La Citometra de flujo:

diagnstico y pronstico en las

hemopatas malignas

I Simposio Internacional de Hemato-Oncologia.

San Jos, 21 julio 2011

Citometra de flujo

Cito : Clula , metra: medicin.

Citometra de flujo

Es el estudio de la expresin de
los genes a travs de sus
productos: las protenas.

DIANAS TCNICAS
Celular: Citologa/Morfologa
Inmunofenotipo

Tejidos: histopatologa
Cromosomas:
Genes:

Citogentica
FISH

PCR (Reaccin en cadena polimerasa).

FISH (Fluorescent in situ hybridation).

TCNICAS DE ANLISIS CELULAR

Anlisis
Informacin
Informacin
basada en
en
basada

Clula

Localizacin
de las clulas
Velocidad
Tipo
Tipo de
de
informacin
informacin
MultiMulti
paramtrica

Baja

Citometra
de flujo
Clula

Biologa
molecular

Media
Media de
de la
la muestra
muestra

No

No
No

Alta

Alta
Alta

Cualitativa Cualitativa
Cuantitativa
Cunatitativa

Cualitativa
Cuantitativa
Cunatitativa
No

PROCEDIMIENTO
Dispersin lateral
(complejidad interna)
Dispersin
frontal
LASER

(Tamao)

PROCEDIMIENTO
1110
0010
1011
0010
0101
0010
1001
0101
1010
1010

DISPERSIN LATERAL

Eosinofilos

Neutrfilos
Monocitos
CD34+

CD45 PERCPCY5.5

Serie Eritroide

Linfocitos

UTILIDAD EN LA HEMATO-ONCOLOGA
1.Diagnstico
Normal reactiva/regeneracin malignidad
2.Clasificacin de las hemopatas
- asignacin de lnea
- estadio de diferenciacin
- relacin con el pronstico
3.Evaluacin de la efectividad del tratamiento:
Deteccin de la enfermedad mnima residual
(EMR):
EMR-estratificacin de grupos de riesgo
(reduccin o intensificacin del tratamiento)

UTILIDAD EN LA HEMATOONCOLOGA

Sndromes mielodisplsicos
(SMD)

SMD: CONTRIBUCIN DEL

INMUNOFENOTIPO
La contribucin del inmunofenotipo para el
diagnstico de los SMD permanece limitada.
OMS 2008: El inmunofenotipo en los SMD
puede ser de utilidad diagnstico/pronstico
( en el futuro).

Criterios para el diagnstico de

SMD.
Prerrequisitos:

1.Citopenia prolongada ( 6 meses) : Hemoglobina < 10g/dL , <

1800 neutrfilos /ul y plaquetas < 100.000/ul
2.Excluir otras enfermedades.

Criterios diagnsticos :

1.Observacin morfolgica de displasia en >10% serie roja y/o

neutrfilos y/o megacariocitos.
2.Identificacin de anormalidades citogenticas caractersticas.
3.Porcentaje de blastos entre 5% a 19%.

Co-criterios diagnstico:

1.Anormalidades inmunofenotpicas.
2.Pruebas de inactivacin del cromosoma X (Test humara).
Valent et al, Leuk Res, 2007

APORTE INMUNOFENOTPICO EN
SMD
Diagnstico

-Sospecha de SMD

Subclasificacin de SMD
-AR vs CRDM
-AREB (% de blastos).

Evaluacin pronostica

-Implementacin de sistemas de puntos.

Monitoreo de la enfermedad

-Seguimiento de las anormalidades inmunofenotpicas luego de la

terapia.

HEMATOPOYESIS
Mdula sea

T/NK cell precursor

Sangre perifrica tejidos

B-cell
precursor

Clula madre
hematopoy?ca

pDC
precursor

Precursor
linfoide

Neutrlos

G-CSF

IL7

CFU-GM
GM-CSF

SCF

CFU-G

M-CSF

CFU-Eo

clulas dendr?cas

Monocito/
Macrfago/DC

CFU-M
Eosinlos

CFU-MC

IL3

Mastocito
Precursor
mieloide
IL11
TPO

CFU-Bs
IL9
EPO

Baslos
BFU-E
Eritrocitos
CFU-Mk
Plaquetas

DISTRIBUCIN DE LAS DIFERENTES POBLACIONES EN MO

Subpoblaciones

MO normal
(n=12)

% CD34+

1.1 + 0.6 (0.3-2.6)

% CD34+ y/o CD117+

2.2 + 1.4 (0.6-6)

% Serie Roja
% Neutrfilos

4.7 + 2.1 (2-9)

67 + 6.1 (57-80)

% Monocitos

4.3 + 1.4 (2-6.5)

% Eosinfilos

2.5 + 1.3 (0.8-5)

% Basfilos
% Mastocitos

0.4 + 0.7 (<0.1-2.4)

0.02 + 0.01 (<0.03)

% Plasmocitos

0.2 + 0.2 (0.01-0.5)

% Clulas B maduras

2.9 + 1.5 (1.6-6.3)

% Precursores - B
% Linfocitos - T

0.9 + 0.8 (0.1-3.9)

9.2 + 4.5 (2.6-18)

% Clulas NK

2.8 + 1.4 (0.7-5)

FITC

PE

PerCP.Cy5.5

APC

cControl

cControl

CD45

CD34

nTdt

cMPO

CD45

CD34

cCD3

CD7

CD45

CD34

CD19

cCD79a

CD45

CD34

sControl

sControl

CD45

CD34

HLA-DR

CD117

CD45

CD34

HLA-DR

CD123

CD45

CD34

CD11b

CD13

CD45

CD34

CD15

CD16

CD45

CD34/CD10

CD36

CD64

CD45

CD34/CD14

CD33

CD61

CD45

CD34

CD71

GphA

CD45

CD34

CD65

7.1

CD45

CD34

CD2

CD56

CD45

CD34

c2D7

CD203c

CD45

CD34

CD45

CD34

cB12

Patrn normal de maduracin de lnea

neutrfilo en Mdula sea (MO).
MYELOBLASTO

PROMIELOCITO

MIELOCITO

METAMIELOCITO

BANDA/
NEUTROFILO

CD13

CD13

CD15

103

CD11b

CD33

CD35
102

CD65

CD64

CD10
101

CD16

CD34

HLA-DR

CD117

CD54

4 estadios maturativos
1,40,7

11,0 2,7

28,6 5,6

58,5 -6,1

CD13

+/-

+/+

-/-

-/+

100
101
102
CD11b FITC ->
CD11b
11b/1 17/DR/1 3.108

CD11b

103

104

100
101
CD13 APC ->
11b/1 17/DR/1 3.108

102

CD13

103

104

4 estadios maturativos

Citometra de flujo (CF) en SMD.

Qu subpoblaciones analizar ?
Generalmente blastos; neutrfilos y monocitos.
Menos frecuente : serie roja y megacarioctica.

Qu anticuerpos y que combinaciones utilizar ?.

Cules alteraciones fenotpicas deben ser
consideradas?.
Aumento de las poblaciones
Intensidad de fluorescencia
Asincronismo madurativo

Definir un modelo de clasificacin ?.

Citometra de flujo en SMD.

Van de Loosdrecht et al, Haematologica, 2009

PARAMETRS A CONSIDERAR
POR CF EN SMD
1. Recuento de blastos.
2. Deteccin de fenotipos aberrantes en
blastos, mieloblastos y precursores B.
3. Identificacin de alteraciones en el
patrn de maduracin en las poblaciones
de neutrfilos, monocitos y clulas
eritroides maduras.
4. Enumeracin de las alteraciones/
defectos fenotpicos identificados.
(Clasificacin fenotpica).

PARAMETRS A CONSIDERAR
POR CF EN SMD
1. Recuento de blastos.
2. Deteccin de fenotipos aberrantes en
blastos, mieloblastos y precursores B.
3. Identificacin de alteraciones en el
patrn de maduracin en las poblaciones
de neutrfilos, monocitos y clulas
eritroides maduras.
4. Enumeracin de las alteraciones/
defectos fenotpicos identificados.
(Clasificacin fenotpica).

SMD
OMS 2008: Grupo de enfermedades
que presentan alteraciones clonales
en la clula madre hematopoyetica ,
caracterizadas por citopenias,
displasias.

CLULAS MADRE (CD34+)

Clula madre
Mieloblasto

Proeritroblasto

DISPERSIN LATERAL

Precursores
linfoide Megacarioblasto

CD34+ HPC:

Pre-B

Inmaduras

Neutrfilos

IDENTIFICACIN DEL COMPROMISO DE

LNEA DE LAS CLULAS CD34+

10 1

10 2

CD34 APC

10 3

10 4

104
103
102

CyMPO PE

768
512

10

256

101

1024

10 0

DISPERSIN
LATERAL
TRANSFORMED
SSC

1024
768
512
256
0

TRANSFORMED
SSC
DISPERSIN
LATERAL

Precursores de neutrfilos

100

10 0
101

102

103

CD45 PERCP

104

10 1

10 2

10 3 10 4

nTDT FITC

Precursores B
Matarraz S et al. Leukemia 2008

COMPROMISO INMUNOFENOTPICO
DE LAS CD34+HPC
SUBPOBLACIN

Serie Roja

15% (5%-35%)

Megacariocitos

Neutrlos

31% (12-39%)

Eosinlos

Baslos

<1% (<1%-3%)

Monocitos

5% (3%-15%)

Mastocitos

<1% (<1%)

pDC

6% (1%-15%)

Linfocitos B

23% (<1%-45%)

Total:

FRECUENCIA
<1%
<1%

81%

Utilidad de la CF en SMD
(subpoblacin de las clulas CD34).
Cuantificacin de las clulas CD34+ es de utilidad para la
clasificacin de los SMD:
Fuchigami K et al Leuk Res 2000; 24
Ogata K et al Blood 2002; 100, Blood 2006;108
Del Caizo et al Haematologica 2003;88
Orfao et al Cytometry A 2004; 58
Mararraz et al Leukemia 2008.

Anormalidades inmunofenotpicas recurrentes detectadas en

clulas CD34+
CD34+ progenitores mieloides:
Aumento relativo y absoluto de CD34+
Expresin de CD117
Expresin de CD5, CD7, CD19, CD56
Disminucin de CD45
Aumento anormal de la intensidad de CD34+
Disminucin de CD38
CD34+ precursores B
Disminucin de las clulas CD34+/CD10+

ALTERACIONES EN SMD PARA LAS CLULAS

CD34+

DISPERSIN LATERAL

MO normal

DISPERSIN LATERAL

Citopenia refractaria con displasia multilineal

(CRDM)

2.3%

0.97%

DISPERSIN LATERAL

Anemia refractaria con exceso de blastos

(AREB-1)

6%

CyMPO PE

CD34+ EN SMD

104

MO NORMAL

Anemia refractaria
(AR)
LMA 2daria A SMD

103

nTDT FITC

10

10

10

10

10

nTDT FITC

CyMPO PE

nTDT FITC
AREB-2

nTDT FITC

CyMPO PE

100

101

CyMPO PE

102

CyMPO PE

CRDM

nTDT FITC

PARAMETRS A CONSIDERAR
POR CF EN SMD
1. Recuento de blastos.
2. Deteccin de fenotipos aberrantes en
blastos, mieloblastos y precursores B.
3. Identificacin de alteraciones en el
patrn de maduracin en las poblaciones
de neutrfilos, monocitos y clulas
eritroides maduras.
4. Enumeracin de las alteraciones/
defectos fenotpicos identificados.
(Clasificacin fenotpica).

MADURACIN NORMAL
DE NEUTRFILOS

Patrn normal de maduracin de lnea

neutrfilo en Mdula sea (MO).
MYELOBLASTO

PROMIELOCITO

MIELOCITO

METAMIELOCITO

BANDA/
NEUTROFILO

CD13

CD13

CD15

103

CD11b

CD33

CD35
102

CD65

CD64

CD10
101

CD16

CD34

HLA-DR

CD117

CD54

Patrn normal de maduracin de lnea

neutrfilo en Mdula sea (MO).

Fin

CD13-PE

CD13-PE

Inicio

CD11b-FITC

CD11b-FITC

DIFERENCIACIN EN NEUTRFILO
Fin

Inicio

MO NORMAL

CD13-PE

?
CD11b-FITC

Hipogranularidad en neutrfilos
MO NORMAL
DISPERSIN LATERAL

DISPERSIN LATERAL

SMD

DISPERSIN FRONTAL

DISPERSIN FRONTAL

PARAMETRS A CONSIDERAR
POR CF EN SMD
1. Recuento de blastos.
2. Deteccin de fenotipos aberrantes en
blastos,mieloblastos y precursores B.
3. Identificacin de alteraciones en el
patrn de maduracin en las poblaciones
de neutrfilos, monocitos y clulas
eritroides maduras.
4. Enumeracin de las alteraciones/
defectos fenotpicos identificados.
(Clasificacin fenotpica).

Clasificacin Inmunofenotpica de los SMD

Sistema de Puntos:
Wells et al, Blood, 2003.
Ogata K et al , Blood, 2006.
Matarraz S et al, Leukemia, 2008

-Alteraciones fenotpicas en las clulas mieloides

(mieloblastos , monocitos y neutrfilos en maduracin)
-Score (Puntaje) Inmunofenotpico:
0-1: normal-leve
2-3: moderado
4-9: displasia severa
Puntaje

Definicin

0 puntos
1 puntos
2 puntos

Sin aberraciones fenotpicas en todas las subpoblaciones analizadas.

-Una aberracin presente en granulocitos o monocitos
-Una aberracin presente en las dos lneas granulocitos y monocitos o
-Expresin de CD34 o infidelidad de lnea en moncitos o granulocitos.
-Cuatro o ms aberraciones en granulocitos o monocitos
-Dos o tres aberraciones en granulocitos o monocitos
-Disminucin del la razn mieloide/linfoide
-porcentaje normal de mieloblastos (<5%) con aberraciones fenotpicas
-Aumento del porcentaje de mieloblastos anormales (5-10%)
-Aumento del porcentaje de mieloblastos anormales (11-20%)
-Aumento del porcentaje de mieloblastos anormales (>20%)

3 puntos
4 puntos
1 punto +
2 puntos +
3 puntos +
4 puntos +

Sistema inmunofenotpico en SMD

80-100% MO normal/reactiva vs Low-R vs High-R (Alteraciones).

100% MO normal/reactiva vs SMD. (Score inmunofenotpico).

Table 5. Example of a screening panel for 4-color flow cytometry of dysplasia in myelodysplastic
syndromes

van de Loosdrecht, A. A. et al. Haematologica 2009;94:1124-1134

Copyright 2009 Ferrata Storti Foundation

UTILIDAD DE LA CITOMETRIA EN SMD

MUESTRAS
-Mdula sea (morfologa ?)
-< 24 horas
-Heparina (EDTA CD10/CD11b/CD16)
-Temperatura ambiente.
- Historia clnica.

Comentarios finales
-El nmero y las aberraciones detectadas en las clulas
CD34+ en los pacientes con SMD estn relacionadas
directamente con la categora y pronstico de la
enfermedad.
-Las alteraciones que se producen en una clula madre clonal
se traduce en una hematopoyesis que presenta patrones
alterados en la maduracin mieloide; caracterstica siempre
presente en los SMD.
-Con la ayuda de la CF se permite una mejor distincin entre
una AR con displasia unilineal vs CRDM.

Comentarios finales
-El nmero y las aberraciones detectadas en las clulas
CD34+ en los pacientes con SMD estn relacionadas
directamente con la categora y pronstico de la
enfermedad.
-Las alteraciones que se producen en una clula madre clonal
se traduce en una hematopoyesis que presenta patrones
alterados en la maduracin mieloide; caracterstica siempre
presente en los SMD.
-Con la ayuda de la CF se permite una mejor distincin entre
una AR con displasia unilineal vs CRDM.

Comentarios finales
-El nmero y las aberraciones detectadas en las clulas
CD34+ en los pacientes con SMD estn relacionadas
directamente con la categora y pronstico de la
enfermedad.
-Las alteraciones que se producen en una clula madre clonal
se traduce en una hematopoyesis que presenta patrones
alterados en la maduracin mieloide; caracterstica siempre
presente en los SMD.
-Con la ayuda de la CF se permite una mejor distincin entre
una AR con displasia unilineal vs CRDM.

Comentarios finales
-El nmero y las aberraciones detectadas en las clulas
CD34+ en los pacientes con SMD estn relacionadas
directamente con la categora y pronstico de la
enfermedad.
-Las alteraciones que se producen en una clula madre clonal
se traduce en una hematopoyesis que presenta patrones
alterados en la maduracin mieloide; caracterstica siempre
presente en los SMD.
-Con la ayuda de la CF se permite una mejor distincin entre
una AR con displasia unilineal vs CRDM.

Comentarios final.
La Citometra de Flujo no
es diagnstico en SMD pero
si

SERVICIO DE CITOMETRIA, DEPARTAMENTO DE MEDICINA

Y CENTRO DE INVESTIGACIN DEL CNCER (IBMCC)
UNIVERSIDAD DE SALAMANCA

LABORATORIO
DE INVESTIGACIN

GRACIAS

NOVEDADES

OBJETIVO
Desarrollo y
estandarizacin de los
tests que se llevan a cabo
en la citometra para el
diagnstico y clasificacin
pronstica de las
patolgias hematolgicas
as como para la evaluacin
de la efectividad del
tratamiento.

Reproducibilidad y resultados objetivos

Objectives of EuroFlow

Development and validation of new antibodies and detection

techniques

immunobead technology for fusion proteins

FRET technology for intracellular detection of fusion proteins
antibodies against (overexpressed) oncoproteins, novel prognostic
markers,
and differentiation markers (e.g. identified via gene
expression profiling)

Development and standardization of 8-color stainings

diagnosis, classification, and follow-up

ALL, AML/MDS, CLL, NHL, and MM

Development and testing of novel flow cytometry software

fast and easy handling of complex data sets

easy and automated recognition of staining patterns (novel vs.
malignant)
integration in one software package

Objectives of EuroFlow

Development and validation of new antibodies and detection

techniques

immunobead technology for fusion proteins

FRET technology for intracellular detection of fusion proteins
antibodies against (overexpressed) oncoproteins, novel prognostic
markers,
and differentiation markers (e.g. identified via gene
expression profiling)

Development and standardization of 8-color stainings

diagnosis, classification, and follow-up

ALL, AML/MDS, CLL, NHL, and MM

Development and testing of novel flow cytometry software

fast and easy handling of complex data sets

easy and automated recognition of staining patterns (novel vs.
malignant)
integration in one software package

Multi-tube EuroFlow classification panel for AML/MDS

Responsible scientist: VHJ van der Velden
Pacific
Blue

Pacific
Orange

FITC

PE

PerCPCy5.5

PE-Cy7

APC

HLADR

CD45

CD16

CD13

CD34

CD117

CD11b

HLADR

CD45

CD35

CD64

CD34

CD117

IREM2

CD14

Diagnosis and
subclassification of AML
and PNH especially
focussed on monocytic
lineage

HLADR

CD45

CD36

CD105

CD34

CD117

CD33

CD71

Diagnosis and
subclassification of AML
especially focused on
erythroid lineage

HLADR

CD45

nuTdT

CD56

CD34

CD117

CD7

CD19

Aberrant expression of
lymphoid-associated
markers and abnormal
lymphoid maturation

Tube

APCH7

Aim**

AML/
MDS
CD10

Diagnosis and
subclassification of AML
and PNH especially focused
on neutrophilic lineage

* Further information about the markers and the availability of hybridoma clones is summarized in Appendix A. Backbone markers are indicated in bold; nu= nuclear.
** The described marker combinations might also be applied for disease staging and monitoring of treatment effectiveness (MRD diagnostics)

N-DIMENSIONAL NEUTROPHIL MATURATION IN

NORMAL BM
Myeloblasts

Promyelocytes

Neutrophils
Bands

Myelocytes

Metamyelocytes

N-DIMENSIONAL NEUTROPHIL MATURATION IN

NORMAL BM
Myeloblasts

Promyelocytes

Neutrophils
Bands

Metamyelocytes

HLADRPE

CD117PE

CD45PO

CD15FITC

CD11bAPC

CD16FITC

CD10APC

CD38APC

CD13PE

CD34PerCP

Myelocytes

Maturation stage of neutrophil precursors in normal BM

HLADRPE

CD117PE

CD45PO

CD15FITC

CD11bAPC

CD16FITC

CD10APC

CD38APC

CD13PE

CD34PerCP

N-DIMENSIONAL NEUTROPHIL MATURATION IN

NORMAL BM

Maturation stage of neutrophil precursors in normal BM

N-DIMENSIONAL NEUTROPHIL MATURATION IN NORMAL BM VS

AML
Maturation stage of AML blasts

Aberrant phenotype of AML blasts

Aberrant markers
CD15

26.6

CD117

19.4

SSC

19.2

FSC

19.0

CD11b

6.0

EuroFlow consor7um aims at

innova7on in ow cytometry

REPRESENTACIN DE LA DIFERENCIACIN
HEMATOPOYETICA EN LA MO

A
Eosinfilos
Clulas precursores
inmaduras CD34+

Basfilos
pDC

CD34+ precursores
B

Monocitos

SSC

Serie roja
Linfocitos
maduros

CD45-PerCP

CD34- precursores B