Espectrometra de Masas

4.5 Aplicaciones de la espectrometra de masas Las aplicaciones de la espectrometra de masas son mltiples. Una de las caractersticas ms apreciadas de la espectrometra de masas es su altsima sensibilidad, que permite su aplicacin en la deteccin y cuantificacin de especies presentes en microcantidades en diferentes matrices. As los controles antidopaje, la deteccin de metabolitos en diferentes fluidos biolgicos y la contaminacin ambiental son campos donde la EM juega un papel principal. A continuacin se ilustran algunas aplicaciones de la EM. 4.5.1 Razones isotpicas La espectrometra de masas permite determinar la composicin isotpica de los elementos en una muestra, la que tiene numerosas aplicaciones prcticas. Las diferencias en masa entre los istopos de un elemento son muy pequeas y los istopos menos abundantes son comnmente muy raros por lo que se requieren instrumentos especialmente sensibles. Estos instrumentos son denominados espectrmetros de masas para la composicin isotpica (isotope ratio mass spectrometer IR-MS por sus siglas en ingls). Para especies con masas pequeas se manifiestan diferencias en las propiedades fsicas, qumicas y biolgicas entre las diferentes composiciones isotpicas como la velocidad de vaporizacin entre H 2 O y HOD, fijacin de
B B

C 16 O 2 y C 16 O 18 O como carbonato de calcio en un foraminfero, etc. La fijacin selectiva de CO 2 con

P P B B P P P P B B

diferente composicin isotpica por parte de organismos vivos depende de la temperatura ambiente. El estudio por EM de materiales fsiles permite el estudio de las condiciones climticas en tiempos remotos (Paleoclimatologa). Un equipo muy especializado se dedica a la determinacin del contenido de deuterio en muestras de agua y otros compuestos. La razn isotpica D/H promedio en el agua de los ocanos es de 156 ppm pero oscila varias decenas de ppm en las aguas fluviales de acuerdo a su procedencia. Las razones isotpicas en una muestra son una fuente de informacin valiosa para determinar adulteracin o falsificacin de vinos u otros productos de alta calidad, establecer la procedencia geogrfica de una droga (cocana, marihuana) y en la deteccin de alteraciones metablicas. La tcnica IR-MS se aplica tambin a la determinacin de la edad de materiales mediante el llamado fechaje del carbono. La determinacin de los tiempos de permanencia a la intemperie o de tiempo de enterramiento de diferentes materiales se basa sobre el hecho de que un objeto enterrado unos pocos metros bajo el suelo, sedimentos, rocas o hielo est protegido de los rayos csmicos y al ser desplazado a la superficie se expone a dicha radiacin. Al ser expuesto se generan los llamados ncleos cosmognicos como
10
P P

Be,

14
P P

C,

26
P P

Al y

36
P P

Cl.

Estos nclidos son radiactivos con tiempos de vida medios desde miles hasta millones de aos. Las mediciones en espectrmetros de masa especializados, con elevada exactitud, permite encontrar las razones entre los istopos estables y los radiactivos. La determinacin del tiempo de exposicin de un material se
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realiza partiendo de las razones entre los istopos estables y los radioistopos. De aqu se deduce la cantidad absoluta de radio-istopos presentes, la que es proporcional al tiempo de permanencia en la superficie. Si la velocidad de produccin de un radio-istopo es conocida puede determinase entonces el tiempo de exposicin del material. La determinacin de los tiempos de enterramiento utiliza tambin a los nclidos cosmognicos. Si el objeto permaneci un tiempo determinado en la superficie puede estimarse la cantidad inicial de radioistopos presentes en el material al momento del enterramiento. Posteriormente se produce una disminucin de la concentracin de los radioistopos, que slo depende de los tiempos de vida medios conocidos. Si se dispone de dos concentraciones en tiempos diferentes puede entonces estimarse el tiempo de enterramiento. 4.5.2 Farmacocintica Muchos estudios de farmacocintica se realizan haciendo uso de la espectrometra de masas dada la naturaleza compleja de las matrices (con frecuencia sangre u orina) y la alta sensibilidad requerida para determinar concentraciones extremadamente bajas de analitos. Se utiliza comnmente un sistema de cromatografa lquida- espectrometra de masas (LC-MS) con sistema de cuadrupolos triple. Un tndem de masas se pude adicionarse para elevar la especificidad. El uso de patrones y estndares internos permite determinar cuantitativamente el frmaco deseado. Puede seguirse entonces la metabolizacin del frmaco a partir de su suministro al paciente. 4.5.3 Protemica 4.5.3.1 Secuenciacin Con el desarrollo de las tcnicas de ionizacin ESI y MALDI, la espectrometra de masas se ha impuesto desde los aos noventa como un mtodo esencial en la caracterizacin de protenas, especialmente en la secuenciacin o determinacin de estructuras primarias. Esta tcnica ha sustituido en buena medida a las tcnicas de secuenciacin de protenas por va qumica. Las tcnicas tradicionales tienen una baja eficiencia y no son adecuadas para la secuenciacin rpida del creciente nmero de protenas obtenidas en los diferentes proyectos de genmica. El procedimiento estndar parte de la hidrlisis enzimtica (tripsina, pepsina) de la protena a secuenciar y una separacin cromatogrfica inicial para llegar a mezcla de un pequeo nmero de pptidos. Los espectrmetros de masa en tndem permiten la separacin final y la caracterizacin de los pptidos, en ellos la mezcla inicial de pptidos puede ionizarse con la tcnica ESI. El primer EM separa los iones moleculares de los diferentes pptidos, estos iones se activan vibracionalmente por colisiones y fragmentan. El espectro de masas que se obtiene de cada pptido en el segundo EM permite su identificacin. Debido a la simplicidad de la fragmentacin es posible utilizar las masas de los fragmentos para la bsqueda en una base de datos de masas para secuencias peptdicas. Finalmente la superposicin de
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los diferentes pptidos, con su abundante informacin redundante que resulta de los diferentes caminos de la protelisis, permite obtener la secuencia de aminocidos o estructura primaria de la protena. En la Figura X4.75 se muestra la nomenclatura para las fragmentaciones principales de una cadena peptdica. Estas rupturas se asocian principalmente con los enlaces peptdicos del esqueleto (fragmentos principales b y y ).
U U U U

Las fragmentaciones de las cadenas laterales, en las condiciones de la tcnica ESI con iones poco activados, resultan poco abundantes.

Figura 4.75 Nomenclatura para la fragmentacin de pptidos. Se ilustran los fragmentos para la ruptura del enlace pepttico entre los residuos 2 y 3, asi como la estructura del in imonio para la treonina. a, b, c retencin de carga en el extremo N-terminal x, y, z retencin de carga en el extremo C-terminal Subindice nmero de residuos en el fragmento

4.5.3.2 Caracterizacin El anlisis de mezclas de protenas complejas directamente en EM presenta dos problemas importantes: 1.- las tcnicas de ionizacin utilizadas para macromolculas (MALDI, ESI) slo funcionan eficientemente si la mezcla contiene cantidades anlogas de las protenas presentes. Si, como es comn en las muestras biolgicas, las concentraciones de las protenas difieren ampliamente; la ionizacin tiende a eliminar las seales de los componentes minoritarios. 2.- el espectro de masas de una mezcla compleja es muy difcil de interpretar por la gran cantidad de seales, que aumenta si cada protena peptdicos. es sometida a digestin enzimtica lo que genera muchos fragmentos

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Para enfrentar estos problemas se aplican mtodos de fraccionamiento de protenas previos al anlisis por espectrometra de masas. La electroforsis bidimensional de gel (2DE) combinada con la EM representa una tecnologa integrada mediante la cual una mezcla de varios miles de protenas pueden ser separadas, detectadas y cuantificadas y varios cientos de ellas identificadas. Las manchas en un gel sobre el que se realiza la electroforsis bidimensional pueden atribuirse a protenas individuales. Si se desea su identificacin, puede extraerse la protena del gel y someterse a proteolsis, como se discuti anteriormente. Las masas de los pptidos resultantes pueden determinarse por EM (ver Figura 4.76) con vistas a la identificacin de la protena mediante el peptide mass fingerprint con bsqueda en una base de datos de las masas resultantes de la digestin de protenas conocidas. Si una secuencia proteica en la base de datos predice un nmero significativo de las masas encontradas experimentalmente se puede asumir que dicha protena est presente en la muestra original. Si la informacin no es suficiente para la caracterizacin inequvoca de la protena, sus pptidos pueden ser sometidos a un tndem de masas.

Figura 4.76 Cromatograma HPLC de una mezcla de pptidos (izquierda). El EM-ESI del pptido que eluye a 30.34 min (derecha) permite su identificacn. El resto de los pptidos puede identificarse anlogamente.

La espectrometra de masas se emplea tambin en la determinacin cuantitativa de protenas. A tales efectos se incorporan ncleos pesados no-radiactivos del carbono o el nitrgeno ( 13 C o
P P

15
P P

N) en una muestra

mientras que otra queda marcada con los istopos ligeros. La mezcla de las dos muestras es analizada y la intensidad relativa de los picos permite determinar las cantidades relativas de los pptidos (y las correspondientes protenas) marcados. 4.5.4 Exploracin espacial Desde el comienzo del envo de naves espaciales a la luna, la espectrometra de masas se ha utilizado en el anlisis de materiales extraterrestres. Dos espectrmetros de masas formaron parte del programa Viking a Marte. En 2005 la misin Cassini-Huygens incluy un sistema CG-EM para estudiar la atmsfera de Titn, la

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mayor luna de Saturno. Este instrumento tom muestras a diferentes alturas y fue capaz al aterrizar de vaporizar y analizar muestras de la superficie congelada del satlite rica en hidrocarburos.

4.6 Ejercicios y problemas 1.- Construya un diagrama de bloques de un espectrmetro de masas. Explique que papel juegan cada uno de los componentes. 2.-Discuta las caractersticas de las principales fuentes de ionizacin en EM. 3.-Indique si los iones cuasimoleculares son iones con nmero par o impar de electrones. 4.-Indique las ventajas y desventajas de la tcnica CI y su complementaridad con la ionizacin electrnica. 5.-Indique las caractersticas de la tcnicas ESI y MALDI. 6.-Indique ventajas y desventajas de la tcnica FAB. 7.- En la tcnica EI se producen tanto iones positivos como negativos. Seale por que es ms difcil producir iones negativos. Explique por que se prefiere utilizar electrones con energa de 70 eV. Indique las ventajas que puede reportar el registro de un EM obtenido con baja energa de los electrones ionizantes. Enumere las limitaciones principales del mtodo EI. 8.-Indique como funciona un analizador magntico. Escriba la ecuacin fundamental de un analizador magntico, indicando el significado de cada trmino. Indique cual es el factor principal que limita el poder de resolucin en un EM con analizador magntico 9.-Describa los fundamentos del analizador de tiempo de vuelo y como puede elevarse el poder de resolucin en el mismo. 10.- Indique los componentes principales y principios de funcionamiento del analizador cuadrupolar. 11.-.-Asuma que est trabajando con un EM de poder de resolucin 5000. Calcule con cuanta precisin puede determinar las masas en la regin de 500. 12.-Asuma que usted tiene que seleccionar un EM para una misin no tripulada a Marte. El instrumento debe ser confiable, pequeo, ligero y resistente y se dedicar a analizar muestras de compuestos orgnicos simples (m/z hasta 150), requirindose su identificacin. Decida el tipo de fuente de ionizacin y analizador a utilizar. 13.-Indique la relacin entre el potencial de aceleracin V y la energa cintica de los iones. 14.- Calcule la intensidad relativa de los picos isotpicos en (M+1) y (M+2) respecto al pico molecular para los compuestos de frmula global C 8 H 18 O, C 4 H 8 O 2 , C 7 H 8 NO 2 y C 9 H 20 .
B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B

15.- Halle la frmula global ms probable de los compuestos A, B y C sobre la base de las intensidades relativas de los iones isotpicos

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Compuesto A B C

M 150 102 128

(M+1) + /M + % 9.9 7.8 7.02

P P P P

(M+2) + /M + % 0.9 0.5 0.81

P P P P

16.-En el EM de la anilina se observan iones metaestables a m/z = 46.8 y 45.9 que corresponden a fragmentaciones del in molecular y del in [M-1]+ respectivamente. Indique que iones son formados. 17.- Describa las fragmentaciones principales del 1-bromo-1-feniletano y el alcohol isoproplico en EM
Br CH CH3

H3C CH H3C OH

18.- Cmo se identifica la presencia de azufre, cloro, bromo, yodo y nitrgeno mediante EM? 19.- Qu utilidad tienen los picos metaestables? Que tecnologa ms moderna permite obtener la misma informacin? 20.-El espectro de masas de un compuesto se muestra en la Figura 4.77. Sugiera una estructura posible para dicho compuesto e interprete las fragmentaciones principales.

Figura 4.77 EM-EI del compuesto del problema 20

21.- Plantee las posibles estructuras para el compuesto cuyo espectro de masas se muestra en la Figura 4.78.

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Figura 4.78 EM-EI del compuesto del problema 21

22.-El EM mostrado en la Figura 4.79 corresponde a un alcohol. Interprete el espectro e identifique al compuesto.

Figura 4.79 EM-EI del compuesto del problema 22

23.-El EM mostrado en la Figura 4.80 corresponde a un ter. Interprete el espectro y sugiera una estructura para dicho ter.

361

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Figura 4.80 EM-EI del compuesto del problema 23

24.- Cules

de los siguientes compuestos presentan reordenamiento de Mc Lafferty?. Formule los

mecanismos y las estructuras de los productos de dicho reordenamiento. a.- CH 3 COCH 2 CH 3

B B B B B B B B B B B

b.- CH 3 COCH 2 CH 2 CH 3
B B

c.- CH 3 COCH(CH 3 ) 2
B B B B B B B B B B B

d.- (CH 3 ) 2 CHCH 2 CHO e.- CH 3 CH 2 COOCH 2 CH 3

B B B B B B B B B B B B B B

f.- CH 3 CH 2 CH 2 CONHCH 3
B B B B B B B

g.- CH 3 CH(CH 3 )CH 2 CH(CH 3 )COOH

B B

h.- CH 3 CH 2 CH(CH 3 )COC 6 H 5

B B B B B B B B B B B B B B B

i.- CH 3 CH=CHCH 2 COCH 2 CH 3

B

j.- (C 6 H 5 ) 2 PO-SCH 2 H 3
B B B B B B B B B

25.-Justifique la formacin de iones a m/z = 88 y 60 en el EM del butanoato de etilo. 26.-El EM mostrado en la Figura 4.81 corresponde a un aldehdo. Interprete el espectro e identifique al compuesto.

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Figura 4.81 EM-EI del compuesto del problema 26

27.-El EM mostrado en la Figura 4.82 corresponde a un aldehdo. Interprete el espectro e identifique al compuesto.

Figura 4.82 EM-EI del compuesto del problema 27

28.-Evale los posibles iones fragmento en el EM de la 4-metil 3-pentanona: (CH 3 ) 2 CHCOCH 2 CH 3

B B B B B B B

29.-El EM mostrado en la Figura 4.83 corresponde a una cetona. Interprete el espectro e identifique a la cetona.

363

Espectrometra de Masas

Figura 4.83 EM-EI del compuesto del problema 29

30.-Indique que iones tipo Mc Lafferty y de doble transferencia de hidrgeno pueden esperarse para los siguientes compuestos: a.- CH 3 CH 2 COOCH 2 CH 2 CH 3
B B B B B B B B B B

b.- C 6 H 5 COOCH 2 CH 2 CH 3
B B B B B B B B B B B B B

c.- CH 3 CH 2 COOCH=CHCH 3
B B B B B B B

d.- CH 3 COOCH 2 CH 2 CH=CH 2

B B B B B B B B B B B

e.- CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 COOCH 2 CH 3
B

31.-El EM mostrado en la Figura 4.84 corresponde a un ster. Interprete el espectro y sugiera estructuras compatibles con el mismo.

Figura 4.84 EM-EI del compuesto del problema 31

32.-Indique que iones deben ser prominentes en el EM de:

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Espectrometra de Masas

a.- (CH 3 ) 2 CHCOOH

B B B B

b.- Acido 2-metil benzoico c.- Acido 3-metoxi benzoico d.- CH 3 (CH 2 ) 4 COOH
B B B B B B

33.-Indique los iones tpicos a esperar en el EM de: a.- CH 3 (CH 2 ) 4 CONHCH 3

B B B B B B B B B B B B B B B

b.- CH 3 CONH(CH 2 ) 4 CH 3 c.- pCl-C 6 H 4 -CONH 2

B B B B B B B B B B B B

d.- mCH 3 -C 6 H 4 -NHCOCH 3

B

e.- pNO 2 -C 6 H 4 -OH

B B B B B B

f.- C 6 H 5 OCH 2 CH 2 CH 3
B B B B B B B B B B B B B B B B B B

g.- C 6 H 5 CH 2 CH 2 OCH 3 34.-Los EM mostrados en la Figura 4.85 corresponden a dos amidas ismeras. Identifique las mismas e interprete las principales fragmentaciones.

Figura 4.85 EM-EI de los compuestos del problema 34

35.-Prediga los iones prominentes en el EM de las siguientes aminas: a.- CH 3 (CH 2 ) 5 NH 2

B B B B B B B B B B B B B B

b.- CH 3 NH(CH 2 ) 4 CH 3
B B B B B

c.- CH 3 CH 2 NHCH(CH 3 )CH 2 CH 3

B B B B B

d.- (CH 3 ) 2 CHN(CH 3 )CH 2 CH 3

B B B B B B B B B

e.- (CH 3 CH 2 ) 3 N
B B B B B B

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Espectrometra de Masas

Pudieran distinguirse slo por su espectros de masas? 36.-Los EM que se muestran en la Figura 4.86 pertenecen a dos aminas terciarias. Identifique las mismas e interprete los principales picos.

Figura 4.86 EM-EI de los compuestos del problema 36

37.- El EM que se muestra en la Figura 4.87 corresponde a una amina. Sugiera una estructura para esta amina.

Figura 4.87 EM-EI del compuesto del problema 37

38.-Indique los iones prominentes en los EM de los siguientes compuestos: a.- 4-F-C 6 H 4 CHO
B B B B

b.- 4-F-C 6 H 4 CH 3
B B B B B

c.- 4-I-C 6 H 4 -Br

B B B B

d.- 3,4-dibromo-clorobenceno e.- 4CH 3 -C 6 H 4 CH 2 Br

B B B B B B B B

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Espectrometra de Masas

39.-El EM mostrado en la Figura 4.88 corresponde a un hidrocarburo. Sugiera una estructura para el mismo.

Figura 4.88 EM-EI del compuesto del problema 38

40.-Plantee los principales mecanismos de fragmentacin en EM de los siguientes pares de compuestos y diga si pueden ser diferenciados mediante sus espectros de forma sencilla:
CH3 CH2CH2CH3 CH CH3

CH 3 COOCH 2 CH 3
B B B B B

CH 3 CH 2 COOCH 3
B B B B B

O Cl C CH3 Cl C

O CH3

CH 3 CH 2 CH 2 NHCH 2 CH 3 CH 3 (CH 2 ) 4 CH 3
B B B B B B B B B B B B B B B B B

CH 3 (CH 2 ) 4 NH 2 CH 3 CH 2 CH 2 CH(CH 3 ) 2
B B B B B B B B B B B B B B B B B

CH3CHCH2CHCH3
OH NH2

CH3CHCH2CH2CH2NH2
OH

OCH2CH3

CH2CH2OH

COOCH2CH2CH3

CH2COOCH2CH3

H3C

NO2

NO2

H3C

41.-EL EM de la Figura 4.89 corresponde a un bromoalcano. Sugiera una estructura para el compuesto e interprete la formacin de los iones ms intensos.

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Figura 4.89 EM-EI del compuesto del problema 41

42.- Interprete las principales fragmentaciones del cloruro de meta-nitro benzolo, cuyo EM se muestra en la Figura 4.90

Figura 4.90 EM del cloruro de m-nitro benzoilo

4.7 Bibliografa
1.- E.de Hoffmann, V.Stroobant, Mass Spectrometry. Principles and Applications, 2nd Edition, Wiley, Chichester, 2002 2.- H.Budzikiewicz, C.Djerassi, DH Williams, Mass Spectrometry of Organic Compounds, Holden-Day, San Francisco, 1967 3.- F.W.McLafferty, F.Tureek, Interpretation of Mass Spectra, 4 th Edition , University Science Books, Sansalito, 1993
P P

4.- F.G.Kitson, B.S.Larsen, C.N.McEwen, Gas Chromatography and Mass Spectrometry. A Practical Guide, Academic Press, London, 1996 5.- R.E.Ardrey, Liquid Chromatography-Mass Spectrometry: An Introduction, Wiley, New York, 2003 6.- Base de datos espectroscpicos de compuestos orgnicos del National Institute of Advanced Science and Technology (AIST), Japn. Direccin de Internet (acceso libre): www.aist.go.jp/RIODB/SDBS/cgi-bin/cre-index.cgi

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