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INSTITUTO DE BIOTECNOLOGA
Inmunoqumica
Presenta:
IBQ. Roco Vanessa Caldern Pascacio
Contenido
Introduccin .....
Anticuerpos ..
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Antgenos .
13
15
17
19
Tcnicas de precipitacin .
21
21
Tcnica de precipitacin .
22
23
Tcnica de inmunoelectroforsis ..
23
23
24
Tcnicas de aglutinacin ..
25
25
Hemoaglutinacin directa .
26
Hemoaglutinacin indirecta ..
27
Tcnicas de inmunofluorescencia
27
Citometra de flujo
29
Tcnica de radioinmunoensayo
32
34
Nefelometra .
36
39
39
Inmunoprecipitacin e inmunoblotting
40
41
43
Bloqueo de la membrana ..
43
45
Colorantes .
45
45
45
46
47
47
48
Southern Blot
48
49
Hybridization) ...
FISH de Metafase .....
50
FISH de Interfase ..
50
PCR in situ
51
Mecanismo de la reaccin
52
Bibliografa ..
53
Introduccin
Para entender las tcnicas inmunoqumicas, primero debemos comprender conceptos
bsicos sobre inmunologa.
Los animales superiores son atacados por microorganismos y partculas extraas. Pero
poseen sistemas defensivos frente a tales patgenos; dichos mecanismos tienden a
distinguir lo propio de lo extrao
La inmunidad es un conjunto de mecanismos de defensa de los animales frente a agentes
externos extraos. Se adquiere al nacer, y va madurando y consolidndose durante los
primeros aos de vida.
La inmunologa es la ciencia biolgica que estudia todos los mecanismos fisiolgicos de
defensa de la integridad biolgica del organismo. Dichos mecanismos consisten
esencialmente en la identificacin de lo extrao y su destruccin. La inmunologa tambin
estudia los factores inespecficos que coadyuvan a los anteriores en sus efectos finales.
La respuesta inmune es la actuacin integrada de un gran nmero de mecanismos
heterogneos de defensa contra sustancias y agentes extraos. En general, a las sustancias
extraas se las denomina como antgenos, y son ellos los que desencadenan en el
organismo una serie de eventos celulares que provocan la produccin de los mecanismos de
defensa.
Historia de la inmunologa
La inmunologa es, en la actualidad, una ciencia autnoma y madura, pero sus orgenes han
estado estrechamente ligados a la Microbiologa. Su objeto consiste en el estudio de las
respuestas de defensa que han desarrollado los animales frente a la invasin por
microorganismos o partculas extraos, aunque su inters se ha volcado especialmente
sobre aquellos mecanismos altamente evolucionados e integrados, dotados de especificidad
y de memoria, frente a agentes reconocidos por el cuerpo como no propios, as como de su
neutralizacin y degradacin.
Como tantas otras ciencias, la Inmunologa presenta un prolongado perodo pre-cientfico,
de observaciones y aproximaciones meramente empricas. Registro de enfermedades y de
epidemias en los documentos picos de Babilonia (Gilgamesh) y de las dinastas antiguas
de Egipto. 2000 a.c, as como la variolizacin era una prctica habitual de la cultura china.
1000 a.C. La resistencia a ulteriores ataques de una enfermedad infecciosa fue ya recogida
en escritos de la antigedad; el historiador griego Tucdides (464-404 a.C.) narra que en
una epidemia acaecida durante la guerra del Peloponeso, los enfermos eran atendidos solo
por aquellos que haban sobrevivido previamente a la enfermedad, en la seguridad de que
stos no volveran a ser contagiados. Hipcrates propone alteraciones en el sistema de los
humores para explicar las enfermedades y el humor maligno como causa de la peste (460377 a.C).
A fines del siglo XIX Robert Koch demostr que las enfermedades infecciosas eran
provocadas por microorganismos, (virus, bacterias, hongos y parsitos), causantes de
enfermedad patologa. Transmite el ntrax a los animales a partir de un cultivo "in vitro",
cumplindose los postulados de Koch. 1876. Hizo adems aportes fundamentales sobre
hipersensibilidad.
El primer abordaje plenamente cientfico de problemas inmunolgicos se debi, a Louis
Pasteur. Estudiando la bacteria responsable del clera aviar (ms tarde conocida como
Pasteurella aviseptica), observ (1880) que la inoculacin en gallinas de cultivos viejos,
poco virulentos, las protega de contraer la enfermedad cuando posteriormente eran
inyectadas con cultivos normales virulentos. De esta forma se obtuvo la primera vacuna a
base de microorganismos atenuados. Fue Pasteur quien dio carta de naturaleza al trmino
vacuna, en honor del trabajo pionero de Jenner.
En los aos siguientes Pasteur abord la inmunizacin artificial para otras enfermedades;
concretamente, estableci de forma clara que cultivos de Bacillus anthracis atenuados por
incubacin a 45C conferan inmunidad a ovejas expuestas a contagio por carbunco. Aos
despus, abordara la inmunizacin contra la rabia, enfermedad de la que se desconoca el
agente causal. Pasteur observ que ste perda virulencia cuando se mantenan al aire
durante cierto tiempo extractos medulares de animales infectados, por lo que dichos
extractos se podan emplear eficazmente como vacunas. Realiz la primera vacunacin
antirrbica en humanos el 6 de julio de 1885, sobre el nio Joseph Meister, que haba sido
mordido gravemente por un perro rabioso. A este caso siguieron otros muchos, lo que vali
a Pasteur reconocimiento universal y supuso el apoyo definitivo a su mtodo de
inmunizacin, que abra perspectivas prometedoras de profilaxis ante muchas
enfermedades. Estos logros determinaron, en buena medida, la creacin del Instituto
Pasteur, que muy pronto reuni a un selecto grupo de cientficos, que enfocaran sus
esfuerzos en diversos aspectos de las inmunizaciones y de sus bases biolgicas. A su vez,
los norteamericanos Salmon y Smith (1886) perfeccionaron los mtodos serolgicos de
Pasteur, lo que les permiti producir y conservar ms fcilmente sueros tipificados contra la
peste porcina.
A finales del siglo XIX existan dos teoras opuestas sobre los fundamentos biolgicos de
las respuestas inmunes. Por un lado, el zologo ruso Ilya Ilich Mechnikov (1845-1916), que
haba realizado observaciones sobre la fagocitosis en estrellas de mar y pulgas de agua,
estableci, a partir de 1883, su "Teora de los fagocitos", tras estudiar fenmenos de
englobamiento de partculas extraas por los leucocitos de conejo y de humanos. Inform
que existan fenmenos de eliminacin de agentes patgenos por medio de "clulas
devoradoras" (fagocitos) que actuaban en animales vacunados contra el carbunco, y explic
la inmunizacin como una "habituacin" del hospedador a la fagocitosis. Ms tarde, ya
integrado en el Instituto Pasteur, propugn la idea de que los fagocitos segregan enzimas
especficos, anlogos a los "fermentos" digestivos (1900). Esta teora de los fagocitos
constituy el ncleo de la teora de la inmunidad celular, de modo que la fagocitosis se
consideraba como la base principal del sistema de defensa inmune del organismo.
Por otro lado, la escuela alemana de Koch haca hincapi en la importancia de los
mecanismos humorales (teora de la inmunidad humoral). Emil von Behring (1854-1917)
6
y Shibasaburo Kitasato (1856-1931), a resultas de sus trabajos sobre las toxinas del ttanos
y de la difteria, observaron que el cuerpo produce "antitoxinas" (ms tarde conocidas como
anticuerpos) que tendan a neutralizar las toxinas de forma especfica, y evidenciaron que el
suero que contiene antitoxinas es capaz de proteger a animales expuestos a una dosis letal
de la toxina correspondiente (1890). La intervencin de Ehrlich permiti obtener sueros de
caballo con niveles de anticuerpos suficientemente altos como para conferir una proteccin
eficaz, e igualmente se pudo disponer de un ensayo para cuantificar la "antitoxina" presente
en suero. Ehrlich dirigi desde 1896 el Instituto Estatal para la Investigacin y
Comprobacin de Sueros, en Steglitz, cerca de Berln, y, a partir de 1899, estuvo al frente
del mejor equipado Instituto de Terapia Experimental, en Frankfurt. Durante este ltimo
periodo de su vida, Ehrlich produce una impresionante obra cientfica, en la que va
ahondando en la comprensin de la inmunidad humoral. En 1900 da a luz su "Teora de las
cadenas laterales", en la que formula una explicacin de la formacin y especificidad de
los anticuerpos, estableciendo una base qumica para la interaccin de stos con los
antgenos. Por su lado, R. Kraus visualiza por primera vez, en 1897, una reaccin antgenoanticuerpo, al observar el enturbiamiento de un filtrado bacteriano al mezclarlo con un
suero inmune especfico (antisuero). Durante cierto tiempo se crey que el suero posee
distintas actividades inmunes humorales, cada una denominada de forma diferente:
antitoxina (neutralizacin de toxinas), precipitina (precipitacin de toxinas), aglutinina
(aglutinacin de bacterias) y bacteriolisina (lisis de bacterias). Hubo que esperara a los aos
30 para caer en la cuenta que todas estas actividades se deban a un nico tipo de entidad,
que fue bautizado como anticuerpo.
En 1898 Jules Bordet (1870-1961) descubre otro componente srico relacionado con la
respuesta inmunitaria, al que bautiza como "alexina", caracterizado, frente al anticuerpo,
por su termolabilidad e inespecificidad (ms tarde se impondra el nombre de
complemento, propuesto por Ehrlich). El mismo Bordet desarroll, en 1901, el primer
sistema diagnstico para la deteccin de anticuerpos, basado en la fijacin del
complemento, y que inici un largo camino, que llega a nuestros das.
La conciliacin de las dos teoras (celular y humoral) se inici con los trabajos de Almorth
Wrigth y Stewart R. Douglas, quienes en 1904 descubren las opsoninas, anticuerpos
presentes en los sueros de animales inmunizados y que, tras unirse a la superficie
bacteriana, incrementan la capacidad fagoctica de los leucocitos. En los aos 50 se
reconoce que los linfocitos son las clulas responsables de los dos componentes, humoral y
celular, de la inmunidad.
El rea de la inmunopatologa inicia con la descripcin del fenmeno de anafilaxia
producido por introduccin en un animal de un suero de una especie distinta (Portier y
Richet, 1902; Arthus, 1903), lo que a su vez abrira la posibilidad de mtodos de
serodiagnstico, con aplicaciones mltiples en Medicina, Zoologa y otras ciencias
biolgicas. En 1905 Pirquet sugiere que la enfermedad del suero (un fenmeno de
hipersensibilidad) tiene relacin directa con la produccin de anticuerpos contra el suero
inyectado, introduciendo el trmino de alergia para referirse a la reactividad inmunolgica
alterada.
La inmunoqumica cobra un gran impulso en las primeras dcadas del siglo XX con los
trabajos de Karl Landsteiner (1868-1943). Su primera contribucin de importancia haba
sido la descripcin, mediante reacciones de aglutinacin, del sistema de antgenos naturales
(ABC0) de los eritrocitos humanos (1901-1902), completada (en colaboracin con Von
Dungern y Hirzfeld), con las subdivisiones del grupo A y el estudio de su transmisin
hereditaria. Estos trabajos sirvieron de estmulo para avanzar en el desentraamiento de la
especificidad qumica de los antgenos que determinan la formacin de anticuerpos.
Landsteiner estudi sistemticamente las caractersticas de inmunogenicidad y
especificidad de reaccin de antgenos con anticuerpos, valindose de la modificacin
qumica de antgenos, denominando haptenos a aquellos grupos qumicos que por s
mismos no desencadenan formacin de anticuerpos, pero s lo hacen tras ser conjugados a
protenas portadoras.
La cuestin de las reacciones antgeno-anticuerpo se convirti en otra polmica entre
escuelas hasta finales de los aos 20. Mientras Ehrlich y sus seguidores mantenan que
estas reacciones tienen una base puramente qumica, Bordet y sus discpulos las explicaban
como fenmenos fsicos de reacciones entre coloides. La resolucin del debate debi
aguardar hasta finales de los aos 30, al incorporarse avances tcnicos como la
electroforesis, la cromatografa en papel, la ultracentrifugacin y el microscopio
electrnico. Heidelberg y Kendall (1936) purificaron anticuerpos a partir de sueros por
disociacin de precipitados. Tiselius (1939) demostr que los anticuerpos constituyen la
fraccin gamma-globulnica del suero. En 1959, Rodney R. Porter y Gerald M. Edelman
presentan el modelo fundamental de las inmunoglobulinas (dos cadenas pesadas y dos
cadenas ligeras) y su estructura qumica., acontecimiento que separ los 200 aos de la
historia de la inmunologa en dos perodos, en los cuales ms de 70 investigadores han
hecho su contribucin en los campos de: la inmunidad, la serologa, la inmunoqumica y la
inmunobiologa.
Durante este lapso de tiempo se descubre que la sntesis de anticuerpos ocurre en las clulas
plasmticas, aunque stas no son puestas en relacin an con los linfocitos; durante muchos
aos se sigui creyendo que los linfocitos eran clulas pasivas, sin funcin inmune. Por
aquella poca se describe, tambin, la diversidad de inmunoglobulinas, llegndose al
establecimiento de una nomenclatura. Enseguida comienza la era de los mltiples
experimentos sobre timectoma en ratones neonatos y sobre bursectoma en aves, as como
los de reconstitucin de animales irradiados, con timocitos y clulas de la medula sea, y
que permiten afirmar el papel esencial de los linfocitos, encuadrarlos en tipos funcionales T
y B, y relacionarlos con las respuestas inmunes celular y humoral, respectivamente.
Una importante faceta de la inmunologa de la primera mitad del siglo XX fue la obtencin
de vacunas. Se lograron toxoides inmunognicos a partir de toxinas bacterianas, en muchos
casos por tratamiento con formol: toxoide tetnico (Eisler y Lowenstein, 1915) y toxoide
diftrico (Glenny, 1921). En 1922 se desarrolla la vacuna BCG contra la tuberculosis,
haciendo uso de una cepa atenuada de Mycobacterium tuberculosis, el bacilo de CalmetteGurin. La utilizacin de coadyuvantes se inicia en 1916, por LeMoignic y Piroy.
La inmunogentica nace cuando Bernstein describe en 1921 el modelo de transmisin
hereditaria de los cuatro grupos sanguneos principales, basndose en el anlisis estadstico
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siglos de historia se han realizado grandes avances cientficos en reas como: la serologa,
inmunidad celular, inmunologa molecular e inmunogentica. Mecanismos inmunolgicos
han permitido explicar la patognia de diversas enfermedades: alergias, enfermedades
autoinmunes, inmunodeficiencias y gamapatas monoclonales. Desarrollo de reas como la
inmunofarmacologa, inmunologa del cncer y la inmunologa del transplante. En el
mbito del diagnstico el uso de sondas y mtodos inmunolgicos contribuyen en reas
como la medicina humana, la veterinaria y la fisiopatologa. El desarrollo de la
inmunohistoqumica es un gran paso para la inmunologa, estudiando directamente lo que
sucede en la clula o en secciones de tejidos.
Anticuerpos
Un anticuerpo se define como una inmunoglobulina (Ig) capaz de una combinacin
especifica con el antgeno que ha causado su produccin en un animal susceptible. Ellos
son producidos en respuesta a la invasin de molculas forneas en el cuerpo. Los
anticuerpos existen como una o mas unidades en forma de Y, compuesta por cuatro cadenas
polipeptdicas. Cada Y contiene dos copias idnticas de una cadena pesada (HC, heavy
chain), y dos copias idnticas entre s de una cadena ligera (LC, light chain), llamadas as
por sus pesos moleculares relativos que son de aproximadamente 50kDa la cadena pesada y
de cerca de 25kDa la cadena ligera. Estas cadenas se mantienen unidas mediante enlaces
disulfuros intercatenarios. Estas cadenas pueden separarse por reduccin de los enlaces S-S
y acidificacin (Figura 1).
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Los anticuerpos pueden ser divididos en cinco clases: IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, basado en
el nmero de unidades Y y en el tipo de cadena pesada. Las cadenas pesadas de IgG, IgM,
IgA, IgD e IgE, son conocidas como gamma, mu, alpha, delta y epsilon (, , , y ),
respectivamente. Las cadenas ligeras de cualquier anticuerpo pueden ser clasificadas como
tipo kappa () o lambda (), basadas en pequeas diferencias estructurales polipeptdicas;
sin embargo, las cadenas pesadas determinan la subclase de cada anticuerpo (Tablas 1 y 2).
Tabla 1. Propiedades fisicoqumicas de inmunoglobulinas humanas
ligera asociada con la regin amino-terminal de una cadena pesada forman un domino de
unin al antgeno. Las regiones carboxi-terminal de las dos cadenas pesadas se doblan
juntas para formar el dominio Fc.
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Antgenos
El principio bsico de cualquier tcnica inmunoqumica es el de que un anticuerpo
especfico se unir con un antgeno especfico para dar un complejo anticuerpo-antgeno
exclusivo.
La definicin clsica de antgeno es cualquier sustancia fornea que elicita una respuesta
inmune cuando es introducida dentro de tejidos de animales susceptibles y que son capaces
de combinar con los anticuerpos especficos formados. Los antgenos son generalmente de
alto peso molecular y comnmente son protenas o polisacridos. Polipptidos, lpidos,
cidos nucleicos y otras molculas pueden tambin funcionar como antgenos. La respuesta
inmune puede tambin ser generada contra sustancias pequeas, llamadas haptenos, si
estos esta acoplados a una protena acarreadora, como la albmina de suero bovino (BSA) u
otras matrices sintticas. Una variedad de molculas como drogas, azucares simples,
aminocidos, pequeos pptidos, fosfolpidos o triglicridos pueden funcionar como
haptenos. As, dndole suficiente tiempo, cualquier sustancia fornea ser identificada por
el sistema inmune y evocara la produccin de un anticuerpo especfico. Sin embargo, esta
respuesta inmune especfica es altamente variable y depende mucho en parte del tamao,
estructura y composicin de los antgenos. Los antgenos que elicitan una fuerte respuesta
inmune se dice que son altamente inmunognicos.
Las partes de las regiones hipervariables del anticuerpo que contactan con el antgeno se
denominan partopos y la regin de un antgeno que puede especficamente unirse a un
anticuerpo es llamado eptope. Un eptope no tiene una propiedad intrnseca de alguna
estructura particular. Estos son usualmente uno a seis monosacridos o 5-8 residuos de
aminocidos sobre la superficie del antgeno.
Debido a que la molcula de antgeno existe en el espacio, el eptope reconocido por un
anticuerpo puede depender de la presencia de una especifica conformacin tridimensional
del antgeno (por ejemplo, un sitio nico formado por la interaccin de dos loops o
subunidades de una protena nativa) o el eptope puede corresponder a una regin de una
secuencia primaria simple, as, los eptopes son descritos como conformacionales y
lineares, respectivamente. El rango de posibles sitios de unin es enorme, ya que cada sitio
de unin tiene sus propias propiedades estructurales derivadas de enlaces covalentes,
inicos e interacciones hidroflicas e hidrofbicas.
Para que exista una eficiente interaccin entre el antgeno y el anticuerpo, el eptope debe
estar fcilmente disponible para la unin. Si la molcula blanco es desnaturalizada, por
ejemplo, por la fijacin, cambios de pH o durante la preparacin para el gel de
electrofresis, el eptope puede ser alterado y esto puede afectar su habilidad para
interactuar con un anticuerpo. Por ejemplo, algunos anticuerpos son inefectivos en un
Western blot pero muy bueno en inmunohistoqumica debido a que en el proceso, un
complejo sitio antignico puede ser mantenido en el tejido, mientras que en el otro
procedimiento la preparacin de la muestra altera la conformacin de la protena lo
suficiente para destruir el sitio antignico y as elimina el sitio de unin con el anticuerpo.
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Interaccin antgeno-anticuerpo
Los antgenos y anticuerpos interactan por complementariedad espacial y no por uniones
covalentes. La asociacin especfica del antgeno y el anticuerpo es dependiente del los
puentes de hidrogeno, las interacciones hidrofbicas, fuerzas electrostticas y las fuerzas de
van der Waals; por lo general solo son efectivas en distancias cortas. Todos estos son
uniones dbiles no covalentes, aunque algunas de las asociaciones entre antgeno y
anticuerpo pueden ser bastante fuertes. Al igual que los anticuerpos, los antgenos pueden
ser multivalentes, ambos a travs de mltiples copias del mismo eptope, o a travs de la
presencia de mltiples eptopes que son reconocidos por mltiples anticuerpos. Las
interacciones que involucran multivalencias pueden producir mayor estabilidad a los
complejos, sin embargo la multivalencia puede tambin resultar en dificultades estricas,
por lo tanto reduciendo la posibilidad de unin.
Los haptenos de tamao pequeo en s son monovalentes en lo que respecta a la reaccin
con el anticuerpo. En un experimento donde se mezcl el hapteno con el anticuerpo en una
bolsa de dilisis se mostr que la combinacin con el anticuerpo era reversible y que el
complejo as formado podra disociarse con facilidad en funcin de la fuerza de unin, a la
que denominamos afinidad. En la situacin simplista de un brazo de unin Fab aislado a un
eptope en el antgeno, la fuerza de unin puede definirse mediante la constante de
equilibrio KA de la reaccin de asociacin:
Ac + Ag
AcAg
Como todas las uniones antgeno-anticuerpo son reversibles y siguen los principios bsicos
termodinmicos de cualquier interaccin reversible bimolecular, tenemos que:
KA =
[Ac-Ag]
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[Ac][Ag]
donde KA es la constante de afinidad, Ac y Ag son las concentraciones molares de los
sitios de unin no ocupados del anticuerpo y del antgeno, respectivamente, y Ac-Ag es la
concentracin molar del complejo antgeno-anticuerpo. Si el anticuerpo y el antgeno
encajaran juntos de modo muy ntimo, el equilibrio estara bien a la derecha de la reaccin
de asociacin; nos referimos a estos anticuerpos que se unen con fuerza al antgeno como
anticuerpos de alta afinidad.
As mismo la afinidad puede definirse en trminos de la constante de disociacin (KD) de la
reaccin:
AcAg
Ac + Ag
Si las concentraciones se expresan en moles por litro:
KD = [moles de Ac/L][moles de Ag/L]
[moles de AcAg/L]
Es claro que KD es la reciproca de KA, es decir, 1/ KA y sus unidades son moles/L o M. Al
contrario, KA se expresa en las unidades L/mol o M-1 y tiene la ventaja de que cuanto
mayor es la fuerza de unin la cifra es mas alta.
El tiempo que toma en alcanzar el equilibrio es dependiente de la velocidad de difusin y
de la afinidad del anticuerpo sobre el antgeno y puede variar ampliamente. Las constantes
de afinidad de unin antgeno-anticuerpo pueden abarcar un amplio rango, extendindose
por debajo de 105 mol-1 hasta ms de 1012 mol-1. Las constantes de afinidad pueden ser
afectadas por la temperatura, el pH y los solventes.
La afinidad describe la fuerza de interaccin entre anticuerpo y antgeno en un solo sitio
antignico. Dentro de cada sitio antignico, la regin variable del anticuerpo interacta a
travs de fuerzas dbiles no covalentes con el antgeno en numerosos sitios. Mientras que el
trmino afinidad describe la unin del anticuerpo a un hapteno monovalente o a un solo
determinante antignico, en la mayora de las circunstancias practicas nos preocupamos por
la interaccin con el antisuero (es decir, el suero proveniente de un individuo inmunizado)
con un antgeno multivalente. El termino empleado para expresar esta unin es la avidez o
afinidad funcional. La avidez es la fuerza con la que el Ac multivalente se une a un Ag
multivalente. Aunque depende de las afinidades individuales de cada uno de los
determinantes individuales de ese antgeno, su valor es mucho mayor que la suma de
afinidades.
Pero por otro lado, hay que considerar que los Ag naturales suelen tener ms de un tipo de
determinante antignico. Cuando un antgeno de este tipo entra en un individuo, ste
produce un antisuero, que presenta varios tipos de anticuerpos, cada uno de ellos dirigidos a
un tipo diferente de determinante antignico del Ag original. En este caso se habla de
avidez del antisuero, que es la fuerza conjunta de los distintos anticuerpos de ese antisuero
que reconocen al antgeno multivalente complejo:
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n Ac + mAg
{Acn Agm}
donde n representa la heterogeneidad del anticuerpo, y m los distintos tipos de epitopos del
antgeno.
Los factores que contribuyen a la avidez del antisuero son complejos, pero uno muy
interesante es el derivado de la multivalencia del antgeno. La fuerza de unin de un
antgeno complejo multivalente a varios tipos de Ac es mucho mayor que la suma
aritmtica de las fuerzas de unin de cada anticuerpo: La avidez refleja mejor la situacin
fisiolgica, pero la afinidad nos caracteriza lo que ocurre con cada tipo de anticuerpo
concreto en su interaccin con el eptope.
La avidez es quiz una medida ms informativa de toda la estabilidad o la fuerza del
complejo antgeno-anticuerpo. Esto es controlado por tres factores: la afinidad anticuerpoeptope; las valencias de ambos, antgeno y anticuerpo; y el arreglo estructural de las partes
que interactan. Cuando el anticuerpo y el antgeno pueden formar complejos
multivalentes, la fuerza de interaccin es grandemente incrementada. Estos factores definen
la especificidad del anticuerpo, que es, la probabilidad de que un anticuerpo particular se
una a un preciso eptope del antgeno. Dado que la intensidad de la reaccin puede
cuantificarse por la afinidad o la avidez, relacionaramos la especificidad de un antisuero
con su avidez relativa por los antgenos para los que estn siendo discriminados.
Al reconocer que un antisuero puede tener una avidez relativamente mayor por un antgeno
que por otro, indicamos que el antisuero despliega una especificidad relativa ms que
absoluta; en la prctica se habla de grados de reactividad cruzada. La reactividad cruzada
se refiere a un anticuerpo o poblacin de anticuerpos unidos a eptopes sobre otros
antgenos. Esto puede ser causado por ambos, por la baja avidez o especificidad del
anticuerpo o por mltiples distintos antgenos que tienen idnticos o muy similares
eptopes. La reactividad cruzada es a veces deseable cuando uno quiere una unin general a
un grupo relacionado de antgenos o cuando se intenta clasificar especies cruzadas cuando
la secuencia del eptope del antgeno no esta muy altamente conservada en la evolucin.
Los aminocidos que forman el sitio de unin del antgeno son derivados de ambas
cadenas, la pesada y la ligera, y corresponden a los aminocidos de las regiones
hipervariables determinadas por la secuencia de la protena. Las regiones hipervariables son
conocidas como las regiones determinantes de la complementariedad o CDRs (por sus
siglas en ingles, complementarity determining regions). Los CDRs son seis, tres de cada
cadena, y estos forman loops discretos anclados y orientados por las estructuras de los
residuos de los dominios variables (Figura 4).
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tratamientos qumicos del antgeno que los anticuerpos policlonales. Esto puede ser
compensado por el uso de dos o ms anticuerpos monoclonales del mismo antgeno.
Algunos usos de las propiedades de anticuerpos policlonales son:
Tcnicas inmunoqumicas
Gran parte de los progresos alcanzados por la biologa moderna se deben al
perfeccionamiento de los mtodos analticos de medida. La introduccin de los
procedimientos basados en las reacciones inmunolgicas ha representado un importante
avance en el anlisis de sustancias de inters en biologa animal y vegetal difciles de medir
empleando los mtodos bioqumicos habituales.
Dentro de los procedimientos inmunolgicos, los ms tiles y prcticos son aquellos que se
basan en la especificidad de la unin Ag-Ac. La propiedad que tienen las Igs de unirse a un
Ag, la especificidad de esta unin y el hecho de que pueda ser visualizable por los
fenmenos de precipitacin, aglutinacin y otros mecanismos indirectos (marcaje con
fluorescena, con radioistopos o con enzimas) hacen que estos mtodos se empleen
ampliamente.
Dado que los antgenos y anticuerpos se definen por sus interacciones mutuas, uno de ellos
puede utilizarse para cuantificar al otro. Si disponemos de una solucin de un anticuerpo
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20
una nubosidad o turbidez, que puede determinarse por dispersin angular anterior de una
fuente de luz incidente (nefelometra). La mayor sensibilidad puede obtenerse mediante el
uno de una luz monocromtica proveniente de un lser y con el agregado de polietilenglicol
a la solucin, de modo tal que aumenta el tamao del agregado. En la practica, la
nefelometra se aplica ms a la deteccin de antgenos que a la de anticuerpos.
Para la realizacin de estas tcnicas se requiere que tanto el Ac como el Ag se encuentren
en un medio fluido en el que sea posible la precipitacin del complejo Ag-Ac.
Existen diferentes modalidades siendo las principales:
1. Tcnica de precipitacin propiamente dicha.
2. Tcnica de difusin radial de Ouchterlony.
3. Tcnica de inmunoelectroforesis.
4. Tcnica de difusin radial simple de Mancini.
1. Tcnica de precipitacin
El complejo Ag-Ac precipita espontneamente o por centrifugacin cuando la proporcin
de Ags y Acs de la mezcla es equivalente. En la Figura 7 se muestra un esquema de los
tipos de complejos formados al mezclar, en tubos de ensayo, soluciones con diferentes
cantidades de antgenos a los que se aaden igual cantidad de un antisuero.
La precipitacin es mxima all donde la proporcin entre ambos es ptima (parte central
de la curva), pero va disminuyendo a medida que predomine el Ac o el Ag (izquierda y
derecha de la curva respectivamente) Este tipo de reaccin no es muy utilizado al requerirse
grandes concentraciones de antgeno y de anticuerpo para poder medir el precipitado
formado.
22
Esta tcnica se realiza en placas de agar en donde se practican pocillos (Figura 8), en uno
de estos pozos se coloca el suero o muestras a investigar y en el resto se coloca el
anticuerpo preparado frente a la sustancia que se quiere identificar.
Cuando difunden, ambos sistemas se encontrarn y se formar en la zona de equivalencia el
complejo Ag-Ac correspondiente que se hace visible en forma de una lnea de
precipitacin. En una preparacin que contenga varios antgenos, se obtendrn mltiples
lneas de precipitado. La tcnica de Ouchterlony permite identificar sustancias segn la
forma de unirse las lneas de precipitacin de dos o varios sistemas.
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Hemoaglutinacin indirecta
Se basa en el principio de la inhibicin de la hemoaglutinacin. Para su realizacin se
precisan glbulos rojos a los cuales se les ha unido la misma sustancia que se desea detectar
o cuantificar (Figura 13). Si estos glbulos rojos son puestos en presencia de anticuerpos
preparados frente a dicha sustancia se producir su aglutinacin. Por el contrario, cuando se
aade un suero problema que contiene la sustancia a cuantificar entonces los anticuerpos se
unirn a dicha sustancia y no a los glbulos rojos. En este caso no se producir la
hemoaglutinacin. Por tanto, aglutinacin (+) indica ausencia de la sustancia a estudiar, y
aglutinacin (-) indica presencia de la misma. La medida de gonadotrofina corinica (HCG)
para el diagnstico de embarazo puede realizarse por esta tcnica.
Figura 13. Inhibicin por aglutinacin de glbulos rojos con gonadotrofina corinica
(HCG) presente en suero
Tcnicas de inmunofluorescencia
La fluorescencia es una propiedad de ciertas molculas que, al ser irradiadas con energa
electromagntica de longitud de onda adecuada, emiten radiacin de longitud de onda
caracterstica permitiendo su cuantificacin.
Las molculas de un colorante fluorescente absorben luz en una longitud de onda y
convierten la luz absorbida de alta energa (longitud de onda ms corta) en luz de menor
energa (longitud de onda ms larga). Cada fluorocromo tiene un espectro de emisin y
excitacin caractersticos; si se utilizan dos con el mismo espectro de excitacin pero
distinto espectro de emisin, se pueden medir dos caractersticas al mismo tiempo
(fluorescencia de dos colores).
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Una molcula que fluoresce puede ser fijada en el anticuerpo para ser detectada usando luz
UV. Ejemplos de estas molculas son la Fluorescena, Rodamina, Texas Red, Cy3 y Cy5
(Figura 14). En la seleccin de los fluorocromos, uno esta limitado por la disponibilidad del
juego de filtros del microscopio a utilizar. Muchos juegos de filtros son ms compatibles
con rodamina o fluorescena. El Texas red puede ser usado tambin con un juego de filtros
para rodamina.
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29
30
Figura 18. Imagen en dos dimensiones de citometra de flujo (Dot-Plot). Detalle de las
subpoblaciones linfocitarias definidas mediante inmunofluorescencia
La puesta a punto de las tcnicas de citofluorometra, en las que se conjugan los avances de
informtica, rayos lser y anticuerpos monoclonales permite el anlisis fenotpico y
funcional de las clulas T, B y de todas aquellas clulas de las que se disponga de un
antisuero que las identifique. En la tabla 5 se recogen los valores normales obtenidos en
clulas de sangre perifrica.
Figura 19. Imagen en una dimensin (histograma) de una de las fluorescencias medidas en
el dot-plot
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500-1000
300-500
300-500
500-700
600-1200
750-1500
750-1800
800-1800
800-1800
800-1800
0-5
2-16
15-30
30-60
30-175
70-250
90-390
90-450
90-450
90-450
IgM
0-10
15-30
35-60
60-180
60-220
60-250
60-280
60-280
60-280
60-280
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Figura 20. Esquema del principio general de radioinmunoensayo para medir hormonas
Este tipo de reaccin se encuentra esquematizado en la Figura 20. Los resultados se
obtienen al medir la radiactividad de la hormona marcada unida al anticuerpo y la de la
hormona marcada libre mediante un contador de centelleo. Al centrifugar, la hormona libre
queda en solucin y la hormona unida al anticuerpo forma agregados fcilmente
precipitables.
Una vez medida la radiactividad se construye una curva con los resultados obtenidos con
cantidades conocidas de hormona sin marcar y marcada. A esta curva se llevan los valores
obtenidos de los sueros problema y se obtiene la concentracin de la hormona no marcada a
investigar.
En el RIA directo, a la fase slida se une una cantidad conocida de Ac. Diferentes
concentraciones conocidas de antgeno marcado se incuban con una concentracin
constante de la muestra de la que se desea conocer la concentracin del antgeno en
cuestin.
El fundamento y la deteccin no sufriran cambios respecto lo anteriormente comentado. El
RIA de inhibicin tambin sera una tcnica competitiva de anlisis pero lo que se une a la
fase slida es una cantidad fija de antgeno. Para el proceso de inhibicin se incuba una
concentracin fija de anticuerpo marcado frente a una serie de diluciones de la muestra que
contiene el antgeno. Existe una tcnica no competitiva que es el denominado sndwich: Se
une un Ac en cantidades constantes a la fase slida. Una vez realizado el bloqueo, se aade
el antgeno en concentraciones variables. Posteriormente se aade un segundo anticuerpo
contra el antgeno, pero esta vez marcado. Adems del radioinmunoensayo antes descrito
hemos de considerar que, en la actualidad, es cada vez ms frecuente el empleo de
inmunoglobulinas marcadas con istopos radiactivos para su posterior aplicacin en
diferentes campos: trazador en determinaciones in vitro de antgenos especficos, en
tcnicas inmunorradiohistolgicas y tcnicas de anlisis no competitivo que pueden ser una
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reconocido por el primer anticuerpo. Despus de un segundo lavado que elimina el material
no retenido se aplica una solucin con un segundo anticuerpo anti-antgeno marcado. As
pues cada molcula de antgeno estar unido a un anticuerpo en la base que lo retiene y un
segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y
sensibilidad debido a la amplificacin de seal que permite el segundo anticuerpo.
Figura 23. Esquema de un nefelmetro. Los complejos Ag-Ac formados son cuantificados
por el grado de difraccin.
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40
41
Figura 28. Esquema de una aparato de aplicacin directa de soluciones de protena sobre
una membrana (dot blot/spot blot)
Trabajar con las protenas fijadas sobre una membrana tiene ventajas sobre el emplearlas
dentro del propio gel:
Transferencia capilar
Transferencia por difusin
Transferencia electrofortica ('electroblotting')
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45
Figura 31. Esquema del principio bsico del BIAcore. SPR obtenido por reflexin total interna
en una interfase entre vidrio-metal. El instrumento permite el registro de las interacciones en tiempo
real entre las macromolculas (Y invertidas) depositadas en la superficie del biosensor y las
molculas que fluyen por el canal (esferas pequeas)
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48
PCR in situ
El PCR in situ es una reaccin en cadena de polimerasa que tiene lugar dentro de la clula.
La amplificacin en el PCR in situ puede ser llevada a cabo sobre tejidos o clulas fijas
(Figura 35).
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