el cristal violeta.

Poe eso se le llama mordiente porque como es estable esta interaccin (con el cristal
violeta) quedan e n a mb o s t i p o s d e bacteria.
De no ponerlo, este complemento no se formara y el cristal violeta saldra del medio
ante el lavado con agua. Tindose todo Gram (-).

Alcohol acetona: Sirve para decolorar, ya que en la misma es soluble el complejo
yodo/cristal violeta. Los organismos GRAM + no se decoloran mientras los GRAM - si
lo hacen.

Entonces permite que el complemento cristal violeta lugol salga de la clula al
debilitar la pared de los GRAM (-).


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Por qu se emple la tincin negativa o de contraste?


Porque tie el fondo de la preparacin y no el microorganismo, aumentando de
este modo su contraste, mostrando la imagen exacta de los microorganismos, nos
permite apreciar el tamao real de estos.
Se usa tambin para la tincin de capsulas, la presencia de estos indica patogenecidad.

EXPLIQUE EL USO DE TINTES EN LA TINCIN DIFERENCIAL

Alcohol-cido en la coloracin de Ziehl-Neelsen.

El uso de este alcohol sirve para intentar decolorar la muestra de bacterias fijadas con
calor en la muestra, si este alcohol q es muy fuerte no llega a decolorar a las bacterias
pero si a los espacios, y seguido a esto la aplicacin del color contraste azul de
metileno, se podra deducir la estructura de l a pared bacteriana compuesta
por cido miclico lo cual le confiere una propiedad hidrofbica y cerosa por eso su
resistencia a este acido alcohol.

Solucin de Lugol y Alcohol-Acetona en la coloracin Gram.

El lugol acta como un fijador entre el primer colorante bsico aplicado y la muestra de
bacterias, mientras que el alcohol acetona funciona como el decolorante, casi similar
al acido alcohol, pero con menor potencia.

RESULTADO ESQUEMATIZADO