FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LAS PROTEINAS A CORTO Y

LARGO PLAZO.
1. INTRODUCCIN

El aislamiento y la purificacin de una protena es a menudo perjudicial para su

estructura y actividad biolgica, en particular en el caso de las protenas
intracelulares que protegidos por el medio celular. Una serie de factores puede
causar dao a las protenas aisladas, incluyendo concentraciones de
macromolculas y compuestos de baja masa molecular, pH, fuerza inica,
potencial redox y la temperatura. Como consecuencia, las protenas pueden ser
covalente o no covalentemente modificados, dando como resultado cambios y / o
agregacin conformacionales. Ha sido habitual utilizar un denominado
estabilizador de protenas para mantener la conformacin nativa de las protenas
durante el aislamiento y almacenamiento [1-6].
La mayora de las protenas son slo marginalmente estables a pH neutro y la
temperatura ambiente y por lo tanto se desnaturalizan fcilmente por el aumento
de (de vez en cuando la disminucin de) la temperatura y la presin, por los
cambios de pH, adicin de urea, HCl de guanidina y sales caotrpicas, como
congelacin-descongelacin y liofilizacin procedimientos [7-10]. Se ha
demostrado que muchos aditivos, tales como azcares, ciertos aminocidos,
algunas aminas, y glicerol, estabilizan protenas contra estas tensiones [1129]. Sin embargo, en muchos casos el uso de estos aditivos es insuficiente para
estabilizar protenas por completo.
Congelacin-descongelacin y la liofilizacin son los mtodos ms comnmente
utilizados para el almacenamiento a largo plazo de las protenas,
aunque muchas protenas no son estables frente a estas tensiones [3034]. Recientemente, Carpenter y Crowe [ 30 ] examinaron una serie de
compuestos por sus efectos sobre la retencin de la actividad de la enzima sobre
congelacin-descongelacin y la liofilizacin . Aquellos compuestos que son
conocidos para estabilizar las protenas en la estabilizacin de las protenas
protegidas solucin de daos de congelacin-descongelacin y aquellos
compuestos que son conocidos para desnaturalizar o desestabilizar las protenas
mejorada dao debido a la congelacin-descongelacin .
Por lo tanto, se propuso que el mecanismo para la estabilizacin co-soluto de
protenas durante la congelacin-descongelacin es el mismo que el descrito para
la estabilizacin en el estado de solucin [30]. Por otro lado, los investigadores
encontraron que slo los sacridos protegidos protenas de dao de liofilizacin
[32,33,35,36]. Crowe et al. [37] lleg a la conclusin de estos resultados que las
tensiones derivadas de la liofilizacin son fundamentalmente diferentes de los
debidos a la congelacin-descongelacin.
En la estabilizacin in vitro de protenas por la co-solutos aparece a paralelo de los
medios para la estabilizacin de macromolculas que es utilizada por un nmero
de organismos que se adaptan a condiciones extremas, tales como alta
osmolalidad, la congelacin y la deshidratacin. Los organismos que viven en

condiciones de alta osmolaridad, o que son resistentes a la congelacin, se

acumulan una gran variedad de compuestos, llamados osmolitos, para elevar la
presin osmtica del citoplasma o servir como crioprotectores, respectivamente.
Estos compuestos son aparentemente no perturbadora a las macromolculas y
son tambin estabilizadores de protenas [38- 44]. Por otra parte, los compuestos
que son utilizados por organismos que pueden sobrevivir en baja actividad de
agua se limitan a disacridos [45-48]. Del mismo modo, para las soluciones in
vitro, las protenas y otros componentes biolgicos estn protegidos de la
deshidratacin solamente por estos azcares [35-37,49,50].
El mecanismo de proteccin y la estabilizacin de las protenas por glicerol y
azcares en solucin y durante la congelacin-descongelacin, a pesar de su
amplio uso, se conoce poco hasta que la investigacin por Timasheff y sus
colegas en la interaccin preferencial de protenas con componentes
disolventes.El anlisis experimental y terica de la estabilizacin y
desestabilizacin de las protenas en solucin de co-soluto inducida observado ha
demostrado que la interaccin protena-disolvente determina el efecto de los
compaeros de solutos en la estabilidad de las protenas, en lugar de la
interaccin directa de los solutos con protenas (revisado en [49-51]). Carpenter y
Crowe [35-38] demostraron que el mismo mecanismo se puede extender a la
estabilizacin de protenas en el estado congelado, pero no hasta el estado
seco. Claramente, los argumentos termodinmicos para la estabilizacin de
protenas en solucin no son aplicables cuando el agua se elimina del sistema.
El mecanismo de la estabilizacin de la protena por sacridos contra liofilizacin
tambin es poco conocido. Recientemente, Carpenter y Crowe [36,90] han
demostrado que la interaccin directa entre los azcares y protenas a travs de
enlaces de hidrgeno es esencial para el otro la estabilizacin observada.Esto se
ampli an ms por el trabajo colaborativo de Prestrelski, Arakawa, y Carpenter, lo
que demuestra que la deshidratacin de protenas a menudo induce cambios
conformacionales.
Sin embargo, la conformacin nativa se mantiene incluso en estado seco si la
protena se deshidrata en presencia de azcares de estabilizacin, es decir,
recuperacin de la actividad despus de la rehidratacin es dependiente de la
prevencin de los cambios conformacionales inducidos por secado.
En esta revisin, vamos a describir el conocimiento actual del mecanismo de
estabilizacin de la protena por varios compaeros de solutos en solucin y
durante -thawing congelacin y liofilizacin. A pesar de la estabilizacin a corto
plazo de las protenas se puede lograr mediante estos compaeros de solutos,
cada vez es ms evidente que se deben desarrollar mtodos para la estabilizacin
a largo plazo de las protenas en solucin y en estado seco.Muchas protenas
pueden ser producidas en grandes cantidades usando tcnicas de ADN
recombinante. Formulacin de solucin de estas protenas requiere que otros
factores (an ms importante) necesitan ser considerados para un
almacenamiento prolongado. Tambin vamos a revisar estos factores.

2. Factores que afectan la estabilidad del estado de solucin.

La discusin detallada del mecanismo de la estabilizacin de la protena en
solucin inducida por co-solutos se presentar ms adelante. En resumen, se ha
observado experimentalmente que existe una deficiencia en la estabilizacin de
co-soluto en la regin inmediata de la protena (en relacin con la solucin a
granel), y que la protena se excluye preferentemente de contacto con la superficie
de la protena. Por lo tanto, como Timasheff y sus colegas explican, la presencia
de estos co-solutos en una disolucin de protena crea una situacin
termodinmicamente desfavorable, ya que se aumentan los potenciales qumicos
de la protena y el aditivo. En otras palabras, un estado entrpicamente
desfavorable se produce cuando las molculas de co-soluto se excluyen
preferentemente del contacto con la protena. En consecuencia, la estructura
nativa de monmeros y la forma polimerizada de protenas oligomricas se
estabilizan porque la desnaturalizacin o disociacin dara lugar a una superficie
de contacto mayor entre la protena y el disolvente y, por lo tanto, aumentar este
efecto termodinmicamente desfavorable.
Los efectos de los co-solutos se pueden examinar de forma ms cuantitativa. Se
ha observado que la estabilizacin de las protenas por los co-solutos es
dependiente de la concentracin, y que la estabilizacin se hace evidente slo a
concentraciones relativamente altas de co-soluto (por ejemplo, .0.3 M). En tales
concentraciones altas, la interaccin no implica la formacin de complejos
estequiomtricos, pero representa las cantidades promediados de los
componentes presentes en el volumen de disolvente de forma permanente o
transitoria perturbado por la protena, que refleja tanto fuerte y dbil, as como
interacciones de atraccin y repulsin. Adems, la interaccin incluye la cantidad
de agua de unin (hidratacin) a la protena, ya que, por un sistema de tres
componentes, el parmetro de interaccin (3) se expresa a presin constante y la
temperatura por la ecuacin.(1) en la que los componentes de la solucin se
expresan mediante los subndices 1, 2 y 3 (componente 1=H 2O, componente
2=protena y componente 3=co-soluto), g 1 es la concentracin del componente i en
gramos por gramo de H2O, y Ai es la cantidad de componente i de unin
(interactuar) a la protena en gramos por gramo. (Por simplicidad, los subndices

Eq. 1

que expresan temperatura y presin constantes se omiten).

El 3 parmetro se puede determinar experimentalmente mediante dilisis de
equilibrio. En eq. (1), es evidente que, a alta concentracin de co-soluto, la
hidratacin de protenas hace una contribucin significativa al valor de interaccin
determinado experimentalmente. Ms importante an, la interaccin preferencial
(no la cantidad de unin real A3) es la interaccin que determina el efecto de la cosoluto en la estabilidad de la protena. Supongamos la siguiente desnaturalizacin
de equilibrio:

Donde N y D son las formas nativa y desnaturalizada de una protena,

respectivamente, y el equilibrio se expresa por una constante K (= [D] / [N]). La
energa libre de cada estado (GN y G D) se relaciona con K por:
-RT In K = GN - GD =G
eq. 2
Si expresamos con el subndice w los parmetros para una solucin de protena
en ausencia de co-soluto, la diferencia est dada por la ecuacin.(3):

Eq. 3

Cuando el 2Dy 2N son las energas libres de transferencia de la protena

desnaturalizada y nativa, respectivamente, a partir de agua a la solucin que
contienen co-soluto. La energa libre transferencia est relacionada con el
parmetro de interaccin preferencial desde entonces.

y
Donde Mi es el peso molecular del componente i, i es el potencial qumico, y m i
es la molalidad. Es decir, un valor negativo de parmetro de interaccin
preferencial, (m3 / m2), significa que el potencial qumico de la protena se
incrementa. La integracin de (2 / 3) con respecto a m3:

da la transferencia de energa libre de la protena a partir de agua a una solucin

acuosa con co-solutos. Por lo tanto, si se pueden determinar las interacciones
preferenciales para los estados nativas y desnaturalizadas como una funcin de
m3, a continuacin, 2 para ambos estados, es decir,2D y 2N se pueden
obtener.
El parmetro de interaccin preferencial (3) puede ser negativo, ya que, a altas
concentraciones de co-soluto, el trmino hidratacin en la ecuacin. (1) se
convierte en importante. En tal caso, el co-soluto se excluye preferentemente de la
protena. Si el co-soluto se excluye en mayor medida a partir de la protena
desnaturalizada,

entonces el co-soluto se estabilizar las protenas, ya

Aunque este mecanismo se aplica a la desnaturalizacin reversible de las

protenas, los mismos compaeros de solutos pueden estabilizar las protenas
frente a la desnaturalizacin irreversible y desactivacin. El proceso irreversible
puede ser mejor descrito como ND D', donde D' representa el producto de
una reaccin irreversible, tales como agregacin o modificacin qumica. Por lo
tanto, se espera que los estabilizadores co-solutos para ralentizar el proceso
desplazando el equilibrio hacia el estado nativo, como se ha observado.
Las mediciones de interaccin preferenciales han llevado a cabo para una
variedad de compaeros de solutos y varias protenas. Estas mediciones se
realizaron en la que siempre indicar la protena asume en las condiciones
experimentales. Cuando los compaeros de solutos son estabilizadores, los
valores experimentales se refieren al estado nativo. Cuando los compaeros de
solutos son desnaturalizantes fuertes y estn en concentraciones lo
suficientemente alta, los valores experimentales se refieren al estado
desnaturalizado. No es posible generar dos estados de una protena bajo
condiciones de solucin idnticos sin desnaturalizar irreversiblemente la protena,
y por lo tanto no hay valores experimentales estn disponibles para ambos
estados en condiciones idnticas.
Numerosos resultados experimentales de las mediciones de interaccin
preferenciales estn ahora disponibles para una variedad de estabilizadores de
protenas, incluyendo azcares (sacarosa, lactosa y glucosa), aminocidos
(glicina, alanina y prolina), aminas (betana y N-xido de trimetilamina), polioles
(manitol y sorbitol), y ciertas sales (amonio, sodio, y sulfato de magnesio). Aunque
estos compuestos difieren ampliamente en sus propiedades qumicas, una cosa
que tienen en comn es la exclusin preferencial de la superficie de las protenas
nativas. Tienen valores negativos de 3 y (m3 / m2) y, por tanto, los valores
positivos de (2 / 3).
Tomando la glucosa como ejemplo [23], los valores de (m3 / m2) se
determinaron a diversas concentraciones de glucosa y se represent frente m 3
(Fig. 1). Suponiendo una dependencia lineal, (m3 / m2) se integr grficamente
con m3 y la energa libre de transferencia as calculada se representa en la Fig.2.
Esto corresponde a la energa libre necesaria para la transferencia de la protena a
partir de agua a una solucin que contiene glucosa. Los valores son positivos y,
por lo tanto, la transferencia es termodinmicamente desfavorable. Como se
describe en la ecuacin 3, el efecto de la glucosa sobre la estabilidad de la
protena se determina por la diferencia de energa libre de transferencia entre los
estados nativa y desnaturalizada. Hasta el momento, estn disponibles para el
estado desnaturalizado no hay datos. La ha supuesto que la exclusin preferencial
ser mayor para el estado desnaturalizado. Con este supuesto, 3 [y (m3 / m2)]
es ms negativo para el estado desnaturalizado y por lo tanto (2 / 3) es ms
positiva. En consecuencia, la transferencia de energa libre de la protena
desnaturalizada a partir de agua a co-soluto es ms positiva, y por lo tanto la
transferencia es ms desfavorable que la del estado nativo. Esto debe resultar en
la estabilizacin de protenas.
El diagrama de energa libre para el caso anterior se representa en la Fig.3. La
diferencia de energa libre entre los estados nativos y desnaturalizadas se

incrementa por la adicin de glucosa, ya que una transferencia de energa libre

mayor del estado desnaturalizado hace que la energa libre de desnaturalizacin
an mayor.

Figura 1. Parcela de el parmetro de interaccin preferencial (m2 / m3) frente a

la concentracin de glucosa (m 3). Los smbolos son ribonucleasa (), albmina de
suero bovino a un pH de 6,0 () y a pH 3,0 (), quimotripsingeno (), y la
lisozima (X). Reproducido con permiso de Arakawa y Timasheff [23]. Derechos de
autor 1982, la American Chemical Society.
Las
mediciones
de
interaccin
preferenciales
tambin
se
han
realizado en aquellos compuestos que
son conocidos por desestabilizar o
desnaturalizar las protenas. Estos
compuestos muestran ya sea una
exclusin preferencial mucho ms dbil
o una unin preferencial, lo que implica
que tienen una mayor tendencia a
unirse a las protenas que ser excluido
de la superficie. Unin preferencial
disminuye el potencial qumico. Aqu
de nuevo, los datos no estn
Figura 2. Transferencia de energa libre (D ) de varias protenas del
disponibles para las interacciones
agua a la solucin de glucosa. Reproducido con permiso de Arakawa y
preferenciales de ambos los estados
Timasheff [23]. Derechos de autor 1982, la Sociedad Americana de
Qumica
nativa
y
desnaturalizada
en
condiciones idnticas. Sin embargo, se espera que la unin ser mayor para el
estado desnaturalizado con una superficie ms grande disolvente expuestos. Esto
conduce a un valor ms positivo de j3 para el estado desnaturalizado y por lo tanto
una disminucin mayor en el potencial qumico:
//
Por lo tanto, la transferencia del estado desnaturalizado de agua a una solucin
que contiene tales compaeros de solutos es ms favorable que la del estado
m

nativo, y por lo tanto debe desestabilizar las protenas. Los ejemplos de las
sustancias que pertenecen a esta clase son MgCl2, clorhidrato de guanidina,
KSCN, y urea.
Este caso tambin se representa en la Fig. 3. En la presencia de
desestabilizadores, la energa libre de la desnaturalizacin se hace ms pequeo
y por lo tanto se reduce la estabilidad de la protena. En desnaturalizacin
sistemas de disolventes, la energa mucho ms favorable de transporte gratuito
para el estado desnaturalizado invierte los estados de energa libre de los estados
nativa y desnaturalizada. Por lo tanto, en este caso el estado desnaturalizado tiene
una energa libre menor que el estado nativo y por lo tanto la protena
desnaturalizada es ms estable (fig 3). Una fuerte correlacin entre la estabilizacin de la solucin y la interaccin
preferencial se ha observado para muchos compuestos. Aquellos compuestos que
estn fuertemente excluidos de la superficie de la protena estabilizan protenas
contra diversas tensiones impuestas a las protenas en solucin. Hay, sin
embargo, algunas excepciones a esta regla, por ejemplo, PEG (polietilenglicol) y
MPD) 2-metyl 2.4 * pentaneidol. Su exclusin de la superficie de la protena es
bastante grande y evem

excede el nivel de exclusin alcanzado por los estabilizadores de protenas

anteriores
conocidos. Sin
embargo,
estos
compuestos
son
dbiles
desestabilizadores de protenas. Ellos no desnaturalizar las protenas a
temperatura ambiente, pero que hacen disminuir la temperatura de fusin de las
protenas.
Por qu su comportamiento no sigue sus interacciones preferenciales con las
protenas? Hay que recordar aqu que los efectos de los compaeros de solutos
se determinan por la diferencia en la interaccin preferencial entre los estados
nativas y desnaturalizadas. Los valores de la interaccin preferenciales para el
MPD y el PEG se determinan a 20 C, es decir, para el estado nativo. No tenemos
ninguna informacin sobre sus interacciones con los estados desnaturalizados en
condiciones idnticas. Uno puede preguntarse cmo se puede analizar esos datos
de estabilizantes de protenas a pesar de que no existen datos sobre el estado
desnaturalizado estn disponibles. Una diferencia importante entre la protena y la
estabilizacin de compuestos excluidos desestabilizadores est en su naturaleza
qumica. La primera clase de compuestos es muy polar y casi no tiene grupos

hidrofbicos en las molculas, mientras que la segunda clase tiene carcter

hidrfobo. Esto implica que los compaeros de solutos tales como PEG y MPD,
pueden tener cierta afinidad por el estado desnaturalizado de la protena, que
tiene muchas ms expuesto
grupos hidrfobos. Una posible interaccin de MPD y la protena se representa en
la Fig. 4, donde se produce la exclusin debido a la repulsin entre las molculas
de MPD y grupos cargados. En el estado nativo (lado izquierdo), MPD est
fuertemente excluido de la superficie de la protena nativa, compacto con un gran
nmero de cargas, pero muestra poca unin, mientras que en el estado
desnaturalizado,

Figura 4. Ilustracin esquemtica de las interacciones preferenciales de una

protena con una protena estabilizante co-soluto (A) y MPD (B). Reproducido con
permiso de Arakawa et al. [73]. Copyrigh 1990, la American Chemical Society.
MPD es menos excluido debido a la disminucin de densidad de carga y muestra
la interaccin con la superficie hidrfoba disolvente expuestos mejorada. Este
debe tener una consecuencia de que j3 es mayor para el estado desnaturalizado y
por lo tanto:

Por lo tanto, la transferencia del estado desnaturalizado a una solucin que

contiene MPD-se hace ms favorable (o menos desfavorable) que la del estado
nativo, lo que lleva a la desestabilizacin del estado nativo. Para la comparacin,
un caso de la estabilizacin de co-soluto se representa en la Fig. 4A. Es
interesante sealar aqu que el MPD y PEG son excelentes crioprotectores para
las protenas, comparable a otros estabilizantes de protenas. Por lo tanto, los

efectos de MPD y PEG sobre la estabilidad de protenas son dependientes de la

temperatura. Esto se explicar adicionalmente en la seccin siguiente, cuando se
describe el mecanismo de la estabilizacin de la protena por los co-solutos contra
el estrs de congelacin-descongelacin.
3. Factores que afectan a la estabilidad de congelacin-descongelacin
Hay varios puntos en el procesamiento, el almacenamiento y el montaje de las
protenas que al congelarse y descongelarse puede alcanzar, ya sea por el diseo
o por accidente. Algunas protenas se congelen por un periodo muy largo y
despus se descongelan para su uso. Ocasionalmente, las protenas liofilizadas
son rehidratadas, se dividen en alcuotas y se almacenan congeladas. El
almacenamiento congelado tambin puede servir como una medida provisional
para tener lotes de protenas, antes de la preparacin de un lote grande por
liofilizacin. Sin embargo, incluso en formulaciones lquidas, existe una necesidad
de estabilizar protenas contra la congelacin y descongelacin, debido a los
riesgos de congelacin accidental, durante el transporte y la manipulacin. Por
ltimo, la tensin de congelamiento que se alcanza durante la liofilizacin, debe
ser tomada en consideracin cuando se disean estrategias de formulacin para
la liofilizacin.
Las tensiones ms crticas a la que una protena se expone durante la congelacin
son una baja temperatura y la formacin de hielo. La desnaturalizacin fra ha sido
claramente documentada para muchas protenas y, por s misma es suficiente
para explicar la inactivacin de muchas protenas durante la congelacindescongelacin. Tambin, ya que la protena es excluida de los cristales de hielo
durante el congelamiento, las molculas de protenas se someten a cambios
qumicos y fsicos que ocurren en la fase no congelada. Como se forma hielo, la
concentracin de todos los solutos incremente dramticamente. Si los solutos
presentes en la fraccin sin hielo estn desestabilizados, entonces, este efecto
puede llevar a la desnaturalizacin de la protena. Para la mayor parte, la
influencia cualitativa de solutos en la estabilidad de protenas durante la
congelacin-descongelacin imita aquel que se nota en una solucin acuosa no
congelada. Por ltimo, cabe mencionar que una solucin que contiene
componentes buffer tales como el fosfato de sodio puede someterse a una
dramtica disminucin en el pH en el punto eutctico. Incluso cuando tales
tensiones individuales no daan la protena, una combinacin de factores que
surgen durante la congelacin-descongelacin, incluyendo bajas temperaturas y
una alta concentracin de sal desestabilizadora, puede ser muy destructiva.
Adems, la duracin de la exposicin de una protena a condiciones de
perturbacin puede influir en cuanto dao puede ocurrir.
Esto se refleja en el hallazgo de que la prdida de la actividad enzimtica durante
la congelacin y descongelacin a menudo se correlaciona inversamente con las
tasas de enfriamiento y calentamiento. La estabilidad de una protena en contra de
estas perturbaciones se puede aumentar de un modo especfico de la protena por
varios medios. En general, cualquier factor que altere la estabilidad de la protena

en solucin acuosa no congelada tienden a tener el mismo efecto cualitativo

durante el congelamiento-descongelamiento. Es decir, si las condiciones de
solucin tales como el pH y la concentracin de protenas son elegidos que dan la
mxima estabilidad en solucin, a continuacin, la protena tiene la mxima
estabilidad inherente (definida como la capacidad de una protena para soportar
una tensin dada independiente de cualquier soluto o cofactor) durante la
congelacin-descongelacin. Por ejemplo,
con muchas protenas, se ha
encontrado que incrementando la concentracin de protenas incrementar la
estabilidad de la protena en solucin y tambin durante la congelacindescongelacin.
Del mismo modo, a pesar de que el pH puede cambiar durante la congelacindescongelacin, un pH inicial que es ptimo para la estabilidad de la solucin
tender a dar la ms alta recuperacin de la protena nativa despus de la
congelacin-descongelacin. Por ltimo, los sustratos especficos, co-factores y/o
modificadores alostricos pueden influir en la estabilidad de protenas durante la
congelacin-descongelacin. Aun cuando todos estos factores estn optimizados
muchas protenas se desnaturalizan an en un alto grado durante la congelacindescongelacin. Es decir, su estabilizacin inherente no es suficiente para
soportar las tensiones involucradas. En estos casos, se pueden emplear
crioprotectores. Una amplia variedad de compuestos (vase la Tabla 1) han sido
utilizados para criopreservar las protenas. Las opciones ms comunes y obvias
son azcares, polioles, polmeros sintticos y ciertos aminocidos.
Recientemente, se ha encontrado que los cidos imino, lactato, succinato y
propionato tambin protegen a las protenas congeladas.
Tal vez no tan obvio como crioprotectores, sino son estabilizantes, sales
inorgnicas. Estos son los mismos iones que son conocidos como compuestos 'de
salados' y estabilizadores de protenas en solucin acuosa no congelado.
As, la concentracin de congelacin inducida de sales no es necesariamente
perjudicial para la estabilidad de la protena. Por ejemplo, se ha encontrado que si
la lactato deshidrogenasa es congelada- descongelada en buffer de fosfato de
potasio 10 mM (sin otros solutos), menos de 20% de la actividad inicial se
recupera. Sin embargo, si las concentraciones iniciales del fosfato de potasio que
exceden 1 M son usadas, un porcentaje mayor al 60 % de actividad es
recuperado. Claramente, la congelacin inducida de sal no es responsable de la
inactivacin observada en el primer caso, ya que la sal en s sirve como un
crioprotector. Una amplia variedad de compuestos qumicamente diversos pueden
proporcionar crioproteccin a las protenas. A pesar de que se han propuesto
varios mecanismos para este efecto, la nica que parece estar universalmente
aplicable a todos los actualmente conocidos crioprotectores es el mecanismo de
exclusin preferencial que se describe en la Seccin 2 de esta revisin para la
estabilizacin de las protenas en soluciones acuosas no congeladas. De hecho, la
una caracterstica unificadora de todos los crioprotectores que figuran en la Tabla
1 es que ellos (o compuestos qumicamente similares) se han mostrado ser
excluidos preferentemente de la superficie de las protenas.

Por el contrario, los compuestos que se sabe que se unen preferentemente a

protenas, tales como urea y guanidina-HCl, fomenta dao adicional durante la
congelacin-descongelacin. As, el mecanismo demostrado por Timasheff y sus
colegas para la estabilizacin de protenas en un sistema acuoso no congelado
aparentemente aplica igualdad en la criopreservacin de protenas. Es decir, a
temperaturas bajo cero, concentracin de solutos inducida por congelacin,
alteraciones en la solucin de pH, y otras condiciones de inestabilidad que pueden
surgir durante la congelacin-descongelacin pueden verse simplemente como
otros tipos de perturbaciones inducidas en la solucin. Preferentemente los solutos
excluidos sirven para evitar estas tensiones de la desnaturalizacin de la protena
durante la congelacin y descongelacin.
Esta conclusin es sencilla si se tiene en cuenta que las interacciones tanto de la
desestabilizacin y la estabilizacin de solutos con las protenas durante la
congelacin y descongelacin actualmente ocurren en la fase acuosa sin hielo.
Adems, los principios termodinmicos bsicos que rigen la estabilidad de la
protena en estado de congelacin no deben ser diferentes de los operativos en
sistemas acuosos no congelados. Sin embargo, como se seal anteriormente,
hay un grupo de compuestos para los que su influencia en la estabilidad de la
protena en solucin acuosa no se correlaciona con su efecto durante la
congelacin-descongelacin. Se ha demostrado que los compuestos tales como
PEG y MPD son excluidos de la superficie de protenas a 20C y son excelentes
crioprotectores. De hecho, el PEG se describe en la Seccin 2 de esta revisin
para la estabilizacin de las protenas en soluciones acuosas no congeladas. Sin
embargo, estos mismos compuestos desestabilizan las protenas a temperaturas
ms altas, al disminuir la temperatura de desnaturalizacin trmica. Esta aparente
paradoja se puede resolver considerando la dependencia de la temperatura de las
interacciones hidrofbicas entre las protenas y los cosolutos. A temperaturas
relativamente bajas las interacciones hidrfobas son ms dbiles y, por las
razones descritas en la Seccin 2, los cosolutos son preferentemente
excluidos. Por el contrario, a temperaturas relativamente altas (>25C), el carcter
hidrofbico de estos compuestos predomina y conduce a la unin preferencial.
En resumen, a pesar de una serie de factores se puede considerar para
desestabilizar las protenas durante la congelacin- descongelacin, la adicin de
una variedad de compuestos que son conocidos para estabilizar las protenas en
solucin puede protegerlos de la tensin de congelacin-descongelacin. El
mecanismo de la estabilizacin de cosoluto inducida es probablemente la
exclusin preferencial de los cosolutos de la superficie de la protena en estado de
congelacin. A pesar de que la liofilizacin tambin implica el proceso de
congelacin, como se describen a continuacin, ms
estabilizadores
especializados se requieren para eliminar la desnaturalizacin debido a las
tensiones que surgen durante la liofilizacin.
4. Factores que afectan la estabilidad del secado por congelacin

El secado por congelacin o mejor conocido como liofilizacin se utiliza en la

preparacin de productos de protenas que no son suficientemente estables para
su almacenamiento a largo plazo en forma de soluciones acuosas. El proceso de
liofilizacin consiste en la congelacin de la solucin de la protena y
posteriormente es secado por medio de vaco. El proceso de secado se lleva a
cabo en dos fases: secado primario, elimina el agua congelada por sublimacin, y
el secado secundario que elimina el agua no congelada unida. La liofilizacin a
menudo presenta problemas de estabilidad debido a la inestabilidad
conformacional de muchas protenas cuando son sometidas al proceso de la
congelacin y a las tensiones de deshidratacin posteriores. La protena debe ser
estabilizada contra estas dos tensiones fundamentales. Para maximizar la
estabilidad del proceso de liofilizacincin se deben optimizar parmetro como: las
temperaturas, tiempo y la humedad residual. Sin embargo, en muchos casos, la
optimizacin de estos parmetros es insuficiente. Para mejorar an ms la
estabilidad de las protenas liofilizadas, a menudo se aaden diferentes tipos de
excipientes a la solucin que contiene la protena.
Numerosos informes han dado resultados empricos de la liofilizacin, usando
diversas protenas y utilizando diferentes aditivos para mejorar la estabilidad
durante la liofilizacin para su posterior almacenamiento. El mecanismo de
estabilizacin de co-soluto durante la liofilizacin tambin ha sido el tema de
muchos informes. Por ejemplo, la fosfofructoquinasa (PFK) es una enzima
tetramrica que se disocia en componentes monomricos por la congelacin y / o
secado, un proceso que desnaturaliza irreversiblemente a dicha molcula. La
proteccin puede conferirse contra cualquiera de estas dos tensiones con la
adicin de estabilizadores llamados: co-solutos. Sin embargo, los requisitos para
la proteccin contra la deshidratacin son mucho ms especficos. Muchos
crioprotectores efectivos no tienen efecto estabilizador durante la deshidratacin.
Los nicos solutos que hacen proporcionar la estabilizacin son los disacridos.
Este mecanismo todava no se entiende completamente, por lo que se prefieren
los
co-solutos. El fracaso de muchos crioprotectores para proteger
adecuadamente en sec, indica que el mecanismo de estabilizacin del solutoinducido durante la deshidratacin es fundamentalmente diferente al de las
protenas en sistemas acuosos o congelados. Adems, los argumentos
termodinmicos necesarios para explicar la estabilizacin de las protenas por la
preferencia de co-solutos no son aplicables cuando el disolvente se elimina del
sistema.En informes anteriores sobre la estabilizacin de las protenas secas,
Carpenter y Crowe sugieren que ciertos carbohidratos podran proteger a las
protenas ya que estos co-solutos tienen puentes de hidrgeno unidos a la
protena seca, por lo que sirve como sustituto del agua, cuando se retira la capa
de hidratacin de la protena. Para probar dicha hiptesis, Carpenter y Crowe

utilizaron Fourier transformado con espectroscopia infrarroja (FTIR) para

observar las interacciones entre las protenas y los carbohidratos secos. Se
encontr que el hidrgeno no slo produce la unin entre las protenas y los
carbohidratos estabilizadores, sino tambin que dicha unin es un requisito para
las protenas lbiles que se conserva durante el secado. Los resultados que
describen a la trehalosa y las interacciones de las protenas en estado seco se
pueden ver en la figura 5 con diferentes puntos se compara la regin de huella
dactilar del espectro de infrarrojo para la trehalosa sola contra el de la trehalosa
seca, ya sea con lisozima o con albmina de suero bovino. La presencia de la
protena conduce a una disminucin en la absorbancia en toda la regin, cambios
en la posicin de la banda, y una prdida de la divisin de la banda. Estos
cambios espectrales de protena inducida pueden ser tratados liofilizando el
azcar incrementando la cantidad de la protena. Los espectros tpicos para la
trehalosa en sec en presencia de lisozima o albmina de suero bovino son
notablemente similares a las de trehalosa hidratada, pero muy diferente al
espectro de trehalosa cristalina. Por lo que las protenas aparentemente juegan el
mismo papel, para la trehalosa en sec al igual que el agua para el azcar
hidratado, forman puentes de hidrgeno con los grupos polares del azcar. Queda
implicito en la conclusin de que las protenas sirven como sustitutos de agua para
los carbohidratos en polvo, para cumplir con las necesidades de puentes de
hidrgeno de los grupos polares, as que lo contrario tambin debe ser verdad.
Para probar esta hiptesis, se investig la influencia de la trehalosa en el espectro
infrarrojo de la lisozima. Cuando se seca la lisozima sin el azcar, la frecuencia de
la banda amida I da un nmero de onda de 1652, mientras que para la protena
completamente hidratada da un nmero de onda de 1659. En el caso de la amida
II la banda se ampla dando un nmero de onda de 1543 a casi 1530 con la
protena seca. En contraste, cuando la lisozima se seca por congelacin en
presencia de trehalosa (5 g de protena de azcar / g), la banda de amida I de la
protena seca es desplazada hacia atrs dando un nmero de onda de 1658. El
efecto ms dramtico del azcar es cambiar la banda de la amida II de nuevo a
1542 cm,que dicha posicin es casi idntica tambin para la protena hidratada.
Se observa adems en este estudio que cuando se usan altas concentraciones
iniciales de trehalosa, el espectro de la protena se desplaza de nuevo a la forma
conocida de la protena seca y sin el azcar. La cristalizacin de la trehalosa
durante la sublimacin disminuye la disponibilidad del azcar para formar puentes
de hidrgeno con la protena. A altas concentraciones de manera similar, la
capacidad de la trehalosa para proteger la actividad de la fosfofructoquinasa es
suprimida. Por lo tanto, Carpenter y Crowe concluyeron que cuando la trehalosa
est en una concentracin que no influye en la frecuencia de la banda de la amida

II para la lisozima en seco, esta concentracin de azcar tambin es ineficaz para

preservar el secado y protenas labiales. Es decir, los puentes de hidrgeno del
azcar en la protena son obligatorios para preservar protenas secas.
En un informe de Tanaka emplearon un enfoque diferente para examinar el
mecanismo de proteccin de liofilizacin por sacridos. Estos investigadores
examinaron la proteccin de la actividad de la catalasa durante la liofilizacin por
valoracin de diversas concentraciones de la enzima con diferentes sacridos. Los
resultados indicaron que el parmetro correlacionado con la proteccin de la
actividad de la enzima fue la relacin del peso del excipiente a la protena y no una
concentracin mayor de excipiente. Este resultado sostiene que una interaccin
directa entre las molculas del excipiente y la protena es la base para
lioproteccion. Claramente, si la interaccin directa no fuera un factor necesario y el
mecanismo implicado para la formacin de cristales o de pedida de agua, una
concentracin mayor del aditivo se correlaciona con la proteccin. Pero esto no se
observ. Estos resultados apoyan adems la afirmacin de que la interaccin
directa de los estabilizadores con la protena es necesaria para la estabilizacin.
En otro estudio, Lippert y Galinski encontraron que la estabilizacin de PFK y
lactato deshidrogenasa liofilizado (LDH) por una clase de solutos compatibles
conocidos como ectoines dependa de la presencia de grupos hidroxilo en la
molcula, lo que sugiere que los puentes de hidrgeno se necesita para la
estabilizacin durante la deshidratacin.
Otros investigadores han propuesto que el mecanismo de lioproteccion de
protenas por diversos excipientes se relaciona con la formacin de cristales en el
estado seco. Es decir, la inmovilizacin de la protena y aditivos en un slido,
amorfo da resultados en la proteccin del estado de la protena por la degradacin
qumica y conformacinal porque la Velocidad de difusin y la velocidad de
reaccin, son lentos. Si bien esto es una hiptesis inadmisible, ya que varias
lneas de evidencia argumentan en contra de esto. En primer lugar, en un estudio
de la estabilidad de la hormona de crecimiento humano recombinante liofilizado,
Pikal observ que las formulaciones que contienen dextrano, que sigue siendo
completamente amorfo y forma un cristal, desestabilizan a la estructura de la
protena y da como resultado un alto grado de formacin de agregados despus
de la reconstitucin. En segundo lugar, en el estudio que se seal anteriormente
por Tanaka, los autores examinaron la capacidad de diversos monmeros y
oligmeros de sacrido para proteger a la catalasa durante la liofilizacin. Se
observ que la capacidad de proteccin disminuy a medida que la longitud de la
cadena aumentaba. Por el contrario, como la longitud de las cadenas de los

sacridos aumentaron, se convirtieron en mejores formadores de cristales (es

decir, que se sometieron a temperaturas ms altas para el cambio a cristales). Si
la formacin de cristales es el mecanismo de proteccin, se esperara una mayor
estabilidad con las cadenas ms largo de sacrido. Sin embargo, se observa lo
contrario. Adems, estos autores tambin examinaron la capacidad del dextrano,
con un nuevo un excipiente que forma cristales amorfos, para preservar la
actividad de la catalasa despus de la liofilizacin. Se observ que el dextrano no
fue tan eficaz en la estabilizacin de la catalasa como los sacridos de menor
masa molecular y, adems, que la eficacia del dextrano disminuy a medida que
aument la masa molecular. Esto se atribuy a la incapacidad del polmero grande
para interactuar eficazmente con los grupos polares de la superficie de la enzima.
Por lo tanto, mientras que la formacin de un estado crsitalino amorfo es
claramente una condicin necesaria para la estabilizacin de protenas durante la
deshidratacin, estos dos estudios independientes indican claramente que la
formacin de cristales no es una condicin suficiente. Claramente, otras
interacciones, tales como las descritas anteriormente, son necesarias.
Durante el secado, el estrs principal que se debe superar es la eliminacin de la
capa de hidratacin de la protena, que, por lo menos en algunas protenas lbiles,
puede resultar en la prdida irreversible de su actividad biolgica. Los resultados
reseados aqu demuestran que los azcares tales como la trehalosa pueden
servir para satisfacer, por lo menos en un grado limitado, los requisitos de enlaces
de hidrgeno de los grupos polares de las protenas secas, y por lo tanto servir
como sustitutos de agua para protenas secas. Sin embargo, el mecanismo por el
que esta interaccin da como resultado la conservacin de la actividad enzimtica
no se conoce completamente. Recientemente, Prestrelski et al., examin la
conformacin de las protenas liofilizadas utilizando espectroscopia de resolucin
mejorada FTIR. Estos estudios proporcionan informacin adicional sobre el
mecanismo de la desestabilizacin de protena durante la deshidratacin y la
estabilizacin soluto-inducida. La comparacin de los espectros de infrarrojo de las
protenas en el estado seco y las protenas hidratadas en estado natural indica
que durante la deshidratacin se inducen de moderados a grandes cambios
conformacionales (dependiendo de las protenas estudiadas) (Figura 7).

Fig. 7. Second derivative infrared spectra of (A) basic fibroblast growth factor, (B) g-interferon and (C) a-lactalbumin in the
aqueous state (upper curves) and dehydrated state (lower curves). Reproduced from Prestrelski et al.

En varios casos, se observaron desnaturalizacin y agregacin durante la

rehidratacin, lo que indica que los cambios observados en las protenas secas
son a veces irreversibles. En contraste, cuando estas mismas protenas se
liofilizaron bajo las mismas condiciones, pero en presencia co-solutos
estabilizantes (es decir, los que son eficaces en la conservacin de la actividad de
enzimas lbiles durante la liofilizacin y la rehidratacin), la estructura natural o
acuosa se conserva en el estado seco, como se muestra en la Fig. 8.

Fig. 8. Second derivative infrared spectra in the amide I region for (A) basic fibroblast growth factor, (B) g-interferon and (C)
a-lactalbumin. Lyophilized in the presence of 200 mg/ml sucrose. Reproduced from Prestrelski et al.

La comparacin de estos espectros con los espectros acuosos en la Fig. 7

muestra que, en presencia de aditivos estabilizantes, las estructuras de las
protenas deshidratadas son esencialmente idnticas a las del estado acuoso.
Adems, despus de la rehidratacin, el estado natural tambin se conserv
cuando las protenas se liofilizaron en presencia de estabilizantes. Basndose en
estos resultados, se plantea la hiptesis de que la preservacin de la estructura
natural es necesaria para preservar la actividad biolgica tras la reconstitucin, y
que el efecto de los co-solutos estabilizantes es a travs del mantenimiento de la
estructura natural en el estado deshidratado.

Prestrelski et al., examin tambin la conformacin de un modelo de polipptido,

poli-L-lisina, tras la liofilizacin. Encontraron que, al igual que con las protenas, la
liofilizacin indujo una transicin conformacional. La poli-L-lisina se transforma de
una conformacin aleatoria en solucin a una -hoja plegada en el estado seco.
La transicin fue atribuida a la prdida de enlaces hidrgeno unidos al agua,
debido a que una espiral al azar en solucin tiene sus enlaces de hidrgeno
satisfechos por las molculas de agua. Tras la deshidratacin, estas molculas de
agua se eliminan y los hidrgenos del pptido se unen entre s. Se observ que
los sacridos inhiben la transicin conformacional observada, presumiblemente
por servir como un sustituto del agua. Estos estudios de apoyan el argumento de
que los cambios conformacionales (como el desplegamiento) son responsables de
la prdida de actividad biolgica durante la liofilizacin y que los sacridos
protegen a las protenas mediante la preservacin de su estructura natural,
presumiblemente por enlaces de hidrgeno.
Un dilema aparente surge del argumento de que ciertos aditivos estabilizan
protenas secas a travs de los enlaces de hidrgeno a las protenas en lugar de
agua. Si fuera necesaria slo esta interaccin para que la conservacin de la
protena durante todo el proceso de liofilizacin, entonces los mono- y disacridos
deben proporcionar una proteccin similar. Este no es el caso. Cuando PFK
(fosfofructoquinasa) se seca por congelacin en presencia de trehalosa 0,2-0,4 M,
ms del 60% de la actividad inicial se recupera despus de la rehidratacin. En
contraste, cuando se utilizan cantidades similares de glucosa, la recuperacin es
inferior a 5%. PFK y otras protenas lbiles son sensibles tanto a la congelacin y
el estrs de la deshidratacin subsecuente encontradas durante la liofilizacin. La
glucosa no protege la PFK liofilizada porque proporciona una estabilizacin
mnima durante la congelacin, mientras que la trehalosa es eficaz en la
estabilizacin de la enzima durante tanto la congelacin como en la
deshidratacin. Por lo tanto, un aditivo dado podra ser muy efectivo en la
estabilizacin de una protena contra el estrs de la deshidratacin. Sin embargo,
si este mismo compuesto no proporciona crioproteccin a la protena, no se
realizar la preservacin durante la liofilizacin. Desde que la criopreservacin se
deriva de la exclusin preferencial del aditivo desde la superficie de la protena, el
aumento de la concentracin del aditivo aumentar la estabilizacin de la protena
durante la congelacin. Sin embargo, los azcares (a altas concentraciones
iniciales) se pueden cristalizar durante la liofilizacin y, por lo tanto, no estar
disponibles para efectuar enlaces con el hidrgeno y proteger las protenas secas.
Para resolver este dilema aparente, el estrs de la congelacin y el secado a la
protena, que surjan durante el proceso de liofilizacin, deben ser tratados por
separado. Muchas protenas son sensibles tanto al estrs de la congelacin como
al estrs de la deshidratacin que surgen durante la liofilizacin. Recientemente,
Carpenter et al., desarroll un sistema de excipientes de dos componentes para la
estabilizacin de un estrs especfico de las protenas durante la liofilizacin, en el
que un excipiente proporciona la crio-proteccin y el segundo proporciona

proteccin durante la deshidratacin. En este esquema de estabilizacin, se utiliz

PEG (polietilenglicol) como un crio-protector y diversos carbohidratos se utilizaron
como lioprotectores. Como se muestra en la Fig. 9, el PEG es un crio-protector
muy eficaz pero proporciona estabilizacin muy baja o nula durante la
deshidratacin. Sin embargo, cuando pequeas cantidades de trehalosa, as como
otros sacridos y alcoholes polihidroxilados se titulan, los dos componentes
proporcionan una excelente estabilizacin de las protenas. En contraste, la
trehalosa (u otros sacridos y alcoholes polihidroxilados) por s sola no
proporcionar estabilizacin a estas concentraciones (Fig. 9B). Por lo tanto, en las
condiciones en que la crio-proteccin es provista por otro co-soluto, la glucosa y la
trehalosa son igualmente eficaces en la estabilizacin de las enzimas secas.

Fig. 9. (A) Effect of polyethylene glycol on phosphofructokinase stability during freezethawing (o) and freeze-drying (). (B)
Comparison of the influence of trehalose alone (o) and trehalose with 1% (w/v) polyethylene glycol () on the stability of
freeze dried phosphofructokinase.

En un estudio estructural complementario de estabilizacin de un estrs concreto

utilizando espectroscopia infrarroja, Prestrelski, et al., encontraron que la
recuperacin de la actividad despus de la rehidratacin se correlaciona
directamente con la capacidad de los sistemas de excipientes para conservar la
estructura natural de las enzimas lbiles en estado seco. Cuando la combinacin
de PEG y los carbohidratos se liofiliza con las protenas, la estructura natural se
observa en el estado seco. Sin embargo, cuando se usan estos excipientes solos,
o no se utilizan excipientes, se observa una estructura desplegada en estado

seco, esto es, que se requiere la preservacin de la estructura natural durante la

deshidratacin para la recuperacin de la actividad despus de la rehidratacin.
En resumen, el mecanismo de estabilizacin de las protenas inducida por solutos
durante la liofilizacin involucra la interaccin directa de molculas de soluto con la
protena a travs de enlaces de hidrgeno. Las molculas de soluto sirven como
sustituto del agua. El efecto de la sustitucin de agua es el de preservar la
estructura natural de la protena durante la deshidratacin. Parece importante el
estado amorfo de las molculas de soluto para permitir el mximo de enlaces de
hidrgeno entre molculas del soluto y protenas. Finalmente, para ciertas
protenas lbiles, un crioprotector tambin debe ser utilizado durante la etapa de
congelacin para proteger a la protena.
Los estudios de estabilizacin de protenas durante la liofilizacin antes descritos,
hacen un nfasis durante el proceso de liofilizacin en s. No obstante, se ha
hecho evidente que la estabilidad a largo plazo de las preparaciones de protena
secas es tambin un factor importante. Una vez ms, la mayor parte de los
informes de la literatura hasta la fecha, proporcionan resultados empricos con
pocos datos sobre el mecanismo. Izutsu, et al., han examinado los efectos de los
aditivos en la estabilidad a largo plazo de la -galactosidasa a temperaturas
elevadas. Muchos aditivos, incluyendo sacridos, aminocidos y alcoholes de
azcar, fueron capaces de estabilizar la protena durante el proceso de
liofilizacin, pero slo disacridos fueron capaces de conferir estabilidad a largo
plazo a 70C. Los resultados de exploracin calorimtrica diferencial de la
rehidratacin de enzimas indican que, en ausencia de disacridos, las enzimas se
despliegan durante el almacenamiento. Por el contrario, los disacridos fueron
capaces de preservar la estructura plegada de la enzima. As pues, parece que el
mantenimiento de la estructura plegada adecuada durante el almacenamiento a
largo plazo es necesario para la estabilizacin. Son necesarios ms estudios, ya
que slo el informe de Izutzu, et al., ha abordado esta cuestin a algn grado. Los
recientes avances en el examen espectroscpico de IR de conformacin de la
protena seca deben proporcionar informacin valiosa sobre el estado
conformacional a temperaturas elevadas.
5. Factores que afectan a la estabilidad de almacenamiento a largo plazo
Los procedimientos del almacenamiento a largo plazo en un estado congelado o
liofilizado son a menudo posibles aunque no son recomendables ya que pueden
ser ms perjudiciales para la protena ya que afectan la estabilidad de la misma.
Por otro lado, el almacenamiento de protenas en estado lquido puede tener
muchas ventajas y por ende es ms utilizado.
Con la aparicin de las protenas recombinantes de importancia teraputica, la
necesidad de establecer condiciones para el almacenamiento a largo plazo es
particularmente importante. Por ello, se deben de comprender ciertos eventos que

pueden comprometer la estabilidad de almacenamiento, por ejemplo, durante el

almacenamiento a largo plazo, los grupos sulfhidrilo libres pueden oxidarse a la
forma disulfuro. Otro caso en las protenas que contienen un par de residuos de
Cys, todos los grupos tiol a menudo se pueden oxidar de manera que no
permanezca el grupo tiol libre.
La gran lista de reacciones que pueden comprometer la estabilidad a largo plazo
de las protenas son los del enlace peptdico en s. Tres reacciones son
importantes en este sentido. En primer lugar es la hidrlisis del enlace peptdico,
para formar dos cadenas de polipptidos ms pequeas. En segundo lugar, la
migracin de N (nitrgeno) y 0 (oxgeno) puede conducir a una estructura diferente
en la posicin afectada. El tercero implica una migracin -carboxi a -carboxi del
enlace peptdico.
Otras cadenas laterales amino-acilo que pueden someterse a modificacin durante
un perodo de tiempo incluyen amida (desamidacin de Asn y Gln), restos
aromticos (oxidacin de Trp y Tyr) grupos amino (acilacin del grupo -amino de
la protena) y carboxilo (esterificacin de Glu, Asp, o un residuo C- terminal).
La inestabilidad con el tiempo puede surgir una la alteracin de la estructura
secundaria, terciaria y cuaternaria de la protena. Muchas fuerzas, incluyendo
fuerzas electrostticas, hidrfobas y asociadas a solventes, estn involucradas en
el mantenimiento de la estructura de la protena. Por otro lado, algunas regiones
de la protena exponen ciertas superficies en el medio ambiente y, con el tiempo,
la protena puede adquirir una estructura diferente. Por otra parte, las superficies
hidrfobas de dos protenas pueden formar dmeros, que debilitan la estructura
global de la protena. Es por ello que las condiciones de almacenamiento a largo
plazo deben favorecer a la estructura deseada y disminuir la posibilidad de que se
produzcan las interacciones protena-protena.
5.1. Propiedades de los excipientes
Cuando las protenas se utilizan en un entorno clnico como agente teraputico
humano, ciertos criterios restringen el tipo de excipientes que pueden ser
utilizados y las condiciones en las que la protena se somete a almacenamiento a
largo plazo. Los componentes del excipiente deben ser seguros (no ser txicos ni
infecciosos), la solucin empleada debe ser isotnica con respecto a la ruta y el
modo de administracin; por ltimo, la eleccin y la cantidad del buffer utilizado se
tiene que tomar en cuenta el pH deseado.
5.2. Tcnicas de monitoreo de la estabilidad
Para evaluar los factores que influyen en el almacenamiento a largo plazo de las
protenas existen tcnicas indicadoras de la estabilidad las cuales son capaces de
medir los cambios de slo un pequeo porcentaje, los ensayos deben ser fciles
de realizar y permitir la deteccin de un gran nmero de muestras. Muchas de las
tcnicas que se usan actualmente caracterizan las propiedades electroforticas y
cromatogrficas de la protena, estas a menudo detectan la presencia de nuevas

especies en una regin de la electroforetograma o cromatograma que no mostr

nada cuando la protena matriz fue sometida a un procedimiento de este tipo. Por
ejemplo, electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida detecta la
aparicin de polipptidos derivados de la hidrlisis de enlaces peptdicos, el
Isoelectroenfoque puede detectar la aparicin de formas alternativas, basados en
cambios en la carga, por ejemplo la desamidacin, la cromatografa de exclusin
por tamao puede detectar la aparicin de agregados. Los cambios en la
hidrofobicidad de la protena se pueden medir por cromatografa lquida de fase
invertida.
5.3. Estabilidad de la protena
La identificacin de las condiciones adecuadas para la estabilidad a largo plazo
deben llevarse a cabo sobre una base de protenas de tipo estabilizadoras, a partir
de estas las patentes y los estudios clnicos publicados suelen dar una descripcin
de las condiciones de almacenamiento de la protena. Por otro lado, se puede
suponer que las condiciones de excipientes enumerados en estos materiales son
adecuados para el almacenamiento a largo plazo de la protena.
Los protocolos de estabilidad deben desarrollarse de forma concomitante con el
desarrollo de protenas con los frmacos. Durante este tiempo, se dispone de
informacin sobre las caractersticas de la protena, por ejemplo, composicin de
aminocidos y la secuencia, hidrofobicidad, y las tcnicas que identifican la
inestabilidad. Esto permite que los procedimientos de fabricacin sean ptimos en
las etapas de pre - formulacin y formulacin.