Cromatografía de líquidos de alta

eficiencia (HPLC)
Fase móvil es un líquido:

• Reparto (Partición)
• Adsorción (Líquido-Sólido)
• Intercambio iónico
• Exclusión por tamaño

Federico Williams
fwilliams@qi.fcen.uba.ar
Aplicaciones de la cromatografía de líquidos
•Sensibilidad
•Determinaciones cuantitativas exactas
•Separación de especies no volátiles
•Gran aplicabilidad: aminoácidos,
proteínas, ácidos nucleicos,
hidrocarburos, carbohidratos, fármacos,
plaguicidas, antibióticos, esteroides,
especies organometálicas e inorgánicas

Cromatografía de exclusión por tamaño:

solutos con masas moleculares superiores
a 10000.
Cromatografía de intercambio iónico:
especies iónicas de masa molecular más
pequeña.
Cromatografía de reparto: especies poco
polares no iónicas.
Cromatografía de adsorción: especies no
polares, isómeros estructurales y grupos de
compuestos como, por ejemplo, los
hidrocarburos alifáticos de los alcoholes
alifáticos.
Eficacia de la columna en la cromatografía de líquidos
Efecto del tamaño de partícula del relleno

Transferencia de masa en la fase móvil

– CM ∝ dp2

Ensanchamiento de banda extracolumna

π r 2u
H ex = r radio del tubo
24 DM
Diferentes velocidades de flujo de las capas de líquido moviéndose adyacentes a las paredes del tubo y las
del centro en los sistemas de inyección, detectores, y conectores. La parte central de la banda de soluto se
mueve con mayor rapidez que la periférica. (No es importante en CG ya que se compensa con la difusión). Se
apunta a la reducción del radio de los tubos del sistema externo a la columna.
 Elución isocrática versus elución con gradiente

Elución isocrática: Separación con disolvente de composición constante

Elución con gradiente: Se utilizan dos o tres disolventes de distinta polaridad y se varía la
composición de forma continua o mediante etapas escalonadas.
Instrumentación para cromatografía de líquidos
 Sistemas de bombeo
Requerimientos:

1. Generación de presiones por encima de 6000 psi (~410 atmósferas)

2. Flujo libre de pulsaciones
3. Intervalo de caudales de 0.1 a 10 ml/min (con control del 0.5%)
4. Componentes resistentes a la corrosión (acero inoxidable o Teflón)

Bombas recíprocas:
na
Desventaja:

Producen un flujo pulsado (amortiguar)

dor
nes
Ventajas:

1.Pequeño volumen interno (35 a 400 μl)

2.Altas presiones (>10000 psi)
3.Adaptable a elución con gradiente
4.Caudales constantes independientes
de la contrapresión de la columna y de
e la viscosidad del disolvente
 Sistemas de inyección de muestra
Válvulas de inyección con bucles de muestra
 Detectores
Detectores basados en la medida de una propiedad del efluente (índice de refracción,
la constante dieléctrica, densidad) o basados en la medida de una propiedad del soluto
(absorbancia en el UV, fluorescencia, o corriente límite) que no es inherente a la fase
móvil.

Sensibilidad adecuada
Estabilidad y reproducibilidad buenas Diferencias con los detectores de CG
Respuesta lineal extendida a varios órdenes de magnitud
Tiempo de respuesta corto Rango de T de operación menor
Respuesta rápida e independiente del caudal Detector de CL volúmen interno mínimo
Manejo sencillo (minizar el ensanchamiento de banda)
No destructivo
Respuesta similar a todos los analitos o respuesta selectiva
a algunos analitos
 Detectores de absorbancia
Celda del detector UV-Visible: Espectros de absorción UV-visible:

Detectores de Fluorescencia: La fluorescencia se detecta por medio de un

detector fotoeléctrico colocado perpendicularmente respecto del haz de excitación.
Es más sensible que el detector de absorbancia y se utiliza para detectar
compuestos fluorescentes (se puede tratar la muestra previamente para generar
derivado fluorescentes).
 Detector de índice de refracción

El disolvente en su camino hacia la columna pasa a través de la mitad de la

cubeta y el eluyente de la cubeta pasa por la otra mitad. Los dos compartimientos
están separados por una placa de vidrio montada a un ángulo tal que si las dos
disoluciones difieren en el índice de refracción se produce una desviación del haz
incidente con respecto a la superficie fotosensible del detector que provoca un
cambio en la señal de salida.

Responden a casi todos los solutos, son detectores universales. Sin embargo son
muy sensibles a los cambios de T y no son tan sensibles como otros detectores.
 Detectores electroquímicos

Intervalos de potencial en los que pueden tener la oxidación o reducción distintos grupos
funcionales orgánicos. En principio las especies que contengan estos grupos podrían detectarse
por métodos electroanalíticos. La detección electroquímica brinda un detector “universal” y sensible
 Columnas para cromatografía de líquidos
• Construcción
– Tubo de acero inoxidable (presiones hasta 10000 psi)
– Ocasionalmente, tubo de vidrio con paredes resistentes (presiones hasta 600 psi)
• Columnas analíticas
– Rectas, de 10 a 30 cm de longitud
– Extender acoplando columnas adicionales
– Diámetro interno: 4 a 10 mm
– Tamaños de partículas de los rellenos: 5 a 10 μm
– Standard: 25 cm longitud; 4.6 mm diámetero; 5 μm particulas; N = 40,000 to 60,000
– Alta performance: 3 a 7.5 cm longitud; 1-4.6 mm diámetro; 3 o 5 mm partículas; N = 100000
platos/metro (Ventaja: rapidez y mínimo consumo de disolvente)
• Precolumnas
– Elimina materia en suspensión y componentes de la muestra que se unen irreversiblemente a la fase
estacionaria.
– Composición similar a la columna analítica. Se usa para mejorar la vida de la CA. Se reemplaza
cuando se contamina.
• Columnas termostatizadas
– La mayoría de las aplicaciones no requieren control de la temperatura y se trabaja a T ambiente.
Aunque T constante mejora el cromatograma.
– Los instrumentos modernos tienen control de T desde ambiente a 100-150 ºC
• Rellenos de la columna
– Relleno pelicular: Esferas de vidrio o polímero no porosas de 30 a 40 μm de diámetro. En la superficie
de las esferas se deposita una capa delgada y porosa de silica, alúmina, polímero.
– Rellenos de partículas porosa: Micropartículas porosas con 3 a 10 μm de diámetro. Las
micropartículas son de silica o alúmina o de un polímero. Se recubren muchas veces con películas
orgánicas que se unen químicamente o físicamente a la superficie.
 Cromatografía de reparto

Es el tipo de cromatografía de líquidos más utilizado. Se puede subdividir en líquido-líquido

y cromatografía de fase unida químicamente, aunque el método más utilizado es la
cromatografía de reparto de fase unida químicamente. Se distinguen dos tipos de
cromatografía de reparto: de fase normal y de fase inversa en ambas la fase estacionaria
se soporta sobre partículas de silica o alumina de 3, 5 o 10 μm. Fase normal: La fase
estacionaria es polar (grupos ciano, amino y diol) y la fase móvil no polar (hexano o iso-
propileter). Fase inversa: La fase estacionaria es no polar y la fase móvil polar (agua,
metanol, o acetonitrilo). En fase normal, el componente menos polar es el que eluye
primero y en fase inversa el componente más polar es el primero en eluir.
 Fase estacionaria reversa

R = CH3
o C8H17
o C18H37

La fase móvil es polar y consiste de soluciones acuosas conteniendo

concentraciones diversas de metanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano. El ph
no debe ser mayor que 7.5 porque esto generaría la hidrólisis del siloxano
y la destrucción del relleno de la columna.
 Eluyentes típicos

Se requiere un equilibrio entre las fuerzas intermoleculares entre el soluto, la fase

estacionaria y la fase móvil (a diferencia de CG donde la fase móvil es un gas idealy
sólo sirve de portador de componentes). En polaridades crecientes: hidrocarburos <
éteres < ésteres < cetonas < aldehídos < amidas < aminas < alcoholes < agua .

Se elige la polaridad de la fase estacionaria bastante similar a la de los analitos y para

la elución se utiliza una fase móvil de polaridad considerablemente distinta.
Optimización del eluyente

Se controla el tiempo total de

elución con la polaridad
(modifica los factores de
retención).

Se controlan los factores de

selectividad para lograr una
buena resolución variando la
natiraleza de la fase móvil
(manteniendo k´ en un
intervalo) o la fase
estacionaria.
Aplicaciones de la cromatografía de reparto
Aplicaciones de la cromatografía de reparto
 Cromatografía de adsorción
La cromatografía de adsorción o líquido-sólido utiliza como fase estacionaria a la silica (o en
pocas ocasiones a la alumina). El orden de los tiempos de retención es:
olefinas < hidrocarburos aromáticos < haluros, sulfuros < éteres < nitroderivados < ésteres,
aldehídos, cetones < alcoholes, aminas < sulfonas < sulfóxidos < amidas < ácidos carboxílicos
Se varía la composición de la fase móvil para ajustar k´y α. (se utiliza la fuerza del eluyente, en
lugar de la polaridad como guía de la fuerza de los disolventes). Se eligen dos disolventes
compatibles, uno que es demasiado fuerte y el otro demasiado débil. Variando la relación de
volúmenes se puede obtener un valor adecuado para k´. Cuando se produce el solapamiento de
picos, el cambio de un disolvente fuerte por otro (mientras k´se mantiene más o menos
constante), permitirá cambiar los valores de α y aumentar la resolución.
Separación de cis y trans pirazolina por cromatografía de adsorción.
Columna: silica pelicular.
 Cromatografía de intercambio iónico

−
+
−
+

+ −

+ −

Los procesos de intercambio iónico se basan en los equilibrios de intercambio entre los iones de
una disolución y los iones del mismo signo que están en la superficies de un sólido de elevada
masa molecular y esencialmente insoluble. Los sitios activos más comunes de intercambiadores
catiónicos son los grupos sulfónico –SO3−H+ (ácido fuerte) y carboxílico –COO−H+ (ácido débil).
Los intercambiadores aniónicos contienen grupos amino terciario –N(CH3)3+OH− (base fuerte) o
grupos amino primarios –NH3+OH− (base débil).
 Rellenos de intercambio iónico

Intercambiador catiónico Intercambiador aniónico

Relleno de partícula pelicular en el que la superficie de una partícula grande (30 a 40 μm)
esférica y no porosa se recubre con una resina sintética de intercambio iónico.

Micropartículas porosas de silica recubiertas con una delgada película del intercambiador.
Métodos de detección en cromatografía iónica
 Cromatografía iónica con columnas supresoras
Problema para utilizar detectores de conductividad debido a la elevada concentración de
electrolito requerido para eluir los analitos en un tiempo razonable. Columna supresora del
eluyente después de la columna de intercambio iónico convierte los iones del eluyente en
especies poco ionizadas.

Para separación de cationes se utiliza un intercambiador aniónico en la columna supresora:

H+(ac) + Cl−(ac) + Resina+OH−(s) → Resina+Cl−(s) + H2O

Para separación de aniones se utiliza un intercambiador catiónico en la columna supresora:

Na+(ac) + HCO3−(ac) + Resina−H+(s) → Resina+Cl−(s) + H2CO3(ac)
 Eluyentes típicos
Analitos Sin supresión Con supresión
Aniones Na Benzoato NaOH
KH Ftalato Na2CO3
NaHCO3
Cationes Ac. benzoico HCl
Ac. ftálico H2SO4
CH3SO3H
Aplicaciones de la cromatografía de intercambio iónico
Columna supresora y detección
conductimétrica:
 Cromatografía de exclusión

Partículas de silica o polímero uniformes, pequeñas y

porosas de ~10 μm.
Las moléculas que son atrapadas en los poros son
removidas del flujo de fase móvil, aumenta tR
Si el tamaño de la molécula es mayor que el tamaño
medio de poro, entonces es excluida - mínimo tR
Las moléculas con diámetros más pequeños que los
poros son atrapadas – máximo tR
Moléculas con tamaños intermedios tienen tR
estadisticamente diferenciables.
La separación no implica una interacción química ni
física entre el analito y la fase estacionaria.
Rellenos de columna para la cromatografría de exclusión por tamaño
Silica:
Ventajas: gran rigidez (empleo de presiones
elevadas), mayor estabilidad (gran variedad de
disolventes), estable a T elevadas.
Desventajas: tienden a retener solutos por
adsorción, puede catalizar la degradación del
soluto.
Poliméricas:
Ventajas: control del tamaño de poro controlando
el grado de entrecruzamiento. Polímeros
hidrofóbicos e hidrofílicos, tamaños de poros en el
rango de cinco órdenes de magnitud.
Desventajas: deformable (limita la presión)
 Aplicaciones de la cromatografía de exclusión por tamaño
Cromatografía de filtración sobre gel: disolventes acuosos y rellenos hidrofílicos para
muestras hidrosolubles.
Cromatografía de penetrabilidad sobre gel: disolventes no polares y rellenos hidrofóbicos
para sustancias solubles en disolventes no polares

Separación de ácidos grasos Separación de una resina epoxi comercial

Ventajas: Desventajas:

• Tiempos de separación cortos y bien definidos • Solo se puede acomodar un número

• Bandas estrechas
• No hay pérdida de muestra (los solutos no
interaccionan con la fase estacionaria
• No se desactiva la columna debido a la ausencia
de interacción del soluto con el relleno
limitado de bandas (escala de tiempos
corta)
• No es aplicable a muestras de tamaños
similares, se necesita una diferencia de
al menos 10% en los pesos moleculares
 Cromatografía de fluidos supercríticos
Tc (Pc) es la T (P) por encima de la cual no puede existir en fase líquida independientemente
de P (T). Propiedades intermedias entre las características del estado gaseoso y líquido.
 Características de la cromatografía de
fluidos supercríticos
Debido a las densidades elevadas (0.2 – 0.5 g/cm3) puede disolver moléculas grandes no
volátiles. CO2 sc disuelve diversos hidrocarburos alifáticos y aromáticos.

Los analitos disueltos en un fluido supercrítico son fácilmente recuperados dejando la

disolución en atmósfera y T relativamente bajas.

Los fluidos supercríticos son baratos e inocuos.

La cromatografía de fluidos supercríticos es un híbrido

entre la cromatografía de gases y la de líquidos. Separa
compuestos que no pueden ser separados por CG ni
CL:

(1) Compuestos no volátiles termolábiles en los que no

se puede aplicar CG.
(2) Compuestos que tienen grupos funcionales no
detectables por técnicas espectroscópicas o
electroquímicas empleadas en CL.

Las difusividades y viscosidades intermedias de los

fluidos supercríticos dan lugar a separaciones más
rápidas que en cromatogrfía de líquidos pero con un
ensanchamiento de banda.
Instrumental de cromatografía de fluidos supercríticos

Fase estacionaria: Generalmente se emplean columnas abiertas con recubrimientos

internos. Longitud de 10 a 20 m, diámetro interno de 0.05 a 0.1 mm y el espesor de la
película entre 0.05 y 1 μm.

Fase móvil: CO2, disolvente de moleculas orgánicas no polares, transparente en el UV,

inolora, no tóxica

Detectores: Ionización de llama, absorción UV, emisión de fluorescencia, etc.

 Efecto de la presión

A medida que aumenta la presión, aumenta la densidad de la fase móvil y aumenta

la capacidad disolvente de la fase móvil, acortando los tiempos de elución.
Cromatografía de afinidad