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1-. INTRODUCCIN
RADICALES LIBRES
Un radical libre es cualquier especie que contiene uno o ms electrones desapareados y que es capaz de mantener una existencia independiente. El radical libre, en estas condiciones, busca a toda costa otro electrn para poder parearse. Es esta intensa bsqueda la que hace a estos radicales libres extremadamente reactivos.
Hidroxilo, Peroxilo, Superxido, Hidroperxilos
ANTIOXIDANTE
Molculas que a bajas concentraciones, respecto a las de un sustrato oxidable, retardan o previenen su oxidacin. El antioxidante al chocar con el radical libre cede un electrn, se oxida y se transforma en un radical libre dbil no txico.
Los procesos fisiolgicos del organismo generan cierta tasa de estas sustancias oxidantes:
RESPIRACIN MITOCONDRIAL
El la formacin de ATP el oxgeno se reduce normalmente hasta agua. As, el O2 se reduce en cuatro etapas en cada una de las cuales se transfiere un electrn. Sin embargo, el transporte electrnico mitocondrial es imperfecto y la reduccin del oxgeno genera O2-..
Se estima que entre 1-3% del oxgeno consumido por el organismo no llega a formar agua y acaba generando ROS y radicales libres.
Las clulas fagocticas del sistema inmune -neutrfilos, monocitos, macrfagos y eosinfilos- que defienden al organismo contra la agresin de agentes extraos, producen grandes cantidades de radicales libres como parte del mecanismo que les permite destruir dichos agentes.
Radiaciones Contaminantes Actividad Fsica intensa Humo del tabaco Dietas Metabolizacin de frmacos
Ac. Nitroso Catin nitrilo Peroxinitrilo Ac. Peroxinitroso Alquil peroxinitritos Ozono Ac. Hipobromoso
HIDROXILO Una molcula de oxgeno que ha adquirido 3 electrones y un protn adicional. PEROXILO Molcula de oxgeno radical carbono +
LPIDOS
Los lpidos, especialmente los que contienen cidos grasos poli-insaturados, son susceptibles a desarrollar procesos de oxidacin no controlados, inducidos por radicales libres. sto se traslada en daos significativos en las membranas celulares, desestabilizndolas y alterando todos los procesos bioqumicos celulares LIPOPEROXIDACIN
ADN
Radicales libres
Antioxidante
PROTENAS
Los aminocidos que forman protenas pueden verse afectados por los ataques de los radicales, originando modificaciones que alteran su estructura impidiendo su accin biolgica
CARBOHIDRATOS
La proporcin de ataques es inferior, pero azcares como la glucosa pueden reaccionar con radicales hidroxilo y originar sustancias reactivas.
ESTRS OXIDATIVO
Antioxidantes
Radicales libres
CLASIFICACIN DE ANTIOXIDANTES
Podemos clasificar los antioxidantes en 4 grande grupos:
Enzimas antioxidantes (SOD, CAT) Antioxidantes de alto peso molecular (Albmina, Ferritina) Antioxidantes de bajo peso molecular (Carotenoides, Ascrbico) Algunas hormonas (Angiotensina)
Radical superxido
(B) CATALASA (CAT)
Perxido de hidrgeno
Perxido de hidrgeno
Oxgeno + agua
VITAMINA E (-tocoferol) VITAMINA C (ac. ascrbico) -CAROTENO (provitamina-A) OLIGOELEMENTOS FLAVONOIDES LICOPENO
VITAMINA E (alfa-tocoferol)
La vitamina E es un antioxidante natural que reacciona con RL solubles en lpidos de la membrana celular-----------INTEGRIDAD Cada molcula de Vitamina E es capaz de proteger 500 molculas de fosfolpidos. Acta junto con otros sistemas antioxidantes: CAT, SOD Captura radicales hidroxilo y aniones superxido y neutraliza perxido de hidrgeno Fuentes: Hortalizas, verduras, frutos secos, aceites (soja, girasol..), arroz integral, lentejas, mantequilla
BETA-CAROTENO
Es el carotenoide ms abundante de la naturaleza y el ms importante para la dieta humana. Al ser ingerido es transformado en vitamina A. Elimina los radicales libres y protege al ADN de su accin mutagnica. Pigmentos vegetales de coloracin amarilla-naranja.
OLIGOELEMENTOS ( Cu/Zn/Mn/Se/Fe)
Forman parte del ncleo activo de muchos antioxidantes:
SOD
Necesita Zn, Mn y Cu para poder eliminar radicales hidroxilo. El Se forma parte del ncleo activo de esta enzima. El Fe constituye el ncleo activo de la catalasa.
GSH-Px
CAT
FLAVONOIDES
Pigmentos vegetales no nitrogenados. Metabolitos secundarios de las plantas. Se les atribuyen ms de 5000 estructuras. Se emplean como colorantes naturales. Su efecto antioxidante reside tanto en su capacidad para secuestrar radicales como en su capacidad para formar quelatos con metales. La mayora (catequnas) tienen una alta capacidad de neutralizar RL-s. Fuentes: ajo, cebolla, t, manzanas, peras , espinacas, naranjas, limones, pomelos
MECANISMOS DE ACCIN ANTIOXIDANTE 1-. Antioxidantes primarios o preventivos Previenen la formacin de nuevos RL, convirtiendo los RL-s existente en molculas menos perjudiciales antes de que puedan reaccionar y generar as una mayor tasa de RL_s. Este mecanismo de accin es el que emplean los antioxidantes de naturaleza enzimtica (SOD, CAT, GSH-Px) 2-. Antioxidantes secundarios chain breaking Capturan los RL-s evitando as que se produzcan reacciones en cadena. 3-. Antioxidantes terciarios Reparan biomolculas daadas por los ataques mediados por RL-s.
2-. MTODOS
Generador sinttico de radicales + Molcula oxidable que acta como sonda + antioxidante.
ORAC/TRAP/CROCIN/LINOLEICO/CARS
MTODOS
1
ABTS-TEAC DPPH DMPD
ORAC TEST COMPETICIN CINTICA CARS TOSC ENSAYO LINOLICO TRAP B-CAROTENO
2
FRAP VOLTAMETRA CCLICA
4
COBAS FARA
El compuesto cromgeno ABTS presenta color azul/verde con mximo de absorcin a 342nm, es soluble en agua y disolventes orgnicos y qumicamente estable. El radical ABTS+ una vez generado por medio de enzimas o qumicamente pasa a presentar nuevas caractersticas con mximos de absorcin a 414, 645, 734 y 815nm.
Generacin del radical catin ABTS 1-. En la generacin por reacciones enzimticas, el ABTS se incuba con perxido de hidrgeno y con metamioglobina, hemoglobina o peroxidasa de rbano. 2-. En la generacin por reacciones qumicas, el ABTS se hace reaccionar con dixido de manganeso, persulfato potsico, ABAP. Estas reacciones por lo general requieren tiempos largos de incubacin o altas temperaturas.
INHIBICIN
Los antioxidantes se aaden previamente a la generacin del radical ABTS, y se determina la inhibicin en la formacin del radical, que se traduce en un retraso en la aparicin de la coloracin verdeazulada.
PEGA: el radical ABTS no se encuentra en nuestro organismo, por lo que representa una fuente no-
fisiolgica.
Algunas reacciones requieren de un mayor tiempo para alcanzar el estado final. El radical
generado
qumicamente
(persulfato
fue validado por su estabilidad, reproducibilidad y por ser una alternativa mucho ms viable econmicamente al mtodo anteriormente descrito.
potsico),
: 734 nm
TEAC %AA
16h
Oscuridad
Este mtodo se basa en la reduccin del radical DPPH por los antioxidantes de la muestra El radical es estable y tiene una coloracin prpura que se pierde progresivamente cuando se aade la muestra conteniendo sustancias antioxidantes. La decoloracin del radical se determina a 515 nm y la cuantificacin se realiza empleando soluciones patrn de ac. ascrbico o trolox.
En general la reaccin se puede medir a los 2, 3, 4, 5 y 10 minutos del inicio, ya que en este intervalo, la mayora de sustancias completan la reaccin con el DPPH,.
VENTAJAS: El ensayo DPPH es un mtodo rpido y sencillo, que no requiere de un equipamiento sofisticado. A diferencia del ensayo ABTS (TEAC), no es necesario generar el radical puesto que el DPPH se comercializa
2,2-Difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH)
Metanol
AEAC %AA
: 515 nm
Este mtodo se basa en la reduccin del radical catin DMPD por los antioxidantes de la muestra. La generacin de este radical requiere un pH adecuado (5.25) y la adicin de una solucin de cloruro frrico. La absorbancia del radical se determina a 505 nm y los compuestos antioxidantes, una vez adicionados, son capaces de transferir un tomo de H+, provocando su decoloracin (proporcional a su concentracin). Slo puede disolverse en medio acuoso.
: 505 nm
TEAC %AA
pH 5.25
Determina la capacidad de la muestra para reducir un complejo de frrico con la molcula tripiridil s-triazina (TPTZ) a su forma ferrosa (pH bajo).
Fe 3+
Fe 2+
De este modo se genera una coloracin azul, de intensa proporcionalidad a la capacidad reductora de la muestra (se genera un complejo ferroso-TPTZ) que puede cuantificarse por colorimetra (593nm) en base a un patrn de sulfato ferroso. La capacidad de reducir el hierro se considera un ndice del poder antioxidante de la muestra.
El ensayo FRAP es sencillo y fcilmente automatizable. Es rpido, generalmente la reaccin se completa entre 4 y 8 minutos. Sin embargo, en el caso de algunos polifenoles se han descrito reacciones ms lentas, llegando incluso a requerir 30 minutos hasta completar la reduccin del complejo. La reaccin no es especfica, y por tanto, cualquier reaccin con un potencial redox menos positivo originar la reduccin del complejo Fe 3+-TPTZ.
Medir la capacidad reductora no significa medir la capacidad antioxidante
Reduccin
TPTZ-Fe 2+
Sulfato Ferroso/g
593 nm
Coloracin azulada
Este ensayo evala el poder reductor total de molculas de bajo peso molecular. Una vez procesada la muestra se introduce en una celda donde se sitan 3 electrodos: electrodo de trabajo, electrodo de referencia, y un electrodo auxiliar. Se aplica un potencial constante (100 mV/seg) al electrodo de trabajo, bien hacia el potencial positivo (con lo que evaluaremos agentes reductores) o hacia el potencial negativo (con lo que evaluaremos agentes oxidantes). Durante este proceso se monitoriza una curva de corriente (voltamograma cclico).
Desventaja: no todos los antioxidantes donan sus electrones a cualquier electrodo de trabajo seleccionado. Se necesitan varios electrodos para determinar antioxidantes concretos: glutatin no se detectara con este electrodo Au/Hg. La compuesto de referencia empleado en este ensayo suele ser el cido ascrbico.
La hidroetidina (HE) se oxida dando lugar al compuesto fluorescente Etidio (E+) en presencia del radical anin superxido (que puede ser aadido como KO2 o producido por activacin de leucocitos).
exc:465nm oxidacin
em: 585 nm
HE
E+
Adems la oxidacin de HE es rpida cuando el oxidante el O2- y no cuando intervienen O2, H2O2, HOCl, ONOO-. Por eso, este mtodo se aplica como detector de O2- intracelular).
La deteccin lminognica y cromognica es propensa a generar radicales O2-, dando lugar a falsos resultados. La tasa de radical producido no es proporcional a la tasa de producto fluorescente determinado, lo cual indica que no todo el radical generado est oxidando el HE.
HIDROETIDINA (EH)
O2KO2 Activ. Leucocitos O2O2O2O2AO-s
Oxidacin
TEAC
O2-
TROLOX
O2O2O2-
O2O2-
ETIDIO (E+)
(Dismutacin)
Oxidacin del KMBA a etileno mediante la accin de radicales peroxilo generados a partir del AAPH. La formacin de etileno (parcialmente inhibida por la presencia de antioxidantes) se monitoriza por GC.
KMBA AAPH
oxidacin
ETILENO
ROO.
Se cuantifica la inhibicin que ejerce un antioxidante sobre la produccin de etileno respecto a una reaccin control.
Ventajas
VERSATILIDAD ----- El KMBA presenta la propiedad
de reaccionar con numerosos oxidantes que son capaces de transformarlo en etileno. Radicales hidroxilo, peroxilo y peroxinitrito. Sistema de cuantificacin.
Desventajas
Reacciones Fenton
OH. OH. OH. OH.
AAPH
ROO.
Descomposicin
ONOO. ONOO. ONOO. ONOO. ONOO.
ROO. OH.OH.
ROO. ROO.ROO.
AO
TEAC KMBA
trolox
Este ensayo se basa en la oxidacin del carotenoide crocin por radicales peroxilos generados a partir del AAPH. La decoloracin del crocin en ausencia (Vo) y en presencia (V) de antioxidantes se monitoriza durante 10 minutos a 443nm. La decoloracin del carotenoide crocin debida a la interaccin con radicales peroxilo, disminuye cuando se introduce otro antioxidante en el sistema.
En algunos casos no queda claro si estamos ante una fase de retardo o un periodo de mxima proteccin del carotenoide crocin. Crocin es una mezcla de pigmentos vegetales extrados a partir del azafrn, cuya composicin esta sujeta a una variabilidad dependiente del lote de produccin .
CAROTENOIDE CROCIN
ROO. ROO. ROO. ROO. ROO.
443 nm
AO-s TROLOX
AAPH
TEAC
LINLICO
LINLICO
VENTAJAS
El uso de cido linoleco como sustrato acerca el ensayo a condiciones biolgicas reales.
DESVENTAJAS
Existen numerosos compuestos orgnicos que absorben a 234nm (catecol y la hidroquinona reaccionan con radicales peroxilo para dar compuestos (0-quinona y p-quinona) con absorbancia a esa longitud de onda. En presencia de agua el ac. Linoleico forma micelas, que complican el ensayo ya que la distribucin de los compuestos se repartir en dos fases.
Se basa en la capacidad de diversos extractos de disminuir la decoloracin oxidativa del betacaroteno en una emulsin cida de betacaroteno/linoleico. El cido linolico se oxida fcilmente en presencia de agua oxigenada y los radicales generados atacan el betacaroteno provocando su oxidacin con la correspondiente perdida de absorbancia a 470 nm. Este ensayo esta indicado para compuestos liposolubles. El patrn utilizado suele ser Trolox o c. Glico.
470nm
TEAC
GAE
eq AC. GLICO/g
AO-s
TROLOX
Oxidacin betacaroteno
Este ensayo emplea radicales peroxilo que se generan mediante la descomposicin trmica de un compuesto hidrosoluble: ABAP Una vez adicionado a la muestra a estudio (plasma originariamente), la oxidacin de las molculas es monitorizada, mediante la determinacin de oxgeno consumido. El periodo de induccin, en el que la oxidacin se inhibe mediante la accin de los compuestos antioxidantes en la muestra, se compara con el generado por el Trolox en iguales condiciones.
MODIFICACIONES (a) introducir en el ensayo un lpido que reaccionaba con los radicales peroxilo producindose una peroxidacin.. (b) otra modificacin introdujo una protena (PE) en lugar del lpido como sustrato, que al mostrar seal fluorescente facilitaba la monitorizacin.
37C
ROO. ROO. ROO.
Electrodo de oxgeno
AO-s
TROLOX
S e a l
A muestra- A blanco
Muestra
Blanco
VENTAJAS: (a) El uso de una protena como sustrato impide que el propio sustrato genere radicales libres debido a su oxidacin. (b) Sirve para determinar la capacidad de muestras acuosas y hidrofbicas (simplemente cambiando la fuente generadora de radicales y el disolvente)
(c) El tiempo tambin es un factor limitante (1h: aunque esta pega ya ha sido solucionada a travs de ensayos de alto rendimiento) (d) El empleo de marcadores fluorescentes aumenta la sensibilidad del mtodo pero implica disponibilidad de un fluormetro.
Fluoresceina
ROO. ROO. ROO. ROO. ROO. AO-s
AAPH
ORAC
TROLOX
H2O2/Cu 2+
OH..
Disminucin en la fluorescencia
COBAS FARA
Ensayo ORAC automatizado mediante espectrofluormetro denominado COBAS FARA II (La Roche), que emplea diferentes filtros fluorescentes.
Mediante una pipeta robotizada dispensa la muestra en diferentes pocillos, centrifuga mezcla e incuba. Determina la capacidad de la muestra para protegerse frente al ataque de los radicales.
Este aparato emplea una fuente que genera radicales peroxilo, uno de los radicales ms comunes. Utiliza el trolox a modo de control. Recoge medidas cada 2 minutos una vez aadida la muestra. Se mide la capacidad antioxidante total de la muestra (antioxidantes de rpida, media y larga actuacin).
Mtodo
Unidades TEAC umol trolox/g AA% AE mg (ueq) ac. Ascrbico/g TEAC mg (ueq) trolox/g. AA% TEAC umol trolox/g. AA% ORAC Umol peroxil radical trapped/L TEAC, GAE, AA% TEAC, AA% TEAC, AA% TEAC, AA%
ABTS-TEAC DPPH
Hidrosoluble Liposolublehidrosoluble Hidrosoluble Liposoluble Hidrosoluble Hidrosoluble Hidrosoluble Liposoluble Liposoluble Hidrosoluble Hidrosoluble
Mtodo
ABTS-TEAC DPPH DMPD ORAC TRAP TOSC CARS TEST. COMP. CINTICA LINOLEICO B-CAROTENO VOLTAMETRA CCLICA FRAP
Alimentos
Aceite, vegetales, vino, zumos, frutas, bebidas alcohlicas Fruta, vegetales, aceites, bebidas alcohlicas, polifenoles Vino, vegetales, t, frutas Frutas, vegetales, frutos secos, cereales, chocolate, bebidas alcohlicas, zumos Vino, t, fruta, bebidas alcohlicas Frutas, zumos Ajo, plantas Vino Aceites, Aceite oliva, frutas, vegetales, alimentos integrales Vino Vegetales, zumos, bebidas alcohlicas
ORAC
1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 0 Ciruela pasa Pasas Zarzamora Fresa Frambuesa Naranjas
ORAC
10000
15000
20000
25000
30000
5000 0
Uvas Cereza Kiwi Pomelo Espinacas Coles Brcoli Remolacha Pimientos rojos Cebolla Maiz Berenjena Tomate Zanahoria Patatas Vino tinto T verde Manzana Banana Melocotn
Moltes grcies