Contenido 1. Introducción Al Laboratorio de Bioquímica Parte I: Reporte Científico

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL
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CONTENIDO
Seccin 1 Introduccin al laboratorio de Bioqumica Parte I: Reporte cientfico Parte II: Revisin de mtodos espectroscpicos y elaboracin de curva estndar de protenas Estructura y propiedades de protenas: Purificacin de la enzima lactato deshidrogenasa de msculo esqueltico de bovino Parte I. Extraccin y precipitacin por salado. Parte II. Purificacin por cromatografa de intercambio inico y de afinidad Parte III. Monitoreo del proceso de purificacin. A. Determinacin de concentracin de protenas. Monitoreo del proceso de purificacin. B. Separacin por electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS Actividad enzimtica Parte I. Curvas temporales de actividad enzimtica de la lactado deshidrogenasa de msculo esqueltico de bovino. Parte II. Factores que modifican la actividad de las enzimas: Efecto de la concentracin de sustrato y de un inhibidor. Gentica Determinacin del tipo de herencia en base a frecuencias fenotpicas y genotpicas Estructura, propiedades y funcin de cidos nucleicos Transferencia de material gentico I. Conjugacin Transferencia de material gentico II: Transformacin Aislamiento de plsmidos Ensayos de restriccin de plsmido Induccin de protena recombinante Regulacin del metabolismo Parte I: Regulacin gentica en el opern lac Parte II. Regulacin hormonal del metabolismo de la glucosa Preparacin de soluciones
1. INTRODUCCIN AL LABORATORIO DE BIOQUMICA PARTE I: REPORTE CIENTFICO

Objetivos Conocer la importancia de realizar un reporte cientfico. Conocer las caractersticas o partes de un reporte cientfico: Introduccin, hiptesis, objetivo, mtodos, resultados, discusin y conclusiones, y referencias. Conocer cmo se formulan las hiptesis. Plantear hiptesis. Aprender a realizar un reporte cientfico. Introduccin Tanto en la Universidad como fuera de ella, sin importar el tema, tus ideas o argumentos, si no son expresados de manera clara y fcil de seguir, difcilmente sern tomados en cuenta. Es de gran valor, tanto para empresas como pare instituciones educativas y de investigacin, contar con personal que pueda expresar claramente sus ideas de manera escrita y oral. En el desarrollo de las ciencias, la comunicacin de las observaciones, resultados y propuestas, es fundamental para continuar avanzando en el conocimiento, y el instrumento principal es el reporte cientfico. En el reporte cientfico, no slo se informa sobre los resultados de una investigacin, sino tambin recopila una serie de ideas y propuestas, da cuenta de los errores y avances tecnolgicos que pueden ayudar a replantear la direccin de una investigacin o llevar a la resolucin de un problema en particular. De hecho, uno de los pasos comunes dentro del llamado mtodo cientfico es la de dar respuesta a las preguntas surgidas de la observacin, a travs de primero investigar la literatura cercana al tema de estudio (Figura 1.1.). As como en el reporte, en todos los pasos que conforman al mtodo cientfico debemos esforzarnos en expresar las ideas de manera clara y lgica. Por ejemplo, en el planteamiento de la hiptesis, tenemos que predecir lo que se espera del experimento propuesto, estableciendo en una frase corta las variables que se estn manipulando o las mediciones que se harn, siempre en trminos mensurables. Adicionalmente, la hiptesis incluye aquella informacin que previamente obtuvimos o conocemos respecto a la investigacin. Para ayudarnos a construir la hiptesis generalmente se utilizan las preposiciones si y entonces. Examinemos el siguiente ejemplo: Si observamos que nuestra garganta nos duele, nos planteamos: Si tengo dolor de garganta entonces podra deberse a que tengo una infeccin en la garganta debida a bacterias o virus, o bien porque gritamos mucho el da anterior. Sin embargo, la anterior hiptesis no toma en cuenta lo que tenemos como conocimiento previo. Al replantearla podemos decir: Si s que el resfriado es contagioso y no estuve en contacto con alguien que estuviera contagiado, y adems fui a un juego de ftbol en donde grite mucho, entonces es probable que esto ltimo me causar el dolor de garganta. A pesar de que mejor, la hiptesis no establece como se validar o no la prediccin. Se podra plantear otra diciendo: Si no tengo fiebre o sntomas de una infeccin en la garganta, pero s una inflamacin en la garganta, entonces el cultivo de exudado farngeo y otros estudios clnicos darn negativo para una infeccin bacteriana o viral, por lo que la inflamacin se deber a un uso excesivo de las cuerdas vocales.
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Apndice
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La hiptesis es una parte importante en una investigacin y como se mostr, debe ser cuidadosamente planteada ya que considera el problema que se est investigando, el conocimiento previo y el diseo del experimento. Adicionalmente, al contrastar la hiptesis con los resultados s llegan a conclusiones vlidas, que permiten replantear las hiptesis y/o reportar lo encontrado.
Frecuentemente, los reportes presentan las siguientes secciones: resumen del contenido, introduccin o antecedentes, mtodos, resultados, discusin, conclusiones, recomendaciones o perspectivas y referencias. La inclusin de recomendaciones generalmente ocurre en reportes para la industria y son determinantes para la toma de decisiones por parte de los directivos. A continuacin se da una breve descripcin de cada una de las secciones que conforman un reporte cientfico. Resumen. Su funcin es presentar un avance del contenido del reporte de una manera en la que el lector juzgue si debe leer el reporte completo. Se incluyen los antecedentes ms relevantes, una frase sobre el objetivo del experimento, una descripcin corta del mtodo que se us, los principales resultados y las conclusiones o implicaciones de los resultados. El resumen normalmente se escribe como un solo prrafo de 100 a 200 palabras. Introduccin. Contiene la informacin necesaria para que el lector conozca por qu es importante el reporte, as como de que trata. La informacin que se utiliza en la introduccin va de lo general a lo especfico, esto es, se comienza primero desde un contexto amplio del tema, lo que facilita entender los conceptos y la importancia del tpico de la investigacin en un rea particular de estudio. Despus, se hace un resumen de investigaciones anteriores, propias o de otros investigadores (literatura especfica) para ayudar a justificar la presente investigacin. La introduccin finaliza con un prrafo en el que se plantea la hiptesis. En algunos casos se requiere que la parte final de la introduccin contenga los objetivos del estudio. Mtodos. El propsito de est seccin es describir precisamente los materiales y mtodos usados para realizar el experimento, siempre con suficiente detalle para que alguna otra persona pueda repetir el mismo procedimiento. Algunas veces se tiene que justificar por qu se us un mtodo en particular. La seccin de mtodos debe escribirse en pasado, ya que describe lo que se hizo. Resultados. En esta seccin se describe pero no se explican los resultados; solo presenta los hechos que van a ser analizados posteriormente. Aunque, se puede explicar algn resultado que es particularmente importante, y que ayuda a entender los siguientes resultados. La seccin de resultados debe ser clara y precisa y generalmente contiene figuras. El uso de las figuras como diagramas, tablas, grficas, cuadros o mapas puede ser muy til para mostrar o enfatizar la informacin en un reporte. Las figuras deben ser usadas para compilar los datos de una manera ordenada, son una herramienta til para ayudar a los lectores a entender datos complejos o numerosos. Es esencial que las figuras estn integradas correctamente en el cuerpo del reporte, que sean referidas inmediatamente despus de mencionarlas y deben explicarse. Un error comn es mencionar la figura, colocarla y slo decir que los datos se encuentran en la figura, lo correcto es decirle al lector en qu dato debe poner atencin en la figura, aquello que es significativo y que podra utilizarse para comparar datos en figuras separadas o bien en ayudarte a explicar el porque del siguiente experimento. Discusin. La seccin de discusin tiene dos principales objetivos, explicar los resultados del estudio y evaluar si lo encontrado en el estudio tiene un significado prctico, biolgico, y/o causal. Para ello se necesita: a) interpretar y explicar los resultados; b) evaluar si las preguntas que se plantearon en la hiptesis han sido contestadas; c) mostrar cmo los resultados de la investigacin se relacionan con los que han sido reportados anteriormente; d) calificar y evaluar la importancia y significado de los resultados, esto es, si los resultados son estadsticamente significativos, o si existi algn defecto en el diseo o en el procedimiento que pudieron afectar el resultado; e) plantear nuevas preguntas o determinar si se abrieron nuevas reas de inters. Conclusiones. Est seccin puede ser incluida como parte de la discusin o bien como una seccin aparte. Establece de manera clara y concisa cul es la relevancia del trabajo y sus implicaciones.
Figura 1.1. Diagrama que muestra los pasos del mtodo cientfico. Se observa que las flechas van hacia delante pero tambin pueden en cualquiera de los puntos regresar. El mtodo cientfico es un proceso que permite replantearse desde las preguntas hasta la manera en que los datos fueron analizados. Reporte cientfico Como se coment con anterioridad, el principal propsito de escribir un reporte cientfico es el de comunicar la informacin que ha sido compilada como resultado de la investigacin o experimentacin y el anlisis de los datos. Los reportes cubren una gran variedad de tpicos pero usualmente se enfocan en transmitir la informacin con un propsito claro y para una audiencia especfica. Un buen reporte es un documento que es preciso, objetivo y completo. Debe tambin estar bien escrito, claramente estructurado y que se exprese de una manera en la que el lector mantenga la atencin en l. Generalmente, el valor de una investigacin se evala a travs del reporte, es decir el reporte escrito es el nico producto tangible de cientos de horas de trabajo. Debido a que se juzga el trabajo a travs de un reporte escrito, ste debe ser de gran calidad.
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Referencias. Es necesario incluir una lista de referencias, las cuales deben estar citadas en el cuerpo del reporte. Las referencias se pueden colocar en una lista por orden alfabtico, o numeradas de acuerdo a como fueron apareciendo en el texto. Cada referencia debe contener toda la informacin bibliogrfica. Hay varios formatos para referencias que se pueden utilizar, consulta en internet o libros los formatos que se utilizan. Actividades sugeridas 1. El profesor proporcionar al menos un artculo de investigacin, para que identifiquen en ste las partes de un reporte. Despus cada equipo expondr sus resultados. 2. Asignar un problema a resolver por equipo, permitir que los estudiantes formulen hiptesis y diseen un experimento. Se podrn realizar al menos dos formas diferentes de reporte: La primera podra ser un reporte oral al final de esta sesin y la segunda un reporte escrito para la siguiente sesin. Cuestionario 1. Qu finalidad persigue el cientfico al escribir y publicar un artculo cientfico? 2. Investiga como se lleva a cabo el diseo de un experimento e incluye cules son las variables independientes, las dependientes y las control? 3. Qu estructura debe tener una hiptesis? 4. Cules son las secciones de un reporte cientfico? 5. Qu diferencia (s) hay entre la seccin de resultados y la discusin? 6. Qu informacin bibliogrfica deben de contener las referencias, si son libros, artculos o catlogos o pginas de internet? Referencias Day, Robert A. How to Write and Publish a Scientific Paper. 4th edition. Phoenix, AZ: Oryx Press, 1994. Williams, Joseph M. Style: Ten Lessons in Clarity and Grace. 6th edition. New York: Longman,2000.
PARTE II: REVISIN DE MTODOS ESPECTROSCPICOS Y ELABORACIN DE CURVA ESTNDAR DE PROTENA

Objetivos Aplicar un mtodo espectrofotomtrico para medir la concentracin de una protena. Conocer el manejo de micropipetas y espectrofotmetros. Construir curvas de calibracin y comprender su importancia. Determinar el intervalo de sensibilidad de una curva estndar. Comparar el intervalo de sensibilidad de dos mtodos para determinar protenas
Introduccin El espectrofotmetro es un instrumento ampliamente utilizado en el anlisis cualitativo y cuantitativo de molculas biolgicas. Parte de la identificacin de una molcula se determina por el trazado del espectro de absorcin (A en funcin de la longitud de onda ) en la regin visible y ultravioleta. Mientras que la cuantificacin de la misma se puede realizar de manera directa (si la sustancia absorbe en alguna regin del espectro) o indirecta (por modificacin del compuesto mediante una reaccin qumica). Leyes que rigen la espectrofotometra Cuando un haz luminoso de intensidad P0 pasa a travs de una solucin, parte de ste se absorbe, por lo tanto la intensidad de la radiacin emergente P es menor al incidente P0. La relacin entre ambos se denomina transmitancia, T: T= P/P0. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . (1) La cantidad de luz absorbida es proporcional al nmero N de iones o molculas capaces de absorber energa; por lo tanto, T disminuye a medida que la concentracin aumenta. Ley de Lambert y Beer, conocida generalmente como Ley de Beer, considera que al dividirse la disolucin en pequeas secciones, en cada una de ellas se absorber una pequea cantidad de radiacin P, que es proporcional a N. Tomando en cuenta que N es directamente proporcional a la concentracin y si la longitud por la que pasa el haz de luz (longitud de la celda) es constante, podemos llegar a la ecuacin general: donde: -log P/ P0= abc . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . (2) c es la concentracin b es la longitud de la celda o paso ptico a es la constante de proporcionalidad llamada absortividad La absortividad o coeficiente de extincin es una caracterstica propia de cada especie y depende de la estructura qumica de sta. El valor de la absortividad para un compuesto vara con la longitud de onda. Definiendo que la relacin -log P / P0 es la absorbancia de la solucin, la ecuacin final que define a la ley de Beer queda de la siguiente manera: A= abc . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . (3) Es importante mencionar que la constante de proporcionalidad a depende de la longitud de onda por ello se le coloca el superndice as como tambin a la absorbancia A (ec. 3). Si la concentracin se
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1 caja con puntas de 1000 L (azules) para micropipeta. 1 Micropipeta 10 L 1 Micropipeta 20-200 L 1 Micropipeta 200-1000 L Vrtex Espectrofotmetro (por grupo)
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expresa en molaridad, entonces se denomina a la constante de proporcionalidad coeficiente de absortividad molar o coeficiente de extincin (). Convencionalmente, el paso de la luz es de 1 cm, por lo que entonces las unidades de son cm-1mol-1L. Hay que destacar que A es adimensional, ya que por definicin es un ndice. Una grfica de absorbancia de una especie en disolucin, a una longitud de onda dada, como una funcin de su concentracin molar, se le llama curva de calibracin o curva estndar. Es una lnea recta y de acuerdo a la ecuacin 3 la pendiente es b. Conociendo y la longitud del paso de la luz b, la concentracin de la sustancia en cualquier otra muestra puede ser determinada usando la Ley de Beer. La cuantificacin de la especie debe realizarse a la longitud de mxima absorcin. Determinacin de protenas Dos aplicaciones comunes de la determinacin de protenas son: 1) para reportar la actividad especfica de una enzima y 2) para hacer un cargado homogneo de protena en geles de poliacrilamida-SDS. Dado que hay varios mtodos para medir protenas totales, Cmo se escoge entre estos mtodos? Generalmente se selecciona de acuerdo a su aplicacin. Por ejemplo, para el clculo de la actividad enzimtica, el principal propsito es tener exactitud en los resultados, mientras que para colocar cantidades iguales de protena en un gel de poliacrilamida-SDS, la precisin es ms importante. Cuantificacin de protenas por medicin de absorbancia a 280 nm. El uso de la absorbancia en la regin ultravioleta para medir la concentracin de protena es posiblemente el mtodo ms simple y rpido, aunque puede producir resultados poco exactos. La cuantificacin de protena por la medida de la absorcin a 280 nm, depende de la presencia de aminocidos aromticos: tirosina (Tyr) y triptfano (Trp). La medida a 260 nm depende de la presencia de fenilalanina (Phe) ya que es en esta longitud de onda donde presenta su absorbancia mxima. Un alto orden de estructuracin puede modificar la contribucin de las Tyr y Trp en la absorbitividad molar del pptido o protena y en consecuencia la absorbancia es sensible a cambios en el pH y fuerza inica del medio. En la prctica determinaremos la concentracin de una muestra problema utilizando, adems de la ecuacin de la Ley de Lambert y Beer, una curva patrn de absorbancia a 280 nm, esto ltimo slo con fines didcticos, ya que de manera rutinaria, la concentracin de protenas utilizando el mtodo de absorbancia a 280 nm se obtiene solamente empleando la ecuacin de Lambert y Beer y el coeficiente de extincin molar. Cuantificacin de protenas por un mtodo colorimtrico. El ensayo de determinacin de protenas por Lowry es uno de los ms usados en Bioqumica. Cuando a un pptido o protena en disolucin bsica se le hace reaccionar con cobre se forma un compuesto colorido por coordinacin entre los nitrgenos del pptido con el in metlico. En el mtodo de Lowry el reactivo de FolinCiocalteu (fosfomolibdato.fosfotungstato) se aade para incrementar la cantidad de color desarrollado. El aumento en el color ocurre cuando el complejo de cobre tetradentado transfiere los electrones al complejo fosfomolibdato/ fosfotungstato, reaccin que produce una coloracin azul que se lee a 750 nm. La reduccin del reactivo de Folin-Ciocalteu ocurre solamente con los residuos de tirosina y triptfano de la protena. Material y equipo Celdas de plstico para espectrofotmetro Celdas de metacrilato grado UV para espectrofotmetro Tubos de microfuga 1 gradilla para tubos de microfuga 1 caja con puntas de 200 L (amarillas) para micropipeta.
Reactivos Albmina de suero bovino o BSA. Solucin problema de protenas (los profesores la proporcionarn) Disolucin de carbonato-tartrato-cobre (CTC). Ver composicin en apndice. 10% Dodecilsulfato de sodio (SDS) 0.8 N NaOH H2O Reactivo A. Se prepara inmediatamente antes de usarse con partes iguales de CTC, 10% SDS, 0.8 N NaOH y H2O. Reactivo B. Dilucin del reactivo de Folin Ciocalteu. 1 volumen de Folin + 5 volmenes de H2O. Guardar en frasco mbar. Preparar preferentemente poco antes de usarse. Desarrollo experimental Determinacin de protenas por absorbancia a 280 m 1. Rotular los tubos de microfuga. 2. Aadir los volmenes del estndar de BSA que se indican en la Tabla 1.1 y completar con agua. 3. Colocar los volmenes indicados de la muestra problema y H2O. 4. Encender el espectrofotmetro por lo menos 15 minutos antes de la determinacin y seleccionar la de 280 m. 5. Utilizar celda de cuarzo para realizar las mediciones. 6. Ajustar el espectrofotmetro a cero con agua. 7. Realizar las lecturas y llenar la tabla con los datos de absorbancia. 8. Calcular la concentracin de protena de la curva estndar de acuerdo al volumen aadido de la solucin estndar. 9. Construir la grfica con los datos obtenidos. 10. Calcular la concentracin de protenas de la muestra con los datos de la regresin de la curva. Tabla 1.1. Volmenes y cantidades del estndar de BSA para determinar la concentracin de protenas de una muestra utilizando la absorbancia a 280 nm. Tubo H2O BSA Muestra Protena** A280m problema* (1mg/mL) (g) 0 500 L 1 485 L 15 L 2 470 L 30 L 3 455 L 45 L 4 440 L 60 L 5 425 L 75 L 6 410 L 90 L 7 395 L 105 L 8 475 25 L 9 450 50 L * La muestra problema la prepararn y entregarn los profesores.
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** Calcular la cantidad de protena que contiene cada tubo de acuerdo a los L que se aadieron del estndar de BSA. Y en el caso de la muestra problema de acuerdo a la frmula y/o a los datos de la regresin de la curva estndar. 11. Calcular la concentracin de protenas de la muestra usa la ecuacin de Lambert y Beer y el coeficiente de extincin molar de la Albumina de Suero Bovino (BSA) que es 43 824 M-1 cm-1 o bien usando el coeficiente dado en porcentaje que es de 6.6 para una solucin de BSA al 1% (10 mg/mL) y usando la frmula 4 para determinar la concentracin de la muestra.
Abs 280nm Concentracin L ( g / L) = (%) *10
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Grafica ambas curvas patrn en una sola grfica y compara la cantidad de protena que se necesita para tener una absorbancia de 0.15 en ambos mtodos. Qu te dicen ambos valores respecto a la sesibilidad de cada uno de los mtodos? Compara tus datos con los de tus compaeros y analiza Qu tan reproducibles son los datos? 6. Se obtiene una lnea recta despus de graficar absorbancia vs g protena? 7. De acuerdo a tus resultados, cul es el intervalo en el que se podra determinar la concentracin de una protena en una muestra utilizando la curva estndar de determinacin de protenas por Lowry? Da una explicacin. 8. Cules son las aplicaciones en general de una curva de calibracin o estndar? Referencias Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. 1982. Molecular cloning a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, NY. Stoscheck CM. Quantitation of Protein. 1990. Methods in Enzymology 182, 50-69. Peterson GL. 1977. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry 83, 346-356. + Wang, Y., et al. Julio 2007. Quantitative analyses reveal the importance of regulated Hdmx degradation for P53 activation. PNAS, (104). 30, 12365-12370. Notas y Clculos.
12. Comparar los resultados obtenidos al haber realizado el punto 10 y el punto 11. Determinacin de protenas por el mtodo de Lowry. 1. Rotular los tubos de vidrio y adicionar los reactivos en el orden que se indica en la Tabla 1.2. Recuerda: debes mezclar con el vrtex despus de aadir cada una de las disoluciones. 2. Encender el espectrofotmetro, seleccionar la de 750 nm. 3. Utilizar las celdas de plstico para realizar las mediciones. 4. Ajustar el espectrofotmetro con la disolucin del primer tubo de la tabla (sin BSA). 5. Realizar las lecturas. 6. Llenar la tabla con los datos de absorbancia. 7. Construir la grficas de absorbancia vs concentracin de protena (g). 8. Calcular la concentracin de la protena en la muestra Tabla 1.2. Reactivos y cantidades a aadir para realizar una curva patrn de BSA y la determinacin de la concentracin de protenas de una muestra problema, utilizando el mtodo de Lowry para su determinacin. Tubo H2O BSA Muestra Reactivo A Reactivo B A750m Protena* (1mg/mL) Problema* (g) 1 450 L 500 L 250 L 2 445 L 5 L 500 L 250 L 3 440 L 10 L 500 L 250 L 4 435 L 15 L 500 L 250 L 5 430 L 20 L 500 L 250 L 6 425 L 25 L 500 L 250 L 7 420 L 30 L 500 L 250 L 8 415 L 35 L 500 L 250 L 9 425 L 25 L 500 L 250 L 10 400 L 50 L 500 L 250 L * La muestra problema la prepararn y entregarn los profesores. ** Calcular la cantidad de protena que contiene cada tubo de acuerdo a los L que se aadieron del estndar de BSA. Y en el caso de la muestra problema utilizando los datos de la regresin de la curva estndar generada. Cuestionario 1. Explica qu tipo de factores contribuyen en la desviacin de la lnea recta al graficar la absorbancia contra concentracin (desviaciones a la ley de Beer). 2. De acuerdo al fundamento de los dos mtodos de cuantificacin de protenas aplicados en est prctica cules son las principales diferencias entre ambos mtodos? Considera los costos, facilidad, sensibilidad, el material utilizado 3. 4. Qu sustancias pueden interferir con cada una de las determinaciones? Incubar a temperatura ambiente por 30 minutos
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2. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTENAS. Purificacin de la enzima lactato deshidrogenasa de msculo esqueltico de bovino. PARTE I. EXTRACCIN Y PRECIPITACIN POR SALADO.
Objetivos - Conocer las propiedades fsicoqumicas de las protenas: carga, punto isoelctrico, masa molecular y afinidad. - Conocer las diferentes estrategias utilizadas para aislar protenas a partir de diferentes fuentes celulares. - Relacionar las propiedades fisicoqumicas de las protenas con el fundamento de las tcnicas utilizadas en la purificacin de protenas: Centrifugacin diferencial, precipitacin por salado, cromatografa en filtracin en gel, cromatografa de intercambio inico y cromatografa de afinidad. - Aplicar las tcnicas de centrifugacin y precipitacin por salado como tcnicas iniciales de purificacin de una protena. Introduccin Una condicin esencial para el estudio de la estructura y funcin de una protena es su purificacin, generalmente de un tejido que contiene miles de protenas que difieren en tamao, forma y carga. Hay varios aspectos que deben considerarse para realizar un mtodo para purificar una protena, como por ejemplo, para que se usara la protena, cuales son las caractersticas propias de la protena (tamao, carga, solubilidad, hidrofilicidad y funcin biolgica), la cantidad que se requiere purificar y el costo. Por lo tanto, no hay un procedimiento nico para la purificacin de protenas, no obstante, si hay una forma sistemtica en la que se puede realizar. Una gua bsica para la purificacin de una protena toma en consideracin lo siguiente: A. Definir los objetivos de la purificacin. Grado de pureza, cantidad y nivel de actividad requeridos. B. Seleccionar la muestra biolgica de inicio. Depender de la localizacin de la protena tanto en tejidos como en compartimentos extracelulares o intracelulares. C. Desarrollar una tcnica de anlisis. Para la determinacin rpida de la pureza, actividad o contenido total de protena. Un mtodo frecuentemente utilizado para evaluar la pureza es la separacin de la protena mediante electroforesis. D. Minimizar la manipulacin de la muestra. Evitar los procedimientos largos, ya que se corre el riesgo de perder la actividad de la protena o reducir el rendimiento. E. Remover al inicio del proceso los posibles contaminantes. Como por ejemplo las proteasas. F. Reducir el uso de aditivos. El uso de muchos y diversos aditivos como sales y amortiguadores en cada paso, puede llevar a la prdida de la actividad de la enzima y aumentar los costos de la purificacin. Seleccionar y usar slo lo necesario. G. Usar una tcnica diferente en cada paso. Para ello tomar en cuenta las propiedades fisicoqumicas de la protena como tamao, carga, hidrofobicidad y especificidad por ligandos. H. Minimizar el nmero de pasos. En cada paso se pierde protena y tiempo, por lo que hay que combinar los pasos de manera lgica. Un protocolo tpico de purificacin de una protena intracelular utiliza varias tcnicas, que pueden incluir en la primera fase, la ruptura de las membranas celulares, la centrifugacin diferencial o en gradiente de densidad para separar protenas de las partculas subcelulares o bien de agregados de
diferente peso molecular. Una purificacin posterior incluir la precipitacin selectiva de protenas por la adicin de sales o solventes miscibles en agua. En la tercera fase de la purificacin se removern los contaminantes utilizando la separacin basada en la carga, tamao y afinidad de la protena. A continuacin se describen brevemente las tres fases del proceso y algunas tcnicas para purificar una protena. SELECCIN DE LA FUENTE DE LA PROTENA. Varias pueden ser las fuentes de la protena, microorganismos, tejidos, cultivos celulares, clulas transformadas1, entre otras. La eleccin de la procedencia de la protena debe basarse en criterios tales como la facilidad de obtener cantidades suficientes de biomasa de la que se asla la protena, la cantidad de la protena de inters en el tejido o clula, y cualquier propiedad peculiar de la protena escogida, que ayudar en su estabilizacin y su aislamiento. En algunos casos, el investigador necesita forzosamente utilizar un tejido en particular, an cuando la cantidad del tejido y de la protena es insuficiente. La recomendacin para estos casos, es realizar un ensayo piloto con una fuente de protena distinta a la requerida. PRIMERA FASE. El objetivo inicial es la obtencin del homogeneizado o extracto crudo y su clarificacin o concentracin. La homogeneizacin es un proceso donde las clulas y los tejidos son lisados en fragmentos lo suficientemente pequeos para dar lugar a una suspensin uniforme y estable llamada homogeneizado. Los equipos con los que se realiza la homogeneizacin son diversos y comprenden desde el mortero hasta las ondas ultrasnicas pasando por la licuadora. El mtodo a utilizar para obtener el homogeneizado depende de la dificultad que presente el material biolgico para romperse. Igualmente importante al mtodo de homogeneizacin es la seleccin de la solucin de homogeneizacin, puesto que ser el medio al que estar expuesta la protena y en el que se pueden adicionar componentes que ajusten el pH de la solucin, la fuerza inica, inhibidores de proteasas o algn estabilizador de la protena. Posteriormente, para eliminar los contaminantes o clarificar la muestra se puede recurrir al proceso de centrifugacin. La centrifugacin aprovecha las propiedades de tamao, forma y densidad de las protenas para separarlas de otras molculas que presentan caractersticas distintas. Como resultado, el efecto de la gravedad para cada protena es diferente. En principio, se pueden separar organelos de una solucin homognea de partculas, al exponer a la muestra a diferente fuerza gravitatoria. Despus de la centrifugacin, algunas de las partculas que normalmente permanecan en solucin se sedimentan. La fuerza centrfuga relativa (RCF) se calcula con la siguiente ecuacin:
Donde RPM son las revoluciones por minuto de un rotor con una distancia r (expresada en mm). El radio usado es la distancia del centro del eje del rotor a la posicin intermedia del tubo. La fuerza centrfuga creada puede ser tan pequea como 600 Xg (600 veces la gravedad) sedimentando pedazos de tejido, clulas intactas, ncleos, entre otros. El lquido residual o sobrenadante puede someterse a un paso posterior de centrifugacin, en un proceso denominado centrifugacin diferencial. Esto es varios pasos secuenciales de centrifugacin a diferentes velocidades. Por ejemplo, despus de sedimentar lo ms pesado, el sobrenadante se puede centrifugar a una velocidad intermedia para sedimentar las membranas celulares o velocidades tan grandes como 300,000 Xg, en donde la mayor parte de las molculas solubles permanecen en solucin y las molculas ligeras sedimentan. SEGUNDA FASE. El objetivo principal es remover una cantidad importante de contaminantes que pueden ser protenas, cidos nucleicos, toxinas y virus. Uno de los mtodos ms utilizados para
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Clulas que fueron obtenidas a travs de la introduccin de un gene que codifica para una protena distinta a la suya, a travs del uso de tcnicas de biologa molecular. Ver seccin 5 del manual.
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eliminar protenas contaminantes es el de la precipitacin. Para que una protena precipite debemos modificar el ambiente que le rodea, debido a que los grupos cargados en la superficie de una protena pueden interaccionar tanto con las molculas de agua como con los iones que se encuentran en solucin. Existen varias estrategias para precipitar a las protenas tales como cambio de pH, incremento en la temperatura, adicin de solventes, molculas cargadas, etc. Pero, el mtodo ms comnmente empleado es la precipitacin por salado con (NH4)2SO4. Las protenas globulares aumentan su solubilidad al incrementar la concentracin de iones, fenmeno denominado de salting in. Pero cuando se eleva en exceso la concentracin de iones, disminuye la solubilidad de las protenas y precipitan (salting out). El mecanismo de salting-out se basa en la exclusin del cosolvente, en este caso la sal. La mayor parte de las protenas presentan una capa de agua (capa de solvatacin) que se encuentra asociada y cercana a su superficie. Al incrementar la concentracin de los iones, la capa de solvatacin disminuye y permite que los iones interaccionen con los residuos de las protenas. Las interacciones de tipo hidrofbico entre los residuos apolares de la protena y el solvente, se evitan gracias al plegamiento o bien por la asociacin entre protenas, produciendo su precipitacin. Debido al uso extensivo de este mtodo, que adems es muy econmico, se han diseado tablas y frmulas en las que se pueden determinar las cantidades a aadir de (NH4)2SO4 slido o en solucin, a una mezcla de protenas para obtener una concentracin dada. Despus de la precipitacin hay que retirar el agente precipitante. Una manera es diluir la solucin para reducir la concentracin del compuesto, otras formas pueden ser realizar la dilisis, la ultrafiltracin o bien el paso por una columna de exclusin molecular. La dilisis suele llevarse a cabo colocando la muestra en un tubo estndar de dilisis, usualmente una membrana semipermeable de celulosa o celofn con un poro determinado. Se sumerge la bolsa de dilisis que tiene la muestra en una solucin al menos 30 veces mayor al volumen de la muestra. La difusin de los materiales hacia adentro y fuera de la bolsa de dilisis permitir reducir la concentracin de la sal precipitante, disolver a la protena, as como cambiar la solucin en la que originalmente estaba la protena. Existen dos desventajas de la dilisis: el costo de la membrana de dilisis y que el proceso puede llevar al menos 12 h. Por su parte, la filtracin en gel no tiene el problema del tiempo. Una columna empacada con Sefadex-G25 puede usarse para eliminar molculas de peso molecular menores a 5000 daltones. La muestra se coloca en la columna, las molculas de menor tamao entran por los poros de la matriz, mientras que las grandes son excluidas, por lo que al adicionar el amortiguador de elucin, las protenas de alto peso molecular se mueven con rapidez a travs de la columna y salen primero, despus eluyen o salen las de peso molecular menor. En un simple paso la muestra se desala, concentra, cambia de amortiguador y pierde protenas o molculas contaminantes. TERCERA FASE. El objetivo es obtener una protena pura o con mnimas trazas de contaminantes. Para alcanzar el objetivo se utilizan uno o la combinacin de varios mtodos cromatogrficos, como la cromatografa de exclusin molecular, intercambio inico, interaccin hidrofbica y de afinidad. A continuacin slo se describen las dos tcnicas que se usarn en el laboratorio. La cromatografa de intercambio inico es una tcnica que separa las biomolculas en base a sus caractersticas de carga. Los grupos cargados sobre la superficie de una protena interaccionan con los grupos con carga opuesta de la fase estacionaria. La carga electrosttica de las protenas depende del pH en el que se encuentren, cuando se iguala el nmero de cargas positivas a las negativas se dice que se encuentran en su punto isoelctrico o pI. La carga neta de una protena es positiva a valores de pH < pI, y se une fuertemente a una resina con cargas negativas o intercambiador catinico. Mientras que, para que la protena presente carga negativa la solucin debe encontrarse en valores de pH > pI, y es capaz de unirse a intercambiadores de tipo aninico que
contienen grupos cargados positivamente (Figura 2.1). Para eluir a la protena de inters se utilizan soluciones que modifican el pH o la concentracin de sales en la resina. Debido a que la separacin de las protenas de la matriz ocurre en orden de menor a mayor fuerza de unin, es comn eluir a las protenas usando un gradiente de concentracin de sales en orden creciente de concentracin.
Figura 2.1. Separacin por cromatografa de intercambio inico. Dependiendo de la carga inica de los soportes o resinas de cromatografa entonces ocurrir la interaccin con molculas cargadas positiva o negativamente. Cromatografa de afinidad. Si la protena a purificar tiene una afinidad especfica por un ligando como su cofactor, un anticuerpo o un in metlico, esa propiedad se puede usar para purificar a la protena. Por ejemplo, para purificar a una deshidrogenasa es comn usar al cofactor de la enzima, el NAD+ o bien a un compuesto que presente alguna similitud a ste (Figura 2.2). Cuando la muestra atraviesa la columna de afinidad, la protena de inters se unir al ligando, mientras que el resto sale de la columna. Este tipo de separacin, basada en el reconocimiento biolgico, es muy especfica y elimina a muchos contaminantes.
Figura 2.2. Comparacin entre las molculas de Cibacrn blue 3GA y el NAD+. A) Los colorantes de triazina como el Cibacrn blue 3GA son comnmente acoplados a resinas de agarosa para utilizarse en ensayos de purificacin por cromatografa de afinidad. La molcula es estable, fcil de movilizar, barata y varias compaas las tienen disponibles para realizar purificaciones de protenas que unen nucletidos de piridina como B) el NAD+. En la prctica se purificar a la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) de msculo de bovino. En la primera parte del protocolo de purificacin, se realizar la clarificacin de la muestra mediante filtracin y centrifugacin y posteriormente se llevarn a cabo dos pasos secuenciales de precipitacin con (NH4)2SO4. En la siguiente sesin se realizar el desalado de la muestra mediante filtracin en gel, para al final purificarla mediante una columna de intercambio inico o de afinidad. Posteriormente, en la tercera parte del protocolo se evaluar el rendimiento, al determinar la cantidad total de protena y por ltimo en la cuarta parte del protocolo se determinar su pureza al realizar la separacin de las muestras proteicas y visualizacin en un gel de poliacrilamida-SDS. Material biolgico 100 g de carne de res preferentemente filete de ternera
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Materiales y equipo para la extraccin de la enzima (por grupo) 1 Tijeras 1 Esptula 1 Recipiente para hielo 1 Par de guantes de ltex Gasa 1 Vasos de precipitados de 1L 1 Probeta de 250 mL 1 Probeta de 100 mL 4 Botellas de centrfuga Licuadora Balanza granataria Balanza de dos platos Materiales y equipo para la precipitacin con sulfato de amonio 2 Tubos para centrfuga con capacidad para 50 mL 1 Recipiente para hielo 2 Vasos de precipitados de 100 mL 1 Esptula Tubos para microfuga de 1.5 mL Gradilla para tubos de microfuga 1 Caja con puntas de 200 L (amarillas) para micropipeta. 1 Caja con puntas de 1000 L (azules) para micropipeta. 1 Micropipeta 20-200 L 1 Micropipeta 200-1000 L 1 Bandeja pequea 1 Barra magntica 1 Agitador magntico Centrfuga (por grupo) Balanza (por grupo) Caja para almacenar tubos de microfuga en el congelador (por grupo) Reactivos Tris 50 mM pH 7.0 (NH4)2SO4 slido.
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de precipitados de 1L. NOTA. Puede tomarse una alcuota de est fraccin y denominarla Fraccin 0. 4. Distribuir el filtrado en botellas de centrfuga y centrifugar a 7,000 rpm a 4C durante 10 minutos. Decantar con cuidado el sobrenadante en un vaso de precipitados de 1 L. Al sobrenadante lo denominamos homogeneizado total (Fraccin 1). Apartar 1 mL de la fraccin 1 en un tubos de microfuga y almacenar a -20C para su posterior uso. Nota: Tirar el contenido de la gasa en el recipiente preparado para su deshecho. B. Precipitacin con sulfato de amonio ((NH4)2SO4) por equipo. 5. Tomar 25 mL de la fraccin 1 y colocarlo en un vaso de precipitados. 6. Agitar el sobrenadante de manera continua y suave en un agitador magntico, mientras se aade lentamente sulfato de amonio slido (8.15g de (NH4)2SO4 por 25 mL del sobrenadante). La agitacin debe ser lo suficientemente vigorosa para evitar la formacin de cmulos de sal no disueltos, pero no demasiado fuerte porque se puede producir espuma, en ningn momento utilizar varilla de vidrio o esptula para disolver los grumos. Se recomienda colocar una bandeja pequea con hielo entre el vaso de pp y la parrilla de agitacin para evitar que la solucin se caliente. 7. Cuando toda la sal se ha disuelto la solucin se encuentra a una saturacin del 55% con sulfato de amonio. 8. La mezcla que ahora se encuentra turbia se vaca a un tubo de centrfuga de 50 mL y se centrfuga a 10,000 rpm 4C por 10 minutos. 9. Colectar el sobrenadante (Fraccin 2) y medir el volumen. Descartar el botn. Tomar 1 mL de la fraccin 2 y almacenarla en un tubo de microfuga a 20C para su posterior uso. 10. Calcular el peso de (NH4)2SO4 para obtener una solucin al 75% de saturacin, (0.125 g de (NH4)2SO4 por cada mL del sobrenadante obtenido). Agitar como se describi anteriormente. 11. Una vez disuelto el (NH4)2SO4, colocar la mezcla turbia en un tubo de centrfuga. Centrifugar a 10,000 rpm a 4C por 10 min y descartar el sobrenadante. 12. Resuspender el botn en 1 mL de agua, el volumen final es de aproximadamente 1.8 mL. 13. Distribuir en 3 tubos de microfuga y etiquetar como Fraccin 3. Uno de los tubos debe contener 1000 L, ese volumen se usar en el siguiente protocolo experimental. Almacenar a 20C. SUGERENCIAS: 1. Para evitar la congelacin y descongelacin innecesaria de las muestras es conveniente que al final de est sesin se almacenen las muestras en alcuotas y que se etiqueten apropiadamente, se sugiere el uso de la tabla que abajo se muestra. 2. Se recomienda slo descongelar la alcuota una sola vez y despus desecharla.
Desarrollo experimental Importante. Todo el procedimiento deber realizarse en fro (4C). Mantener las soluciones y suspensin proteica en bao de hielo. Anotar en su libreta el peso del tejido utilizado, as como el volumen de la solucin de homogeneizacin y los volmenes resultantes despus de cada uno de los pasos de purificacin (Figura 2.3). Ya que estos valores son necesarios para calcular el rendimiento, contenido de protena y actividad enzimtica. A. Extraccin. Esta primera parte la realizar el profesor con ayuda de un par de voluntarios y se distribuir el homogeneizado a todos los equipos. 1. Cortar en trozos pequeos 80 g de tejido (eliminar el tejido conectivo y graso que acompaa a la carne) y colocarlos en un vaso de licuadora previamente enfriado (mantener el vaso en el cuarto fro hasta su uso). 2. Agregar 3 volmenes de 50 mM Tris/HCl pH 7.0 fro por cada g de tejido (240 mL) y licuar brevemente, hacerlo en pulsos de 3 seg/3 a 6 veces para evitar que la licuadora se caliente. 3. Filtrar la mezcla sobre dos capas de gasa grandes (previamente humedecidas con agua destilada). Exprimir suavemente sobre la pared de un embudo y colectar el filtrado en un vaso
Nmero
Alcuota almacenada para:
Volumen
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de Determinacin Fraccin de protenas. PAGE-SDS Curva temporal de actividad enzimtica. III Obtencin de parmetros cinticos. IV Desalado
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total almacenado

_____g Tejido ______mL 50 mM Tris/HCl pH 7.0 Moler Homogeneizado
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I 0 1 2 3 4* FPA* FPB*
II
Filtrar con gasa Homogeneizado Distribuir en botellas de centrfuga Centrifugar 7,000 rpm, 10 min, 4C Botn Sobrenadante (SN) __________mL VOLUMEN TOTAL (FRACCIN 1; _________mL) A _______mL SN aadir ________g (NH4)2SO4 (55% saturacin) Agitar
* Fracciones que se obtendrn en la siguiente sesin Notas y clculos:
Distribuir en tubos de centrfuga Centrifugar 10,000 rpm, 10 min, 4C Botn Sobrenadante (FRACCIN 2;_________mL) Aadir ________g (NH4)2SO4 (75% saturacin) Agitar Recuerda que ya est al 55% de la sal
Distribuir en tubos de centrfuga Centrifugar 10,000 rpm, 10 min, 4C Botn (FRACCIN 3) Aadir 1 mL de H20; Volumen total obtenido______mL Sobrenadante
Figura 2.3 Esquema de purificacin inicial de la lactato deshidrogenasa mediante precipitaciones sucesivas con sulfato de amonio. Se sugiere llenar los espacios vacos con las cantidades solicitadas.
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Cuestionario 1. Mencione cuatro usos que se les puede dar a las protenas purificadas? 2. Dentro de la gua para purificar a una protena se plantea que es importante establecer cul va a ser el uso final de la protena purificada. Explique por qu. 3. Clasifique los mtodos que se seguirn para la purificacin de la lactato deshidrogenasa, de acuerdo a las propiedades de las protenas como carga, peso, solubilidad y unin a ligandos. 4. Por qu es importante mantener a la mezcla de protenas a 4C? 5. Investiga cules son las propiedades de la lactato deshidrogenasa, como localizacin subcelular, secuencia primaria de aminocidos, pI (punto isoelctrico), actividad enzimtica que cataliza, peso molecular, estructura terciaria y/o cuaternaria. 6. De acuerdo al pI de la lactato deshidrogenasa que encontraste predice cual ser su carga elctrica cuando la protena se encuentre en un amortiguador de fosfatos pH 7.0. Qu tipo de columna y eluyente recomiendas para su purificacin y porqu? 7. Existen varios mtodos en la literatura para purificar a la lactato deshidrogenasa, por qu existe esa variedad si todos purifican a la misma protena? 8. Cules son las protenas que se estn purificando con un fin de uso farmacutico o mdico? Menciona al menos 2 y para que se usan Referencias Allen T, Mark W. 2004. Desalting, Concentration, and Buffer Exchange by dialysis and ultrafiltration. Current protocols in protein science 4.4.1-4.4.15. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Castle DJ. 2004. Overview of cell fractionation. Current protocols in protein science 4.1.14.1.9. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Cuarta edicin. 1997. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 69-85. Localizacin QP514.T4 Protein purification Handbook. 1999. Amhersham Pharmacia Biotech AB. Uppsala, Sweden. Code number 18-1132-29 Pp 94. Salem J. 2001. Enzymes: purification. Encyclopedia of life sciences. John Wiley & Sons Ltd. Pp 1-7. Consultar la pgina www.els.net Sheehan D, OSullivan S. 2001. Ion exchange chromatography. Encyclopedia of life sciences. John Wiley & Sons Ltd. Pp 1-4. Consultar la pgina www.els.net Voet D, Voet JG. Biochemistry. Segunda edicin. 1995. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 71-104 Sitios recomendados para 1. aprender sobre las caractersticas y propiedades de las protenas http://depa.pquim.unam.mx/proteinas/estructura/index.html pgina desarrollada por el Dr. Rogelio Rodrguez Sotres. 2. calcular la concentracin de sulfato de amonio a aadir a una muestra. http://www.encorbio.com/protocols/AM-SO4.htm http://www.proteinchemist.com/cgi-bin/s2.pl 3. calcular la fuerza centrfuga de un rotor. Convierte rpm a Xg o vicerversa. http://www.gmi-inc.com/archivedpages/Rotor%20RCF%20Calculator.htm
PARTE II. PURIFICACIN POR CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO Y DE AFINIDAD

Objetivos - Aplicar la cromatografa en filtracin en gel como una de las tcnicas para el desalado y cambio de la solucin amortiguadora de extractos proteicos. - Aplicar los mtodos de cromatografa de intercambio inico y de afinidad para purificar una protena Material biolgico Fraccin 3 obtenida en la seccin anterior Material y equipo 1 Columna de cromatografa vaca 1 Columna de Sephadex G-25 empacada con 2.5 mL de resina 1 Probeta de 50 mL Tubos para microfuga de 1.5 mL 1 Recipiente para hielo 1 Soporte universal 1 pinzas de tres dedos de sujecin con nuez Micropipeta de 1000 L Micropipeta de 200 L 1 caja de puntas de 1000 L para micropipeta 1 caja de puntas de 200 L para micropipeta Centrfuga (por grupo) Balanza (por grupo) Reactivos Desalado 2.5 % Sephadex-G25 (p/V). La columna contiene 2.5 mL de volumen de cama de Sephadex, preparado segn se indica en el Apndice. Se entrega empacada para su uso inmediato. Amortiguador Tris--Mercaptoetanol. Contiene 10 mM de Tris/HCl pH 8.8 y 0.5 mM Mercaptoetanol. (Ver preparacin en el apndice) 400 mM PMSF Amortiguador Tris--Mercaptoetanol-PMSF (1 mM). Se prepara poco antes de su uso. (Se entrega por grupo: Un frasco mbar con 26 mL del amortiguador Tris--Mercaptoetanol, aadir 65 L de 400 mM PMSF para obtener una concentracin final de 1 mM (agitar vigorosamente para disolver el PMSF aadido) Agua destilada estril para el lavado de las columnas. Purificacin por cromatografa de intercambio inico Matriz para intercambio catinico, Macro-prep High S de BIORAD (ver Apndice). Amortiguador de equilibrio I. Contiene 50 mM de amortiguador de fosfatos pH 7.0. Amortiguador de elucin I. Contiene 50 mM de amortiguador de fosfatos pH 7.0 y 1 M de NaCl. Amortiguador de elucin II. Contiene 50 mM de amortiguador de fosfatos pH 3.0. Purificacin por cromatografa de afinidad Matriz para purificacin por afinidad. DEAE affi-gel blue gel (ver Apndice). Amortiguador Tris--Mercaptoetanol-PMSF El mismo que se uso para el desalado
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Amortiguador de elucin A. Amortiguador Tris--Mercaptoetanol-PMSF-NAD+, preparado al momento segn se indica a continuacin: adicionar la solucin de Tris--MercaptoetanolPMSF al frasco que contiene NAD+ en polvo, para una concentracin final 5 mM (ver apndice). Desarrollo experimental Desalado mediante cromatografa de exclusin molecular 1.- Sujetar a un soporte universal la columna de sefadex, como se muestra en la Figura 2.3. 2.- Tomar 1 mL de la fraccin 3 y aadirlo a la columna. 3.- Adicionar a la columna poco a poco la mezcla de protena y esperar a que entre a la columna por gravedad (aproximadamente en 1 minuto o menos). 4.- Desechar el primer mL que eluye de la columna (correspondiente al volumen vaco), agregar a la columna 1 mL de amortiguador Tris--Mercaptoetanol-PMSF y colectar en un tubo de microfuga fro el segundo mL. Esta fraccin contiene a la LDH (Fraccin 4). Se guardan 100 L para llevar a cabo la medicin de actividad y determinacin de protena. El resto de la muestra se utilizar en el siguiente paso. NOTAS. 1La columna se lava con 10 mL de agua destilada estril y se mantiene hidratada para reutilizarla, entregarla al profesor. 2No es necesario realizar la operacin en condiciones de esterilidad, pero el usar agua estril ayuda a disminuir una posible contaminacin de la columna para el uso posterior de otro grupo de estudiantes.
Figura 2.3 Purificacin de protenas por cromatografa lquida. A. Empacado de la columna y B. Colecta de fracciones de protena despus de aadir la solucin de elucin. Purificacin por cromatografa de intercambio inico o de afinidad. La mitad del grupo realizar la purificacin por intercambio inico de la LDH de la fraccin 4 y la otra parte del grupo se enfocar en la purificacin de la LDH por columna de afinidad, tambin a partir de la fraccin 4. A. Empacado de la columna para la fase tres de la purificacin. Adicionar 1 mL de alguna de las dos matrices que el profesor te proporcionar, para realizar intercambio catinico o de afinidad. (Dejar drenar hasta obtener 0.5 mL de volumen contenido inicialmente en la columna). Si es necesario colocar la columna en un tubo de vidrio de 13X100 para centrifugar a 3,000 rpm por 10 min a 4C). Es importante revisar que no se hayan producido burbujas para que el flujo del lquido sea constante; eliminar el eluato. B. Purificacin por cromatografa de intercambio inico 1. Se utilizar la columna que se prepar en el paso anterior con la matriz de intercambio inico. 2. Equilibrar la columna adicionando poco a poco en la parte superior de la columna 1.0 mL de Amortiguador de equilibrio I. Es muy IMPORTANTE adicionar el volumen lentamente, de manera que el flujo de salida sea gota a gota. Se puede acelerar el proceso centrifugando a 3000 rpm por 5 minutos a 4C. 3. Cuando la ltima gota del amortiguador de equilibrio haya salido, tapar la salida de la columna con parafilm y adicionar los 900 L de la fraccin 4. Posteriormente tapar la parte superior de la columna y agitar por inversin entre 5 a 10 veces. Destapar la salida y dejar que pase el lquido por la columna desechando ste volumen (Este es el volumen muerto y no contiene protena). Nuevamente, se puede acelerar el proceso centrifugando a 3000 rpm por 5 minutos a 4C. 4. Realizar un lavado con 1 mL de Amortiguador de equilibrio I (para eliminar la unin no especfica). Alternativamente se centrfuga como se mencion en los pasos 2 y 3. 5. Solicitar a su profesor el amortiguador de Elucin I o II considerando las caractersticas de pI de la LDH. Para la elucin se adiciona poco a poco 1.0 mL de amortiguador de elucin y se recolectan 900 L en al menos 2 fracciones de 450 L cada una (Figura 2.3), las que denominamos, Fraccin purificada FPIa y FPIb. Alternativamente se centrfuga como se mencion anteriormente. 6. Estas fracciones se usaran posteriormente para determinarles protena, actividad y realizar el corrimiento electrofortico. NOTA. Posteriormente se lava la columna con al menos 10 mL de agua estril y se guarda la columna lavada para ser reutilizada por otro grupo de estudiantes. Entregar al profesor.
C. Purificacin por cromatografa de afinidad. 1. Se utiliza una columna que se empaca con DEAE Affi-gel Blue (ver apndice) 2. Se equilibra la columna al adicionar poco a poco 1 mL de amortiguador Tris--MercaptoetanolPMSF (preparado al momento, como se indica en Reactivos o Apndice I). El volumen que drena se desecha. Para acelerar el proceso de paso de las soluciones en la columna se puede centrifugar a 3000 rpm por 5 min a 4C. 3. Enseguida se adiciona poco a poco 900 L de la Fraccin 4. Se centrfuga a a 3000 rpm por 5 min a 4C o se deja drenar y se elimina la fraccin no adsorbida (aproximadamente 900 L, este es el volumen muerto, y no contiene protena. 4. Aadir 1 mL del amortiguador Tris-PMSF para eliminar a las protenas que no se han unido a la columna.
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5. Para despegar a la LDH de la columna se adicionan 400 L de Amortiguador de elucin A (amortiguador adicionado con NAD+) y se recolecta el volumen en un tubo de microfuga fro (Fraccin purificada A o FPA). 6. Se repite el paso 5 para recuperar cualquier cantidad de protena que haya quedado an unida a la columna (Fraccin purificada B o FPB). NOTA. Finalmente se lava la columna con al menos 10 mL del agua estril, y entregar la columna lavada al profesor para ser utilizada nuevamente por otro grupo Cuestionario 1. Por qu es necesario llevar a cabo el proceso de desalado de la fraccin 3 del protocolo experimental? 2. Cules otros usos tiene la cromatografa de exclusin molecular que no sea la de ayudar a desalar una suspensin de protenas? 3. Qu intervalo de fraccionamiento de molculas tiene el Sephadex-G25 y que aplicaciones tiene? 4. Qu es el volumen vaco en una columna de filtracin en gel? 5. A que se refiere el trmino volumen muerto en una columna cromatogrfica? 6. Investiga la composicin de la matriz de intercambio inico que se uso para purificar a la LDH?. 7. De acuerdo al pI de la LDH y conociendo el tipo de columna de intercambio inico que ests utilizando, indica que amortiguador de los que estn enlistados en los reactivos usaras para su purificacin y fundamenta t respuesta. 8. Qu propiedad de la protena se utiliza para purificar a la protena mediante una columna de intercambio catinico? 9. Que debe contener el eluyente para la purificacin de la LDH en la cromatografa de intercambio inico que se propone en este protocolo y porqu? 10. Qu propiedad de la protena ests utilizando para purificarla por cromatografa de afinidad y cul es el componente clave para la purificacin de la LDH en est columna? Referencias Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Cuarta edicin. 1997. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 69-85. Localizacin QP514.T4 Protein purification Handbook. 1999. Amhersham Pharmacia Biotech AB. Uppsala, Sweden. Catlogo 18-1132-29 Pp 94. Salem J. 2001. Enzymes: purification. Encyclopedia of life sciences. John Wiley & Sons Ltd. Pp 1-7. Consultar la pgina www.els.net Sheehan D, OSullivan S. 2001. Ion exchange chromatography. Encyclopedia of life sciences. John Wiley & Sons Ltd. Pp 1-4. Consultar la pgina www.els.net Voet D, Voet JG. Biochemistry. Segunda edicin. 1995. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 71-104. Macro-Prep Ion Exchange Supports Instruction manual. 2000. BIORAD www.bio-rad.com Sitios recomendados para 1. Aprender sobre cromatografa http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/cromatografia.htm 2. Realizar una autoevaluacin sobre los fundamentos de la cromatografa http://www4.ujaen.es/~acarrera/TBQ_HotPot/T3_TBQ_VF/T3_TBQ_VF.htm Revisado por los Profesores: Carmen Parra G., Elpidio Garca R y Diana Snchez R.
Parte III. Monitoreo del proceso de purificacin. A. Determinacin de la concentracin de protenas

Objetivos Conocer los mtodos que se utilizan para monitorear el proceso de purificacin de una protena. Adquirir la habilidad para analizar el progreso de la purificacin de una protena. Aplicar un mtodo espectrofotomtrico para medir la concentracin de una protena. Determinar la concentracin mediante la deteccin de la absorbancia a 280nm. Determinar la concentracin de una protena utilizando un mtodo colorimtrico: Determinacin de protenas por Bradford. Analizar el progreso de la purificacin de una protena. Conocer algunos parmetros que se determinan durante la purificacin de una protena: rendimiento y pureza. Aplicar el conocimiento adquirido para elaborar esquemas de purificacin de protenas. Introduccin Para evaluar de manera cuantitativa el xito de una purificacin de protenas es necesario conocer dos parmetros el rendimiento y el grado de pureza en cada paso del proceso de purificacin. El rendimiento es un parmetro expresado en porcentaje que se obtiene de medir la actividad biolgica de la protena de inters en cada paso de la purificacin, el 100% corresponde a la actividad del extracto inicial. Mientras que el grado de pureza se refiere al incremento en pureza, valor que se obtiene de dividir la actividad especfica de cada paso entre la actividad especfica del paso inicial de purificacin, este ndice da el valor de 1 para el extracto inicial. Para obtener el valor de la actividad especfica que se encuentra generalmente expresado en Unidades/ mg protena-1 es necesario contar con a) una tcnica que determine la concentracin de protenas en la muestra, y b) una tcnica que especficamente detecte o mida la cantidad de la protena blanco (Unidades de actividad). En casos raros, la protena blanco es fcil de detectar, porque es colorida (mioglobina) o porque es fluorescente (protena verde fluorescente). Cuando la protena es una enzima, como la lactato deshidrogenasa, se puede realizar un ensayo enzimtico especfico para determinar si estamos llevando a cabo la purificacin de manera adecuada, actividad que se realizar y que se encuentra descrita en la seccin 3 del manual. Para las protenas que no son enzimas, el ensayo se basa en medir la actividad biolgica de la protena. En est seccin se realizar la determinacin de protenas de cada una de las fracciones obtenidas durante el protocolo de purificacin de la lactato deshidrogenasa de msculo esqueltico de bovino, paso necesario para determinar la actividad especfica de la protena de inters. Adems es necesario conocer la concentracin de protenas ya que llevaremos a cabo el corrimiento electrofortico de las muestras. Cuantificacin de protenas por un mtodo colorimtrico. La determinacin de protenas por Bradford es ampliamente usada ya que es simple, rpida, barata y sensible. Es necesario construir una curva de calibracin para determinar la concentracin de las muestras. El mtodo se basa en la unin especfica del colorante azul de Coomassie brillante G250 (CBBG) a los residuos de Arg, Trp, Tyr, His y Phe de las protenas. El CBBG se une a los residuos de las protenas produciendo una absorbancia mxima a 595 nm, mientras que el colorante libre tiene una absorbancia mxima a 470 nm. A diferencia del Lowry (otra tcnica colorimtrica para determinar protenas) que es muy sensible a la composicin de la solucin que acompaa a las
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protenas, el Bradford slo es afectado por algunos detergentes. Una de las desventajas del Bradford es que el colorante CBBG se une fuertemente a las cuvetas de cuarzo, es por ello que se recomienda usar vidrio o cuvetas depolipropileno. Al usar cuvetas de polipropileno se facilita su limpieza con un poco de alcohol. Determinacin de protenas Material biolgico. Fracciones 0 a la 4 y FPA y FPB Material y equipo 1 Recipiente para hielo Celdas metacrilato grado UV para espectrofotmetro Celdas de polipropileno para espectrofotmetro Tubos para microfuga de 1.5 mL 1 Vrtex Micropipeta de 200-1000 L Micropipeta de 20-200 L Micropipeta de 5 a 10 L 1 caja de puntas de 1000 L para micropipeta 1 caja de puntas de 200 L para micropipeta 1 piceta con etanol y una con agua bidestilada. 1 gradilla para tubos de microfuga Espectrofotmetro Reactivos Reactivo de Bradford Solucin estndar de albmina de suero bovino (BSA) 0.1mg/mL. Desarrollo experimental Determinacin de protenas por el mtodo Abs 280 nm. Seccin sugerida pero puede omitirse y realizarse directamente la cuantificacin de protenas por el mtodo de Bradford. 1. 2. 3. 4. 5. Descongelar slo las alcuotas de las fracciones de protena destinadas para este protocolo y que fueron recolectadas durante la purificacin de la lactato deshidrogenasa. Mantener las fracciones en un recipiente con hielo durante todo el experimento. Colocar las fracciones en cuvetas de metacrilato grado UV. Leer la absorbancia las fracciones que te indique t profesor a la longitud de 280 nm. Calcular la concentracin de protena usando la frmula descrita en la seccin 1 del Manual. Llenar la Tabla 2.1 Tabla 2.1 Concentracin de protena calculada por la Absorbancia a 280nm Absorbancia Concentracin (g/L)
Usar este estimado para determinar las diluciones o alcuotas a usar en la determinacin colorimtrica de protenas. Recordar que la sensibilidad del Bradford es de 1 a 20 g de protena con una absorbancia mxima aproximada de 0.6.
Determinacin colorimtrica de protenas por el mtodo de Bradford. Se utilizar una curva estndar de BSA y las muestras se harn por duplicado, utilizando tubos de microfuga para hacer las mezclas de ensayo. Para la curva estndar: 7. Etiquetar los tubos de microfuga segn se indica en la tabla 2.2, despus aadir los reactivos en el orden mostrado, agitando despus de cada adicin. Precaucin, maneja con cuidado el reactivo de Bradford, ya que contiene H3PO4!. 8. Registrar la absorbancia a 595 nm. Importante incubar a temperatura ambiente por al menos 5 minutos. La absorbancia se incrementar con el tiempo por lo que las muestras no deben incubarse por ms de 1 h a temperatura ambiente. Tabla 2.2 Orden de adicin de reactivos para la determinacin de protenas del estndar de BSA Tubo B 1 2 3 4 800 770 760 740 720 H2O (L) 0 30 40 60 80 BSA (L) 200 200 200 200 200 Reactivo Bradford (L) Absorbancia 9. Graficar absorbancia del estndar vs cantidad de protena (g) y obtener los regresin. 5 700 100 200 parmetros de
Para las muestras: 10. Descongelar slo las alcuotas de las fracciones de protena destinadas para este protocolo y que fueron recolectadas durante la purificacin de la lactato deshidrogenasa o usar las muestras que descongelaste para la determinacin de protenas por Abs 280nm. 11. Mantener las fracciones en un recipiente con hielo durante todo el experimento. 12. Hacer las diluciones de cada una de las fracciones, segn indicaciones de su profesor. Cada muestra diluida se determinar por duplicado. Anotar la dilucin empleada en la Tabla 2.2 13. Numerar los tubos segn se indica en la Tabla 2.3 y dependiendo de los volmenes de protena que te indique el profesor, registrarlos y completar la tabla. Una vez llena la tabla aadir los reactivos segn se indica. 14. Usar el tubo B como blanco 15. Utilizar los parmetros de regresin obtenidos de la curva estndar, para calcular el contenido de protena de cada una de las muestras de acuerdo a la siguiente frmula:
Tubo F0 F1 F2 F3 F4 FPA FPB
Abs 595 nm b Contenido de protena K ( g ) = * F m

Donde, b es la ordenada al origen, m la pendiente y F es el factor de dilucin de cada muestra. 16. El valor obtenido en 9 dividirlo entre el volumen de muestra que utilizaste en el ensayo, obteniendo la concentracin de protena en g/L. 17. Posteriormente realizar los promedios por muestra, recuerda que tienes duplicados para cada fraccin.
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7. Da el fundamento de otro mtodo para determinar protenas.
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Tabla 2.3. Determinacin de la concentracin de protena de las fracciones obtenidas durante los diferentes pasos de la purificacin de la LDH de msculo esqueltico de bovino. F corresponde a Fraccin y conc a que la muestra se usar concentrada.
Tubo H2O (L) cbp 800 L F0 ____ (L) F1 ____ (L) F2 ____ (L) F3 ____ (L) F4 ____ (L) FPA conc (L) FPB conc (L) Reactivo Bradford (L) Absorbancia 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 780 760 780 20 40 20 14 760 40 200
Referencias Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. 1982. Molecular cloning a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, NY. Stoscheck CM. Quantitation of Protein. 1990. Methods in Enzymology 182, 50-69. Pginas web que se pueden consultar: Http://www.histosoft.com/services/background/colorimetric-assay-html
200 200
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18. Determinar la cantidad de protena total que se obtuvo de cada una de las fracciones de los diferentes pasos de purificacin, para ello multiplicar el volumen total de la fraccin por el promedio obtenido en el punto 7, colocar los datos en la Tabla 2.4. Tabla 2.4. Rendimiento proteico durante las diferentes fases de la purificacin de la LDH Fraccin Promedio Volumen total en la fraccin Protena total en la fraccin g protena/L (L) (g o mg ) 0 1 2 3 4 FPA FPB Cuestionario 1. Compara los resultados de concentracin que obtuviste con los dos mtodos empleados en la prctica. 2. Qu desventajas tiene determinar la concentracin de protena por Abs 280 con respecto al Bradford en muestras que tienen una cantidad variada y diferente de protenas, como en nuestras fracciones de la purificacin de la lactato deshidrogenasa? 3. Puedes usar otra protena como estndar que no sea BSA? Si es as porqu y cul? 4. Qu sustancias pueden interferir en cada uno de los mtodos empleados y si se puede como evitas su interferencia? 5. Investiga el intervalo de concentracin que detectan cada uno de los mtodos. 6. Porqu es necesario construir una curva de calibracin en la determinacin colorimtrica de protenas por Bradford?
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1 Recipiente para hielo 1 Micropipeta de 2-10 L 1 Micropipeta de 20-200 L 1 caja de puntas de 200 L para micropipeta 1 Recipiente de plstico/gel para la tincin. 1 Cmara para electroforesis 1 Fuente de poder 1 juego de placas de vidrio 1 Peine 1 juego de separadores Pinzas para sujetar las placas Reactivos Acrilamida. Mezcla de 30% acrilamida y 0.8% NNmetilen-bisacrilamida. 2 M Tris /HCl pH 8.8 0.5 M Tris/HCl pH 6.8 20% SDS TEMED 10% Persulfato de amonio Agua destilada Isopropanol o butanol Mezcla de estndares de peso molecular de protenas. Amortiguador de muestra * Amortiguador de corrida * Solucin teidora * Solucin desteidora * *La composicin de las soluciones se encuentra en el apndice. Desarrollo experimental
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Parte III. Monitoreo del proceso de purificacin. B. Separacin de las protenas en gel de poliacrilamida-SDS
Objetivos Conocer los mtodos que se utilizan para monitorear el proceso de purificacin de una protena. Adquirir la habilidad para analizar el progreso de la purificacin de una protena. Aplicar la electroforesis como una herramienta para monitorear la pureza de una protena. Analizar el progreso de la purificacin de una protena. Conocer algunos parmetros que se determinan durante la purificacin de una protena: rendimiento y pureza. Aplicar el conocimiento adquirido para elaborar esquemas de purificacin de protenas. Introduccin La electroforesis de protenas en geles de poliacrilamida es una herramienta analtica indispensable y rutinaria en un laboratorio de Bioqumica. La electroforesis puede usarse para separar y comparar una mezcla compleja de protenas, evaluar la pureza de una protena durante el proceso de aislamiento y provee algunos valores aproximados de las caractersticas fisicoqumicas de las protenas como la composicin de subunidades, punto isoelctrico, tamao y carga. En la electroforesis la migracin de las partculas o molculas cargadas ocurre cuando se establece un campo elctrico. La velocidad de la migracin depende de la fuerza del campo elctrico aplicado y la carga neta de las molculas a separar. Si el reservorio de la solucin que se encuentra en contacto con la muestra, generalmente llamada amortiguador de corrida, se encuentra en un pH cercano a 9.0, la mayor parte de las protenas se encontrarn cargadas negativamente, por lo que al aplicar el campo elctrico migrarn al nodo. La migracin diferencial de las protenas depender no slo de su tamao sino tambin de su carga, pero cuando se trata de un gel en el que se ha incluido un agente desnaturalizante como el dodecil-sulfato de sodio (SDS), se pierde la estructura terciaria y cuaternaria de la protena y se uniforman las cargas de las protenas, llevando a que la migracin slo dependa de su peso molecular. Existe una gran variedad en la composicin de los geles, que responde a las necesidades de separacin de diferentes mezclas de protenas. En este caso se utilizar a la electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS para evaluar el proceso de purificacin de una protena. El gel de poliacrilamida, se hace a partir de la reacciones entre los radicales libres de los monmeros de la acrilamida. Las cadenas de poliacrilamida se entrecruzan con la N,N-metilen bisacrilamida para formar una red. La tetrametilndiamina o TEMED es el agente iniciador de la polimerizacin y el in persulfato (S2O8-) realiza la funcin de catalizador con la formacin de radicales libres. Las protenas pequeas viajan ms rpido que las de mayor tamao, porque el tamao del poro entorpece el paso de las protenas de mayor peso molecular. Material biolgico Fraccin 0 o 1 Fraccin 2 Fraccin 3 Fraccin PA Fraccin PB Material y equipo 2 vasos de precipitados 25 mL 1 Pipeta Pasteur con bulbo Tubos para microfuga de 0.5 mL
Preparacin del gel de poliacrilamida-SDS. 1. Se lavan perfectamente las placas de vidrio. Ensamblar las dos placas de vidrio con los separadores. Hay que asegurarse de que queden bien niveladas y fijas las placas con las pinzas. 2. Se hace una marca a los 2/3 de la capacidad de los vidrios (ver Figura 2.5). 3. Se mezclan los componentes del gel separador que se indican en la Tabla 2.5, aadiendo al final el persulfato de amonio y el TEMED. Agitar cuidadosamente la solucin (USAR GUANTES MIENTRAS SE MANIPULE LA ACRILAMIDA). Tabla 2.5. Minigel en placa al 12 % de acrilamida con SDS. Reactivos Gel separador Gel concentrador 30% Acrilamida + 2 mL 0.66 mL 0.8% Bisacrilamida 2 M Tris/HCl pH 8.8 1 mL 0.5 M Tris/HCl pH 6.8 0.6 mL 10% SDS 50 L 50 L H2O 1.94 mL 3.67 mL TEMED* 2 L 2.5 L 10% Persulfato de amonio* 40 L 40 L Volumen total 5 mL 5 mL *Aadir justo antes de vaciar entre las placas de vidrio.
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4. Aadir inmediatamente la mezcla anterior en el espacio entre las dos placas de vidrio. 5. Agregar poco a poco con la ayuda de una pipeta pasteur isopropanol o n-butanol saturado con agua, con la finalidad de disminuir la tensin superficial y que no se forme un menisco en la parte superior del gel. 6. Se espera a que polimerice la acrilamida, no ms de 20 minutos. 7. Decantar el isopropanol o butanol y se hace un lavado con agua bidestilada, se elimina el exceso de agua con papel absorbente cuidando de no tocar el gel 8. Preparar la mezcla del gel concentrador similar al punto 2. 9. Se aade entre las placas de vidrio e inmediatamente se coloca el peine en la parte superior para formar los depsitos en los que colocaremos la muestra. 10. Se espera a que se forme este segundo gel, el cual tarda aproximadamente 20 min. 11. Remover con cuidado el peine y se fija el gel con las placas de vidrio a la cmara de electroforesis. 12. Aadir el amortiguador de corrida en ambos reservorios.
Cabe sealar que los pozos tienen una capacidad mxima de 30 L por lo que la mezcla protena:amortiguador de muestra no debe exceder ese volumen. 15. Realizar tambin una mezcla de estndares de peso molecular. Usar 7 L del estndar y mezclar con un volumen adecuado de amortiguador de muestra. Fraccin 0 1 2 3 4 FPA FPB Estndar Tabla 2.6. Preparacin de muestras para su corrimiento electrofortico. Concentracin de L para 35 g Amortiguador de Estndar protena muestra (l) (g/L) 23 L 7L
Adicin de muestras y corrida 16. Aplicar las muestras en los pozos del gel concentrador en el orden en el que se obtuvieron las fracciones y colocando al final el estndar, PREGUNTAR A SU PROFESOR LOS PESOS MOLECULARES DE LOS ESTNDARES (Figura 2.6).
Figura 2.6 Aplicacin de las muestras en los carriles de un gel de poliacrilamida-SDS. Figura 2.5. Pasos a seguir para la preparacin de un gel de poliacrilamida-SDS. Preparacin de muestras 13. Ya que conoces los g protena/L, calcular cul es el volumen necesario para tener 25 g de protena. Con los datos llenar la tabla 2.6. 14. Descongelar las muestras y colocar el volumen que se calcul en un tubo de microfuga y a ese volumen aadirle un volumen igual de amortiguador de muestra. Es recomendable tambin, si los volmenes resultantes son muy diferentes entre muestra y muestra, que al aadir el volumen de amortiguador de muestra ajustemos todos a un volumen similar total. 17. Iniciar la electroforesis de 10 a 15 mA hasta que el frente haya entrado en el gel separador. Despus incrementar el amperaje a 25 mA, siempre y cuando no se caliente el gel. 18. Terminar la corrida una vez que el frente haya alcanzado el borde inferior del el o segn se desee. 19. Enseguida el gel se desprende de las placas y se realiza la tincin depositando el gel en una charola que contenga solucin teidora y colocando la bandeja en agitacin constante. 20. Decantar la solucin teidora, lavar el exceso con H2O destilada y aadir la solucin desteidora. Poner a agitar suavemente.
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21. Tomar una foto al gel teido. 22. De acuerdo a los resultados sealar el o los pasos de purificacin en donde se produjo el mayor enriquecimiento en la protena de inters, la lactato deshidrogenasa. Cuestionario 1. Con la informacin de los pesos moleculares utilizados en la electroforesis, realizar la curva de log. movilidad electrofortica (Rf) vs log. peso molecular. 2. Determinar el Rf en el que se espera se encuentre la lactato deshidrogenasa. 3. De acuerdo a la anterior informacin seale en la foto del gel en donde se localizara la LDH. 4. En cul de los pasos se obtuvo una mayor cantidad de LDH. 5. Cul de los dos mtodos de purificacin cromatogrfica produce una mayor cantidad de LDH, la cromatografa de afinidad o la de intercambio inico. 6. Usualmente, en una purificacin se utilizan la cromatografa de intercambio inico y la de afinidad como pasos secuenciales, una despus de otra, pero por costos hemos utilizado slo una de ellas. Predice con los resultados que obtuvo t equipo y los otros equipos cul sera el resultado si primero realizan la cromatografa de intercambio catinico y luego la de cromatografa de afinidad. 7. Qu cantidad de protena enriquecida en LDH se obtuvo en la fraccin purificada de t columna 8. Cuntos contaminantes se tienen en la mezcla de protenas obtenida en el proceso cromatogrfico final? 9. Elabora un esquema de purificacin para la protena malato sintasa, utilizando semillas de girasol. A) Busca cual es la funcin de la protena B) En que material biolgico se encuentra C) En que compartimento subcelular se encuentra D) Busca la informacin estructural y/o fisicoqumica de la protena. E) Diagrama de flujo del protocolo de purificacin propuesto, indicando en cada paso en donde se queda t protena. Referencias Bradley JSCO, Markwell J. 2007. Assay for determination of protein concentration. Current protocols in protein science 3.4.1-3.4.29. Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Cuarta edicin. 1997. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 69-85. Localizacin QP514.T4 Reiner W. 2005. Gel electrophoresis. John Wiley & sons, Ltd. www.els.net Voet D, Voet JG. Biochemistry. Segunda edicin. 1995. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 71-104 Problemas resueltos de purificacin de protenas http://depa.pquim.unam.mx/proteinas/webprobs/solucion.html
3. ACTIVIDAD ENZIMTICA PARTE I: CURVAS TEMPORALES DE ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LA LACTATO DESHIDROGENASA DE MSCULO ESQUELTICO DE BOVINO.
Objetivos - Conocer las caractersticas generales de las enzimas como catalizadores biolgicos. - Adquirir la habilidad para medir la actividad de una enzima utilizando un mtodo espectrofotomtrico. - Relacionar los distintos parmetros asociados a la medicin de la actividad enzimtica que permiten seguir y evaluar la purificacin de una enzima (actividad especfica, rendimiento y grado de pureza o enriquecimiento). Introduccin Las enzimas son catalizadores proteicos que aceleran la velocidad de una reaccin y no se consumen o modifican durante sta. Sin su presencia, muchas de las reacciones bioqumicas celulares no podran proceder a la velocidad requerida. El incremento en la velocidad de la reaccin se encuentra entre 106 a 1012 veces con respecto a la reaccin en ausencia del catalizador. Otra propiedad de las enzimas es su alto grado de especificidad; solamente catalizan la reaccin en la que participa un sustrato (especificidad absoluta) o un grupo de sustratos con ciertas caractersticas qumicas y geomtricas comunes (especificidad de grupo). La enzima, al ser una protena, tiene una estructura geomtrica caracterstica y la porcin de la enzima que especficamente une o reacciona con el sustrato se denomina centro cataltico o sitio activo. Para muchas enzimas sus residuos de aminocidos son suficientes para efectuar la catlisis, para otras es necesario que exista un cofactor, ya que en ausencia de ste no se cataliza la reaccin. El cofactor es un in metlico como el Fe2+, Zn2+, Mo2+. Para otras reacciones se necesita una coenzima, es decir una molcula orgnica con caractersticas no proteicas, que generalmente se sintetiza a partir de vitaminas. La coenzima funciona como un cosustrato cuando se une transitoriamente al sitio activo de la enzima, de tal forma que se libera al medio durante cada ciclo cataltico. ste es el caso de las deshidrogenasas que trabajan con el NAD+, como la enzima que nos ocupar en sta seccin experimental. Cuando la coenzima se une fuertemente a la enzima, ya sea por medio de enlaces covalentes o interacciones no covalentes, se le da el nombre de grupo prosttico. Diseo de un ensayo enzimtico Durante el aislamiento y purificacin de una enzima, es necesario realizar un ensayo para determinar la cantidad y pureza de la enzima, as como evaluar sus caractersticas cinticas. Para el diseo de un ensayo enzimtico se requiere conocer la reaccin que se analiza, es decir: A) cuales son las especies que se requieren (sustrato, la o las coenzimas, el o los cofactores, entre otros); B) la estequiometra completa, y C) los efectos del pH, temperatura y fuerza inica sobre la actividad de la enzima. Adicionalmente a lo anterior, debe de estar disponible un mtodo para identificar y monitorear cualquier cambio fsico, qumico o biolgico que ocurre durante la conversin del sustrato a producto. Se pueden utilizar distintas tcnicas para determinar los cambios en las concentraciones de sustrato o producto como la espectrofotometra, la fluorometra, la titulacin cido-base y el conteo radiactivo. La eleccin de alguna de ellas depende esencialmente de las caractersticas estructurales del sustrato y/o producto, as como de la qumica de la reaccin.
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Material y equipo Celdas de plstico Tubos de microfuga Parafilm 1 Recipiente para hielo 1 Micropipeta de 200-1000 L 1 Micropipeta de 20-200 L 1 Micropipeta de 2-10 L 1 caja de puntas de 1000 L para micropipeta 1 caja de puntas de 200 L para micropipeta 1 Vrtex Espectrofotmetro (por grupo)
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Si un ensayo enzimtico involucra el seguimiento de la concentracin del sustrato o producto durante un intervalo de tiempo, el ensayo se denomina cintico. Por otro lado, cuando se realiza la determinacin de la concentracin del sustrato o producto a un solo tiempo, se denomina ensayo a tiempo fijo. En lo posible se recomienda realizar ensayos temporales de reaccin, ya que cualquier desviacin de la linealidad puede detectarse inmediatamente. Los cambios en la linealidad de la reaccin pueden deberse a una o varias causas, el decremento en la concentracin de sustrato, la desnaturalizacin de la enzima y a la inhibicin causada por el producto de la reaccin. Pero, hay que aclarar que la velocidad inicial de una reaccin ocurre en los primeros minutos de la reaccin, una relacin lineal que se mantiene cuando el consumo de sustrato no va ms all del 5% de la concentracin inicial. Por tanto, cuando se realiza un estudio sobre la actividad enzimtica, es fundamental que las velocidades que se obtengan sean las iniciales. Lactato deshidrogenasa de mamfero. El nombre cientfico de la lactato deshidrogenasa o LDH es L-lactato: NAD+ oxidoreductasa (EC 1.1.1.27). Es una enzima importante en el metabolismo anaerobio de la glucosa para la regeneracin del ATP. La actividad de la LDH es alta durante la actividad fsica intensa, cuando la tensin de oxgeno disminuye y la demanda de ATP es alta. Bajo condiciones aerobias, la enzima cataliza de manera reversible la conversin de lactato a piruvato (Figura 3.1). Pero lo contrario ocurre cuando disminuye el O2 celular o bien el pH es cercano a 7.0, entonces el piruvato es convertido a lactato con la concomitante conversin de NADH a NAD+. La regeneracin del NAD+ permite que el flujo de la va glucoltica contine. La actividad de la enzima decrece en el sentido de Piruvato Lactato cuando la demanda de energa cesa o hasta que los niveles de lactato llegan a ser altos e intolerables.
Reactivos 1 M Amortiguador de fosfatos pH 7.0 10 mM Piruvato de sodio 4 mM NADH. Reactivo que debe de disolverse justo antes de usarlo, puede usarse el amortiguador de fosfatos para su disolucin. Verificar que la absorbancia a 340 nm sea mayor de 1.0, si no es as volver a pesar y medir. El NADH no se puede almacenar disuelto, por lo que al final la sesin experimental se desecha el reactivo. Desarrollo experimental. Curvas temporales de actividad de lactato deshidrogenasa. Se sugiere que todos los equipos midan primero la curva temporal de actividad a la fraccin 3, que es la fraccin que usarn para obtener los parmetros cinticos de la enzima. Para obtener las curvas de actividad se determinar la dilucin ptima de enzima para realizar los ensayos. Una vez que concluyan con esa fraccin y dependiendo del tiempo que hayan consumido de la sesin, realizar posteriormente las curvas temporales de actividad a la fraccin 1 y/o la fraccin purificada A o B. Las mezclas de reaccin se realizarn directamente en las celdas de plstico. Se usar agua para ajustar a 0 el espectrofotmetro. 1. Descongelar la protena y mantenerla a 4C en un recipiente con hielo. Hacer una primera dilucin de la fraccin 3, se recomienda 1:50. 2. Se etiquetan 5 celdas. 3. A cada una de las celdas se les aadirn los siguientes componentes: 515 L 100 mM Amortiguador de fosfatos 29.3 L 10 mM Piruvato 210.7 L H2O 4. Todas las celdas se mantienen en el hielo. Adicionar a una de la celdas 50 L de 4 mM NADH e inmediatamente agregar 10 L de la muestra de enzima diluida o la cantidad indicada por los profesores. 5. Se tapa la celda con parafilm y se agita por inversin dos veces y se lee inmediatamente la absorbancia a una longitud de onda de 340 nm. Consideraciones: si la primera absorbancia leda una vez que se aadi enzima es menor de 0.4 es posible que la actividad de la enzima sea muy alta, por lo que se recomienda repetir el ensayo en una de las celdas ya preparadas y hacer una dilucin mayor de la enzima, si no hay cambio en la absorbancia entonces diluir menos la muestra.
Figura 3.1. Reaccin que cataliza la lactato deshidrogenasa. La reduccin del piruvato para formar lactato es reversible y dependiente de la presencia de una coenzima.
La LDH es un tetrmero de subunidades con un peso molecular de 35 kDa cada una. Hay dos tipos de subunidades, la H que predomina en el corazn y la M que predomina en el msculo y el hgado. Las subunidades se pueden asociar formando 5 tipos de tetrmeros con estequiometras distintas: H4, H3M1, H2M2, H1M3 y M4. Todos estos tienen actividad de LDH, pero tienen diferentes afinidades por el lactato o el piruvato. Las enzimas que catalizan la misma reaccin pero difieren en su estructura son llamadas isoenzimas. En la prctica se determinar la actividad de la LDH de msculo esqueltico de bovino, enzima que contiene casi exclusivamente subunidades M, esto es la isoenzima M4. En est parte del protocolo se medir a diferentes tiempos la reaccin en el sentido de Piruvato Lactato, utilizando como fuente de enzima las fracciones que fueron obtenidas durante el protocolo de purificacin de la LDH de la seccin II del manual. El ensayo de actividad est basado en la deteccin del cambio de absorcin del NADH y el NAD+. El NADH es una molcula que absorbe a 340 nm, mientras que el NAD+ no. Entonces, la actividad de la enzima en las muestras se detectar como una disminucin en la absorbancia a 340 nm, debido a que en la reaccin el NADH es convertido a su forma oxidada, el NAD+. Material biolgico. Fracciones obtenidas durante la purificacin de la LDH (seccin 2 del manual)
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6. Los valores de la absorbancia se registran cada 30 segundos durante 5 minutos (Tabla 3.1). El ensayo de actividad se realizar a temperatura ambiente, por lo que una vez adicionada la enzima hay que mantener la celda dentro del espectrofotmetro.
inicial. Para la obtencin del rendimiento se considera que el 100% es la actividad total recuperada en la fraccin inicial en relacin con la actividad total recuperada en cada paso de purificacin.
Tabla 3.1. Registro de absorbancia de las fracciones obtenidas de la purificacin de protenas. Anotar la fraccin y su dilucin.
Tiempo (min) F3 dilucin F__ dilucin F___ F____ F____ dilucin Dilucin Dilucin F____ Dilucin F____ Dilucin F____ Dilucin F____ Dilucin
Tabla 3.2. Tabla de purificacin de la LDH de msculo esqueltico de bovino.

Procedimiento Protena total en la fraccin (mg) Actividad total mmolmin1 Actividad enzimtica especfica (mmol min-1mg-1) Veces de purificacin 1 Rendimiento
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0
Homogeneizado (F1 o F0) Sobrenadante de la precipitacin con sulfato de amonio 45% (F2) Botn obtenido de la pp con sulfato de amonio 70% (F3) Primera Fraccin que sali de la cromatografa* (FPA) Segunda Fraccin que sali de la cromatografa* (FPB)
100
Anotar cual cromatografa se realiz de intercambio inico o de afinidad. 11. Analizar los resultados.
Cuestionario 1. Por qu se us H2O como blanco para calibrar el espectrofotmetro en la prctica? 2. Realiza el anlisis dimensional de la frmula que se propone para calcular la actividad de la enzima. 3. Cules son las diferentes unidades en que se puede reportar la actividad de una enzima? 4. Proponga un protocolo para determinar la actividad de la enzima que no sea el de realizar una curva temporal de aparicin de productos. 5. Analizando los resultados que se encuentran en la tabla 3.1 menciona cual fue el paso en el que la protena se enriqueci ms. Por qu? 6. Al analizar en conjunto los datos obtenidos en la electroforesis y los de actividad en qu pasos de la purificacin se eliminan ms contaminantes?. 7. Cul es la utilidad de realizar una tabla de purificacin en la que se toma en cuenta la actividad de la enzima? Referencias Devlin TM. 1992. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Ed. Wiley- Liss, pp. 135190. Localizacin QP514.2 Kopperschlger G, Kirchberger J. 1996. Methods for separation of lactate dehydrogenases and clinical significance of the enzyme. Journal of chromatography B, 684, 25-49. Mathews C. 1992. Bioqumica, 2da edicin, Ed. McGraw-Hill pp. 398-433. Localizacin QP514.2 Nelson D. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp. 202233. QH345 L43
7. Realizar una grfica de Absorbancia vs Tiempo (minutos) para cada una de las diluciones de cada una de las fracciones y obtener la pendiente de la recta. Se sugiere colocar todas las fracciones en una misma grfica. 8. Para calcular la actividad total de la enzima se utiliza la siguiente ecuacin:
Actividad =
Abs m * Vol . ensayo (mL ) * F min = mmol min 1 M 1 cm 1 * b (cm )
Donde: m: es la pendiente de la recta (Abs/t) en unidades de abs / min : es el coeficiente de extincin molecular para el NADH, 6.22 x 103 M-1 cm-1. b: es la distancia de la celda, que corresponde a 1 cm Vensayo: es el volumen total del ensayo. F: es el factor de dilucin de la protena
9. Con los datos de actividad y los obtenidos en la prctica de purificacin de protenas llena la Tabla 3.2. 10. Recuerda que para obtener el dato de la actividad especfica hay que dividir la actividad total entre los mg totales de protena en la fraccin. Para obtener las veces de purificacin o Grado de pureza se divide la actividad especfica de cada una de las fracciones entre la fraccin
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Pardo-Vzquez JP. Cap 10. Cintica enzimtica. En Bioqumica de Laguna. El Manual Moderno, SA de CV., 2002, pP185 Voet D, Voet JG. 1992. Bioqumica. Ed. Omega S. A. pp. 342-378. Localizacin QP514.2
PARTE II. FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS: EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE SUSTRATO Y DE UN INHIBIDOR.
Objetivos: - Determinar la concentracin de sustrato en la cual la enzima alcanza su velocidad mxima. - Entender el significado de los parmetros cinticos Vmax y Km. - Calcular los parmetros cinticos de la reaccin catalizada por la lactato deshidrogenasa utilizando diferentes grficos de la ecuacin linealizada de Michaelis-Menten. - Determinar el efecto de una inhibidor en la actividad de la lactato deshidrogenasa - Analizar el efecto de un inhibidor sobre los parmetros cinticos de la enzima. Introduccin El trmino cintica enzimtica implica el estudio de la velocidad de una reaccin catalizada por una enzima y los efectos que pueden tener varios factores como los inhibidores. Uno de los principales estudios que se realizan en una enzima es medir el efecto en la velocidad de la reaccin cuando se modifican las concentraciones del sustrato de la enzima y se mantienen constantes la concentracin de enzima, el pH, la fuerza inica del medio, la temperatura, entre otros. Curva de velocidad en funcin de la concentracin de sustrato. Tanto en una reaccin catalizada por una enzima como en una reaccin qumica, se espera que la velocidad de la reaccin de conversin de sustratos a productos, sea directamente proporcional a la concentracin de los reactantes que participan en la reaccin, es decir si se duplica la concentracin de cualquiera de los sustratos la velocidad de la reaccin tambin se duplica. A una reaccin as se denomina reaccin de segundo orden y se representa como una lnea recta con pendiente positiva y diferente de cero. Pero en una reaccin que es catalizada por una enzima, slo a concentraciones bajas del o los sustratos se obtiene una reaccin de segundo orden. A concentraciones altas de sustrato la velocidad es independiente de la concentracin de sustrato, debido a que no hay ms enzima que lleve a cabo la reaccin. La reaccin a concentraciones altas de sustrato se llama reaccin de orden cero y tambin se representa como una lnea recta pero con pendiente casi igual a cero. En resumen, en una reaccin catalizada por una enzima la variacin en la concentracin del o los sustratos presenta diferentes rdenes de reaccin. Para un gran nmero de enzimas la grfica que se produce se puede describir mediante la expresin matemtica de una hiprbola rectangular. Como en cualquier expresin matemtica se expresan en ella la relacin entre las variables junto a 1 o ms constantes. El trabajo pionero de Michaelis y Menten y Bringgs y Haldane llev a describir la ecuacin de la hiprbola rectangular, ahora conocida como ecuacin de Michaelis-Menten, con ella es posible predecir el comportamiento de la enzima en condiciones experimentales diferentes. Entonces, la ecuacin se describe as:
la cual la velocidad de la reaccin es la mitad de la velocidad mxima. La Vmax es la velocidad terica mxima de una reaccin. A concentraciones muy altas de sustrato el valor de la velocidad se aproxima al de la velocidad mxima de la reaccin, pero nunca se llega a sta. Los valores de Km y Vmax son caractersticos de una enzima, aunque dependen de las condiciones en las que se llev a cabo la reaccin, ya que hay que recordar que la enzima es una protena que responde modificando su estructura y carga elctrica cuando los componentes de la solucin cambian. Una manera para obtener los valores de Km y Vmax de una enzima tambin llamados parmetros cinticos de una enzima, es graficando los valores de velocidad contra la concentracin de sustrato. Este mtodo tiene la desventaja de que se grafica una curva y no una lnea recta por lo que la interpolacin es difcil. Otra manera, es la de utilizar alguna de las expresiones matemticas que producen una lnea recta como son la de Eadie-Hosftie, la de Hanes o la ms popular la de Lineaweaver-Burk y que es la ecuacin que a continuacin se muestra:
Como se observa en el ejemplo anterior, las formas lineales de la ecuacin de Michaelis-Menten son expresiones matemticas simples y aunque cada una tiene sus problemas de interpretacin son tiles para obtener los valores de Km y Vmax. Una de las formas de regulacin de la actividad de una enzima es a travs de molculas que disminuyen su velocidad de reaccin, inhibidores. Los inhibidores pueden encontrarse de manera natural en las clulas para controlar la velocidad de una reaccin metablica, o bien pueden ser compuestos sintticos que se utilizan como herramientas experimentales para el estudio de las reacciones enzimticas. Muchos compuestos txicos como antibiticos, pesticidas o herbicidas son inhibidores de enzimas que son responsables de reacciones vitales para la clula. La interaccin de un inhibidor y la enzima no es siempre la misma, ya que depende de la naturaleza qumica del inhibidor as como de la reaccin qumica que cataliza la enzima. Para dilucidar el tipo de interaccin entre ambas molculas se recurre a determinar el efecto del inhibidor en las constantes cinticas de la enzima. Inhibidores competitivos. Son molculas que tienen una similitud estructural y qumica al sustrato de la enzima. Debido a lo anterior el inhibidor se puede unir al sitio activo de la enzima. Pero como el inhibidor no es idntico al sustrato, la enzima no es capaz de convertir el inhibidor a producto. El inhibidor simplemente bloquea el sitio activo, por regla no es posible que tanto el inhibidor como el sustrato se encuentren al mismo tiempo en el sitio activo. Si se adiciona ms sustrato y el inhibidor es reversible, el aumento en la concentracin de sustrato reduce la inhibicin. El inhibidor afecta exclusivamente el valor de la Km de la reaccin catalizada por la enzima (Figura 3.2).
v=
V max [s ] Km + [s ]
Donde las dos variables de la ecuacin son la velocidad (v) y la concentracin de sustrato (s). Mientras que las dos constantes son la Km y la Vmax. La Km es llamada la constante de MichaelisMenten. El valor de Km de una enzima para un sustrato especfico es la concentracin del sustrato a
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0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL Figura 3.2. Efecto de los inhibidores sobre los parmetros cinticos de una enzima.
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1 M Amortiguador de fosfatos pH 7.0 10 mM Piruvato de sodio 10 mM Oxamato de sodio 4 mM NADH. Reactivo que debe de disolverse justo antes de usarlo.
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Inhibidor no competitivo. El inhibidor no se une al sitio activo de la enzima sino a un sitio alejado del sitio activo y ocasiona un cambio conformacional en el sitio activo de la enzima. Un inhibidor no competitivo puro es aquel en el que slo se altera la capacidad de unir al sustrato. La mayor parte de los inhibidor son inhibidores mixtos es decir no slo se afecta la unin del sustrato sino tambin la conversin del sustrato a producto. Debido a lo anterior, los inhibidores mixtos alteran tanto el valor de la Vmax como el de la Km de la enzima (Figura 3.2). Inhibidor acompetitivo. Es un inhibidor que no es capaz de unirse a la enzima libre, es decir slo se une al complejo Enzima-Sustrato. Lo anterior puede deberse a que la unin del sustrato expone o crea sitios de acceso o unin para el inhibidor, en el o fuera del sitio activo. Una vez que el inhibidor se une la enzima se previene la formacin de producto. El inhibidor acompetitivo altera tanto la Km como la Vmax de la enzima. Sin embargo, a diferencia de la grfica que se produce con un inhibidor de tipo no competitivo mixto, las curvas a diferentes concentraciones de inhibidor son paralelas en este ltimo. En la prctica se determinarn las constantes cinticas, Km y Vmax, de la lactato deshidrogenasa de msculo de bovino, para la reaccin en el sentido de piruvato a lactato, manteniendo constante la concentracin de enzima, el pH y la temperatura de reaccin. Tambin se determinar el tipo de inhibicin que un cido carboxilico produce en la actividad de la enzima, el oxamato (Figura 3.3) a travs de medir la actividad de la enzima a diferentes concentraciones de sustrato y a una sola concentracin de inhibidor su efecto en las constantes cinticas de la reaccin catalizada por la enzima.
Desarrollo experimental. Efecto de la concentracin de sustrato. 1. Numerar las celdas. 2. En una celda de plstico se adicionan el amortiguador de fosfatos, el agua y el piruvato de acuerdo a lo que se indica en la tabla 3.3. Justo antes de medir se aaden 50 L de NADH 4 mM y 10 L de la muestra de enzima diluida, fraccin 3 obtenida en la prctica de purificacin.
Solucin
Tabla 3.3. Efecto de la concentracin de sustrato. 1 2 3 4 0.06* 515 235.1 4.9 50 10 0.09* 515 232.7 7.3 50 10 0.15* 515 227.8 12.2 50 10 0.25* 515 219.6 20.4 50 10
5 0.36* 515 210.7 29.3 50 10
6 0.5* 515 200 40 50 10
*Concentracin final de piruvato (mM) 100 mM Amortiguador de fosfatos pH 7.0 H2O c.b.p. 815 L (L) 10 mM Piruvato (L) 4 mM NADH (L) ENZIMA (diluida*) (L)
*Usar la dilucin apropiada de enzima, preguntar a su profesor.

3. Tapar la celda con parafilm y agitar 2 veces por inversin. 4. Ajustar el espectrofotmetro con agua y leer la absorbancia de la muestra a una longitud de onda de 340 nm. 5. Los valores de la absorbancia se registran cada 30 segundos durante 5 minutos (Tabla 3.4).
Figura 3.3 Estructuras del piruvato y el inhibidor que se usar en la prctica, el oxamato.
Material biolgico Fraccin 3 obtenida en la prctica de purificacin. Materiales y equipo 10 celdas de plstico Tubos para microfuga 1 Recipiente para hielo 1 Vaso de precipitados de 25 mL 1 Micropipeta de 1000 L 1 Micropipeta de 200 L 1 Micropipeta de 10 L 1 Micropipeta de 50 L Puntas para micropipeta de diferentes capacidades 1 Vortex Parafilm Espectrmetro (por grupo) Reactivos
Tabla 3.4. Lecturas de absorbancia de la actividad de la LDH a diferentes concentraciones de sustrato.

Tiempo (seg) 30 60 90 120 150 180 210 240 270 0.06 0.09 Piruvato (mM) 0.15 0.25 0.36 0.5
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6. Obtener la pendiente y calcular la actividad de manera similar al punto 6 de la prctica anterior. 7. Posteriormente se grafican: A) Actividad vs concentracin de sustrato (grfica de Michaelis-Menten); B) La actividad de acuerdo a la ecuacin de Lineweaver-Burk y C) La curva de acuerdo al mtodo de Hanes-Wolff. 8. Calcular las constantes cinticas Km y Vmax, con los datos obtenidos de los tres grficos anteriores. Efecto de un inhibidor en la actividad de la LDH. Al igual que en la seccin anterior se mide la actividad de la lactato deshidrogenasa a diferentes concentraciones de piruvato, pero ahora se adiciona el oxamato de sodio, compuesto que inhibe la actividad de la LDH (Tabla 3.5).
Tabla 3.5. Registro de absorbancias de la actividad de la LDH en presencia de un inhibidor.

Tiempo (seg) 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 0.06 0.09 Piruvato (mM) + Oxamato 0.35 mM 0.15 0.25 0.36 0.5
Tabla 3.5. Composicin de medio de reaccin para medir el efecto del oxamato en la actividad de la lactato deshidrogenasa.
Solucin *Concentracin final de piruvato (mM) 100 mM Amortiguador de fosfatos pH 7.0 H2O c.b.p. 815L 10 mM Oxamato (L) 10 mM Piruvato (L) 4 mM NADH (L) ENZIMA (diluida) (L) 1 0.06* 515 235.1 27.2 4.9 50 10 2 0.09* 515 232.7 27.2 7.3 50 10 3 0.15* 515 227.8 27.2 12.2 50 10 4 0.25* 515 219.6 27.2 20.4 50 10 5 0.36* 515 210.7 27.2 29.3 50 10 6 0.5* 515 200 27.2 40 50 10
Cuestionario 1. Por qu es importante determinar los valores de Km y Vmax de una enzima? 2. Disea un protocolo diferente al presentado en est seccin para determinar la actividad de la lactato deshidrogenasa. 3. Cul fue el blanco de la reaccin? 4. En que intervalo de concentracin la reaccin de la LDH muestra un comportamiento de primer orden? 5. En que intervalo de concentracin la reaccin de la LDH muestra un comportamiento de orden cero? 6. En que intervalo de concentracin la reaccin de la LDH muestra un comportamiento de orden cero orden mixto? 7. Qu significado tiene? 8. Define Km e indica qu unidades tiene. 9. Define Vmax e indica qu unidades tiene. 10. Qu tipo de inhibidor es el oxamato? Fundamenta tu respuesta. 11. Cules son los inhibidores naturales de la LDH de msculo? 12. En el humano que tejidos contienen LDH? 13. Qu es el ciclo de Cori y como participa la LDH en el ciclo? Referencias Mathews C. 1992. Bioqumica, 2da edicin, Ed. McGraw-Hill pp. 398-433. Localizacin QP514.2 Nelson D. 2004. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp. 202-233. QH345 L43
1. Se adiciona en una celda de plstico los reactivos de acuerdo a los volmenes y el orden que se encuentra en la Tabla 3.5. 2. Los valores de la absorbancia se registran cada 30 segundos durante 5 minutos (Tabla 3.6). 3. Obtener la pendiente y calcula la actividad enzimtica por mg de protena. 4. Realizar los siguientes grficos: A) Actividad vs concentracin de sustrato; B) La grfica de actividad de acuerdo a Lineweaver-Burk y C) La curva de acuerdo al mtodo de Hanes-Wolff. 5. Calcular las constantes cinticas Km y Vmax, con los datos obtenidos de los tres grficos anteriores. 6. Determinar el tipo de inhibicin que oxamato ejerce sobre la LDH.
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Voet D, Voet JG. 1992. Bioqumica. Ed. Omega S.A. pp. 342-378. Localizacin QP514.2
Sitios recomendados para 1. aprender utilizar los conceptos de Km, Vmax http://csm.jmu.edu/biology/courses/bio220/aotw3.html en la pgina pulsar la tecla kinetics_model.xls, despus regresa a la pgina inicial y contesta las preguntas que se te hacen. http://www.mhhe.com/biosci/genbio/biolink/j_explorations/ch07expl.htm NOTAS Y CLCULOS
4. GENTICA DETERMINACIN DEL TIPO DE HERENCIA EN BASE A FRECUENCIAS FENOTPICAS Y GENOTPICAS.

Objetivos: Entender los principios de la transmisin de los caracteres hereditarios. Explicar y usar la terminologa relevante: dominante, recesivo, portador, mutacin, heterocigoto, homocigoto, sndrome, alelo y locus. Resolver problemas aplicando las leyes de Mendel: Determinacin de frecuencias Distinguir entre enfermedades autosomales y ligadas al sexo. Introduccin La descripcin morfolgica o funcional de un organismo vivo en cualquier momento dado de su desarrollo es el fenotipo de ese organismo. Mientras que el genotipo se define como el conjunto de instrucciones o genes, contenidos en su material gentico heredable; es decir, la informacin contenida en las secuencias de su cido desoxirribonucleico (DNA), que se transmite de generacin en generacin entre los miembros de una especie. Este conjunto de instrucciones es una amplsima, pero finita, predeterminacin de las posibilidades fenotpicas de un organismo. Por otro lado, existen los factores epigenticos, tales como las influencias o eventos que no estn escritos en el material gentico heredable de los seres vivos, pero que modifican los fenotipos. Los fenmenos epigenticos como por ejemplo el ambiente, pueden determinar, en un momento dado, el modo en que se expresan las instrucciones genotpicas y por lo tanto, el fenotipo del individuo. Una caracterstica del genotipo es su heredabilidad. Los mecanismos implicados fueron publicados por Gregor Johann Mendel en 1866. l identifico ciertos rasgos fenotpicos que se transmiten de manera predecible en plantas de chcharos y Propuso que estos caracteres estn determinados por factores genticos que segregan independientemente, es decir, que se heredan de padres a hijos en forma de unidades de herencia individuales, los genes. Los estudios de Mendel se basaron realizando cruzas entre individuos de lneas puras que diferan en un par de caracteres de fcil identificacin fenotpica y la observacin del aspecto de la primera generacin hbrida (F1 o primera generacin filial, formada por plantas monohbridas). Posteriormente, cruz las plantas hbridas entre s y obtuvo la segunda generacin filial (F2). Cont el nmero de individuos de la F2, que presentaron cada uno de los caracteres utilizados que podran ser comparados, tales como color de las flores, el color y textura de la testa de las semillas y la longitud de los tallos. Mendel, a partir de sus experimentos, concluy que los chcharos tienen una dotacin gentica doble. Es decir, que son organismos diploides, en los que existen dos copias o alelos del gen causante de un rasgo fenotpico. En los organismos diploides cada copia allica proviene de cada uno de los progenitores. Mendel, tambin postul que, frecuentemente, una de estas copias en particular puede ser dominante sobre su contraparte heredada del otro progenitor. Cuando en la descendencia se encuentra un alelo recesivo del gen y uno dominante, el fenotipo observado en esta combinacin heterocigota, corresponder al tipo dominante. Para la aparicin de un fenotipo recesivo es indispensable la transmisin, por ambos progenitores, de una combinacin homocigota de alelos recesivos. Obviamente, la combinacin homocigota de las variantes allicas dominantes resultar en un fenotipo dominante. Las interpretaciones que Mendel dio a sus observaciones han resultado correctas para un tipo de herencia que hoy llamamos Mendeliana, precisamente por manifestarse de la manera en que Mendel lo descubri. En este caso un rasgo fenotpico est determinado por la combinacin de dos copias allicas de un gen, cada una de ellas en distinto grado de dominancia,
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combinaciones que se heredan en los miembros de una familia en una forma matemticamente predecible. Con los datos que obtuvo, formul una explicacin terica con postulados, que ahora constituyen las leyes de la herencia. La primera Ley de Mendel o Ley de la segregacin dice que durante la formacin de los gametos, los pares de factores se separan o segregan al azar, de manera que cada gameto recibe uno u otro miembro del par con la misma probabilidad. Segunda Ley de Mendel o Ley de la distribucin independiente postula que la segregacin de diferentes pares de factores se realiza de manera independiente durante la formacin de los gametos. Enfermedades genticas y la herencia mendeliana Se cree que cerca de 400 enfermedades en humanos son resultado de cambios en un solo gene. Muchas de ellas son enfermedades raras, pero discapacitantes que pueden llevar a la muerte del individuo. Aunque las enfermedades genticas en un individuo son raras, el nmero total de personas afectadas es significativo, alrededor del 2% de todos los nacimientos al ao. Actualmente no existen medios totalmente efectivos de tratamiento o cura para la mayor parte de ellos. Muchos de los desrdenes genticos pueden ser mantenidos en la poblacin, ya sea por la transmisin de genes desde los padres hacia los hijos o por la aparicin de mutaciones. Los cambios en el DNA o en los cromosomas, mutaciones, pueden provenir desde la formacin de las clulas sexuales (vulos y esperma) o en el estado temprano del desarrollo del feto. Un ejemplo de esto ltimo es la aparicin del sndrome de Down, el cual causa retardo mental, estatura baja y algunos otros cambios. Proviene de un error durante la divisin celular (meiosis) llevando a contener 47 cromosomas en el nio en lugar de 46, generalmente causado por la disyuncin o separacin incompleta del cromosoma de uno de los progenitores (cromosoma 21). Los humanos presentamos clulas diploides en la mayor parte de nuestras clulas. Con un contenido de 23 pares de cromosomas, donde slo un par es diferente entre hombres y mujeres y es el que define el sexo. Las mujeres presentan 2 cromosomas X similares, mientras que los varones un cromosoma X y otro ms pequeo denominado Y. A los genes que se localizan en el par 23 de cromosomas son a menudo denominados genes ligados al sexo, mientras que los otros 22 son denominados genes autosomales. Todas las enfermedades causadas por el cambio de slo un gene tienen patrones claros de herencia, lo cual significa que es posible determinar las probabilidades de que alguien herede una condicin particular. Tres patrones de herencia estn involucrados: Condiciones recesivas, dominantes y ligadas al sexo. Condicin recesiva. Para presentar los sntomas de la enfermedad, el individuo debe presentar las dos copias del gen afectado. Su descendencia presentar la enfermedad slo que el otro padre tambin sea portador del gen, como en la fibrosis qustica (Figura 4.1). Condicin dominante. La enfermedad es causada por un alelo dominante, por lo que un individuo slo tiene que heredar una copia para presentar la enfermedad. Los hijos de padres que presentan la enfermedad, tienen 50% de probabilidades de presentarla tambin. Un ejemplo grave de est condicin es la enfermedad de Huntington, la cual se desarrolla entre los 35 a 45 aos, disminuyendo la movilidad motora y ocasionando demencia. Figura 4.1. Frecuencia fenotpica de la aparicin de la fibrosis qustica cuando ambos padres son portadores (progenitores heterozigos). La fibrosis qustica es una disfuncin o sndrome producido por la alteracin en un gen presente en el cromosoma 7. En este ejemplo, la descendencia de progenitores heterozigotos siempre tendr una distribucin de frecuencias NN=25%, cfcf=25% y Ncf=50%. Condicin ligada al sexo. Debido a que los varones slo poseen un cromosoma X frente a los dos que poseen las mujeres, las enfermedades de un solo gen recesivas localizadas en el cromosoma X, aunque raras, afectan con mayor frecuencia a los hombres que a las mujeres. Como ejemplos tenemos al daltonismo y a la hemofilia. Otro tipo de herencia de gran relevancia mdica es la llamada herencia polignica. Un gran nmero de enfermedades, entre las cuales destacan el asma, la diabetes y la hipertensin, tienen un componente gentico polignico. Se dice que un rasgo fenotpico es polignico cuando est determinado por ms de un gen; mientras que los ejemplos discutidos anteriormente, son casos de herencia monognica. Existen otros tipos de herencia que no siguen las reglas mendelianas. Esto ocurre cuando los genes que causan el fenotipo son mviles, es decir que a diferencia de los genes que siguen una segregacin mendeliana, hay genes que no tienen una residencia o locus fijo en el genoma o cromosoma, lo cual hace imposible predecir su heredabilidad de acuerdo a las leyes de Mendel. Actualmente, se han desarrollado tcnicas para la determinacin de mutaciones o modificaciones en los cromosomas. Sin embargo, slo cubren una gama limitada de alteraciones, por lo que el diagnstico y la prevencin es difcil. Para aqullos en los que hay protocolos de deteccin de si se es o no portador de una enfermedad congnita, es posible orientarlos sobre el tratamiento, las posibilidades de transmitir la enfermedad a sus hijos y las tcnicas de deteccin una vez que se est esperando a un hijo. Material y equipo Computadora conectada a internet, por cada 2 personas. Desarrollo experimental Resolver los problemas interactivos que les entregarn los profesores Cuestionario
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1. Cmo se aplican las Leyes de Mendel a las enfermedades hereditarias en humanos? 2. Cules son las caractersticas principales de la herencia autosmica dominante, autosmica recesiva, recesiva ligada al X y dominante ligada al X? 3. Es posible determinar todas las caractersticas fenotpicas a travs de las reglas de Mendel? 4. Fundamente su respuesta. 5. D un ejemplo de una enfermedad autosmica diferente a las sealas en la introduccin. 6. Proporcione un ejemplo de una enfermedad ligada al sexo diferente a la indicada en la introduccin. 7. Cules son los pasos a seguir para la prevencin o tratamiento si se sospecha ser portador de una enfermedad congnita? 8. Cules son los pasos a seguir si su pareja se encuentra embarazada y usted es portador de una enfermedad congnita? 9. Qu aplicaciones tienen en su prctica profesional o en su vida cotidiana los conceptos adquiridos al realizar esta prctica? Referencias Gardner JE. Garder E. Principios de gentica. 1998, 4a edition Ed. Limusa, pp. 390-407. Localizacin QH581.2 M 65 Garvin W, Adley C, Dixon B, Frings J, Madden D, Marcussen L, Turner J, Wymer PEO. Unit 4. Issues in human genetics. European initiative for biotechnology education 1995. http://www.reading.ac.uk/NCBE
5. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIN DE CIDOS NUCLEICOS TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENTICO I: CONJUGACIN

Objetivos Identificar al DNA como portador de la informacin gentica Conocer los mecanismos por los que una bacteria puede adquirir un plsmido. Reconocer a la conjugacin bacteriana como un fenmeno de transferencia horizontal de material gentico. Entender el mecanismo por el cual se realiza la conjugacin bacteriana. Introduccin Los plsmidos son molculas de DNA extracromosmico, covalentemente cerrados y generalmente, de tamao pequeo que se encuentran en muchas especies bacterianas y que se pueden replicar de manera independiente del DNA cromosmico. A diferencia de ste, los plsmidos no son necesarios para la viabilidad general de la clula, pero pueden contener genes que contribuyen a la sobrevivencia en condiciones especiales, como los que confieren resistencia a antibiticos, a metales, etctera. Algunas clases de plsmidos poseen adems la propiedad conocida como "replicacin relajada", esto es, estn presentes en muchas copias por clula, lo que facilita enormemente su aislamiento y su purificacin. Una bacteria slo puede adquirir un plsmido a partir de otra bacteria que lo contenga, ya sea por transmisin vertical o por cualquiera de los tres mecanismos conocidos de transferencia horizontal de material gentico. Estos son: la transformacin, la transduccin y la conjugacin. En la transformacin, el DNA liberado de una clula bacteriana entra a otra clula, generalmente de la misma especie. En la transduccin, un virus bacteriano accidentalmente toma DNA del cromosoma o de un plsmido de la bacteria a la que ha infectado y lo inyecta a otras bacterias. La conjugacin bacteriana es un proceso de transferencia de material gentico, en el que la informacin gentica de un plsmido con o sin parte del cromosoma bacteriano es transferido a otra clula (Figura 5.1). Este proceso, a diferencia de la transduccin, tiene como condicin esencial el contacto celular. A la clula que aporta el material gentico se le llama donadora y aquella que lo recibe, receptora. No todos los plsmidos pueden llevar a cabo la conjugacin, es decir ser conjugativos, solamente aquellos que poseen un grupo de genes denominados genes tra. Dentro de este grupo de plmidos se encuentra el factor de fertilidad o plsmido F de E. coli. El plsmido F confiere a la clula bacteriana la capacidad de conjugarse con otra clula que no lo posea. El plsmido F se presenta en una sola copia por cromosoma bacteriano. Cuando se integra al cromosoma bacteriano, suprime su sistema de replicacin y se replica como parte del cromosoma bacteriano. El plsmido F contiene ms de 40 genes tra, la mayora de los cuales son necesarios para la construccin de un organelo llamado pili sexual o pili F constituido por una protena, la pilina, codificada por uno de los genes tra. El Pili F es necesario para promover el contacto entre las bacterias donadora y receptora y para la formacin de un puente citoplasmtico por donde pasar el material gentico. La transferencia se inicia a partir de un sitio determinado en el plsmido y que forma parte de los genes tra, denominado oriT
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Material biolgico Un cultivo de E. coli JM1452StrR (cepa receptora), cultivada por una noche en caldo Luria a 37C. Un cultivo de E. coli W3110/FKmTn3 (cepa donadora), cultivada por una noche en caldo Luria a 37C. Materiales y equipo 1 tubo 13 X 100 mm con 1 mL de caldo Luria estril 5 cajas Petri con medio Luria-agar-2% estreptomicina (25 g/ml) 2 cajas Petri con medio Luria-agar-2% sulfato de kanamicina (30 g/ml) 100 palillos de madera estriles 1 asa bacteriolgica 1 propipeta 1 mechero Incubadora a 37C Bao Mara a 37C Refrigerador a 4C Por grupo para controles de las cepas 1 cajas Petri con medio Luria-agar 2%-estreptomicina (25 g/ml) 1 cajas Petri con medio Luria-agar-2% sulfato de kanamicina (30 g/ml) Desarrollo de la prctica 1. En condiciones estriles tomar el tubo de 13X100 con 1 mL de caldo Luria estril y hacer la siguiente mezcla de conjugacin: 0.5 mL del cultivo de E. coli JM1452Str ms 0.2 mL del cultivo E. coli W3110/FKmTn3 (Figura 5.2). 2. Incubar el tubo a 37C SIN AGITACIN durante 30 min. 3. Dividir una caja Petri con medio Luria-agar 2% sulfato de estreptomicina en 3 partes. Marcar la zona 1 como bacteria receptora, la zona 2 como conjugacin y la zona 3 como bacteria donadora. Colocar una gota pequea de cada cultivo en el sitio correspondiente y dejar que se absorba. Nota: Si el profesor lo considera necesario, en lugar de colocar una gota del cultivo se puede sembrar por estra cada cultivo, lo anterior ofrece la ventaja de adelantar un da. 4. Incubar a 37C durante 24 h o hasta que aparezca crecimiento en la zona de conjugacin, refrigerar a 4C. 5. Testigo por grupo: Dividir una caja petri con Luria-agar 2% sulfato de estreptomicina y una caja petri con Luria-agar-2% sulfato de kanamicina. Sembrar por estra las cepas donadora y receptora en cada mitad respectivamente de las cajas. Incubar a 37C durante 24 h. Al observar crecimiento refrigerar las cajas. 6. Despus del tiempo de incubacin trabajar con la caja del paso 3. Si no se sembr por estra en el paso 3 entonces este es el momento de tomar una asada de las zonas receptora y de conjugacin y sembrar por estra en una caja petri con Luria-agar-2% sulfato de estreptomicina, cada una en una caja diferente. Incubar a 37C durante 24 h. 7. De las colonias aisladas, parchar colonias de cada caja en una caja Petri con Luria-agar-2% sulfato de estreptomicina y 50 colonias en otra de Luria-agar 2%-estreptomicina y despus la replica en la caja de Luria-agar-2% sulfato de kanamicina. Parchar consiste en tomar bacterias de una colonia aislada al picar con un palillo la colonia y luego picar una caja de medio de cultivo para as transferir la bacteria. En la prctica una colonia se transferir con el palillo del cultivo de bacterias aisladas a dos diferentes cajas Petri, empezando por la que contiene el antibitico estreptomicina. Para facilitar y agilizar el parchado, marcar divisiones por la parte de atrs de las 4 cajas o bien pegar una hoja cuadriculada en el exterior y por debajo de la caja (ver Figura). 8. Incubar a 37C durante 24 h o hasta que aparezca crecimiento. Observar y analizar los resultados. Reportar el porcentaje de colonias transconjugantes. Refrigerar las cajas.
Figura 5.1. Conjugacin bacteriana. Paso del plsmido F de una clula donadora a una receptora a travs del conducto proteico denominado pili. Al centro se muestra como slo una de las hebras del DNA del plsmido se inserta en la clula hospedera, por lo que la DNA polimerasa de cada una de las bacterias se encarga de sintetizar la hebra faltante. Al final ambas clulas presentan al plsmido F. Algunos plsmidos no son capaces de llevar a cabo la conjugacin por s mismos, pero pueden ser transferidos (plsmidos movilizables) a otras bacterias cuando coexisten con plsmidos con genes tra, debido a que contienen un grupo de genes denominados genes mob, los cuales incluyen un sitio oriT, pero carecen de otros genes necesarios para la conjugacin, incluyendo los que codifican para la formacin del pili. En relacin al plsmido F, existen cuatro tipos de cepas bacterianas: Cepa F-. Clula bacteriana que no posee un plsmido F, y que acta como clula receptora en la conjugacin. Cepa F+. Clula bacteriana que posee un plsmido F independiente del cromosoma bacteriano, acta como clula donadora en la conjugacin y transfiere al plsmido F a la clula receptora transformndola en clula F+. Cepa Hfr (High frequency of recombination). Bacteria que posee un plsmido F integrado a su cromosoma. Las cepas Hfr tienen la capacidad de transferir porciones de su cromosoma (clula donadora) y por ello confieren alta frecuencia de recombinacin. No transfieren el plsmido F, por lo que al trmino de la conjugacin de las clulas receptora permanece como F. Cepa F. Clula bacteriana que posee un plsmido F extracromasmico, pero que antes estuvo integrado al cromosoma y que se encidi llevando consigo genes bacterianos. Acta como clula donadora en la conjugacin y transfiere el factor F junto con los genes bacterianos, transformando a la clula receptora en una clula F, la cual ser un diploide parcial o merocigoto. Es decir, tendr dos copias de los genes bacterianos que estn presentes en el plsmido F. A ese tipo de transferencia se le conoce como sex-duccin. Una bacteria Hfr transfiere los genes bacterianos a una clula F- en un tiempo constante. Se calcula en aproximadamente 100 minutos la transferencia total del cromosoma de Escherichia coli. Esta caracterstica ha sido utilizada en el mapeo gentico localizando un determinado marcador gentico en un tiempo dado. En esta prctica se comprobar la conjugacin bacteriana mediante la transferencia de un marcador gentico, la resistencia a la kanamicina. El marcador gentico de seleccin que se utilizar para la cepa receptora ser la resistencia a la estreptomicina.
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0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL 0.2 mL

Mezcla de conjugacin E. coli W3110/FKmTn3 cepa donadora
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LuriaE. coli JM1452Str cepa receptora
Cuestionario 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Qu es un plsmido? Cules son los mecanismos de transferencia horizontal de material gentico en bacterias? Qu es la conjugacin? Qu diferencia existe entre la conjugacin y los otros mecanismos de transferencia horizontal de material gentico? Cules son las principales caractersticas del plsmido F y qu genes contiene? Cules son los genes del plsmido F necesarios para la transferencia de material gentico por conjugacin y para qu codifican? De acuerdo al plsmido F cuntos tipos de cepas bacterianas se conocen? y qu diferencia existe entre ellas? Seale que tipo de transconjugantes se obtiene en cada una de las siguientes cruzas: a) F+ X Fb) F X Fc) Hfr X FQu caractersticas tiene las cepas empleadas en la prctica? Por qu tanto la cepa donadora como la receptora tienen un marcador de resistencia? Hubo crecimiento de las cepas empleadas en la prctica en las cajas controles con antibiticos? Por qu son importantes estas cajas control? Por qu se parchan la cepa receptora y la transconjugante tanto en medio con estreptomicina como kanamicina? Qu resultados se obtuvieron en esas cajas? Cmo se comprob la conjugacin en la prctica? Qu porcentaje de bacterias transconjugantes se obtuvo? Cul es el genotipo de la cepa transconjugante obtenida en la prctica? Qu diferencias existen entre que un plsmido sea conjugativo o sea movilizable? La conjugacin puede realizarse entre las bacterias Gram positivas o solo se da en las bacterias Gram negativas? Con qu frecuencia y dnde se realiza la conjugacin en forma natural? Cul es la importancia biolgica de la conjugacin? Indique los mecanismos por los que se da la resistencia de las bacterias a los antibiticos utilizados en la prctica. Qu aplicaciones tienen en su prctica profesional o en su vida cotidiana los conceptos adquiridos al realizar esta prctica?
Incubar 30 min a 37C sin agitacin
Luria-Estreptomicina Incubar 24 h, 37C Sembrar por estra las cepas receptora y transconjugante en Agar Luria-estreptomicina (se necesitan colonias aisladas para el siguiente paso) Incubar 24 a 37C 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. Cepa receptora Cepa transconjugante 17. 18. 19. 20.
Parchar 50 colonias
Marcar las cajas
Referencias Brown T.A. Genetics. A Molecular Approach. 2nd ed. Chapman & Hall. USA. 1992. pp 467. Lewin B. Genes V. Oxford University Press. USA. 1994. pp 1272. Gentica General, Manual de prcticas de laboratorio. Regulacin gentica en el opern lac. Facultad de Qumica, UNAM. Ciudad Universitaria. Mxico, 2002.
Luria- Kanamicina
Luria-Estreptomicina
Luria-Estreptomicina
Luria-Kanamicina
Figura 5.2. Esquema experimental de conjugacin bacteriana. Produccin de una cepa transconjugante, a partir de una cepa receptora resistente a estreptomicina, con una cepa que es capaz de proporcionar la informacin gentica para la resistencia a kanamicina. No olvidar realizar hacer los testigos.
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TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENTICO II: TRANSFORMACIN

Objetivos Conocer el fundamento para transformar clulas bacterianas. Realizar la tcnica de transformacin bacteriana. Aprender a identificar clulas transformantes mediante su fenotipo. Conocer la definicin de organismo transgnico. Conocer las aplicaciones de la transformacin bacteriana: beneficios y riesgos. Introduccin Desde pocas antiguas, el hombre ha seleccionado animales y plantas con caractersticas fenotpicas deseables. La domesticacin ha proporcionado importantes beneficios a la humanidad incrementando la produccin de insumos para consumo humano, por ejemplo, hace 100 aos una vaca produca en promedio 2000 a 3000 litros de leche al ao. Actualmente, las vacas Holstein proporcionan un promedio de 6000 litros al ao, y las mejores vacas son capaces de producir de 8000 a 10,000. Asimismo, una gallina hace 100 aos produca en promedio 70 huevos al ao, en este siglo las mejores razas producen cerca de 250 al ao. Las tcnicas convencionales de reproduccin han llevado a nuevas combinaciones de genes. Sin embargo, la recombinacin cruzada entre miembros de especies distintas no ha sido exitosa. Por ejemplo, la cruza entre la yegua y el burro, llev a producir a la mula, organismo estril. As, el nmero de combinaciones nuevas es limitado, debido a que los genes pueden recombinarse slo entre los miembros de la misma especie o con organismos muy relacionados. Las barreras impenetrables entre especies han sido parcialmente superadas con el surgimiento de tcnicas de manipulacin y de seleccin del material gentico, la ingeniera gentica. Debido a que el DNA contiene un cdigo gentico esencialmente similar para todos los organismos, en principio se pueden transferir secuencias de genes de organismos totalmente no relacionados y producir organismos con caractersticas tiles y particulares, que de otra manera sera imposible de obtener, los denominados organismos transgnicos. Un nmero amplio de genes ha sido identificado y caracterizado, conocimiento que abre la posibilidad de buscar mtodos para introducir o modificar un gene para adquirir una caracterstica deseable, como por ejemplo, para curar enfermedades. No obstante los posibles beneficios, hay que considerar que al introducir genes no propios al husped, se pueden ocasionar efectos no deseados, como que la caracterstica introducida lleve a una respuesta general alterada y, por tanto, modifique la fisiologa y sobrevivencia del individuo, o bien que se escape la nueva informacin de manera indiscriminada a otros organismos. Requisitos para construir un vector de clonacin An cuando el cdigo gentico es bsicamente el mismo para todos los organismos, los detalles finos del control gentico difieren. Un gene bacteriano no siempre puede expresarse eficientemente si es introducido en una clula eucarionte. Para la produccin de un organismo genticamente modificado se tienen que hacer algunas consideraciones, producir o construir un transgene, es decir el gene de inters ms una parte extra de DNA que controle correctamente la funcin del gene en el nuevo husped. Por ejemplo, para que un gen procarionte se pueda expresar en un organismo eucarionte se le debe agregar una regin promotora en el extremo 5 del gen para que sea reconocido por el aparato transcripcional del organismo receptor. Asimismo, se debe aadir una secuencia de poli A en la porcin 3 del gen para que el RNAm pueda ser traducido.
Figura 5.3. Vector de clonacin pET-24. Se muestran algunas caractersticas del vector, como el sitio origen de la transcripcin (ori), el sitio de clonacin mltiple (SCM), el sitio que confiere resistencia a kanamicina, KanR; fl ori, origen de replicacin fl y el sitio que servir para controlar la expresin del transgene una vez que sea insertado en el sitio de clonacin mltiple, el sitio de unin al represor lacI.
Los plsmidos poseen un inters singular en la Ingeniera Gentica por ser uno de los sistemas vectores ms sencillos de usar. Un vector de clonacin es un sistema que permite introducir en una clula hospedera un fragmento de DNA que se pretende clonar (obtener mltiples copias); en esta clula hospedera el vector se replica y se expresa. La molcula que resulta de la unin de un DNA vector con el DNA de inters (inserto) se denomina molcula vector recombinante. Para ser utilizado como vector de clonacin, un plsmido ideal debe poseer al menos tres caractersticas (Figura 5.3): 1) Debe tener su propio origen de replicacin y, por tanto, la capacidad de replicacin autnoma e independiente del genoma del hospedero. 2) Debe tener un sitio de clonacin mltiple (SCM) que permita la apertura del DNA con enzimas de restriccin (enzimas que cortan secuencias internas de DNA de manera especfica) y hace posible la clonacin de insertos de DNA en la forma y orientacin deseada. 3) Debe poseer marcadores genticos seleccionables que permitan aislar a las clulas hospederas que contengan al vector, generalmente resistencia a un antibitico. La mayora de los plsmidos naturales no cumplen todas estas condiciones, por lo que una primera tarea de la Ingeniera Gentica ha consistido en la construccin de plsmidos artificiales, combinando en una misma molcula diversos rasgos tiles procedentes de los plsmidos naturales. La presencia en el plsmido del gen de resistencia a ampicilina, kanamicina o tetracilina permite seleccionar las bacterias que portan estos plsmidos, gracias a su capacidad para crecer en presencia de dicho antibitico. Adicionalmente, hay que considerar que muchos genes se expresan slo bajo ciertas circunstancias metablicas y/o en tejidos especficos, por lo que usualmente es necesario sustituir el promotor del donador por uno que asegure su expresin, denominados promotores fuertes, que tambin pueden ser inducibles bajo ciertas condiciones de crecimiento. Transformacin
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Existen varias tcnicas para la introduccin del transgene en la clula u organismo, como son la microinyeccin, la infeccin de una clula husped con virus que contenga al vector o bacterias. En este ltimo caso Agrobacterium tumefaciens es capaz de infectar a plantas y producir tumores, el factor Ti ocasiona los sntomas. Sin embargo, al removerlos e incluir en ese sitio el transgene, se conduce a la expresin del transgene en la planta. En el caso de la transformacin de bacterias, generalmente se introduce el DNA extrao por microelectroporacin o por choque trmico. En el caso del choque trmico, las bacterias que sern las hospederas son pre-tratadas con agentes que ocasionan el aumento en su permeabilidad membranal como son un aumento en la temperatura, as como de iones que se encargan de cambiar la carga elctrica de la membrana al recubrir las cabezas polares de lpidos (por ejemplo con iones Ca2+), lo que disminuye la repulsin de cargas elctricas entre los fosfatos de los nucletidos y la membrana y adems facilita la entrada del plsmido al interior celular. A las clulas que han recibido un tratamiento apropiado para llevar a cabo la introduccin de material gentico se denominan clulas competentes. Posteriormente a la introduccin del material gentico a las clulas competentes, se disminuye la temperatura y se diluye el calcio, con lo que se permite que se restaure la permeabilidad membranal. Al colocarlas en una condicin ptima de crecimiento se obtienen las clulas transformantes. En la prctica utilizaremos el vector recombinante que se muestra en la Figura 5.4, en donde se encuentra insertado el gen de la -lactamasa (transgene). Se realizar la transformacin mediante la tcnica de choque trmico y la resistencia a kanamicina se utilizar como indicador de que las clulas son transformantes.
Material biolgico 1 tubo de microcentrifuga con 100 L clulas competentes de E. coli por grupo mantenerlas congeladas hasta su uso. 1 tubo de microcentrifuga con 100 L clulas competentes de E. coli por equipo mantenerlas congeladas hasta su uso. Plsmido PET-TEM-1. Materiales y equipo 2 cajas Petri con medio LB/Kanamicina (30 g/mL) Tubos de microfuga de 1.5 mL Varilla de vidrio en forma de L Recipiente para hielo Mechero Bunsen Micropipeta de 100-1000L Micropipeta de 10-100 L Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 10 L estriles Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 200 L estriles Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 1000 L estriles Material por grupo Bao de incubacin a 42C Incubadora con agitacin a 37C Reactivos Medio SOC. Medio Luria adicionado con 20 mM Glucosa. 5 mL por grupo. Desarrollo experimental Las clulas competentes se proporcionarn congeladas. En el apndice se encuentra el protocolo de preparacin de las clulas competentes. Preparativos 1. Revisar y/o equilibrar el bao de incubacin a 42C. 2. Colocar el medio SOC a temperatura ambiente. 3. Se sugiere colocar las placas de Agar-LB-Kanamicina en la incubadora a 37C por 30 min antes del plaqueo. Transformacin de clulas competentes con el vector PET-TEM-1 por el mtodo de choque trmico. 1. Tomar un tubo de clulas competentes del congelador y colocarlas directamente en el hielo. Descongelar las clulas competentes en el hielo (las clulas competentes son muy sensibles a los cambios de temperatura). 2. Aadir 1 a 5 L (1 a 50 g) del plsmido a un microtubo que contiene 100 L de clulas competentes. 3. Mezclar invirtiendo el tubo. 4. Dejar en hielo por 30 minutos. 5. Dar choque trmico a 42C durante 45 segundos NO AGITAR. 6. Agregar 450 L de medio SOC e incubar por 60 minutos a 37C con agitacin (225 a 250 rpm). 7. Si es necesario, concentrar las clulas por centrifugacin a 14,000 rpm por 1 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender el paquete celular en 100 L de medio SOC. 8. Esparcir los 100 L de las bacterias transformadas, en las cajas con el medio de seleccin (Agar-LB-kanamicina), ayudados con una varilla de vidrio.
Figura 5.4. Vector recombinante pET-TEM-1-ompA-lactamasa. El vector pET24 (Figura 5.3) fue utilizado para la construccin del vector pET-TEM-1. Adicionalmente se aadi el sitio de restriccin BamHI para entonces insertar el gen que codifica para la -lactamasa (transgene) en el sitio de clonacin mltiple del vector pET24. El transgene, ompA-lac, contiene la secuencia completa de la protena TEM-1 -lactamasa. Adems se coloc hacia la regin 5 del gen, a la secuencia que codifica para la secuencia seal o de trnsito de una protena que se encuentra en la membrana externa de bacterias, en este caso la ompA. A diferencia de la protena OmpA, la -lactamasa es una enzima soluble, por lo que la secuencia seal permitir que la bacteria transformante secrete a la enzima. Recuerda que al transformar a las clulas con el vector pET-TEM-1-ompA-lactamasa pET, la resistencia que confiere a las clulas es a Kanamicina ya que contiene un gene que confiere la resistencia a ese antibitico en particular.
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9. Incubar a 37C por 24 h. Observar crecimiento y guardar la caja a 4C. 10. Como control negativo incubar 100 L de clulas competentes en una caja con LBKanamicina por 24 h a 37C. 11. Calcular la eficiencia de la transformacin para lo cual se necesita conocer la concentracin del DNA usado para la transformacin, el volumen aadido a la mezcla de transformacin, el volumen usado para el plaqueo y el nmero de colonias obtenidas. Cuestionario 1. Qu es un organismo transgnico? 2. Cules son las principales diferencias entre los mtodos de reproduccin asistida y la de produccin de organismos transgnicos para la produccin de organismos mejorados? 3. Cules son las consideraciones ticas que consideras se deben de tomar en cuenta para producir los organismos transgnicos? 4. Qu es un vector de clonacin? 5. Cules son los requisitos que debe cumplir un vector de clonacin para ser utilizado para transformar a un organismo? 6. Da dos ejemplos de tipos de vectores que son usados para la clonacin de fragmentos de DNA de alto peso molecular? 7. Qu tipo de vector de clonacin es el pET24? 8. Cul es el mtodo de transformacin que se utilizar en la prctica? 9. Describe al menos otros dos mtodos para transformar clulas ya sea de animales, hongos o plantas. 10. Cul es el marcador de seleccin de las cepas transformantes y donde se encuentra codificado? 11. Para realizar la transformacin de clulas adems del vector de clonacin se necesitan las clulas receptoras, qu tipo de clulas receptoras son las E. coli DH5 y las clulas E.coli BL21? 12. Despus de obtener un organismo transgnico, cules son los cuidados que se deben tener para su manipulacin o almacenamiento? Referencias Devlin T. Biochemistry. 1992 Ed. Wiley- Liss, pp. 768-773. Localizacin QP514.2 Micklos DA, Freyer GA y Crotty DA. 2003 DNA Science. A first course. 2nd edition. Cold spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, USA. Localizacin QH442. Nelson D. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp. 279317. QH345 L43 Seidman C, Brent R. 1998. Introduction of plasmid DNA into cells. Current protocols in protein science. A.4D.1-A.4D.2. Sosa-Peinado A. Mustafi D, Makinen MW. 2000. Overexpression and biosynthetic deuterium enrichment of TEM-1 beta-lactamase for structural characterization by magnetic resonance methods. Protein Expression & Purification 19: 235-45. Stryer L. Bioquimica, 2004, Ed. Revert, pp.745-773. http://www.colvema.org/PDF/amg1.pdf http://www.revista.unam.mx/vol.1/num3/art3/ http://es.geocities.com/picodelobo/transgenesis.html http://openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes http://www.sciencegateway.org/tools/transform.htm (determinacin de eficiencia de la transformacin)
TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENTICO II: AISLAMIENTO DE PLSMIDOS

Objetivos Conocer los fundamentos para la purificacin del DNA plasmdico y su separacin del DNA genmico. Realizar el aislamiento del DNA plasmdico. Introduccin Desde finales de la dcada de los aos 70 del siglo pasado, se desarroll un gran nmero de mtodos de aislamiento de plsmidos. La mayora tomando en cuenta las diferencias topolgicas entre los plsmidos circulares y los fragmentos cromosomales lineales, as como el tamao de ambos. Cuando los puentes de hidrgeno entre las cadenas complementarias del DNA del plsmido circular se rompen, ya sea por calentamiento o por un pH alcalino, las cadenas permanecen cercanas ya que el enrollamiento de las dos cadenas no se ha perturbado grandemente. En contraste, las cadenas lineales o rotas de DNA se liberan o separan completamente. Si una mezcla de plsmido desnaturalizado y de DNA cromosomal se renaturalizan rpidamente ya sea por enfriamiento o al restaurar el pH neutro de la solucin, la fidelidad de la reasociacin es substancialmente diferente para ambas macromolculas. La renaturalizacin de los plsmidos circulares es rpida debido a que las cadenas estn prximas. Mientras que, las molculas lineales de DNA se renaturalizan menos precisamente, formando redes de DNA o agregados que pueden ser removidos de la suspensin por centrifugacin. El plsmido permanece en la solucin y puede ser precipitado con alcohol despus de que el DNA cromosomal ha sido removido. Material biolgico Clulas de E. coli transformante obtenidas en la prctica anterior. Materiales y equipo Tubos para microfuga Recipiente para hielo Microcentrifuga Micropipeta de 100-1000 L Micropipeta de 20-200 L Micropipeta de 0.5-10 L Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 10 L Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 200 L Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 1000 L Reactivos Tubo de ensayo de 16X150 mm con 5 mL de medio Luria-Kanamicina (30 g/mL) Solucin GTE. 50 mM Glucosa, 25 mM Tris/HCl pH 8.0 y EDTA 10 mM pH 8.0. 3 M Acetato de potasio pH 4.8 70% Etanol Isopropanol 10 N NaOH 10% SDS Para preparar 500 L de solucin de lisis (0.2 N NaOH y 1% SDS p/v), tomar 10 L de 10 N NaOH y 50 L 10% SDS, aforar con agua destilada. De preferencia cada equipo deber hacerla justo antes de usarla. Desarrollo experimental (Figura 5.5)
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Trabajo previo 1. Inocular una colonia de las clulas transformadas en 5 mL de medio Luria que contenga kanamicina a una concentracin de 30 g/mL, e incubar a 37C por 12 h con agitacin horizontal constante. Colocar los tubos de preferencia en forma diagonal para que se agiten bien las clulas y haya buen crecimiento. Obtencin de plsmido por el mtodo de lisis alcalina 2. Tomar la mitad del cultivo y colocarlo en 1 tubo de microfuga de 1.5 mL y centrifugar a 10,000 rpm por 1 min a 4C. Descartar el sobrenadante eliminando totalmente el medio Luria. Repetir este paso en el mismo tubo dos veces ms. 3. Eliminar el sobrenadante por decantacin. 4. Resuspender el paquete celular en 300 L de solucin GTE fra, agitando en el vrtex. Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos, preparar la solucin de lisis durante este tiempo de incubacin. 5. Adicionar 300 L de la solucin de lisis. Mezclar suavemente por inversin del tubo. IMPORTANTE no agitar en el vrtex. Incubar en hielo por 5 min. 6. Agregar 300 L de la solucin fra de acetato de potasio 3 M, pH 4.8 y mezclar suavemente por inversin del tubo. Incubar en hielo por 5 min. 7. Centrifugar a 12,000 rpm durante 5 min a 4C. 8. Colocar el sobrenadante en un tubo limpio y adicionarle un volumen igual de isopropanol fro. 9. Incubar por 20 min a -20C. 10. Centrifugar a 12,000 rpm por 5 min, a 4C. 11. Eliminar el sobrenadante y para lavar el DNA aadir 1 mL de etanol al 70% y centrifugar a 12,000 rpm durante 5 min. 12. Remover el sobrenadante por decantacin y eliminar el etanol residual por evaporacin a temperatura ambiente (aproximadamente 5 a 10 min). 13. Resuspender el DNA en 30 L de agua estril, guardar a 20C. Nota. Se recomienda cuantificar el DNA por su absorbancia a 260 nm. Obtener los g/mL considerando que 1unidad de A260 nm de DNA de doble cadena es igual a 50 g/mL.
Inocular
5 mL Medio LB + Kanamicina
Clulas transformantes
Incubar a 37 0C / agitacin durante 12- 16 h
b. Eliminar el sobrenadante
a. Tomar 1.5 mL del cultivo y centrifugar
Repetir a. y b. en el mismo tubo con el resto del cultivo Eliminar el sobrenadante Resuspender el paquete celular con sol. GTE fra. Agitar e incubar por 1 a 5 min a Tamb Adicionar sol. de lisis
Mezclar por inversin (no agitar). Incubar en hielo mximo 5 min.

Adicionar sol. de acetato de potasio fra
Mezclar por inversin (no agitar). Incubar en hielo mximo 5 min.

Centrifugar y tomar el sobrenadante Adicionar isopropanol (v/v) Incubar en hielo por 20 min y centrifugar.
Aadir etanol al 70%, agitar en vrtex Centrifugar

Eliminar sobrenadante por decantacin y eliminar el etanol residual por evaporacin
Resuspender el DNA en 30 L de agua estril. 5 a 10 uL para la cuantificacin Cuantificar cidos nucleicos (relacin Abs260 nm / Abs 280 nm).
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62 Figura 5.5. Protocolo de obtencin de DNA plasmdico a partir de las clulas transformantes que se obtuvieron en la prctica anterior.
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TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENTICO II:

Cuestionario 1. Cules son las propiedades del DNA plasmdico que nos permiten separarlos del DNA cromosomal o genmico? 2. Explica por qu se usa NaOH y SDS, acetato de potasio y etanol en la purificacin de plsmidos. 3. Cules son los principales contaminantes de una preparacin de plsmidos? 4. Cmo los eliminas? 5. Cules son los usos que se le dan a los plsmidos una vez purificados? 6. Cules son los mtodos utilizados para cuantificar a los cidos nucleicos? 7. Qu experimento realizaras para determinar si el plsmido que obtuviste se encuentra puro? 8. Porqu a veces es necesario utilizar RNAasa para visualizar el DNA plasmdico? 9. Busca el factor de conversin de pares de bases a nmero de aminocidos y de nmero de aminocidos a peso molecular de protena en kDa. Referencias Tmmler B y Mekus F. Genomic DNA: Purification. Encyclopedia of life sciences & 2005, John Wiley & Sons, Ltd. www.els.net. Stryer L. Bioquimica, 2004, Ed.Revert, pp.745-773. Watson JD, Gilman M, Witkowski JA, Zoller M. Recombinant DNA. Segunda edicin, WH Freeman.
ENSAYOS DE RESTRICCIN DE PLSMIDO.

Objetivos Conocer el principio de separacin y deteccin de cidos nucleicos en geles de agarosa. Emplear la electroforesis en geles de agarosa para visualizar cidos nucleicos. Determinar el tamao de fragmentos de cidos nucleicos separados en geles de agarosa. Conocer la utilidad de las enzimas de restriccin en la transformacin gentica y la biotecnologa. Introduccin Las endonucleasas de restriccin se caracterizan por su habilidad de reconocer una secuencia usualmente de 4 a 6 pares de bases (pb) y cortarla especficamente en ambas cadenas de la molcula de DNA. Existen tres tipos de endonucleasas, las de tipo II son las que se utilizan en biologa molecular, debido a que son capaces de cortar sobre la secuencia que reconocen y a que han perdido su capacidad de ser metilasas de DNA. Las endonucleasas se denominan enzimas de restriccin, debido a que es la forma de defensa de las bacterias contra la invasin por bacteriofagos, es decir, restringen la invasin por el DNA viral. Las enzimas de restriccin generalmente reconocen secuencias palindrmicas, es decir segmentos de DNA que se leen igual de derecha a izquierda que de izquierda a derecha. Algunas enzimas de restriccin (EcoRI, HindIII) rompen las dos cadenas del DNA en posiciones no simtricas del centro del palndrome y producen fragmentos con secuencias complementarias de una cadena, denominados extremos cohesivos. Mientras que otras enzimas (HaeIII) cortan exactamente sobre los dos ejes de simetra, produciendo extremos romos (Figura 5.6).
EcoRI
HindIII
HaeIII
Figura 5.6. Dos diferentes formas de corte de las enzimas de restriccin en una secuencia de DNA. Las dos primeras enzimas EcoRI y HindIII producen extremos cohesivos al cortar la secuencia que se muestra y en el ltimo ejemplo, HaeIII produce fragmentos de DNA con extremos romos. Las primeras 3 letras de la enzima se refieren a las iniciales del gnero y especie de la bacteria de donde se aisl y se escribe en itlicas. Por ejemplo, EcoRI se refiere a que la enzima proviene de Escherichia coli. Las enzimas de restriccin son una herramienta experimental muy importante en el desarrollo de las tcnicas para el anlisis y la manipulacin de los cidos nucleicos. Han sido utilizadas en la eliminacin de secuencias genmicas desde un nucletido hasta cientos de bases, as como en la introduccin de secuencias distintas a un genoma, lo que ha permitido la produccin de protenas recombinantes. Diferentes factores afectan la reaccin de restriccin por endonucleasas. Se inhiben usualmente con los contaminantes que se pueden encontrar en las preparaciones de DNA, tales como otras protenas, el fenol, el cloroformo, el etanol, el EDTA, el SDS y la alta concentracin de sales. Los
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Transiluminador Pantalla de acrlico Cmara fotogrfica
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efectos de la contaminacin pueden disminuir si se aumenta la cantidad de enzima aadida a la reaccin, arriba de 10 a 20 U /g DNA, incrementando el volumen de reaccin, lo que diluye a los inhibidores potenciales, o aumentando la duracin de la incubacin. La digestin del DNA genmico puede facilitarse por la adicin de policationes como espermidina, la cual acta uniendo contaminantes cargados negativamente. Cuando un plsmido est superenrollado es necesario aadir ms enzima o bien desnaturalizarlo. El tratamiento de una molcula de DNA con enzimas de restriccin permite producir fragmentos definidos que pueden ser separados mediante electroforesis horizontal. En soluciones alcalinas, los fosfatos de los nucletidos se encuentran cargados negativamente, entonces al imponer un campo elctrico, estas molculas migran hacia el electrodo positivo o nodo. Cuando la migracin toma lugar en un gel, las molculas de DNA se separan de acuerdo a su tamao, en donde las molculas pequeas se mueven ms rpidamente a travs del poro del gel que las ms grandes. Generalmente, un segmento de DNA contiene secuencias blanco para varias enzimas de restriccin. Si un fragmento de DNA a analizar es lo suficientemente extenso, se puede cortar con una o varias enzimas de restriccin, de manera individual o en mezclas. Un diagrama de una molcula de DNA en donde se muestran los sitios de corte de las enzimas de restriccin se denomina mapa de restriccin. El anlisis de los mapas de restriccin constituyen una importante herramienta para localizar secuencias de bases especficas en un cromosoma y para estimar el grado de diferencias entre cromosomas relacionados. Existen varias aplicaciones de los mapas de restriccin, como la obtencin de los patrones de RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) utilizados en las pruebas de paternidad, as como tambin en la identificacin de individuos a partir de evidencias forenses como saliva, sangre, semen, cabellos etc. En la prctica se utilizarn dos enzimas de restriccin en una mezcla, debido a que el vector utilizado en la transformacin no presenta dos sitios de restriccin para la misma enzima (Figuras 5.3 y 5.4). De tal manera que slo se podr liberar el fragmento de DNA de inters al cortar por los extremos con dos enzimas distintas. Material biolgico DNA plasmdico purificado de la prctica anterior. Materiales y equipo Recipiente para hielo Tubos para microfuga Gradilla para tubos de microfuga Recipientes para teir el gel. Micropipeta de 100-1000 L Micropipeta de 20-200 L Micropipeta de 0.5-10 L Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 10 L estriles Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 200 L estriles Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 1000 L estriles Cmara de electroforesis horizontal Fuente de poder Vrtex Horno de microondas Microfuga Bao de incubacin a 37C Bao de incubacin o bloque de calentamiento a 100C
Reactivos NdeI. Solicitar al profesor justo antes de usarse. Se almacenan a 20C. BamHI. Solicitar al profesor justo antes de usarse. Se almacenan a 20C. NOTA. Las enzimas de restriccin son muy sensibles a la temperatura mantenerlas en fro durante su manipulacin. Amortiguador TANGO de restriccin. Reactivo que es proporcionado por el proveedor junto con la enzima NdeI. TAE 1X. Ver preparacin en el apndice. Agarosa Amortiguador de muestra Estndar de peso molecular. Proporcionado por el laboratorio, se utilizar de acuerdo a las instrucciones del proveedor. Bromuro de etidio 10 mg/mL (GIBCO BRL) Desarrollo experimental Ensayo de restriccin 1. Etiquetar dos tubos de microfuga. 2. Colocar en cada tubo los siguientes reactivos: 10 L de Plsmido y 1 L de Amortiguador Tango10X 3. Incubar a 100C por 5 min. 4. Transferir al recipiente con hielo e incubar por 5 min. 5. Pasado el tiempo de incubacin aadir al tubo 1 solo una de las dos enzimas de restriccin que fueron proporcionadas, se sugiere que un par de equipos coloque 1 L BamHI y otro par de equipos 1 L NdeI. Mezclar suavemente despus de aadir la enzima. 6. Al tubo 2 aadir 1 L de BamHI y 1L de NdeI. Mezclar suavemente con ligeros golpes al tubo de microfuga. 7. Centrifugar los dos tubos de microfuga por 5 segundos, para que todo el lquido se deposite en el fondo. 8. Incubar a 37C por 1.5 h. 9. Se sugiere aadir 0,5 l de una solucin de RNasa (1 g/ml) e incubar 30 min a 37C. Este procedimiento eliminar el RNA y facilitar la visualizacin de los productos de la restriccin en el gel. Otra opcin para la eliminacin de la RNAasa es aadir 2 l de la solucin de RNA a los 35 mL de gel poco antes de vaciarlo a la cmara de electroforesis. 10. Al trmino de la incubacin colocar los tubos en hielo. 11. Tomar una alcuota de 10 L o todo el volumen de restriccin de cada tubo para correr en un gel de agarosa. Preparacin del gel Durante el tiempo de incubacin del DNA con las enzimas de restriccin, preparar el gel de agarosa, se sugiere utilizar 1 gel por cada 2 equipos y utilizar el peine para hacer 8 pozos o carriles en el gel. Sellar con cinta adhesiva el contorno de la bandeja del gel, colocar el peine (Figura 5.7 A). Preparar un gel de agarosa al 1.2%. Pesar 0.42 g agarosa en un matraz Erlenmeyer, aadir 35 mL de amortiguador TAE 1X, tapar con algodn o una servitoalla. Se calienta la mezcla en microondas por 1 a 3 min o hasta que la agarosa se disuelva bien. Esperar a que la temperatura baje hasta 45-60C, aadir entonces 2 L bromuro de etidio (MANEJAR CON GUANTES, REACTIVO MUTAGNICO) para obtener una concentracin
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final de 0.5 g/mL, agitar el matraz para mezclar. SUGERENCIA, EN LUGAR DE USAR EL BROMURO DE ETIDIO AADIR 1L de Syber-safe 2X por cada 1 mL de Agarosa. Depositar el gel en la bandeja de la cmara (Figura 5.7 B), evitando la formacin de burbujas. Se deja enfriar hasta que polimerice (aproximadamente 20 min). Quitar la cinta adhesiva y colocar la bandeja con el gel en la cmara de electroforesis. Aadir el amortiguador TAE en la cmara. La cmara de electroforesis se llena con aproximadamente 275 mL de TAE 1X o hasta que se cubran los pozos. Figura 5.8. Cargado de la muestras en los pozos del gel de agarosa. 6. 7. Una vez depositadas las muestras, se coloca la tapa con los electrodos (rojo con rojo y negro con negro) y se conecta a la corriente. Aplicar 80 V por 30 a 40 min. Verificar que las muestras migren hacia el lado positivo de la cmara. Al concluir la electroforesis se desconecta el equipo y se retira la bandeja para la observacin de DNA (USAR GUANTES). El gel puede ser inmediatamente colocado sobre una lmpara de luz UV para visualizar las bandas de DNA. La radiacin ultravioleta es peligrosa, usar lentes especiales o colocar una pantalla de acrlico entre el observador y la fuente de luz UV. Tomar la foto del gel. Posteriormente desechar el gel en el recipiente colocado para ese propsito, los geles sern incinerados, junto con los guantes y puntas si estuvieron en contacto con el bromuro de etidio. Utilizando la foto, medir la distancia desde el centro del pozo hasta cada una de las bandas de DNA detectadas. Estimar el tamao aproximado de cada uno de los fragmentos de DNA as como del vector sin restringir, utilizar para ello los valores del estndar de peso molecular que se proporcionaran durante la prctica. Llenar la siguiente tabla 5.2.
8. 9.
Figura 5.7. Preparacin de un gel de agarosa. A. Sellado de la bandeja que contendr el gel y B. Adicin de la agarosa disuelta en TBE.
Preparacin y cargado de las muestras. 1. Etiquetar 4 tubos de microfuga: E, P, R1, R2 2. Aadir los reactivos como se indica en la tabla 5.1. Usar una punta de micropipeta distinta para cada tubo, de esta manera se evita la contaminacin cruzada.
Tabla 5.2. Valores estimados de peso molecular de las bandas de DNA que se detectaron en las muestras analizadas.
Bandas Estndar de DNA Distancia en mm 1 2 3 4 5 6 7 10. Analizar los resultados. Pares de bases Plsmido sin restringir Distancia en mm Pares de bases estimado Plsmido restringido con 1 enzima de restriccin Distancia Pares de en mm bases estimado Plsmido restringido con 2 enzimas de restriccin Distancia Pares de en mm bases estimado
Tabla 5.1. Preparacin de muestras para aplicar en el gel de agarosa. Estndar* Plsmido sin Plsmido digerido Plsmido digerido (E) digerir con una enzima con dos enzimas (P) (R1) (R2) Muestra 10 L 10 L 10 L 1 L DNA-HindIII H2O 9 L Amortiguador de 2 L (Stop Mix) 3 L 3 L 3 L muestra El estndar que se usa en el laboratorio lambda DNA digerido con HindIII puede calentarse a 65C por 10 min para separar las bandas de 23130 y 4361. Los pesos moleculares que deben encontrarse en el carril del estndar son 23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027 y 564 pb. Reactivos
3. 4. Centrifugar por 3 segundos en microfuga, para que se mezcle y deposite el lquido en el fondo. Se retira el peine de la bandeja. Muy importante, los pozos del gel tienen que estar orientados hacia el ctodo, generalmente el electrodo se presenta de color negro. Nota: Procurar colocar la cmara de electroforesis en hielo para evitar que la temperatura se incremente durante la corrida del gel. Se toman los 13 L de cada una de las muestras y se colocan en los pozos como se muestra en la Figura.
Cuestionario 1. Qu parte de la molcula de DNA le confiere la carga negativa? 2. Cul es el papel de cada componente del amortiguador de carga, en particular de los dos colorantes que contiene? 3. A que se le denomina topoismeros? 4. En la prctica se pudieron observar topoismeros? 5. Qu peso molecular tienen los topoismeros?
5.
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6. Qu tipo de extremos producen las enzimas utilizadas en la prctica, romos o cohesivos? 7. Cuntos fragmentos de DNA o restriccin se obtuvieron al utilizar las dos enzimas NdeI y BamH1? 8. Cuntos fragmentos se obtuvieron al utilizar slo una de las enzimas de restriccin? Por qu? 9. Cul fue el peso molecular del DNA liberado y del plsmido o vector? 10. Cules son las aplicaciones de rutina de las enzimas de restriccin? Referencias Devlin T. Biochemistry. 1992 Ed. Wiley- Liss, pp. 768-773. QP514.2 Kenneth D. Digestion of DNA with Restriction Endonucleases. Current Protocols in Protein Science (1998) A.4I.1-A.4I.3. Mitsis P, Exonucleases. Encyclopedia of life sciences 2001, John Wiley & Sons, Ltd. www.els.net. Micklos DA, Freyer GA y Crotty DA. 2003. DNA Science. A first course. 2ndedition. Cold spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, USA. Localizacin QH442 Nelson D. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp. 279317. Localizacin QH345 L43 Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T. 1989. Molecular cloning. A laboratory manual. Cold spring Harbor Laboratory. CSH, New Harbor Laboratory. CSH. New York, USA. Voet y JG Voet. Biochemistry. Energy metabolism: Integration and organ specialization. 2da. Ed. John Willey & Sons, INC. 1995. Pp848-914.
TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENTICO II: INDUCCIN DE PROTENA RECOMBINANTE. Objetivos

Conocer el fundamento de la induccin de la sntesis de protenas recombinantes en E. coli. Realizar la induccin de una protena recombinante (-lactamasa) Obtener la curva temporal de induccin de una protena recombinante. Interpretar el patrn electrofortico de produccin de una protena recombinante Conocer las aplicaciones biotecnolgicas de las protenas recombinantes
Introduccin La necesidad de producir protenas heterlogas o recombinantes para varias aplicaciones cientficas como comerciales ha influido en el desarrollo de diversas herramientas para purificar y manipular protenas. Los sistemas bacterianos han sido los sistemas ms utilizados para este fin, debido a que son fcilmente manipulables genticamente, se propagan en periodos de tiempo corto, son econmicos y se requiere slo un entrenamiento mnimo para su manejo. Adems, muchas de las caractersticas inherentes a los sistemas bacterianos permiten que los sistemas se automaticen en proyectos de produccin a gran escala, donde se requiere la produccin y muestreo de cientos de clonas. A pesar de lo anterior, los sistemas bacterianos tienen sus limitantes, las protenas de eucariotes o las protenas de membrana, generalmente no se expresan o no son funcionales. El carcter qumico del citoplasma de las bacterias y de sus chaperonas, as como las enzimas que se encargan de las modificaciones post-transduccionales son muy diferentes entre los organismos eucariotes. Por ejemplo, los sistemas de expresin de bacterias no glicosilan a las protenas. Otros sistemas de expresin como los sistemas de clulas de mamfero o de insecto o levadura, tienen la capacidad de procesar las protenas eucariotes de manera correcta y son utilizados cuando la funcionalidad de las protenas es crtica, aunque el costo de stos sistemas es considerablemente ms alto y la tecnologa que se necesita es ms complicada. Adicionalmente, la produccin de grandes cantidades de protenas como algunos productos teraputicos, se pueden lograr tanto en plantas como en sistemas animales. Muchas compaas ofrecen una serie de diferentes vectores con capacidades de expresin muy variadas, con o sin protenas de fusin que funcionan como etiquetas para la deteccin y/o purificacin de la protena deseada. La presencia de marcadores selectivos de la cepa transformante y con promotores distintos. Los vectores de expresin como el pET son usados comnmente para la expresin de protenas heterlogas. En los sistemas pET, los plsmidos son clonados bajo las seales de expresin fuerte del bacteriofago T7, la expresin de la protena es inducida cuando la clula hospedera provee una cantidad de RNA polimerasa T7. En unas pocas horas de induccin, la formacin del producto puede llegar a ser ms del 50% de la protena total en la clula. Otro beneficio importante es que en ausencia del inductor la transcripcin del transgene no se lleva a cabo. Adicionalmente, los sistemas pET cuentan con una copia del gen cromosomal de la RNA polimerasa T7 bajo el control del operador de la lactosa, sistema que se estudiar con ms detalle en el siguiente protocolo experimental del curso. Basta mencionar ahora, que para que se exprese la RNA polimerasa T7 y por tanto se lleve a cabo la expresin de nuestra protena de inters, se tiene que introducir lactosa o un anlogo de sta, el ms utilizado es el Isopropil -D tiogalactosido (IPTG), anlogo no hidrolizable de la lactosa que sirve como un inductor artificial o gratuito del opern de la lactosa. La produccin de la protena recombinante en una organismo no relacionado, como se mencion anteriormente, puede llevar a que la protena no sea funcional, ya sea porque no presenta las
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modificaciones postraduccionales necesarias o bien porque adquiri un plegamiento inadecuado. Cuando las protenas se aglomeran formando agregados que slo pueden solubilizarse a travs del uso de soluciones de detergentes, se dice que estn formando cuerpos de inclusin. Una protena que no se encuentra soluble aumenta los costos en su produccin y/o recuperacin. En la prctica se llevar a cabo el monitoreo de la induccin de la -lactamasa, en clulas completas de E. coli transformadas con el vector pET-TEM-1-ompA-lactamasa (Figura 5.4), vector que fue producido a partir del vector pET-24a-d(+) que se mostr en la Figura 5.3. Material biolgico por grupo 1 matraz de 150 mL con 25 mL cultivo lquido saturado de clulas transformadas de E. coli (crecidas por 12 a 16 horas con agitacin vigorosa). Material y equipo 1 mechero 1 recipiente para hielo Tubos para microfuga de 0.5 mL 2 vasos de precipitados 25 mL 1 Pipeta Pasteur con bulbo Recipiente de plstico para la tincin. Micropipeta de 2 a 10 L Micropipeta de 20 a 200 L Micropipeta de 200 a 1000 L 1 caja de puntas de 10 L para micropipeta 1 caja de puntas de 200 L para micropipeta 1 caja de puntas de 1000 L para micropipeta Placas de vidrio Peine Separadores Pinzas para sujetar las placas Cmara para electroforesis Fuente de poder Vrtex Incubadora a 37C con agitacin Cmara fotogrfica Reactivos 1 tubo de 50 mL con 15 mL de medio LB-kanamicina (30 g/mL) 100 mM IPTG Estndar de peso molecular de protenas 8 mL de LB por grupo para ajustar a cero el espectrofotmetro. Desarrollo experimental Induccin de protena recombinante, -lactamasa (Figura 5.8). 1. Tomar 2.5 mL de un cultivo saturado de clulas de E. coli transformadas con el vector PETTEM-1-ompA-lactamasa, y aadirlos a 15 mL de medio LB-kanamicina, tomar una alquota de 1 mL y leerla en el espectrofotmetro a 600 m contra un blanco de medio Luria la absorbancia debe ser menor a 0.3, incubarlos con agitacin vigorosa a 37C (colocarlos en posicin diagonal para que se mezcle bien el medio). El cultivo celular debe llegar a una absorbancia entre 0.6 a 0.8.
2. Para verificar que se lleg a la absorbancia indicada, tomar una alquota de 1 mL y leerla en el espectrofotmetro a 600 m contra un blanco de medio Luria. Si an no llega volver a incubar el matraz con agitacin vigorosa. 3. Al llegar a la absorbancia apropiada, tomar una alcuota a la que llamaremos tiempo 0 (mantener en hielo el tubo de microfuga). 4. 5. Despus agregar el IPTG para tener una concentracin final en el tubo de 0.5 mM. El volumen del medio con clulas puede variar, dependiendo del nmero de alcuotas que se hayan tomado para determinar que la absorbancia corresponde a 0.6-0.8. Hacer el clculo tomando en cuenta el volumen final de medio con clulas. 6. Incubar nuevamente a 37C con agitacin horizontal y tomar alcuotas de 1 mL cada 30 min por 1.5 o 2 h. 7. Guardar todas las alcuotas en tubos de microfuga y a 4C. Preparacin de un gel de poliacrilamida-SDS Durante el tiempo de incubacin e induccin de la protena recombinante, preparar un gel de poliacrilamida-SDS por cada dos equipos, utilizar un peine que genera 10 carriles o pozos. Las instrucciones de elaboracin se encuentran en la seccin II, parte III del manual. Preparacin de las muestras y separacin en un gel de poliacrilamida-SDS 1. Directamente de cada una de las alcuotas que fueron recolectadas se toman 15 L y se mezclan con 10 L de amortiguador de muestra en un tubo de microfuga. Tambin hacer una mezcla apropiada de estndares de peso molecular, se sugiere 7 L de los estndares de peso molecular ms 18 L de amortiguador de muestra. 2. Ensamblar el gel en la cmara de electroforesis. 3. Aplicar las muestras en el gel. 4. Iniciar la electroforesis aplicando una corriente de 10 a 15 mA y hasta que el frente del colorante haya entrado en el gel separador. Despus incrementar el amperaje a 25 mA, siempre y cuando no se caliente el gel. 5. Terminar la corrida una vez que el frente haya alcanzado el borde inferior del gel. 6. Enseguida el gel se desprende de las placas y se realiza la tincin depositando el gel en una charola que contenga solucin teidora y colocando la bandeja en agitacin constante. 7. Decantar la solucin teidora, lavar el exceso con H2O destilada y aadir la solucin desteidora. Poner a agitar suavemente. 8. Tomar la foto del gel. 9. Analizar los resultados. La protena tiene un peso molecular aproximado de 32 kDa si tiene el pptido seal de la protena ompA y de 29 kDa sin pptido seal.
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Cuestionario
1. Qu es una protena recombinante? 2. Por qu el cultivo de clulas debe de llegar a una densidad ptica de 0.6 a 0.8 antes de comenzar el proceso de induccin de la protena recombinante? 3. Cul es la funcin del IPTG? 4. Cul fue el tiempo en el que produjo la mxima cantidad de protena recombinante? 5. Qu otros parmetros se podran modificar para obtener el mayor rendimiento de la protena? 6. Qu son los cuerpos de inclusin? 7. Qu experimento realizaras para determinar si la protena se encuentra en forma soluble o en forma agregada? 8. Qu mtodo propondra para purificar a la protena recombinante obtenida? 9. Describe tres ejemplos de protenas recombinantes que se producen actualmente de manera comercial, explicando sus usos. Referencias Ghrayeb J, Kimura H, Takahara M, Hsiung H, Masui Y, Inouye M. 1984. Secretion cloning vectors in Escherichia coli. The EMBO Journal 3, 2437-2442. Hammlev D, Madden D, Nrby S, Turner J. Unit 2. DNA profiling. European initiative for biotechnology education 1995. http://www.reading.ac.uk/NCBE. LaVallie E. 1995. Production of recombinant proteins in Escherichia coli. Current Protocols in Protein Science 5.1.1-5.1.8. Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T. 1989. Molecular cloning. A laboratory manual. Cold spring Harbor Laboratory. CSH, New Harbor Laboratory. CSH. New York, USA. Sosa-Peinado A. Mustafi D, Makinen MW. 2000. Overexpression and biosynthetic deuterium enrichment of TEM-1 beta-lactamase for structural characterization by magnetic resonance methods. Protein Expression & Purification 19: 235-45. Voet y JG Voet. Biochemistry. Energy metabolism: Integration and organ specialization. 2da. Ed. John Willey & Sons, INC. 1995. Pp906-914.
Figura 5.8. Proceso de induccin de protena recombinante en E. coli.
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6. REGULACIN DEL METABOLISMO PARTE I: REGULACIN GENTICA EN EL OPERN lac

Objetivos - Comprender la importancia de la regulacin gentica como mecanismo para controlar los niveles de enzimas en la clula. - Conocer los elementos que integran el opern de la lactosa. - Entender el funcionamiento del opern de la lactosa en presencia y ausencia de este carbohidrato. - Conocer el concepto de represin catablica y cmo se lleva a cabo. Introduccin La regulacin metablica es el incremento o el decremento de una reaccin enzimtica o de toda una secuencia de reacciones enzimticas de las rutas metablicas. Esto surge de la necesidad de la clula de estar en equilibrio normal, distinto al equilibrio que tiene en un estado de enfermedad. La clula logra el equilibrio entre sus reacciones enzimticas, a travs, principalmente, de la modificacin de la actividad simultnea de sus enzimas presentes. Dado que el nmero de enzimas es alto, lo logra a travs de algunos mecanismos globales de regulacin metablica. Una de las modalidades de regulacin es la que involucra la expresin diferencial en aumento o disminucin de la concentracin de enzima, la regulacin de la expresin gentica. El DNA de una clula puede contener miles de genes dependiendo de su complejidad. Sin embargo, slo una parte de esta conformacin gentica es requerida por la clula en todo momento (expresin constitutiva). Adems, existen genes con una funcin ms especializada y cuya participacin slo es requerida por la clula bajo ciertas circunstancias. Por ello, todos los organismos son capaces de regular la expresin de sus genes. En el caso de las bacterias, la regulacin de la expresin gentica les permite responder metablicamente a los cambios en su ambiente de manera rpida y precisa. Las bases de nuestro entendimiento sobre la regulacin de la expresin gnica en bacterias fueron propuestas por Francois Jacob y Jacques Monod en 1961. Ambos, junto con Andr Lwoff, compartieron el Premio Nobel de 1965 por su teora del opern. El opern de la lactosa est formado por los genes estructurales lacZ, lacY y lacA, que codifican para las enzimas -galactosidasa, permeasa y transcetilasa respectivamente. Todos ellos se transcriben en una molcula de RNA mensajero (RNA policistrnico), a partir de un promotor localizado ro arriba de lacZ. Tambin descubrieron el gen lacI, que no se encuentra adyacente al opern, pero cuyo producto proteico es un represor que se une al operador, localizado entre el promotor y lacZ. De hecho, el operador y el promotor estn traslapados, de manera que cuando el represor esta unido al operador la RNA polimerasa no puede unirse al promotor y por lo tanto no hay transcripcin de los genes estructurales. Cuando hay lactosa presente, la bacteria toma unas pocas molculas de ellas y las convierte en alolactosa que es capaz de unirse al represor, impidiendo que ste se
pegue al operador. La subsecuente unin de la RNA polimerasa al promotor ocasiona la transcripcin de los genes estructurales y la posterior traduccin en las enzimas necesarias para la utilizacin de la lactosa como fuente de carbono y energa. Cuando se termina la lactosa, el represor se vuelve a unir al operador bloqueando la expresin de los genes estructurales. La presencia o ausencia de la lactosa no es el nico factor que influye sobre la expresin del opern de la lactosa. Si la clula tiene una fuente de glucosa suficiente para sus requerimientos energticos, no necesita metabolizar lactosa an cuando est presente. El proceso por el cual esto ocurre se denomina represin catablica e involucra una segunda protena reguladora, CAP (protena activadora de catabolito), y un segundo sitio de unin, el sitio CAP, adyacente al promotor. La CAP se une al sitio CAP slo en presencia de AMP cclico (AMPc), un nucletido modificado derivado del ATP por la adenilato ciclasa. La cantidad de AMPc en la clula depende de la concentracin de glucosa, y por ende de ATP, que inhibe a la adenilato ciclasa. Si los niveles de glucosa son altos (nivel de ATP alto) hay poco AMPc y si son bajos hay mucho AMPc (niveles de ATP bajos). Al controlar la cantidad de AMPc en la clula, la glucosa indirectamente regula la unin del complejo CAPAMPc al sitio CAP. Esto es muy importante porque cuando el complejo CAP-AMPc est unido, se estimula la unin de la RNA polimerasa al promotor (regulacin positiva), lo que ocasiona la transcripcin de los genes estructurales del opern de lactosa. Material biolgico Cultivo de E. coli W3110 en medio M9-glicerol. Material y equipo de laboratorio 5 Tubos para microfuga de 1.5 mL (estriles) 1 gradilla para microtubos 1 mechero 1 Micropipeta con capacidad de 200-1000 L 1 Micropipeta con capacidad de 50-200 L 1 Micropipeta con capacidad de 10 a 50 L 1 Caja de puntas para micropipeta de 200 L 1 Caja de puntas para micropipeta de 1000 L Centrfuga clnica Incubadora a 37C Reactivos 1 tubo con medio M9-glicerol estril Solucin de glucosa al 2% estril Solucin de lactosa al 2% estril Solucin de glucosa 2% + lactosa 2% estril Amortiguador Z (Na2HPO4-7H2O 60 mM, NaH2PO4-H2O 40 mM, KCl 10 mM, MgSO4-7H2O 1mM, -mercaptoetanol 50 mM, pH 7.0). Reactivo ONPG (Orto-Nitrofenil Galactosa). El reactivo es incoloro y debe prepararse justo antes de usarse para mejores resultados. SDS al 0.1% Na2CO3 1M Cloroformo
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Desarrollo de la prctica (Figura 6.1) Slo los pasos 1 al 4 requieren condiciones de esterilidad. 1. Coloca 1 mL del cultivo de E.coli W3110 en cada uno de los 4 microtubos estriles y rotlalos de la A a la D. El tubo E no contendr clulas pero si 1 mL de medio M9-glicerol como E (blanco). 2. Aadir a cada tubo lo siguiente: Tubo A 250 L de glucosa 2% Tubo B 250 L de lactosa 2% Tubo C 250 L de glucosa 2% + lactosa 2% Tubo D 250 L de glucosa 2% Tubo E 250 L de glucosa 2% + lactosa 2% 3. Incubar los tubos a 37C con agitacin ocasional. A los 7.5 minutos de incubacin aadir, nicamente al tubo D, 250 L de lactosa 2% y reintegrarlo a la incubadora a 37C. 4. Cuando hayan transcurrido 15 minutos de incubacin, centrifugar los microtubos en la Microfuga durante a 10,000 rpm 1 minuto.. 5. Decantar y resuspender cada paquete celular en 250 L de amortiguador Z. 6. Aadir a cada tubo 25 L de cloroformo y 12.5 L de SDS 0.1%. Agitar durante 10 segundos. 7. Aadir a cada tubo 50 L de reactivo ONPG y agitar. 8. Incubar a temperatura ambiente durante 2 minutos o hasta el desarrollo de color amarillo. Nota: monitorear la aparicin del color amarillo y no dejar que el color se iguale en todos los tubos. 9. Parar la reaccin con 125 L de Na2CO3 1M. 10. Anotar que tubos desarrollan color amarillo y con qu intensidad. 11. Para un resultado cuantitativo se puede leer la absorbencia de la solucin a 420 nm. 12. Analizar y reportar los resultados obtenidos.
Cultivo E. coli
Colocar 1 mL / Tubo
250 L Glucosa 2%
250 L Lactosa 2%
250 L Glucosa 2% Lactosa 2%
250 L Glucosa 2%
250 L Glucosa 2% Lactosa 2%
Incubar a 37 0C / 15 min (*A los 7.5 min de incubacin aadir 250 L de lactosa 2% al tubo D) Centrifugar a 10,000 rpm / 1 min
Decantar el sobrenadante
Resuspender el paquete celular en 250 L amortiguador

Z
Aadir 25 L de CHCl3 + 12.5 L SDS 0.1% Agitar suavemente 10 seg Aadir 50 L de reactivo ONPG Agitar
Incubar a Tamb / 2 min
Aadir 125 L Na2CO3 1 M
Observar la intensidad de color amarillo o leer la Abs 420 nm Figura 6.1. Protocolo de induccin de expresin de los genes involucrados en la utilizacin de lactosa 78
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0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL Stryer L. Bioquimica, 2004, Ed.Revert, pp.868-873.
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Cuestionario 1. Qu es la regulacin gentica? 2. Cules son las diferencias entre la expresin gentica constitutiva, la inducible y la represible? 3. Cmo funcionan los mecanismos de control positivos de la expresin gentica? 4. Cmo funcionan los mecanismos de control negativos de la expresin gentica? 5. Qu son un activador y un inductor? 6. Qu son un represor y un co-represor? 7. Qu es un opern y cules son sus componentes? 8. Cul es la estructura del opern de lactosa de E.coli? 9. Cmo funciona este opern en ausencia y en presencia de lactosa? 10. Qu es la represin catablica y como se ejerce este proceso sobre el opern de lactosa? 11. Por qu la bacteria utilizada en la prctica fue cultivada inicialmente en medio M9-glicerol? 12. Para qu se utiliza cada reactivo de la prctica? 13. Explique que ocurre en los tubos A-E en la prctica. 14. Qu reaccin es responsable del color amarillo observado en los tubos? 15. Qu ocurrira si a los tubos B y C se agregara ATP? 16. Cul ser el fenotipo en ausencia y en presencia de lactosa de cada uno de los siguientes mutantes del opern lac: i-, is, z-, y-, a-, p-, y oc? Explique por qu. 17. Qu diferencias existen en la regulacin de una va metablica como la de la degradacin de la lactosa y una va anablica, como la de la sntesis de triptfano? 18. Qu importancia tiene la regulacin de la expresin gentica en procariontes? 19. Cules son las principales diferencias en la regulacin gentica entre procariontes y eucariontes? 20. Qu aplicaciones tienen en su prctica profesional o en su vida cotidiana los conceptos adquiridos al realizar esta prctica? Referencias Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Regulation of gene expression. Ed John Wiley & Sons, INC, New York, 1997. Pp. 20-52. Localizacin QP514.2 Gardner JE. Garder E. Principios de gentica. 1998, 4a edition Ed. Limusa, pp. 390-407. Localizacin QH581.2 M 65 Gentica General. Manual de prcticas de laboratorio. Regulacin gentica en el opern lac. Facultad de Qumica, UNAM. Ciudad Universitaria. Mxico, 2002. Klug SW, Cummings RM. Conceptos de gentica. Ed. Prentice Hall. Madrid 1999. Pp. 51-71. Lodish H, Molecular Cell Biology, 2003, Ed. Freeman and company, pp. 115-125. Localizacin QH581.2 M 65 79
PARTE II: REGULACIN HORMONAL DEL METABOLISMO DE LA GLUCOSA

Objetivos - Conocer la definicin de hormonas. - Conocer que las hormonas participan en la regulacin del metabolismo. - Conocer los mecanismos de accin y transduccin de la seal por insulina: activacin de protenas cinasas y de protenas involucradas en transporte y metabolismo. - Manejar un modelo experimental animal para medir el efecto de insulina sobre la toma de glucosa por diferentes tejidos. - Analizar el efecto de un inhibidor de la cascada de transduccin de seales en el transporte de glucosa. Introduccin Los seres vivos coordinamos los eventos intracelulares a travs de complejos sistemas de seales qumicas. La comunicacin intracelular mantiene la sntesis o modifica la concentracin de una gran variedad de molculas, por tanto controla la actividad de las vas metablicas. Las hormonas, los factores de crecimiento y los neurotransmisores, son las seales qumicas que alteran o regulan la actividad celular. Una gran variedad de molculas mensajeras (primeros mensajeros) no entran a la clula para iniciar sus acciones biolgicas, sino que interaccionan con diferentes receptores en la superficie de stas. La unin de los ligandos con sus receptores induce un cambio conformacional en el receptor que lo convierte en una forma activa, capaz de interaccionar directa o indirectamente sobre diversas molculas, tales como factores de acoplamiento. La asociacin con otras protenas activan o inhiben una cascada de sucesos moleculares (proceso de transduccin de seales) que llevan a una respuesta biolgica especfica y determinada de acuerdo al ligando que se uni al receptor. La insulina es una hormona polipeptdica que al interaccionar con su receptor estimula una compleja cascada intracelular de eventos dependientes de la fosforilacin o defosforilacin especfica de protenas y culmina con una variada respuesta celular. Ocurren cuatro cambios principales por la presencia de la insulina: la activacin del receptor, el control del transporte de la glucosa, la estimulacin del metabolismo como la gluclisis y el almacenamiento de lpidos y la regulacin de la transcripcin de genes. La insulina tiene un papel importante en la regulacin de la homeostasis de la glucosa en sangre, debido a que incrementa el transporte y utilizacin (metabolismo) de glucosa en ciertos tejidos. La insulina incrementa la toma de la glucosa en las clulas de msculo y de tejido adiposo de mamferos. La principal causa es la movilizacin del transportador de glucosa, GLUT4, desde el interior celular hacia la membrana celular. El incremento en molculas de GLUT4 en la membrana plasmtica causa un incremento de 10 a 40 veces en la toma de glucosa. El mecanismo que lleva a la translocacin de GLUT4 hacia la membrana celular no se ha descrito totalmente, pero se conoce que una vez que la insulina se une a su receptor, ste se autofosforila en un residuo de tirosina, lo que desencadena la fosforilacin de protenas como IRS-1 y Shc, las cuales se asocian a protenas que contienen residuos -SH2 (Cys) como p85, SYP o GRb. La formacin del complejo IR1-p85 activa a una cinasa denominada PI3 cinasa, protena clave involucrada en la
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1 Pinzas de diseccin 1 Tijeras 1 Vaso de precipitados 1 Caja Petri 1 Cmara para el sacrificio de las ratas (por grupo) 1 Tanque de CO2 (por grupo) Bao de agua con agitacin (por grupo)
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movilizacin hacia la superficie celular de las vesculas de membrana que contienen al transportador GLUT4 (Figura 6.2).
Reactivos Solucin Krebs-Ringer-Glucosa-Hepes (130mM NaCl, 5mM KCl, 1.2 mM KH2PO4, 2mM MgSO47 H2O, 10 mM Glucosa, 1 mM CaCl22 H2O, 0.2% BSA y 20 mM HEPES pH 7.0) 0.9% NaCl Solucin de insulina 2000 U/mL 4 M Wormanina Desarrollo experimental Se ha dividido est seccin en tres partes, la extraccin de los tejidos de las ratas, la induccin de la toma de glucosa por insulina en los tejidos y tercero la cuantificacin de glucosa residual en los tubos en donde se incub el tejido. Debido a que el procedimiento es largo, se sugiere realizar el experimento en dos sesiones, sin embargo lo pueden realizar en una sola sesin.
Figura 6.2. Va de transduccin de seales por insulina. P, residuos de tyr fosforilados; GSK3, glucgeno sintasa cinasa-3; PP1, protena fosfatasa tipo 1; GluT, transportador de glucosa; PI3-K, fosfatidil inositol 3-cinasa subunidad cataltica; p85, PI3-K subunidad regulatoria; PKB, protena cinasa B; IRS, substrato del receptor de insulina; MAPK, protena cinasa activada por mitgenos. Las vas conocidas se muestran con lneas continuas y las vas que an no se demuestran pero que podran encontrarse relacionadas a insulina se indican con lneas discontinuas. Tomado de Bradey y Saltiel, 2001.
Una de los enfoques experimentales que ha ayudado a encontrar los blancos moleculares de la accin de insulina y as describir la va de transduccin de seales implicada, es el uso de inhibidores de protenas cinasas o fosfatasas. Existen inhibidores especficos de algunas cinasas como las MAPK, p70S6 cinasas y PI3cinasas. Un defecto en alguna de las respuestas celulares por el uso del inhibidor, nos permite asociar a la protena inhibida como parte de los intermediarios dentro de la va de transduccin de seales encendida en este caso por insulina. Material biolgico Hgado, msculo y tejido adiposo de rata. Material y equipo 7 Tubos falcn 50 mL 1 Recipiente para hielo 1 Micropipeta con capacidad de 200-1000L 1 Caja de puntas para micropipeta de 1000L 1 Probeta de 50 mL 1 Piceta con agua destilada Tubos para microfuga
Aislamiento de tejidos. Las instrucciones para el manejo de los animales del laboratorio y el sacrificio de las ratas sern proporcionadas por un profesional en el rea. En nuestro caso, ser el jefe del bioterio de la Facultad de Qumica. No obstante, a continuacin se enlistan algunas recomendaciones que les pueden ser tiles en el manejo de las ratas. Manejo y sacrificio de las ratas. Recuerden mantener la calma, los animales perciben el miedo. Para capturar a las ratas dentro de la jaula, la manera ms prctica es tomarla con una mano de la cola y con la otra sujetar la piel del cuello, con esto no puede atacar y queda inmovilizada. Tambin es posible sujetar a la rata con una sola mano, rodeando el cuello con el pulgar y el ndice, cuidando de no ejercer mucha presin. El mtodo de sacrificio ser el qumico, utilizando una cmara saturada con CO2 por 5 min. Posteriormente se realiza la dislocacin cervical, sujetando la base de la cola del animal y jalando firmemente, al hacer presin sobre la regin cervical debe producirse un espacio de 2 a 4 mm entre el crneo y las primeras vrtebras cervicales. Una vez realizado lo anterior, colocar al animal en posicin decbito dorsal (boca arriba) sobre la mesa previamente cubierta con un papel. Se sujetan los miembros con el fin de que el animal se encuentre firme a la manipulacin. Para tener acceso a la cavidad torcica y abdominal se debe sujetar y levantar la piel con unas pinzas de dientes de ratn y hacer una incisin a lo largo de la lnea media con unas tijeras y posteriormente abrir la piel a cada lado. Una vez expuestas estas cavidades se puede proceder a la recoleccin de los rganos que se requieran utilizando unas pinzas rectas y tijeras (Figura 6.3).
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Induccin de toma de glucosa por insulina (Figura 6.4) Se recomienda que por grupo midan el efecto de insulina sobre la captacin de glucosa en tres tejidos distintos: hgado, msculo y tejido adiposo. A continuacin se describe el protocolo experimental a seguir en un tejido. Preincubacin del tejido con wormanina y posteriormente la incubacin con insulina. 1. Colocar 2 mL de solucin Krebs-Ringer-Hepes-Glucosa (KRH-Glu) en un tubo falcn de 50 mL marcado como W. Adicionarle 50 L wormanina para una concentracin final de 100 nM. 2. Pesar el tubo con el lquido. 3. Aadir un trozo del tejido. Volver a pesar el tubo. Es necesario conocer la cantidad de tejido que se coloca en el tubo. 4. Incubar por 30 min a 37C. Este paso es la preincubacin del tejido con wormanina. 5. Al finalizar la incubacin aadir 0.5 mL de la solucin de insulina 2000 U/mL y 0.5 mL de NaCl 0.9%. 6. Mezclar e Incubar en bao de agua con agitacin moderada a 37C por 30 min. CUIDAR DE QUE LA TEMPERATURA DEL BAO NO EXCEDA LA RECOMENDADA. 7. Aadir 47 mL de agua. 8. Filtrar el tejido. 9. Si no se determina la concentracin de glucosa inmediatamente, entonces guardar en un tubo de microfuga 1.2 mL del sobrenadante. Rotular el tubo con una W, el nmero de equipo y el grupo. Almacenar a 20C hasta su uso. 10. Se determinar el contenido de glucosa segn se describe en la siguiente fase del protocolo. Incubacin del tejido con insulina. 12. Etiquetar 6 tubos falcn de 50 mL de la siguiente manera: I. II. III. IV. V. VI. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 1000 U 500 U 250 U 125 U 62 U 0 U
Figura 6.3. Localizacin de algunos rganos de la rata. Obtencin de hgado Antes de cortar el tejido realizar el procedimiento de perfusin. El hgado contiene sangre que normalmente era bombeada por el corazn, entonces para eliminar la sangre del hgado hay que introducir una aguja de jeringa (llena con solucin solucin salina isotnica o la solucin 0.9% NaCl fra) por la vena porta del corazn. Una vez que el hgado tome su color natural, de rosa a rojo, extraerlo. Cortar un hgado en 7 fragmentos de aproximadamente el mismo tamao y distribuirlos en 7 tubos que contienen concentraciones de insulina similares al del tejido adiposo Obtencin de tejido adiposo Abrir el abdomen ampliamente haciendo una ligera presin en la cavidad abdominal para desplazar los testculos, levantar hacia arriba el testculo izquierdo y de un solo corte separar el tejido adiposo de tal manera que no lleve sangre, en caso contrario, quitar la sangre con solucin de NaCl 0.9% Sujetar el tejido adiposo con pinzas por la parte ms angosta procurando manejarlo lo menos posible. Hacer lo mismo con el tejido adiposo que cubre el testculo del lado derecho y repetir la operacin con cada una de las 2 ratas. Cortar rpidamente 7 fragmentos de tejido adiposo por rata, de aproximadamente el mismo tamao y depositarlos en cada uno de los 7 tubos falcn previamente pesados. . Obtencin de msculo Cortar el msculo de las patas y de la regin ventral. Lavar el tejido en solucin 0.9% NaCl. Cortar en 7 segmentos, pesar y distribuir en los tubos indicados en el protocolo anterior.
Aadir a cada tubo 1 mL de NaCl 0.9%. Aadir al tubo 1, 1 mL de la disolucin de insulina. Agitar bien. Tomar 1 mL de la solucin de insulina del tubo I y pasarlo al tubo II. Agitar. Tomar ahora 1 mL del tubo II y pasarlo al tubo III. Agitar y continuar de esa manera hasta el tubo V. Tomar 1 mL del tubo V y desecharlo. El tubo 6 no deber contener insulina. Aadir a cada matraz 2 mL de solucin de KRH-Glu. Pesar los tubos en balanza analtica y ponerlos en hielo. Sacrificar las ratas una por una y aislar el hgado y el tejido adiposo de las testculos (ver descripcin del procedimiento). Mantener los tejidos en 0.9% NaCl y a 4C una vez aislados.
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23. Adicionar a cada tubo un fragmento de tejido de aproximadamente del mismo tamao. Para exponer la mayor superficie posible del tejido al medio se sugiere cortar en pedazos el trozo de tejido seleccionado. 24. Volver a pesar los tubos, pero ahora con los tejidos. 25. Colocar los tubos en un bao de incubacin con agitacin moderada a 37C y se incuba por 30 min. 26. Aadir 47 mL de agua al tubo, mezclar y filtrar cada tubo. Se pesa el tejido que queda en el filtro y el sobrenadante se utilizar para determinar la cantidad de glucosa residual. 27. Debido a que slo se necesita una pequea fraccin del volumen para medir el contenido de glucosa residual, se puede tomar 1.2 mL de cada uno de los sobrenadantes y guardarlo en un tubo de microfuga. Rotular los tubos y almacenar congelado hasta su uso, siempre y cuando no se vaya a utilizar para la determinacin de glucosa en esa sesin. 28. Se determinar la cantidad de glucosa en la siguiente fase experimental.
Etiquetar tubos Aadir a cada tubo 1 mL 0.9% NaCl, excepto al W Realizar diluciones seriadas de insulina (Excepto los tubos VI y W)
Aadir a todos 2 mL Krebs Ringer-Glucosa Aadir a W _________L de wormanina Sacrificar las ratas una por una y aislar tejido.
-Distribuir en todos los tubos -Pesar tejido
Incubar todos los tubos a 37C/30 min Tubos I al VI Tubo W Aadir 0.5 mL Insulina 2000 U/mL + 0.5 mL 0.9% NaCl Incubar a 37C/30 min Tomar el tejido y pesarlo Ajustar el volumen del sobrenadante aadiendo 47 mL de H2O Guardar 1.2 a 1.5 mL sobrenadante en tubo de microfuga Congelar (Solamente si no se puede hacer en esa sesin la determinacin de glucosa) Determinar contenido de glucosa
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Determinacinen el contenidotransduccin de seales iniciado por insulina. de wormanina del proceso de de glucosa transportada. Objetivos Conocer el fundamento de la determinacin de glucosa, mtodo de NelsonSomogyi. Determinar de manera indirecta la toma de glucosa por un tejido.
Figura 6.3. Protocolo de induccin de la toma de glucosa por insulina y determinacin del efecto
Solucin B para determinacin de glucosa. CuSO4 y H2SO4, ver preparacin en el apndice. Reactivo de cobre mezclado (RCuM): 24 partes de solucin A + 1 parte de solucin B. Prepararlo justo antes de usarlo. Reactivo de arsenomolibdato ((NH4)6Mo7O24, Na2HAsO4 y H2SO4). Ver preparacin en el apndice.
Introduccin Los carbohidratos son una de las fuentes principales de carbono y de energa en las clulas y los podemos encontrar en alimentos y en bebidas, as como tambin en la sangre. Dada la importancia de los carbohidratos, se han desarrollado varios mtodos para su determinacin: Fehling, Benedict, Somogy, Lane-Enyon, Hagerdorn-Hensen, etc., pero todos ellos se basan en el mismo principio. Todos los carbohidratos con un grupo aldehdo libre o un grupo cetnico se clasifican como azcares reductores y se transforman fcilmente en enedioles al calentarlos en soluciones alcalinas; dichos enedioles son altamente reactivos y se oxidan fcilmente en presencia de oxgeno u otros agentes oxidantes. Por lo tanto, los carbohidratos en solucin alcalina rpidamente reducen iones oxidantes como Ag+, Hg+, Cu2+ y Fe(CN)63-, el carbohidrato oxidado forma mezclas complejas de cidos. Esta accin reductora es la que se utiliza tanto en las determinaciones cualitativas como cuantitativas. Tcnica de Nelson-Somogyi empleada desde 1952 para la determinacin de actividad de enzimas que degradan polisacridos, es la que se usar en el protocolo. El mtodo utiliza como reactivos al Cu2+ y al arsenomolibdato, est ltimo un complejo formado cuando se hacen reaccionar al (NH4)6 Mo7O24, con el arsenato de sodio, Na2HAsO7. El Cu2+ es reducido a C1+ por el carbohidrato y luego el C1+ es reoxidado a Cu2+ en la reaccin con el arsenomolibdato, ste ltimo al reducirse cambia de color de amarillo a azul. Material biolgico Los sobrenadantes obtenidos anteriormente Material y equipo Tubos de microfuga 1 Mechero 1 tela de alambre 1 tripi 15 tubos de 16X150 13 Canicas 1 Gradilla para tubos de vidrio 1 Propipeta 1 Micropipeta de capacidad 200-1000 L Caja de puntas para micropipeta 1000 L 6 Celdas de plstico Vrtex Espectrofotmetro Reactivos - Solucin patrn de glucosa, 200 g/mL. - Solucin A para determinacin de glucosa. Contiene Na2CO3, tartrato de sodio y potasio, NaHCO3 y Na2SO4, ver apndice.
Desarrollo experimental 1. Numerar los tubos de ensayo segn se indica en la tabla 6.1. 2. Descongelar los sobrenadantes y agitar. 3. Aadir los reactivos en la cantidad y orden sealados.
1 2 3 4 5 6 I II III IV V VI W
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 -
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
2.0 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 -
2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
Mezclar bien y colocar los tubos en agua en ebullicin por 10 min (tapar con canicas durante la ebullicin), enfriar en hielo y mezclar bien.
Tubo
Tabla 6.1. Cantidades y orden en el que se realiza la cuantificacin de carbohidratos 200ug/mL Sobrenadantes H2O RCuM NH4(AsMoO4)2 Glucosa (mL) (mL) (mL) 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
H2O (mL) 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0
Abs 520nm
Clculo de la toma de glucosa por el tejido. a) Elaborar la curva patrn de la glucosa. Graficar absorbancia vs contenido de glucosa en g. Obtener los valores de ajuste o regresin lineal de la curva. b) Determinar el contenido inicial de glucosa. Recuerda la solucin Krebs-Ringer tiene una cantidad inicial de glucosa. c) Glucosa incorporada en los tejidos. Calcular el contenido de glucosa de cada uno de los sobrenadantes, utilizando los valores de regresin lineal obtenidos en el inciso a). Calcular la diferencia entre el valor de la glucosa inicial (valor obtenido en el inciso b) y la determinada para cada muestra problema. El resultado se divide entre el peso en gramos del tejido que se coloco en cada matraz correspondiente para obtener lo g de glucosa transportada por gramo de tejido. d) Realizar la grfica de toma de glucosa (g de glucosa incorporada/ g tejido) vs concentracin de insulina y aadir en la misma grfica el resultado de insulina ms wormanina. e) Interpretar los resultados.
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Tejido
Curva patrn
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Cuestionario 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. Cul es la funcin de la solucin de Krebs-Ringer-Hepes en el experimento? Por qu el aislamiento del tejido debe ser rpido? Qu se esta removiendo al lavar el hgado con solucin salina? En el sistema experimental que utilizamos, qu componente representa la sangre? Cules son los procesos celulares que se estn evaluando en el tejido incubado o no con insulina? Cul es el metabolito que se debe cuantificar para la determinar si la insulina tiene o no efecto en el transporte? Dnde se cuantifica este metabolito? Describa la reaccin qumica que utiliza para cuantificarlo. Qu efecto produce la wormanina en la toma de glucosa por los tejidos? Elabore una grfica comparativa del efecto de insulina en la captacin de glucosa por los diferentes tejidos. Analice la grfica anterior.
7. APNDICE. PREPARACIN DE REACTIVOS.

SECCIN I. INTRODUCCIN AL LABORATORIO DE BIOQUMICA Determinacin de concentracin de protenas por Lowry y Absorbancia a 280 nm Solucin Solucin de carbonatotartrato y cobre (CTC) Mtodo de preparacin Pesar y disolver 10 g de Na2CO3 en un volumen aproximado de 60 mL, todava en agitacin aadir 0.1 g de CuSO4 y 0.2 g de tartrato de Na+ y K+, aadir H2O cuanto baste para 100 mL 10 g de SDS y disolver con H2O Comentarios Es estable 2 meses a temperatura ambiente.
10% Dodecil sulfato de sodio (SDS o tambin llamado lauril sulfato de sodio) 0.8 NaOH Reactivo A Reactivo B
Usar cubrebocas para su preparacin. No almacenar en fro ya que se precipita a temperaturas menores de 17C, pero se redisuelve si la temperatura se eleva. Se prepara antes de usarse
Referencias Brady MJ, Saltiel AR. 2001. Insulin and glucagon. Encyclopedia of Life Science. John Wiley & Sons, Ltd. DOI: 10.1038/npg.els.0000638 Devlin TM. 1997. Textbook of biochemistry with clinical correlations. 4ta. Ed John Willey & Sons, INC. Biochemistry of hormones I: polypeptide hormones Pp 878-883. Localizacin QP514.2 Hashiramoto M, James D. 2000. Characterization of insulin-responsive GLUT4 storage vesicles isolated from 3T3-L1 adipocytes. Molecular and cellular biology 20, 416427. Romn-Palacios R. 1998. Regulacin metablica. Departamento de Bioqumica, Facultad de Qumica, UNAM. Svetlana E, 2001. Impaired muscle glycogen synthase in type 2 diabetes is associated with diminished phosphatidylinositol 3-kinase activation. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 86, 43074314. Voet y JG Voet Biochemistry. Energy metabolism: Integration and organ specialization. 2da. Ed. John Willey & Sons, INC. 1995. Pp785-794.
Solucin estndar de Guardar la solucin en alcuotas a 20C albmina de suero bovino 1mg/mL SECCIN II. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTENAS. Purificacin de la enzima lactato deshidrogenasa de msculo esqueltico de bovino. Parte I. Extraccin y precipitacin por salado Solucin Mtodo de preparacin Comentarios 0.03M KOH Pesar 1.6833 g de KOH para 1L Solucin por grupo Guardar a 4C. Parte II. Desalado y purificacin por cromatografa de intercambio inico y de afinidad Solucin Mtodo de preparacin Comentarios 2.5 % Sephadex-G25 (p/V) Hidratar 10 g Sefadex-G-25 con 160 mL de El sefadex hidratado se puede agua estril durante 24 h a 4C. Cantidad almacenar a 4C por al menos un mes. que alcanza como para 50 columnas. Los laboratoristas entregarn una columna empacada con sefadex/equipo. Enpacado de la columna con A una columna de cromatografa se 1. Cada vez que se centrifuga la columna, es importante revisar que Sephadex G-25 le adicionan 2.0 mL de la no se hayan producido burbujas y suspensin de Sephadex-G25. que el flujo del lquido sea Centrifugar a 3,000 rpm durante 5 constante. min, o esperar a que el lquido 2. Las columnas se pueden reusar drene de la columna. Repetir la varias veces, mantenerlas operacin hasta que la columna hmedas, tapadas con parafilm y a llegue a un volumen final de 1 mL. 4C. Lavarlas antes de usar. Para 104 mL disolver 0.126 g Tris en un Se usar para preparar dos soluciones Amortiguador Tris-poco menos de 90 mL de agua destilada, distintas ver abajo. mercaptoetanol (10 mM de ajustar el pH a 8.8 con HCl, despus Tris/HCl pH 8.8; 0.5 mM adicionar 3.6 L de -Mercaptoetanol y Mercaptoetanol) ajustar el volumen a 104 mL con agua destilada. 400mM PMSF Disolver 0.209 g de PMSF en 3 mL de 1. El PMSF; se aade justo antes de etanol, mezclar bien y almacenar en usarse. microtubos de centrfuga a -20C. 2. Proporcionar por grupo 250 L de 400 mM PMSF. 84 mL / grupo Para 13 mL de amortiguador los Amortiguador Tris-A 4 equipos entregarles alcuotas de 13 mL mercaptoetanol-PMSF (10 estudiantes aadirn 32.5 L de 400 mM
3.2 g NaOH para 1000 mL Mezclar con partes iguales de CTC, 10% SDS, NaOH, 0.8 N y H2O Dilucin del reactivo Folin Ciocalteau. 1 Folin Ciocalteau + 5 H2O Pesar 100 mg y disolver en 100 mL de agua destilada.
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mM de Tris/HCl pH 8.8; 0.5 mM -Mercaptoetanol y 1 mM PMSF). Macro-Prep High S support (BIORAD) de Tris--mercaptoetanol a los otros 4 equipos darles 8 mL a cada uno y adems proporcionar una solucin stock de PMSF/grupo para aadirle al amortiguador. Lavar la matriz con 2 a 3 volmenes del amortiguador de equilibrio (de preferencia esterilizar antes el amortiguador). Guardar a 4C. 8 mL/ equipo Mezclar 30.75 mL 1M K2HPO4 y 19.25 mL de 1M NaH2PO4 y ajustar el volumen a 1 L (solucin suficiente para 8 grupos y para lavar la matriz).
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PMSF. Para 8 mL aadir 20 L de 400 mM PMSF. Proporcionar lavada a los estudiantes

0.5 M Tris/HCl pH 6.8 10% SDS Amortiguador de muestra Para 200 mL pesar 12.114 g de Tris. Ajustar el pH con HCl. 1 g de SDS para 10 mL de agua destilada
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Almacenar a temperatura ambiente. Pesar usando cubrebocas. No colocar en fro. Almacenar a 20 0C
Amortiguador de equilibrio (50 mM de fosfatos pH 7.0)
Matriz Cibacrn-blue agarosa presentacin en suspensin (SIGMA C1535) Amortiguador de elucin I
Amortiguador de elucin II Amortiguador de NAD+ (10 mM de Tris-HCl pH 8.8, 0.5 mM de -mercaptoetanol y 5 mM de NAD+).
Lavar la matriz con 2 a 3 volmenes del amortiguador Tris--mercaptoetanol (de preferencia esterilizar antes el amortiguador). 50 mM de amortiguador de fosfatos pH 7.0 y 1 M de NaCl. Mezclar 7.7 mL 1M K2HPO4 y 3.85 mL de 1M NaH2PO4 en un volumen menor 200 mL, aadir 11.7 g de NaCl, disolver y ajustar el volumen a 200 mL. 50 mM de amortiguador de fosfatos ajustado con H3PO4 a pH 3.0 20mL/ 4 equipos (solucin que se entrega por grupo) Repartir 20 mL de Tris--mercaptoetanol y proporcionar 0.0018 g de NAD+
Se sugiere hacer los stocks de 1 M K2HPO4 y 1M NaH2PO4, ya que tambin se utilizar amortiguador de fosfatos en la parte de cintica enzimtica. Se almacenan por al menos 1 mes a 4C. 1M NaH2PO4H2O, para preparar 100 mL pesar 13.79 g 1M K2HPO4 pesar 17.41 y ajustar a 100 mL Guardar a 4C. Entregar en un frasco al profesor 16-20 mL de matriz ya lavada. Almacenar a 4C.
350 L de 1M Tris base. 250 L al 20% SDS. 160 L de 1 M ditiotreitol (DTT). 150L al 50% Glicerol. 20 L de azul de bromofenol (20%). 70 L de H2O. Hacerlo y almacenarlo en tubos de microfuga de 1.5 mL. Amortiguador de corrida -Preparar un stock a 5X 0.25N Tris Base, 1.9M Glicina, 0.5 % SDS (30.285 g Tris; 142.62 g Glicina, 5 g SDS para 1L) -Tomar 200mL del amortiguador 5X y llevarlo a 1L. Solucin teidora 0.125% (p/v) azul de Coomasie Blue R250. 50% (v/v) metanol. 10% (v/v) cido actico Solucin desteidora 45% Metanol. 10% cido actico SECCIN III. ACTIVIDAD ENZIMTICA
Almacenar a 40C, el reactivo dura al menos un ao en stock al 5X y en la solucin de trabajo (1X) se puede reutilizar hasta que la solucin cambie a un color amarillo. Solucin reutilizable
Disolver el NAD+ justo antes de usarse.
Parte III. Determinacin de concentracin de protenas y separacin por electroforesis en gel de poliacrilamidaSDS Solucin Mtodo de preparacin Comentarios Reactivo de Bradford Reactivo preparado (SIGMA) Guardar a 4C. Solucin estndar de albmina de suero bovino (BSA) 0.1mg/mL. pesar 0.1g de BSA en un tubo microfuga, y disolverla en 1 mL de H2O bidestilada. Tomar 100 L de la solucin de BSA 100 mg/mL colocarla en un tubo para microfuga y aadirle 900 L de H2O bidestilada, la solucin quedo 10 mg/mL. Volver ha hacer una dilucin 1:10 para obtener una solucin de 1 mg/mL de BSA. Por ltimo volver ha hacer una dilucin 1:10 para obtener una solucin de 0.1 mg/mL de BSA. Esta es la solucin de referencia. Guardar a 20C
Parte I: Curvas temporales de actividad enzimtica de la lactato deshidrogenasa de msculo esqueltico de bovino. Solucin Mtodo de preparacin Comentarios 1 M Amortiguador de fosfatos Mezclar 30.75 mL de K2HPO4 1M y 19.25 mL Guardar a 4C. pH 7.0 de NaH2PO4 1M y aforar a 500 mL. Solucin suficiente para todo un semestre. 10 mM Piruvato de sodio Para un volumen de 2 mL, pesar 0.0022g de Reactivo que debe ser preparado justo piruvato de sodio. antes de usarlo. 4 mM NADH. Para un volumen de 2 mL, pesar 0.0054g de Reactivo que debe de disolverse justo NADH. antes de usarlo. SECCIN V: ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIN DE CIDOS NUCLEICOS Solucin Cultivo de E. coli JM1452StrR (cepa receptora) Cultivo de E. coli W3110/FKmTn3 (cepa donadora) Luria lquido 5 cajas Petri con medio Luria-agar-2% estreptomicina (25 g/ml) Transferencia de material gentico I: Conjugacin Mtodo de preparacin Comentarios Cultivada por una noche en caldo Luria a Proporcionada por el cepario. 37C. Se solicitan al inicio del semestre. Se intercambian tubos por los tubos por cultivo de bacterias. Cultivada por una noche en caldo Luria a Proporcionada por el cepario. 37C. Se solicitan al inicio del semestre. Se intercambian tubos por los tubos por cultivo de bacterias. Medio Luria lquido en tubos para realizar Almacenar a 4C. conjugacin Una vez esterilizado el medio lquido o en Almacenar a 4C. agar en autoclave a 121C, dejar enfriar a 50-55C antes de adicionar el antibitico par evitar que sea inactivado por el calor. Preparar una solucin de 20 mg/mL de sulfato de estreptomicina en agua. Esterilizar por filtracin y guardar en alcuotas a 20C. Adicionar al medio estril enfriado a 50-55C
Separacin de las protenas en gel de poliacrilamida-SDS Solucin Mtodo de preparacin Comentarios Acrilamida. Mezcla de 30% acrilamida y 0.8% Precaucin. La acrilamida es un NNmetilen-bisacrilamida, disuelto en agua. neurotxico y es absorbido por la piel. Usar guantes al manipularlo. 2 M Tris /HCl pH 8.8 Para 200 mL pesar 48.45 g de Tris. Ajustar el Almacenar a temperatura ambiente. pH con HCl.
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para tener una concentracin final de 25 g/mL Una vez esterilizado el medio lquido o en agar en autoclave a 121C, dejar enfriar a 50-55C antes de adicionar el antibitico par evitar que sea inactivado por el calor. Preparar una solucin de 25 mg/mL de sulfato de kanamicina en agua. Esterilizar por filtracin y guardar en alcuotas a 20C. Adicionar al medio estril enfriado a 50-55C para tener una concentracin final de 30 g/mL
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2 cajas Petri con medio Luria-agar-2% sulfato de kanamicina (30 g/ml)
Almacenar a 4C.
3 M Acetato de potasio pH 4.8 70% Etanol 10 N NaOH 10% SDS Solucin de lisis (0.2 N NaOH y 1% SDS p/v) 500 L
Para una solucin 3M de acetato de potasio; A 60 mL de acetato de potasio adicionar 11.5 mL de cido actico y 28.5 mL de H2O Para 100mL de solucin de etanol al 70%, se mezclan 70 mL de etanol y 30 mL de agua Para 10 mL de solucin NaOH 10 N, se pesan 0.4 g de NaOH. Disolver 10 g de SDS en 100 mL de agua destilada Tomar 10 L de 10 N NaOH y 50 L 10% SDS, aforar con agua destilada.
Mantener a -20C Mantener a -20C
Utilizar cubre bocas para su preparacin. No almacenar en fro Los alumnos la preparan justo antes de usarla.
Transferencia de material gentico II: Transformacin Solucin Mtodo de preparacin Clulas competentes de E. Se describe la tcnica para preparar 200 L coli de las clulas competentes: Inocular 3 mL de medio Luria con E. coli BL21 y se deja crecer en agitacin toda la noche a 37C. Tomar 0.2 mL del precultivo y agregrselo a 10 mL de medio Luria. Las bacterias se dejan crecer hasta llegar a una absorbencia de 0.6 a 0.8 (lectura a 600 nm). Centrifugar la suspensin de clulas a 5000 rpm durante 5 min a 4C. Descartar sobrenadante Resuspender el paquete celular muy bien en 3 mL de NaCl 10 mm isotnico fro. Centrifugar a 5000 rpm durante 5 min a 4C. Descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 5 mL de CaCl2 30 mm fro. Dejar incubando en hielo por 20 min con agitacin ocasional suave y centrifugar a 2500 rpm por 7 min. El precipitado debe ser de forma anular. Resuspender el precipitado en 0.5mL de CaCl2 30 mM fro. Tomar 0.2 mL y pasarlo a un tubo microfuga. Plsmido PET-TEM-1 Se prepara de acuerdo al protocolo que se encuentra en la seccin V, Parte II: Obtencin del plsmido. Medio LB/Kanamicina (30 g/mL) Medio SOC. Para 200 mL de medio lquido se adicionan el volumen necesario de un stock 25 mg/mL Kanamicina Medio Luria adicionado con 20 mM Glucosa.
Comentarios Los laboratoristas entregaran los tubos de microfuga con las clulas competentes congeladas.
Transferencia de material gentico II: Ensayos de restriccin de plsmido. Solucin Mtodo de preparacin Comentarios NdeI 100U/L Marca Fermenta. Viene Guardar a 20C. acompaada la enzima con un vial que Ser proporcionada por el laboratorio contiene el amortiguador TANGO. BamH1 10U/L Marca Fermenta Guardar a 20C. Ser proporcionada por el laboratorio TAE 1X Preparacin para TAE 50X, pesar 242 g Tris Almacenar a temperatura ambiente. base, 57.1 mL cido actico glaciar y 100 mL Diluir y proporcionar a los alumnos el de 0.5 M de EDTA (pH 8). Aforar a 1L TAE 1X. Bromuro de etidio 10 mg/mL Marca Gibco BRL. Ya viene preparado a la concentracin sugerida. Manejar con mucho cuidado, reactivo mutagnico Transferencia de material gentico II: Induccin de protena recombinante. Solucin Mtodo de preparacin Comentarios IPTG Para 1 mL de solucin 100 mM de IPTG, se Almacenar a 20C pesan 0.0238 g de IPTG. SECCIN VI: REGULACIN DEL METABOLISMO Parte I: Opern de la lactosa Solucin Cultivo de E. coli W3110 en medio M9-glicerol. 4 mL medio M9-glicerol estril Mtodo de preparacin Comentarios Proporcionado por el cepario. Se solicitan al inicio del semestre. Se intercambian tubos limpios por los tubos con cultivo de bacterias. Cada una de las soluciones deber esterilizarse por separado por filtracin. La mezcla deber hacerse en condiciones de esterilidad.
Se entregar la preparacin de plsmido aislada de un cultivo reciente. Entregar en alcuotas en tubos de Microfuga Guardar el stock de Kanamicina a 20C Guardar a 4C
Preparacin de Sales M9 10X 60g Na2HPO4 30 g KH2PO4 5 g NaCl 5 g NH4Cl 10 g H2O cuanto baste para 1L, esterilizar la solucin en autoclave a 121C, dejar enfria a 50-55C antes de adicionar el resto de soluciones. Sales M9 10X 100 mL Glicerol 20% 10 mL MgSO4 0.1M 10 mL CaCl2 0.01M 10 mL H2O estril c.b.p. 1L.
Transferencia de material gentico II: Aislamiento de plsmidos Solucin Mtodo de preparacin Solucin GTE 50 mM Glucosa, 25 mM Tris/HCl pH 8.0 y EDTA 10 mM pH 8.0.
Comentarios Mantener a 4C Solucin de glucosa al 2% estril
Preparar las soluciones y luego filtrar para esterilizar.
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No esterilizar en autoclave. Preparar las soluciones y luego filtrar para esterilizar. No esterilizar en autoclave. Preparar las soluciones y luego filtrar para esterilizar. No esterilizar en autoclave.
Solucin de lactosa al 2% estril Solucin de glucosa 2% + lactosa 2% estril Amortiguador Z (Na2HPO47H2O 60 mM, NaH2PO4-H2O 40 mM, KCl 10 mM, MgSO41mM, 7H2O mercaptoetanol 50 mM, pH 7.0) Reactivo ONPG (0.1% de onitrofenil--galactsido) SDS al 0.1% Na2CO3 1M Parte II: Regulacin hormonal del metabolismo de la glucosa Solucin Mtodo de preparacin Para 250 mL disolver 1.89 g NaCl, 0.093g Solucin Krebs-RingerKCl, 0.040g KH2PO4, 0.122g MgSO4 . 7 H2O, Glucosa-Hepes (130mM NaCl, 5mM KCl, 1.2 mM 0.45 g glucosa, 0.036g CaCl2 . 2 H2O, 0.5 g KH2PO4, 2mM MgSO4 . 7 de BSA y 10 mL de HEPES de un stock de 500 mM ( o bien calcular el peso para 20 mM H2O, 10 mM Glucosa, 1 mM CaCl2. 2 H2O, 0.2% BSA y 20 y disolver) ajustar a pH 7.0 mM HEPES). Solucin de insulina 2000 Dependiendo de la presentacin habr que calcular la dilucin. U/mL Solucin patrn de glucosa, Pesar 0.02 g de glucosa y disolverlo en 100 mL de agua destilada, guardar en alcuotas. 200 g/mL. 12.5 g carbonato de sodio anhidro + 12.5 g Solucin A para tartrato de sodio y potasio +10 g bicarbonato determinacin de glucosa de sodio +100 g sulfato de sodio anhidro y se lleva a 500 mL con agua destilada Solucin B para 7.5 g sulfato de cobre en 50 mL de agua determinacin de glucosa destilada + 50 L H2SO4 concentrado el Reactivo de cobre 24 partes de solucin A + 1 parte de solucin mezclado (RCuM): B. Reactivo de arsenomolibdato Disolver 25 g de (NH4)6Mo7O24 en 450 mL de agua destilada aadir 21 mL de cido H2SO4 concentrado. Disolver por separado 3 g de Na2HAsO47H2O en 25 mL de agua destilada. Mezclar ambos reactivos y colocar en un frasco mbar, incubar a 37C durante 24 h, no agitar. Se recomienda disolver el contenido total de 4 M Wormanina un vial que contiene 0.25 mg en 1 mL de DMSO. Despus de esa solucin que queda a 583.8 M tomar 34 L y aadrselos a 5 mL DMSO, as la solucin final queda a 4 M. Por grupo usaran 450 L de 4 M wormanina Na2HPO4-7H2O 16.1g, NaH2PO4-H2O 5.5 g, KCl 0.75 g, MgSO4-7H2O 0.264 g, mercaptoetanol 2.7 mL, disolver en menos de 1 L de agua, ajustar el pH 7.0 y aforar a 1 L. Disolver 0.2 g en 50 ml de solucin amortiguadora Z Disolver 0.1 g en 100 mL de agua destilado
Usar cubrebocas al preparar el reactivo. Almacenar a temperatura ambiente.
Comentarios Almacenar a 4C
Depende de la presentacin, se almacena a 4C o 20C. Almacenar a 20C. Proporcionado en alcuotas por el laboratorio. Proporcionado en alcuotas por el laboratorio. Los estudiantes lo prepararan en el momento La solucin debe presentar una coloracin amarilla, de lo contrario desechar. Repartir por equipo 28 mL
Almacenar a 20C.
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Contenido 1. Introducción Al Laboratorio de Bioquímica Parte I: Reporte Científico

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0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

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1. INTRODUCCIN AL LABORATORIO DE BIOQUMICA PARTE I: REPORTE CIENTFICO

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PARTE II: REVISIN DE MTODOS ESPECTROSCPICOS Y ELABORACIN DE CURVA ESTNDAR DE PROTENA

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Abs 280nm Concentracin L ( g / L) = (%) *10

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Alcuota almacenada para:

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* Fracciones que se obtendrn en la siguiente sesin Notas y clculos:

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PARTE II. PURIFICACIN POR CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO Y DE AFINIDAD

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Parte III. Monitoreo del proceso de purificacin. A. Determinacin de la concentracin de protenas

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Tubo F0 F1 F2 F3 F4 FPA FPB

Abs 595 nm b Contenido de protena K ( g ) = * F m

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200 200 200 200 200

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Tabla 3.2. Tabla de purificacin de la LDH de msculo esqueltico de bovino.

Abs m * Vol . ensayo (mL ) * F min = mmol min 1 M 1 cm 1 * b (cm )

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5 0.36* 515 210.7 29.3 50 10

6 0.5* 515 200 40 50 10

*Usar la dilucin apropiada de enzima, preguntar a su profesor.

Tabla 3.4. Lecturas de absorbancia de la actividad de la LDH a diferentes concentraciones de sustrato.

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Tabla 3.5. Registro de absorbancias de la actividad de la LDH en presencia de un inhibidor.

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4. GENTICA DETERMINACIN DEL TIPO DE HERENCIA EN BASE A FRECUENCIAS FENOTPICAS Y GENOTPICAS.