Procedimiento General para el Informe de Laboratorio de Actividad Enzimtica

El informe de este laboratorio debe ser entregado al finalizar el prctico. Por tal
motivo, se exigir que los grupos de trabajo ingresen con un informe parcial.
Debe estar escrito a mano, en cuadernillo cuadriculado, tamao oficio, siguiendo
el formato de identificacin y contenidos acostumbrado.
Debe contener portada (1 hoja), Introduccin y objetivos (1 hoja), Aspectos
tericos (1 hoja mx.), Materiales y Mtodos (2 hojas mx.). Objetivos claros,
que no se confundan con actividades;
Tablas de datos, clculos y grficos correspondientes a los ensayos 1 y 2 de la
gua.
Las tablas de datos, clculos y grficos correspondientes a los ensayos 3 y 4,
deben ser agregados durante el prctico. Las tablas preliminares pueden estar
incorporadas, listas para agregar los datos donde corresponda, a medida que los
obtenga. Tablas y grficos deben ser claros. Los grficos en papel milimetrado,
indicando ttulo y rtulos de los ejes, con las respectivas unidades de medida.
La discusin y conclusiones finales no deben exceder de media pgina cada una
y limitarse a demostrar una evaluacin de los datos obtenidos y su nexo con la
teora.
Contener un desarrollo de ideas lgico y coherente con la secuencia de
actividades propuestas. Ser relevante la ortografa y redaccin.

Instituto de Ciencias Biolgicas

PRCTICO
DETERMINACIN DE ACTIVIDAD ENZIMTICA
INTRODUCCIN
Espectrofotometra
La Enzimologa que se ocupa del estudio de la velocidad de las reacciones
catalizadas por enzimas y las causas de su variacin. Los ensayos enzimticos se
emplean rutinariamente en muchos laboratorios clnicos para el diagnstico de
numerosas enfermedades, ya sea observando velocidades de reaccin anormales o bien
niveles enzimticos inadecuados en el plasma u otros tejidos.
Un ensayo enzimtico se basa en la capacidad de una enzima de transformar un
sustrato en un producto especfico. Normalmente ya sea sustratos o productos son
coloreados, es decir absorben fotones a una longitud de onda determinada. Ello permite
seguir el avance de la reaccin mediante Espectrofotometra. Por otro lado, el empleo
de reactivos especficos que reaccionan con sustratos o productos generando
compuestos coloreados facilita el seguimiento de un ensayo enzimtico.
La espectrofotometra es el mtodo de anlisis ptico ms usado en las
investigaciones qumicas y biolgicas. Se aprovecha la propiedad de ciertos compuestos
o molculas de absorber radiacin electromagntica. Todas las sustancias pueden
absorber radiaciones dentro del espectro UV- Visible. Por ejemplo, el vidrio
transparente absorbe radiacin de longitudes de ondas que no pertenecen al espectro
visible, en tanto que el agua absorbe fuertemente en la regin del infrarrojo. Las
longitudes de onda de las radiaciones que una molcula puede absorber y la eficiencia
con la que se absorben dependen de la estructura atmica y de las condiciones del
medio (pH, temperatura, fuerza inica, constante dielctrica), por lo que dicha tcnica
constituye un valioso instrumento para la determinacin y caracterizacin de
biomolculas.
Los diferentes tipos de radiacin electromagntica: rayos X, luz ultravioleta
(UV), luz visible, luz infrarroja (IR), ondas de radio, etc., se propagan a la misma
velocidad, pero difieren en longitud de onda y frecuencia. El ojo humano detecta la
radiacin en un rango de longitudes de onda de 400 a 780 nm, llamada luz visible (1
nm=10-9m). La luz del espectro visible y del UV cercano (200 a 400 nm) posee la
energa necesaria para producir sobre ciertos compuestos, llamados cromforos,
transiciones de electrones desde un orbital de menor energa a otro de mayor energa.
Las sustancias coloreadas absorben luz visible y su color corresponde a la radiacin no
absorbida. La absorcin de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas, depende
de la estructura de las molculas, y es caracterstica para cada sustancia qumica.
Adems, la absorcin y transmitancia de luz depende de la concentracin del
cromforo.
Ley de Lambert-Beer
La relacin entre la absorcin de la luz y la concentracin de una solucin se
representa por la Ley de Lambert-Beer. La Ley de Lambert-Beer seala que la cantidad

de luz absorbida por un cuerpo depende de la concentracin en la solucin y de la

distancia recorrida por el haz de luz.
Consideremos un rayo de luz monocromtica (luz de una sola longitud de onda)
de intensidad Io, que incide perpendicularmente sobre una cubeta rectangular de vidrio
que contiene una solucin de un compuesto qumico que absorbe luz (o cromforo), el
haz lo atravesar, el compuesto absorber una parte de la radiacin incidente (Ia) y
dejar pasar el resto (It), de forma que se cumple: Io = Ia + It.

Fig. 1. Esquema de deteccin de un espectrofotmetro

Si el compuesto absorbe a la longitud de onda dada, habr una prdida de

intensidad al traspasar la solucin. Esto es, It es menor que Io. Cuanto mayor es el
nmero de molculas del cromforo que se interponen al paso del haz, menor ser la
intensidad de la luz transmitida. Dicho nmero de molculas depende de la distancia
recorrida a travs de la solucin (camino ptico o largo de la cubeta = b) y de la
concentracin de soluto en la muestra (c). El coeficiente de extincin molar () depende
de la naturaleza de la muestra y define cuan fuertemente una substancia absorbe la luz a
una dada longitud de onda, por unidad de concentracin molar. La relacin entre estos
parmetros est dada por la ley de Lambert-Beer:
It/Io = T-bc
donde It, es la intensidad de luz que sale de la cubeta y que va a llegar a la celda
fotoelctrica (radiacin o intensidad transmitida); y Io es la que intensidad con la que
llega a la cubeta (radiacin intensidad incidente) y la relacin entre ambas (T) es la
transmitancia. El signo negativo se debe a que la energa radiante decrece a medida que
el recorrido aumenta.
La ecuacin simplificada de la ley de Beer-Lambert es
A = .b.c
corresponde a la mnima ecuacin que relaciona la concentracin (c), la absorbancia de
la muestra (A), la distancia recorrida por la radiacin, o sea ancho de cubeta (b), y el
coeficiente de extincin molar ().
La ley de Lambert-Beer se cumple para soluciones diluidas (inferiores a 1,0);
para valores de c altos, vara con la concentracin, debido a fenmenos de dispersin
de la luz, agregacin de molculas, cambios del medio, etc.
Transmitancia
La transmitancia (T) de una sustancia en solucin es la relacin entre la cantidad
de luz transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra (It), y la
cantidad de luz que incidi sobre ella (Io), y se representa normalmente en tanto por
ciento:

% T = It/Io x 100
La transmitancia nos da una medida fsica de la relacin de intensidad incidente
y transmitida al pasar por la muestra. La relacin entre %T y la concentracin no es
lineal, pero asume una relacin logartmica inversa.
Absorbancia
La absorbancia (A) es un concepto ms relacionado con la muestra, puesto que
nos indica la cantidad de luz absorbida por la misma, y se define como el logaritmo de
1/T, en consecuencia:
A = log 1/T = -log T = -log It/ Io
Cuando la intensidad incidente y transmitida son iguales (Io = It), la
transmitancia es del 100% e indica que la muestra no absorbe a una determinada
longitud de onda, y entonces A vale log 1 = 0.
Esta relacin indica que la absorbancia aumenta en forma lineal con la
concentracin (con un paso ptico constante), mientras que la transmitancia disminuye
en forma exponencial. Estas ecuaciones slo son vlidas si la radiacin incidente es
monocromtica y la absorcin ocurre en un volumen de seccin transversal uniforme.
Espectrofotmetro
El espectrofotmetro es un instrumento que permite comparar la radiacin
absorbida, o transmitida, por una solucin que contiene una cantidad desconocida de
soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.
Cuando se desea estimar la longitud de onda absorbida por un compuesto puro,
el aparato permite variar la longitud de onda (espectro visible y UV cercano) del rayo de
luz que incidir sobre una solucin de este, y medir en una fotocelda la intensidad de la
luz que logra traspasarla. Con los datos obtenidos se construye un espectro de
absorcin. Esto es, una representacin grfica que indica la cantidad de luz absorbida a
diferentes valores de , manteniendo constantes el camino ptico recorrido (b) y la
concentracin (c).
A partir de una solucin diluida de un compuesto, cuya absorbancia mxima
entra dentro del rango de medida del espectrofotmetro, se ver el valor de absorbancia
a diferentes longitudes de onda frente a un blanco que contenga el disolvente de la
solucin de la muestra a caracterizar. A partir del espectro de absorcin se obtendr el
valor de al que el compuesto presenta la mayor absorbancia (max). Dicho se
utilizar a la hora de hacer determinaciones cualitativas y cuantitativas del compuesto.

Fig. 2. Espectro de absorcin del p-nitrofenil fosfato en agua

El espectro de absorcin de un cromforo depende, fundamentalmente, de la

estructura qumica de la molcula. No obstante, hay una gran cantidad de factores que
originan variaciones en los valores de max y , entre los que se incluye el pH, la
polaridad del solvente o molculas vecinas y la orientacin de los cromforos vecinos.
Una vez obtenido el valor de max para un compuesto puro, se debe construir
una grfica que exprese la relacin entre la absorbancia y la concentracin del
compuesto puro, denominada curva de calibracin. Para esto, se mide la absorbancia
A del compuesto a diferentes concentraciones de solucin. Estos valores de absorbancia
se representan en el eje de abscisas (eje de x) y los de concentracin en el eje de
ordenadas (eje de y). Se observar que, a bajas concentraciones, el aumento de
concentracin se corresponde con un incremento lineal en la absorbancia (zona de
cumplimiento de la ley de Lambert-Beer). A concentraciones altas la linealidad se
pierde y se observa que la lnea se aplana, por lo que las medidas son poco fiables.
Esta curva de calibracin permite estimar la concentracin de una muestra
desconocida del mismo compuesto, al interpolar la absorbancia que esta produce en la
recta obtenida.

Fig. 3. Curva de calibracin para una solucin de albmina srica bobina en = 700 nm y un paso
ptico de 1 cm.

Cintica enzimtica
Las enzimas son catalizadores biolgicos de naturaleza proteica. Una
determinada enzima (E) se combina con un determinado sustrato (S) formando un
complejo enzima sustrato (E-S), el cual se descompone para dar el producto (P) y la
enzima libre (E):

E+S

ES

E+P

La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas.

Estos estudios proporcionan informacin directa acerca del mecanismo de la reaccin
cataltica y de la especificidad de la enzima por el sustrato. La velocidad de una
reaccin catalizada por una enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en
muchos casos no es necesario purificar o aislar la enzima. El tiempo de incubacin,
concentracin de enzima, concentracin de sustrato, pH, presencia de cofactores,
temperatura del medio, etc., son factores que influyen en la cintica de reaccin. Por
esta razn la medida se realiza siempre en las condiciones ptimas de estos factores y se
utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de
reaccin observada es la velocidad mxima (Vmax). La velocidad puede determinarse
midiendo la aparicin de los productos o la desaparicin de los reactivos.

Las reacciones enzimticas se caracterizan porque aunque aumente la

concentracin de sustrato, la velocidad no aumenta linealmente, apareciendo un efecto
de saturacin. La saturacin ocurre cuando todos los sitios activos de la enzima estn
ocupados por sustrato.

Fig. 4. Variacin de la concentracin de las especies qumicas que participan en una reaccin
catalizada por enzimas, en funcin del tiempo.

Producto formado (pmoles)

La mayora de las reacciones biolgicas transcurren lentamente si no son

catalizadas. Las enzimas hacen que el equilibrio de esas reacciones sea alcanzado
rpidamente.
Al seguir la velocidad de aparicin de producto (o de desaparicin del sustrato)
en funcin del tiempo se obtiene la llamada curva de avance de la reaccin, curva de
progreso o simplemente, la cintica de la reaccin. Para estimarla, es necesario elegir un
intervalo de lectura que sea vlido para un rango amplio de concentraciones de enzima,
y donde la concentracin de sustrato no sea limitante, de modo tal que se logre ocupar
todos los sitios activos en las molculas de enzima, alcanzando un punto de saturacin.
As, a medida que la reaccin transcurre, la velocidad de acumulacin del producto va
disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato, hasta llegar a un mximo de
produccin por intervalo de tiempo (Fig. 5). La pendiente de esta curva corresponde a la
velocidad inicial de reaccin (Vo) a tiempo cero. Se aprecia que, inicialmente la
velocidad se mantiene constante (la curva es una recta) y que posteriormente sta
decae.
Dado que la velocidad disminuye hasta hacerse constante, se mide la velocidad
inicial de la reaccin (Vo). De esta forma, la medida de Vo se realiza antes de que se
consuma el 10% del total del sustrato, de manera que pueda considerarse la
concentracin de sustrato como esencialmente constante a lo largo del experimento.
Adems, en estas condiciones no es necesario considerar la reaccin inversa, ya que la
cantidad de producto formada es tan pequea que la reaccin inversa apenas ocurre.

Tiempo transcurrido
(min)

Fig. 5. Curva de progreso a distintas concentraciones de enzima.

Fig. 6. Curva de Progreso de la reaccin

As: Vo = Cantidad de sustrato consumido (o producto formado) (moles, mmoles)

Tiempo (min, hr)

Existen dos tipos de ensayos enzimticos:

a) Ensayo de tiempo fijo: en este ensayo se detiene la reaccin enzimtica despus de
un tiempo determinado y se mide la concentracin de producto formado o de
sustrato consumido. Este tipo es el ms sencillo y el ms utilizado.
b) Ensayo cintico: es este caso se determina la concentracin de sustrato o de
producto en forma continua durante el transcurso del ensayo o a una serie de
tiempos muy prximos. Se obtienen grficos como el de la figura 1, con pendiente
positiva para las determinaciones de producto o de pendiente negativa para las
determinaciones de sustrato.
Para estudiar la cintica enzimtica se mide el efecto de la concentracin inicial
de sustrato sobre la velocidad inicial de la reaccin, manteniendo la cantidad de enzima
constante. Es decir, se utiliza slo el rango de tiempo en el cual la velocidad de reaccin
se mantiene constante. Si se representa la velocidad de reaccin frente a la
concentracin de sustrato se obtiene una hiprbola rectangular, cuya expresin
matemtica se conoce como Ecuacin de Michaelis-Menten (figura 7). A bajas
concentraciones de sustrato la velocidad inicial es directamente proporcional a dicha
concentracin. Cuando la concentracin inicial de sustrato es pequea, la velocidad
inicial es directamente proporcional a la concentracin de sustrato, y por tanto, la
reaccin es de primer orden. Cuando la concentracin de sustrato es muy elevada, la
velocidad de reaccin tiende a un lmite superior conocido como velocidad mxima
(Vmax). La enzima se encuentra saturada por el sustrato, y la velocidad ya no depende
de la concentracin inicial de sustrato. En este punto, la reaccin es de orden cero.

Figura 7. Curva de velocidad a concentracin saturada de sustrato

El parmetro Km se denomina constante de Michaelis-Menten y es la

concentracin de sustrato a la cual la enzima funciona a la mitad de su velocidad
mxima. En efecto, si Km = [S], la ecuacin de Michaelis-Menten se reduce a v =
Vmax/2.
La representacin de Lineweaver-Burk, como transformacin lineal de la
ecuacin de Michaelis-Menten permite obtener de manera fiable la Vmax y Km. En la
representacin de Lineweaver-Burk se presentan los inversos de las velocidades
enzimticas obtenidas frente a los inversos de las respectivas concentraciones de
sustrato. Se obtiene as una recta cuyo corte con el eje de abscisas equivale a vale
1/Km y con el eje de ordenadas a 1/Vmax. La pendiente es Km/Vmax.
De esta forma, a partir de los datos experimentales se puede calcular
grficamente, los valores de Km y Vmax de un enzima para diversos sustratos.

Fig. 8. Grfico de dobles recprocos de Michaelis-Menten.

La constante de Michaelis-Menten (Km) es un parmetro cintico importante,

que permite evaluar la afinidad de la enzima por el sustrato. A menor Km, mayor
afinidad del enzima por el sustrato, y a mayor Km, menor afinidad. La Km del sustrato
natural es menor que la de los sustratos anlogos. Si dos sustratos de la misma enzima
tienen distinta Km, el que presente mayor Km tiene menor afinidad por la enzima, y la
reaccin transcurre siempre a menor velocidad que con el sustrato de menor Km, salvo
a concentraciones saturantes de sustrato, donde la V = Vmax. Los valores de Km de
muchas enzimas son prximos a los de la concentracin fisiolgica de sus sustratos, de
forma que pequeas variaciones en la [S] pueden suponer grandes cambios en la
velocidad de toda una ruta metablica.
En el presente prctico, se estudiar en primer lugar la cintica de aparicin de
producto para la reaccin de la fosfata cida, usando un ensayo de tipo cintico. Ello
nos permitir determinar el tiempo durante el cual la velocidad inicial de reaccin se
mantiene constante. Por otra parte, como la velocidad de la reaccin depende de la
cantidad de enzima presente en el medio de ensayo, se determinar la concentracin de
enzima apropiada para el ensayo.
En segundo lugar, utilizando un ensayo de tiempo fijo, se determinar la
constante de Michaelis-Menten (Km) para el sustrato.

TRABAJO PRCTICO
DETERMINACIN DE ACTIVIDAD ENZIMTICA
Para la determinacin de la actividad enzimtica se utilizar como modelo de
trabajo la enzima fosfatasa. Esta enzima es de gran inters prctico en clnica humana.
Las fosfatasas (ortofosfrico monoster fosfohidrolasa), son enzimas ampliamente
distribuidas en los sistemas biolgicos, que hidrolizan el enlace ster fosfrico entre un
grupo fosfato y un radical orgnico, liberando fosfato inorgnico. Existen dos tipos de
fosfatasas: alcalinas y cidas. Las alcalinas funcionan a pH bsico (pH ptimo entre 9 y
10) estn presentes en rin, hgado, intestino y hueso. Su concentracin en suero
aumenta en las enfermedades hepatobiliares y seas, entre otras. La medida de niveles
anormales indican la existencia de enfermedades seas degenerativas (raquitismo,
osteomalacia, hiperparatiroidismo secundario, osteosarcoma) o bien daos hepticos. El
aumento fisiolgico de los niveles plasmticos de fosfatasa alcalina se produce en
animales en fase de crecimiento (se est formando tejido seo) o en hembras gestantes
(fosfatasa alcalina de la placenta). El grado de destruccin o dao celular guarda
relacin con la cantidad de enzima presente en suero. La fosfatasa cida no tiene su
funcin an bien conocida, encontrndose principalmente en la glndula prosttica del
adulto y en los eritrocitos. Una fosfatasa cida srica elevada sugiere casi siempre un
carcinoma metastsico, como puede verse en el 80 % de los casos de carcinoma
prosttico.
Como sustrato de la fosfatasa cida utilizaremos un compuesto artificial, el pnitrofenil-fosfato (pNPP), que posee un grupo fosfato en su estructura que es
reconocido e hidrolizado por la enzima fosfatasa cida. El sustrato al ser hidrolizado
origina un producto, el p-nitrofenol (pNP), que es coloreado en medio alcalino y
absorbe a una longitud de onda de 405 nm, por lo que su aparicin en el transcurso de la
reaccin puede seguirse colorimtricamente.
Es posible detener la reaccin de la fosfatasa cida mediante la adicin de
concentraciones elevadas de NaOH, o agregando a la reaccin un exceso de fosfato, que
inhibir la actividad enzimtica.

Reaccin enzimtica Fosfatasa pNPP

ACTIVIDADES:
I. Anlisis de datos.
En esta parte del trabajo, usted analizar los resultados de ensayos de tipo
cintico para fosfatasa cida obtenidos por el profesor. Cada grupo de trabajo debe
determinar la concentracin ptima de enzima a utilizar para los ensayos siguientes y
obtener la curva de calibracin para p-nitrofenol.
Para la realizacin de los ensayos realizados y propuestos, se utiliza una
preparacin comercial de fosfatasas cidas, extrada de germen de trigo (Sigma).

MATERIALES Y MTODOS
Ensayo 1: Curva de calibracin para p-nitrofenol.
Se realiz un ensayo espectrofotomtrico para determinar la relacin entre
cantidad de p-nitrofenol (moles p-nitrofenol) y Absorbancia (A, 405 nm). La curva
permitir establecer la cantidad de producto formado en una reaccin enzimtica, a
intervalos de tiempos determinados y en condiciones ptimas de pH y temperatura.
Se tom 6 tubos de ensayo y se agreg 0, 1, 2, 3, 4 y 5 ml de una solucin 60
M de p-nitrofenol (preparada en NaOH 20 mM), respectivamente. Luego, a cada tubo
se aadi suficiente solucin de NaOH 20 mM hasta completar un volumen final de 5
ml. La solucin obtenida fue mezclada y transferida a un tubo de espectrofotmetro y
se midi la absorbancia a 405 nm. El tubo sin p-nitrofenol, fue utilizado como blanco
para ajustar la absorbancia del colormetro a cero.
Ensayo 2: bsqueda de una dilucin adecuada de enzima y Curva de progreso.
El ensayo enzimtico que se utiliza para fosfatasas normalmente es un ensayo de
tiempo fijo, por lo que se debe determinar en primer lugar la dilucin adecuada de
enzima, de modo de obtener una velocidad de aparicin de producto (Vo) constante
durante el tiempo de ensayo. Esto es de vital importancia en el caso de fosfatasas,
debido a que sufren inhibicin por producto.
Dos diluciones de extracto enzimtico fueron preparadas a partir de una solucin
stock de 1 mg/ml. Para esto se tom 0,5 ml de la solucin stock y se complet a 5 ml
con una solucin de BSA al 0,1%. De esa manera obtuvo una dilucin 1:10 del extracto
enzimtico, con concentracin de 0,1 mg/ml. Desde esta dilucin 1:10, se tom una
alcuota de 0,5 ml y se agreg 4,5 ml de una solucin de BSA al 0,1%, obteniendo una
dilucin enzimtica 1:100 (concentracin de la enzima 0,01 mg/ml).
Se prepar 3 tubos, que contenan 2 ml de tampn 0.1 M citrato (pH 4,8) y 2 ml
de 2,5 mM p-nitofenil fosfato disdico (pNPP). Los tubos fueron incubados durante
unos minutos en un bao termoregulado a 37C, para permitir que la solucin alcanzara
la temperatura del ensayo.
La reaccin fue iniciada mediante la adicin de 1 ml de la dilucin enzimtica
indicada anteriormente (sin diluir, dilucin 1:10 y 1:100) en cada tubo, respectivamente.

La mezcla de reaccin fue homogeneizada por agitacin del tubo e inmediatamente se

tom una alcuota de 0,5 ml de cada mezcla, la que fue transferida a otro tubo de ensayo
con 4,5 ml de NaOH 0.1M. La adicin de NaOH detiene la reaccin y proporciona el
medio de pH alcalino, adecuado para la determinacin de p-nitrofenol. Esta muestra
corresponde al valor de tiempo cero.
Luego de 10, 20, 30 y 40 minutos de iniciada la reaccin, se repiti el
procedimiento anterior, tomando alcuotas de 0,5 ml de cada medio de reaccin, que
fueron transferidos a tubos de ensayo con 4,5 ml de NaOH 0.1 M.
Se determin la absorbancia de los tubos a 405 nm. Como blanco se utiliz un
tubo que no contena extracto enzimtico (tubo 0 de la curva de calibracin para pnitrofenol).

Resultados:
Ensayo 1: Curva de calibracin para p-nitrofenol.

Tubo
1
2
3
4
5
6

Volumen (ml)
60 M pNP
0
1
2
3
4
5

Concentracin
moles pNP

Absorbancia
405 nm
0,000
0,151
0,296
0,460
0,594
0,746

a) Grafique Abs 405 nm (eje y) versus moles de p-nitrofenol en la muestra (eje x).
Recuerde que la curva de calibracin obtenida ser posteriormente utilizada para la
determinacin enzimtica de la fosfatasa cida.
b) De acuerdo a los resultados obtenidos, indique si la determinacin de p-nitrofenol
obedece la Ley de Lambert-Beer.

Ensayo 2: Bsqueda de una dilucin adecuada de enzima y curva de progreso.

Tiempo
(minutos)
0
10
20
30
40

Absorbancia 405 nm
Dilucin 1:10
Extracto enzimtico
(0,1 mg/ml)
(1 mg/ml)
0,091
0,013
0,389
0,059
0,638
0,102
0,835
0,149
0,926
0,184

Dilucin 1:100
(0,01 mg/ml)
0,009
0,022
0,027
0,033
0,135

Utilizando la curva de calibracin para p-nitrofenol, determine la cantidad de

producto formado luego de 10, 20, 30 y 40 min de ensayo. Antes de ello, debe restar la

absorbancia determinada para cada tubo a tiempo 0 a cada uno de los tubos de la serie.
Este valor de Abs distinto a 0 corresponde a coloracin propia de cada mezcla de
reaccin, debido probablemente al extracto enzimtico o degradacin de sustrato.

Tiempo
(minutos)
0
10
20
30
40

moles p-nitrofenol producidos

Dilucin 1:10
Dilucin 1:100
Extracto enzimtico
(0,1 mg/ml)
(0,01 mg/ml)
(1 mg/ml)

c) Grafique la cantidad de producto formado versus tiempo. Decida con cul de las
diluciones enzimticas empleadas se observa un aumento constante en la formacin
del producto (pNP) durante el tiempo de ensayo. Utilice la dilucin enzimtica
seleccionada para sus futuras determinaciones.
e) Calcule la velocidad inicial de reaccin (Vo) en cada caso.
[NOTA: Para la realizacin de los clculos de la cantidad de p-nitrofenol formado, no
olvide que el volumen del ensayo es de 5 ml y que la alcuota del ensayo utilizada (0,5
ml) fue diluida a 5 ml para la determinacin de producto (absorbancia a 405 nm)].