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Cromatografa de lquidos de alta resolucin

Tipos
Cromatografa de reparto
En fase inversa En fase normal

Cromatografa de reparto
Mtodo mas popular. Analitos de peso molecular bajo (PM<3000) Polares o no-polares Columnas con fase estacionaria unida (liquido unido qumicamente a un soporte de slido de partculas) 3,4 o 10m de partculas de slice hidrolizadas recubiertas con siloxano
R1 Si R2 O n

Cromatografa de adsorcin o lquidoslido Cromatografa inica Cromatografa de exclusin por tamaos o en geles

Cromatografa de reparto
Fase inversa (FI)
Fase mvil polar/ Fase estacionaria no polar

Fase inversa
Mas ampliamente utilizada Solvente de alta polaridad-solutos de alta polaridad eluyen en primero. R= mas comn- C8 (n-octil) o C18 (n-octildecil) Los grupos estn en posicin perpendicular a la superficie generando una estructura de cepillo o brocha. Cuanto mayor es el numero de tomos de carbono en R mayor es la eficacia. Elucin a pH>7.5 puede ocurrir hidrlisis del siloxano

Fase normal (FN)


Fase mvil no polar/ Fase estacionaria polar

Fase Normal
FM de baja polaridad/ FE polar Solutos poco polares eluyen primero Incrementar la polaridad de la FM tienen el efecto de reducir el tiempo de elucion. R-Polar- ciano, diol, amino, dimetilamino. FM-baja polaridad- etil eter, cloroformo, hexano

Establecimiento del mtodo en Cromatografa de reparto.


Mas complejo que en CG
En CG la FM solo transportaba al soluto En HPLC la FM interacciona con el soluto

Establecimiento del mtodo en Cromatografa de reparto.


Seleccin de la fase movil Solventes polares interaccionan mas con analito polares- eluyen mas rapido pero con menor resolucion Cuantitativamente se describe la polaridad con el indice de polaridad P
Varia de 2 ( no-polar) a 10.2 ( altamente polar) En una mezcla
PAB= APA+ B P B En HPLC el factor de capacidad kpuede ser manipulado cambiando la composicion del solvente Mejor relacion resolucion/tiempo cuando k=2-5

Seleccin de columna - basado en las fuerzas intermoleculares de los 3 componentes ( soluto, FE, FM). La polaridad de la FE debe ser semejante a la de los analitos y FM polaridad distinta.

Cromatografa de absorcin
Cromatografa liquido-slido FE= slice o alumina Seleccin de la FM
Para optimiza ky se varia la composicion de la FM-se utiliza la fuerza del eluyente o. Se eligen dos solventes compatibles uno con opequena y otro con ogrande. Se varian hasta obtener una k adecuada.

Cromatografa de adsorcin

Aplicaciones
Compuestos no polares con masas <5000 Muestras solubles en disolventes no polares Capaz de diferenciar entre compuestos isomeros

Cromatografa inica
Separacin de iones FE= resinas de intercambio inico FM= disoluciones acuosas con algn disolvente orgnico o disoluciones reguladoras. Detector de conductividad.

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO RESINAS

Cromatografa inica
El uso de detectores de conductividad tienen el inconveniente de que requieren una elevada concentracin de electrolito en la FM para eluir al analito
La conductividad de la FM enmascara a la de los analitos

Solucin: COLUMNAS SUPRESORAS inmediatamente despus de la columna analtica.


Relleno de resina de intercambio inico que convierte los iones del disolvente en especies moleculares poco ionizadas

Cromatografa inica

Cromatografa de exclusin por tamaos


Separacin de compuestos de alto peso molecular- protenas y polmeros, cidos grasos, azucares FE= partculas polimricas o de slice que contienen una red de poros
Las molculas son atrapadas en los poros y eliminadas por el flujo de FM. molculas > poro son excluidas- salen antes molculas < poro penetran y eluyen despus. molculas~ poro se retienen, tiempo de elucion intermedio.

Cromatografa de exclusin