En una columna cromatografica

Para tener mas platos teoricos

conviene usar particulas mas finas

Ecuacin de van Deemter

altura plato
terico

caminos
mltiples
MEJORA CON
PARTICULAS
FINAS.
difusin
longitudinal

tiempo de equilibracion
entre fases MEJORA
CON PARTICULAS
FINAS.

Se usa silica mas fina, y por lo

tanto se precisa mas presin ...

y se sigue por este camino ...

... hasta tener una HPLC

Equipos de HPLC

HPLC
Las fase movil es un lquido.
Las columnas estan empaquetadas con una fase
estacionaria muy fina que obliga a usar altas
presiones.
Por lo tanto hay que usar una bomba capaz de dar esas
altas presiones, y mangueras (tubing) que las pueda
soportar.

La resolucin y el dimetro de las

partculas de la fase estacionaria.

silica 10 micrones

silica 5 micrones

HPLC es un conjunto de cromatografas,

segn las columnas que se usen.

Partes comunes
Vlvula de inyeccin.
Bomba.
Detector

Partes diferenciadas
Columnas de distinto tipo.
Mezcladores de solvente.
Otros accesorios.

Vlvula de inyeccin
Poder cargar a
baja presion y
eluir la muestra
a alta presin.

Alta repetibilidad
en cantidad de
muestra inyectada.

Bomba
Generar muy alta
presion (6000 psi
~ 400 Atm).
No tener
pulsaciones.
Poder regular el
caudal y/o la
presin.
Resistir la
corrosin de los
solventes y las
muestras.

Detectores

El mas usado:
Detector de absorbancia

La celda tiene muy

pequeo volumen
y paso ptico
normal.

Espectros a lo largo de la elusin,

tomados con espectrofotmetro de
matriz de diodos.

Detector de fluorescencia:
muy selectivo y sensitivo

Para los compuestos de alta fluorescencia, el lmite de

deteccin es unas 100 veces menor que los de absorbancia.

El ms universal:
Detector de indice de refraccin

Detectores
electroqumicos

Comparacin de detectores

 Qu columna usar ?

Qu columna usar ?

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Solventes
Los solventes para HPLC deben ser MUY puros.
Calidad HPLC es una de las calidades mas altas.
Las impurezas de un solvente malo producen:
- seal de fondo en el detector
- arruinan las columnas, en especial por partculas
Aun con estas precauciones, se usa una
precolumna cortita del mismo tipo que la
columna a usar, pero mas barata.

Solventes - poder de elusin

Serie eluotrpica en cromatografia en fase directa de almina o slica

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Fase reversa

El pH no debe ser mayor a 7.5 o se destruye la columna !

Fuerza eluotrpica en fase reversa

Smezcla = VaSa + VbSb + ...

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Gradientes de solventes
Si se tienen 2 bombas, se pueden mezclar 2 o ms
solventes en la proporcion que uno quiera.
De esta forma, se comienza con un solvente que eluye
poco, y las substancias mas afines por el solvente salen
rpido.
Las substancias mas afines por la fase estacionaria
se van sacando aumentando la fuerza de elucin de
la mezcla con un gradiente.

Aminoacidos derivatizados con o-ftalaldehido

en columna de fase reversa C18

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Columnas de exclusin molecular

Partculas nanoporosas de slica o polmeros que

atrapan a las moleculas pequeas, y las grandes no
entran. En un rango intermedio, las molculas
pasan tiempos estadisticamente diferentes dentro
de la fase slida.

Columnas de exclusin molecular

La slica es mas rgida, soporta mayor presin y T.

Los polimeros pueden sintetizarse de diversas propiedades y
tamao de poro en 5 rdenes de magnitud

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Cromatografa de intercambio inico

Los cationes o aniones presentan diferente afinidad por el

relleno de la columna, permitiendo la cromatografa.

Resinas de intercambio inico

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Detectores para cromatografia ionica

CONDUCTIVIDAD

CONDUCTANCIA
ELECTRICA

AMPEROMETRIA
UV/VIS

OXIDAXION/REDUCCION EN
UN ELECTRODO INERTE
ABSORCION DE LUZ

FLUORESCENCIA

EMISION MOLECULAR

ANIONES Y CATIONES DE
ACIDOS O BASES
MODERADAMENTE
FUERTES (pKa O pKb < 7)
ANIONES Y CATIONES
OXIDABLES O REDUCIBLES
ANIONES Y CATIONES QUE
ABSORBEN.
METALES PESADOS
DESPUES DE REACCION CON
COMPLEJANTES QUE DAN
COLOR.
SILICATOS Y FOSFATOS
MEDIANTE REACCION CON
MOLIBDATO.
ALCALINOTERREOS CON
ARSENAZO I
NH4+, AMINOACIDOS,
POLIAMINAS CON
REACCION CON
orto FTALALDEHIDO

Selectividad a diversos iones

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Cromatografa inica

columna de
intercambio
aninico

mS

Columnas supresoras.
sin supresion

columna de
intercambio
aninico

mS

con supresion
columna
supresora
(catinica)

mS

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Solventes de elusin

Aplicaciones de la cromatografa inica

Iones inorgnicos, con columna
supresora y detector conductimtrico

alfa-aminocidos naturales

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Otros tipos de cromatografas

- de afinidad.
- de exclusin inica
- de gases (muy usada, la vemos en la prxima clase)

El mejor detector de todos:

el espectrometro de masas.
Los espectrmetros de masa permiten determinar la masa
exacta de molculas nicas, por lo tanto su identidad qumica.
Precisan un alto vaco para que las molculas puedan volar
libremente sin chocar, ya que en eso se basa la separacin por
masa molecular.

como conectar un HPLC, cuya salida es un

lquido a T y P ambientes con un sistema de
ultra-alto vaco ?

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Electrospray

Electrospray

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