ECOLOGIA MICROBIANA

- Estudio de los microorganismos en su ambiente natural

-Ambiente es todo aquello que rodea a un organismo vivo.
- Por ejemplo los factores qumicos, fsicos y biolgicos.
- Los microorganismos (MOs) son parte de comunidades
organizadas llamadas ecosistemas.
- Los MOs interactan con el entorno y pueden cambiar en
forma marcada las caractersticas del mismo.
Desempean papeles importantes en la sntesis y
degradacin de distintos compuestos.

MOs autotrficos: generan materia orgnica a partir de CO2

MOs organotrficos: participan en la biodegradacin y
reciclado de materia orgnica.
Se puede definir un ciclo biogeoqumico para los elementos
clave (C, N, S, Fe) en el cual los mismos sufren distintos
estados de xido reduccin a medida que se mueven a travs
de un ecosistema.
Los MOs participan en las reacciones biogeoqumicas. Para
muchos elementos son los nicos capaces de generar los
compuestos clave capaces de ser utilizados por otros
organismos.

Biodiversidad de los MOs

Eclogo microbiolgico
Actividades metablicas y como interaccionan

Conocer aspectos cuali y

cuantitativos de la
microbiologa de un
ecosistema

Da una idea del potencial

biogeoqumico en un ecosistema

Conocer las actividades

de los MOs en su
ambiente natural
- La existencia de MOs no implica que los mismos sean activos
-Solo los MOs activos tienen impacto ecolgico.
-Medir la existencia de una determinada transformacin bioqumica
especfica implica que un grupo especfico de bacterias existe y que
es metablicamente activo.

Clulas individuales

poblaciones

gremios

comunidades

Distintas poblaciones relacionadas metablicamente forman

agrupaciones llamadas guilds o gremios.
La interaccin de los gremios que llevan a cabo procesos fisiolgicos
complementarios da lugar a la formacin de una comunidad bacteriana
Las comunidades microbianas interactan con comunidades de
macroorganismos para definir el ecosistema entero.

Luz
Compuestos orgnicos

Energa

Ecosistema

Sustancias inorgnicas
Luz

organismos fototrficos, sntesis de materia

orgnica que contiene C, N, S, P, Fe
Muerte de los MOs y liberacin de energa
de sus constituyentes qumicos orgnicos

Materia orgnica

organismos quimioorganotrficos
(usan compuestos orgnicos como fuente de energa)

Sustancias inorgnicas
reducidas

organismos quimiolitotrficos
(organismos que obtienen energa de la oxidacin de
compuestos inorgnicos)

Comunidad microbiana en un ecosistema lacustre

En el lago tenemos tres

organismos fototrficos

comunidades microbianas

organismos quimioorganotrficos
(aerobios y aerobios facultativos)
organismos anaerobios

La ciencia de la microbiologa ecolgica tiene 2 objetivos:

1ro) el estudio de la biodiversidad de los MOs en la naturaleza y de
cmo los diferentes gremios interactan en las comunidades
microbianas.
2do) medir las actividades de los MOs en la naturaleza y monitorear
sus efectos sobre los ecosistemas.

Hay muchos MOs que no se han descubierto an. La medicin de las

actividades microbianas en la naturaleza permite conocer el
funcionamiento metablico de las comunidades microbianas an si
conocemos poco acerca de los organismos que las componen

LOS MICROORGANISMOS EN LA NATURALEZA

- Cualquier hbitat adecuado para el crecimiento de organismos
superiores puede tambin soportar el crecimiento de MOs. La
inversa no es vlida.
-Los MOs pueden habitar la superficie de animales superiores y
en algunos casos pueden vivir dentro de plantas y animales. En
tales hbitat alcanzan grandes nmeros y pueden ser
beneficiosos para las plantas o animales o ser patgenos de sus
respectivos hospedadores.
LOS MICROORGANISMOS Y EL MEDIO AMBIENTE
El crecimiento de los MOs

Los recursos nutricionales

en la naturaleza depende de

Las condiciones de crecimiento

- El nicho de un organismo en particular est definido por los recursos

nutricionales, la cantidad de los mismos, el pH, la temperatura, la
disponibilidad de agua, luz y oxgeno de su hbitat.

-Cada organismo tiene un nicho primario o principal en el cual dicho

organismo es el mas exitoso.
- En la tierra existe un nmero innumerable de nichos microbianos
siendo stos en parte los responsables de la gran diversidad metablica
y de la biodiversidad de los MOs que tenemos en la actualidad.
- El hbitat de un MO es pequeo (est en relacin al tamao de los
MOs), pero pueden existir gradientes qumicos y fsicos en dicho hbitat
que afecten a los MOs.

MICROAMBIENTE
Es donde el MO vive y metaboliza dentro de un hbitat.
Perfil de las concentraciones de
O2 en una partcula de suelo

En una partcula de suelo de 6 mm pueden

existir varios microambientes diferentes, tanto
fsicos como qumicos y pueden coexistir
distintos tipos fisiolgicos de MOs. Los MOs
anaerobios podran ser activos en el centro de
la partcula de tierra, los microaerfilos podran
ser activos mas afuera y los aerobios obligados
podran metabolizar en los 0,2 a 0,3 mm
externos de la partcula
Las condiciones fisicoqumicas en el microambiente pueden cambiar rpidamente en
funcin del tiempo y del espacio. La
respiracin de los MOs o el incremento de
agua en el suelo pueden cambiar
drsticamente el gradiente de O2 a travs del
micro medioambiente.

Conclusiones: Los microambientes son

heterogneos. Las condiciones pueden cambiar

drsticamente. Una gran diversidad microbiana
puede existir en un rea fsica relativamente
pequea.

10

NIVELES DE NUTRICIN Y VELOCIDAD DE CRECIMIENTO

- Los nutrientes entran al ecosistema en forma intermitente. A perodos de
gran abundancia le siguen perodos de escasez.
- Los MOs han diseado mecanismos de defensa que les permiten acumular y
almacenar materiales de reserva en forma de polmeros. Por ej. Poli-betahidroxibutirato, alcanoatos, polisacridos (glucgeno), polifosfatos, azufre
elemental, etc.
- La velocidad de crecimiento de los MOs en la naturaleza no es la ptima o la
velocidad mxima que se da en el laboratorio. Las bacterias del suelo
tienen una velocidad de crecimiento de aproximadamente 1% de la
velocidad mxima de crecimiento obtenida en el laboratorio.
Hbitat
Escherichia coli

en el intestino
en el laboratorio

Tiempo de duplicacin
12 horas
20 minutos

La disminucin de la velocidad de crecimiento en la naturaleza se debe a:

a) Baja disponibilidad de nutrientes
b) Distribucin no uniforme de los nutrientes en el hbitat
c) Efectos competitivos con otros MOs.

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SUSTANCIAS DE RESERVA
(a) Estructura qumica del poli--hidroxibutirato
(PHB); (b) Microfotografa electrnica del bacilo
fototrfico Rhodospirillum sodomense.

Microfotografa de campo claro del

bacilo prpura del azufre Chromatium
buderi.

12

COMPETENCIA Y COOPERACIN MICROBIANA

La competencia por los recursos disponibles en la naturaleza es muy
intensa y el resultado depende de:
a) La tasa de incorporacin de los nutrientes
b) Las tasas metablicas inherentes a cada MO
c) La velocidad de crecimiento
- En algunos casos de competencia microbiana, un MO puede inhibir el
crecimiento de otros, por ej. con la produccin de antibiticos o de
productos txicos (Ej. el cido producido por la fermentacin de
azcares).
- En algunos casos los MOs colaboran para llevar a cabo una
transformacin determinada que ninguno de ellos puede llevar a cabo
por si solos. Esto se llama sintrofa. Los organismos que participan
deben convivir en un mismo microambiente ya que el producto del
metabolismo de uno de ellos debe ser de fcil acceso para el otro.
Estas interacciones son cruciales para el xito competitivo de algunas
bacterias anaerbicas.
Otro ejemplo de relaciones cooperativas son por ej. el metabolismo
complementario entre las bacterias nitrosificantes y las nitrificantes
para oxidar el amonaco a nitrato. Otro ej. son las bacterias reductoras
de sulfato y oxidantes de sulfuro.

13

Sintrofa: proceso por el cual dos o mas MOs cooperan

en la degradacin de una sustancia que no pueden
degradar por s solos.
En la mayora de los casos, en la reaccin sintrfica
interviene el H2, que es producido por un miembro de la
relacin sintrfica y consumido por el otro. Por este
motivo la sintrofa es conocida tambin como
transferencia interespecfica de H2. El organismo que
consume el H2 puede ser por ej. bacterias sulfato
reductoras, homoacetgenos, metangenos, bacterias
desnitrificantes, etc. Las reacciones sintrficas son
caractersticas de transformaciones anaerbicas y se dan
en hbitat anxicos.

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Fermentacin de etanol a metano y acetato por la accin

sintrfica de una bacteria que oxida el etanol y una
bacteria que consume el H2 producido por la primera.

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SUPERFICIES Y BIOFILMS
-Las superficies absorben nutrientes
-Son hbitats microbianos importantes
-La concentracin de los nutrientes es muy superior en las superficies
respecto a la del medio que la rodea
-La tasa metablica y de crecimiento de los MOs aumenta mucho en las
superficies
-La concentracin de MOs que crecen en las superficies suelen ser mucho
mayores que las que se encuentran en el medio lquido

Existen tcnicas sencillas de tincin de poblaciones microbianas adheridas

a una superficie slida para medir la velocidad de crecimiento de MOs, por
ej. La tincin con naranja de acridina y posterior observacin por
microfotografa fluorescente
La superficie de adherencia puede ser tambin un nutriente o materia
orgnica o inorgnica que los MOs adheridos catabolizan directamente de
la superficie de la partcula

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SUPERFICIES Y BIOFILMS MOSTRANDO MICROCOLONIAS

BACTERIANAS
Microfotografa fluorescente de una
comunidad microbiana natural
colonizando races de plantas en el
suelo. Obsrvese el desarrollo de la
microcolonia. La preparacin se ha
teido con naranja de acridina

Microcolonias bacterianas desarrollndose

sobre un portaobjetos inmerso en agua de
un arroyo. Las partculas brillantes son
materia mineral. Las clulas cortas de
forma bacilar miden unos 3 m de largo.

17

COLONIZACIN
-La mayor parte de los MOs crecen sobre superficies adheridos
por medio de polisacridos bacterianos, secretados por las
mismas bacterias.
-Los biofilms atrapan nutrientes y en medios fluidos impiden que
los MOs se desprendan
-Los biofilms tienen importancia en medicina y en las industrias
-Las bacterias contenidas en biofilms pueden escapar al ataque
del sistema inmunitario de los organismos
-Los implantes mdicos pueden convertirse en el lugar de
desarrollo de biofilms que pueden contener MOs patgenos
-La placa dental es un biofilm tpico que contiene bacterias
productoras de cido lctico que es el causante de las caries
dentales
-En las industrias los biofilms pueden causar el entorpecimiento
del flujo de agua o de petrleo en los oleoductos
-Los biofilms pueden contribuir a la degradacin de objetos
sumergidos, plataformas petroleras, barcos, instalaciones en la
costa, etc.

18

LOS DIENTES Y LA PLACA DENTAL

-El diente est compuesto por una matriz de cristales de
fosfato de calcio (esmalte) y tejido vivo del diente
(dentina y pulpa)
-El diente influye en la naturaleza de la flora microbiana
(microbiota)
-En el 1er ao de vida predominan en la boca las
bacterias anaerbicas aerotolerantes as como
estreptococos y lactobacilos.
-Al aparecer los dientes hay un cambio marcado de la
microflora hacia los MOs anaerbicos. Aparecen bacterias
adaptadas especficamente al crecimiento sobre las
superficies y hendiduras de los dientes

Colonizacin bacteriana
1-Formacin de una pelcula fina de glicoprotenas cidas de la saliva sobre el
diente
2-Anclaje firme de clulas bacterianas. La colonizacin de sta pelcula por
crecimiento en forma de microcolonias es muy especfica y se llama placa dental.

Caries dentales
Es el resultado del aumento de la placa dental y de la formacin de productos
cidos, como el cido lctico producido por la fermentacin de los azcares, que
provoca la descalcificacin del diente.

19

Una vez que ha comenzado la rotura del tejido duro, tiene lugar la protelisis de
la matriz del esmalte dentario bajo la accin de las enzimas proteolticas liberadas
por las bacterias.
El flor en la matriz del cristal de fosfato de calcio hace que la matriz sea mas
resistente a la descalcificacin por el cido.
Se han implicado dos MOs en las caries dentales. Streptococus sobrinus y
Streptococus mutants. Ambas bacteria son productoras de cido lctico.
S. sobrinus tiene una gran afinidad especfica por las glicoprotenas de la saliva y
se adhiere firmemente a las superficies lisas del diente colonizndolo.
S. mutants se encuentra principalmente en la hendiduras y fisuras pequeas y su
capacidad para fijarse a ambas superficies es el resultado de la produccin de un
polisacrido de dextrano que es extraordinariamente adhesivo. S mutants
produce dextrano nicamente cuando existe sacarosa, mediante la enzima
dextransacaridasa.
n sacarosa

(glucosa)n + n fructosa
dextrano

Distribucin de la placa dentaria utilizando un agente

de revelado en un diente cepillado (arriba) y sin
cepillar (abajo). Los nmeros expresan el rea total de
la placa dentaria al da 1 (1436 mm2) y al da 10
(22522 mm2).

20

Microcolonias bacterianas que crecen sobre una superficie dentaria artificial insertada
en una boca durante (a) 6 hs ; (b) a mayor aumento la misma preparacin que se
muestra en (a).

Obsrvese la diferencia morfolgica

de los organismos presentes y el
material viscoso, indicado con flechas,
que sujetan a los microorganismos.

21

22

METODOS EN ECOLOGIA MICROBIANA

Interesan dos aspectos en la ecologa microbiana
1) La biodiversidad, es decir qu MOs y en qu nmero
se encuentran en un determinado hbitat.
2) La actividad microbiolgica, o sea como afecta la
presencia de un determinado MO al ecosistema.
Esto se puede llevar a cabo realizando las siguientes
actividades:
Anlisis de las comunidades microbianas
dependientes de cultivos.
Anlisis molecular de las comunidades microbianas.
Medicin de las actividades microbianas en la
naturaleza.

23

Anlisis dependientes de cultivos:

enriquecimiento y aislamiento.
- En la naturaleza los microbios existen en
cultivos mezclados llamados comunidades
microbianas.
- Para aislar y estudiar un organismo
particular los microbilogos utilizan tcnicas
de enriquecimiento.
- Se usan medios y condiciones de incubacin
que seleccionan a un organismo particular y
contra-seleccionan a los organismos no
deseados.
24

Ejemplo: el mtodo de Beijerinck Martinus

(microbilogo holands) a quien se deben las
primeras tcnicas de cultivo de enriquecimiento
para aislar la bacteria fijadora de nitrgeno
Azotobacter.
Azotobacter puede crecer rpidamente fijando N2 del
aire, los medios de enriquecimiento carentes de
amonaco u otras formas de nitrgeno fijado son muy
selectivos para este organismo; las bacterias no
fijadoras de nitrgeno o las bacterias fijadoras de
nitrgeno anaerbicas son contra-seleccionadas con este
mtodo.

25

Aislamiento de Azotobacter

26

ENRIQUECIMIENTO Y AISLAMIENTO.
La columna de Winogradsky:
. Se usa para aislar y enriquecer en bacterias fototrficas
prpuras y verdes, bacterias reductoras de sulfato, y
muchos otros anaerbios.
. Es un sistema anxico en miniatura.
. Se prepara llenando aproximadamente por la mitad un
cilindro de vidrio grande con un lodo rico en materia
orgnica.
. El lodo es cubierto con agua de un lago, embalse o
acequia y se tapa.
. Se coloca cerca de una ventana donde recibe luz solar
atenuada y se deja varias semanas.

27

Columna de Winogradsky
Agua de pozo
o lago

Lodo
suplementado
con nutrientes
orgnicos y
sulfato de
calcio y
carbonato de
calcio

28

Se desarrolla una mezcla de organismos

- Cianobacterias y algas en el tope (zona oxignica).
- Proceso de descomposicin en el lodo o sedimento
produce productos adecuados como cidos orgnicos,
alcoholes y H2, sustratos adecuados para las bacterias
reductoras de sulfato.
- El sulfuro producido a partir del sulfato gatilla el
desarrollo de las bacterias verdes o prpuras del azufre.
Se toman muestras de la columna a profundidad para
obtener muestras de cultivos anaerbicos.
- La columna de Winogradsky se ha usado para enriquecer
diversos procariotas, tanto aerobios como anaerobios. Una
vez que se ha establecido un enriquecimiento, se puede
intentar obtener cultivos axnicos.

29

SESGO EN EL ENRIQUECIMIENTO
En el laboratorio, el organismo que est mejor adaptado
a las condiciones in vivo podra crecer mas rpido y
convertirse en el organismo dominante.
Tpicamente, el organismo ms apto in vivo es solo un
componente minoritario del ecosistema.
La solucin es la dilucin del inculo. Se cree que la
dilucin elimina aquellas poblaciones minoritarias, pero
de crecimiento rpido dando de este modo la
oportunidad de desarrollarse a otros miembros de la
comunidad que tienen tiempos de duplicacin mayores.
La dilucin del inculo es una prctica comn en el
cultivo de enriquecimiento en la microbiologa actual.

30

AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS O AXNICOS.

Los cultivos axnicos se pueden obtener a partir de cultivos de
enriquecimiento de varias maneras; los mtodos ms frecuentes son:
a) la siembra por estra en superficie (caja de Petri),
b) la siembra en profundidad (agar shake) y
c) la dilucin en lquido.
-Siembra por estra en superficie.
Para aquellos MOs que crecen bien en medio slido, este es el mtodo
de eleccin. A partir de una poblacin mixta se obtienen al estriarla
en superficie de agar colonias aisladas. Repitiendo con cada una de las
colonias aisladas este procedimiento se consigue un cultivo axnico que
puede ser transferido a un medio lquido.
-Siembra en profundidad o agar-shake
La dilucin de un cultivo mixto en agar fundido da lugar a colonias
embebidas en el agar. Este mtodo es til para purificar anaerbios.
Se hacen diluciones sucesivas seriadas para obtener cultivos puros.

31

Mtodos de cultivo axnico

Jarra anxica. Una reaccin qumica producida por

el contenido del sobre en el interior de la jarra
genera H2 + CO2. El H2 reacciona con el O2
presente en la jarra sobre la superficie de un
catalizador de paladio para formar H2O2. La
atmsfera final contiene N2, H2 y CO2.

32

AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS.

El nmero ms probable.
- Dilucin serial de un inculo en medio lquido hasta
que el tubo final en la serie no muestre crecimiento.
- Conocida como la tcnica del nmero ms probable
(NMP).
-Se usa para estimar el nmero de microorganismos en
alimentos, aguas residuales y otro tipo de muestras
donde el nmero necesita ser asignado en forma
rutinaria.
Utilizando diluciones seriadas de 10 en 10, el ltimo tubo que muestre
crecimiento tiene que haberse originado a partir de 10 clulas o menos. Si
se repite este proceso varias veces se obtiene cultivos puros. Se pueden
usan medios altamente selectivos y condiciones de incubacin dirigidos a
uno o a un pequeo grupo de organismos, como por ej. un determinado
patgeno, o medios complejos para obtener una estimacin del nmero
total de clulas.

33

Procedimiento de enriquecimiento por dilucin de

extincin o anlisis del nmero mas probable NMP

34

- El ltimo tubo que muestra crecimiento (en el ej. Es la

dilucin 10-5) debe haberse desarrollado a partir de 10
clulas o menos.
- Para obtener cultivos axnicos se utiliza como inculo la
mayor dilucin que muestra crecimiento y se repite el
procedimiento.
- Para una estimacin del nmero
de un tipo
determinado de bacteria en una muestra, el NMP se
define como la dilucin ms elevada que muestra
crecimiento. Si el medio utilizado fuera muy selectivo, por
ejemplo para bacterias reductoras de sulfato, se podra
concluir que para el caso mostrado en la figura hay entre
105 y 106 clulas recuperables de ese organismo por
gramo de muestra. Se hacen rplicas para mayor
exactitud y un blanco de dilucin.

35

CULTIVOS AXNICOS DE ALTA TECNOLOGA:

Las pinzas lser
- Las pinzas de lser consisten de un microscopio ptico
invertido equipado con un lser infrarrojo enfocado con
precisin y un instrumento de micromanipulacin.
- Una clula individual del campo de visin es atrapada
por el haz de rayos lser y separada del resto de los
microorganismos contaminantes.
- Es un mtodo til para aislar bacterias de crecimiento
lento que pueden ser superadas por el crecimiento
rpido de otras poblaciones en los cultivos de
enriquecimiento tpicos o para organismos presentes en
bajo nmero.

36

Pinzas de lser para el aislamiento de bacterias.

(a) Principio de las pinzas pticas.
Un haz de rayos lser fuertemente
enfocado sobre un objeto tan
pequeo
como
una
clula
bacteriana,
crea
fuerzas
de
radiacin descendentes (Fa, Fb)
sobre la clula, que permiten su
desplazamiento
en
cualquier
direccin mientras est sometida a la
fuerza del haz de rayos lser.
(b) Aislamiento. El haz de rayos
lser puede enfocarse sobre una
clula individual presente en la
mezcla de un tubo capilar, atraparla
ptimamente y separarla. Una vez
separada lo suficiente de las otras, el
capilar se corta, se desconecta el
lser y la clula se coloca en un
medio de cultivo estril.

37

ANLISIS MOLECULAR DE LAS

COMUNIDADES MICROBIANAS.
Viabilidad y cuantificacin mediante tcnicas de
tincin.
- El colorante fluorescente DAPI (4,6-diamido-2fenilindol) se usa con frecuencia para teir
microorganismos en hbitat opacos.
- Clulas teidas con DAPI presentan fluorescencia
azul brillante y son muy fciles de ver y contar.
- Tincin con DAPI es ampliamente usada para la
enumeracin de microorganismos en el ambiente, en
alimentos y en muestras clnicas.
- Para muestras acuticas las clulas pueden ser
teidas sobre la superficie de un filtro, despus que la
muestra lquida ha sido pasada a travs del mismo.

38

Clulas de Escherichia coli despus de haber sido teidas con DAPI

(4,6-diamido-2-fenilindol)

DAPI es un colorante fluorescente inespecfico que tie cidos nucleicos y no

suele reaccionar con la materia inerte. DAPI es una forma razonable de estimar
el nmero de clulas presentes en una muestra.
Ventaja: es una tcnica sencilla, no es especfica (tie todos los MOs de una
muestra.
Desventaja: No diferencia entre clulas vivas y muertas, ni permite el rastreo de
organismos especficos en el ambiente.

39

TINCIN DE VIABLES
- Hay mtodos de tincin fluorescentes que permiten
distinguir entre clulas vivas y muertas.
- Basadas sobre la integridad de la membrana
citoplasmtica (MC). A la muestra se aaden dos
colorantes (verde y rojo).
- El colorante verde penetra todas las clulas.
- El colorante rojo penetra en las clulas donde la MC no
est intacta (por ejemplo clulas muertas).
- Mtodo no adecuado para examinar microscpicamente
muestras naturales debido al teido inespecfico de los
materiales inertes. Se utiliza con cultivos bacterianos de
laboratorio (muestras clnicas, del ambiente y de
alimentos).

40

Tincin de clulas viables

Clulas vivas (verdes) y clulas muertas (rojas) de Micrococcus luteus

(cocos) y Bacillus cereus (bacilos) teidas por el mtodo de tincin
Live/Dead (vivas/muertas) Bac Light TM de viabilidad bacteriana. El
colorante verde penetra en todas las clulas, viables o no, mientras que el
rojo, penetra solo en aquellas clulas cuya membrana est daada (clulas
muertas). Este mtodo da una evaluacin instantnea de la viabilidad. Se
utiliza en cultivos bacterianos de laboratorio, pero no es adecuado para el
examen de muestras naturales debido a problemas de tincin inespecfica con
los materiales inertes

41

ANTICUERPOS FLUORESCENTES
- Explota la especificidad de anticuerpos contra los
constituyentes de superficie de un organismo particular.
- Se usa para la identificacin o seguimiento de organismos
en hbitat complejos con muchos microorganismos, tales
como suelos o muestras clnicas que contengan una mezcla
de muchos organismos.
- Requiere de la preparacin de anticuerpos especficos
contra el microorganismo de inters lo cual es largo y
laborioso.
- Anticuerpos relevantes clnicamente son disponibles
comercialmente.

42

Anticuerpos fluorescentes.

Mediante la tcnica de
anticuerpos fluorescentes
se observan microcolonias
bacterianas (las clulas
aparecen como puntos
verde-amarillentos) y la
arquea hipertermfila
Sulfolobus acidocaldarius
en la superficie de
partculas del suelo de una
solfatara. Las clulas
miden alrededor de 1m
de dimetro.

43

Mtodos de utilizacin de anticuerpos florescentes para

detectar antgenos de la superficie microbiana
(a) Preparacin de anticuerpo fluorescente
por acoplamiento del colorante
fluorescente, el isotiocianato de
fluorescena, con una molcula de
anticuerpo (Ac).

(b) Reacciones con anticuerpos

fluorescentes. Clulas de Clostridium
septicum con un Ac conjugado con
isotiocianato de fluorescena que da
fluorescencia amarilla verdosa y clulas
de Clostridium chauvei teidas con Ac
conjugado con rodamina B, que da
fluorescencia roja.

Parte superior del panel: Mtodo de

tincin directa
Parte inferior del panel: Mtodo de tincin
indirecta

44

Protena fluorescente verde para el etiquetado celular

Las clulas bacterianas pueden ser alteradas mediante tcnicas de
ingeniera gentica para volverlas fluorescentes. Se puede insertar en su
genoma el gen que codifica por la protena verde fluorescente (GFP,
green fluorescent protein). Al expresarse, las clulas que contienen la
GFP aparecen color verde cuando se observan con un microscopio de luz
ultravioleta. Las clulas etiquetadas con GFP se pueden introducir en un
medio, como las races de las plantas, y seguir con el microscopio la
clula etiquetada. Aunque ste mtodo no resulta til para medir
poblaciones naturales, las clulas etiquetadas con GFP se pueden
introducir en un medio, como las races de las plantas. Con ste mtodo,
los eclogos microbianos pueden estudiar in situ la competencia
microbiana entre la microbiota nativa y la cepa con GFP introducida, o
evaluar el efecto de la perturbacin en el ambiente. La GFP tambin se
puede utilizar como un gen indicador reporter fusionado a un opern
para estudiar la regulacin de la transcripcin de distintos promotores
por medicin de la fluorescencia.

45

Clulas modificadas por ingeniera gentica que expresan

la GFP (green fluorescent protein).
Clulas de Pseudomonas fluorescens
modificadas por ingeniera gentica con la
GFP observadas por microscopa lser
confocal. Las clulas estn adheridas a
races de cebada y presentan fluorescencia
de color verde. Las clulas teidas de azul
son parte de la biota normal de las races de
cebada y se han teido con el colorante
inespecfico DAPI.

El uso de GFP permite rastrear las

clulas introducidas en el ambiente.
Este mtodo no es un mtodo de tincin sino que es un mtodo de etiquetado molecular.

46

Limitaciones de la microscopa

La microscopa es una tcnica importante para la enumeracin e

identificacin de MOs en muestras naturales pero no es suficiente para el
estudio de los mismos.
Procariotas pequeos pasan inadvertidos si la muestra natural contiene
mucha materia orgnica o elevados nmeros de clulas grandes.
Es difcil diferenciar entre clulas vivas y muertas y la materia inerte.
Imposibilidad de evaluar la diversidad gentica de los MOs en un hbitat
natural.
Clulas muy similares morfolgicamente pueden ser genticamente muy
distintas y por lo tanto desempear funciones diferentes en un ecosistema.
Los estudios de microscopa en el rea de la ecologa microbiana deben
complementarse con mtodos de cultivo o moleculares, preferiblemente de
ambos si se quiere entender bien la ecologia de un ecosistema microbiano.

47

Morfologa y diversidad gentica

Dos fotos de un mismo campo de clulas. a)
microscopa de contraste de fases. b) tincin
filogentica. Aunque las clulas ovaladas grandes
tienen una morfologa y tamao poco corrientes en
procariotas (2,25 um de dimetro), y parecen similares
por microscopa de contraste de fases, la tincin
filogtica revela que son dos tipos distintos
genticamente.

48

TINCIONES GENTICAS
- La sonda de cido nucleico es un oligonucletido de DNA
o RNA complementario a un gen diana.
-Las sondas de cidos nucleicos son un instrumento
poderoso para identificar y cuantificar microorganismos en
la naturaleza.
-La tcnica de hibridizacin florescente in situ (FISH,
fluorescent in situ hybridization) usa sondas de DNA o
RNA fluorescentes para identificar organismos que
contienen una secuencia de cido nucleico que es
complementaria a la sonda.
- La tcnica de FISH es una herramienta muy comn en
ecologa microbiana y permite la identificacin rpida de
organismos patgenos especficos en la industria
alimenticia y en el diagnstico clnico.

49

Tincin filogentica con FISH

- Los colorantes filogenticos son oligonucletidos
fluorescentes complementarios en la secuencia de bases a las
secuencias signatura en el rRNA 16S (en procariotas) o
18S (en eucariotas).
-Los colorantes filogenticos penetran en la clula, donde
hibridan con el RNA ribosmico directamente en los
ribosomas.
-Se han identificado sondas filogenticas signatura para
especies microbianas individuales, as como para dominios
enteros de organismos.
-El grado de especificidad de un colorante filogentico puede
controlarse mediante la secuencia de la sonda fusionada al
colorante. FISH permite identificar o rastrear un organismo
particular , o un grupo de organismos relacionados,
dependiendo de la especificidad de la sonda.

50

Identificacin de microorganismos en ambientes naturales por mtodos de sonda

de cidos nucleicos
(a)

Microfotografas de clulas hibridizadas con

sondas complementarias a secuencias
especficas en el 16S rRNA de Bacteria
(izquierda) y de el 18S rRNA de Eukarya
(derecha)

(b)

Sondas de RNA ribosomal marcadas

fluorescentemente. Izquierda: microfotografa
de contraste de fases de B. megaterium y la
levadura Saccharomyces cerevisiae (no hay
probes presentes. Centro: el mismo campo,
clulas teidas con la probe de rRNA universal.
Derecha: el mismo campo, clulas teidas con
la sonda para eukarya (slo las clulas de S.
cereviciae reaccionan).

(c)

Diferenciacin de bacterias Gram-negativas

estrechamente relacionadas. Izquierda:
microfotografa de una mezcla de Proteus
vulgaris y de una bacteria relacionada aislada
de avispas. Centro: el mismo campo con una
sonda bacterial. Derecha: probe especfica para
las bacterias aisladas de avispa.

51

Estudio de muestras naturales mediante sondas

filogenticas multiples por FISH

a) Bacterias nitrificantes en muestra de aguas residuales. En rojo bacterias

oxidadoras de amonaco, en verde bacterias oxidadoras de nitritos. b) Micrografa
laser confocal de rastreo de una muestra de fango de aguas residuales. La muestra
fue tratada con tres sondas filogenticas distintas.

52

TINCIONES GENTICAS
Tcnicas de FISH:
a) Tincin de cromosomas:
- Comienza con el marcado fluorescente de una sonda de
oligonucletidos o del gen completo, de un conjunto de
genes, o incluso de un genoma completo digerido, para
obtener sondas pequeas.
- Las sondas se utilizan para averiguar qu organismo(s)
de una muestra contiene(n) el gen o los genes presentes en
la sonda(s).
- La tincin de cromosomas es til para identificar
bacterias que contienen genes especficos, como los que
codifican para la nitrogenasa, responsable de la fijacin
de N2, los componentes del centro de reaccin
fotosinttico, o vas autotrficas especficas.
- Los nmeros de clulas fluorescentes en cada caso darn
una estimacin de las bacterias fijadoras de N2, fottrofas
o auttrofas, respectivamente, en una muestra natural.
53

b) Transcripcin inversa in situ (in situ reverse

transcription, FISH-ISRT).
- Usada para determinar si un organismo est expresando
un gen o genes particulares en la naturaleza, a un tiempo
dado.
- Involucra el uso de una sonda que hibridiza con un mRNA.
- Permite a los cientficos explorar los factores que controlan
la expresin del gen en poblaciones naturales.

54

Tcnicas de fluorescencia que

emplean tincin de
cromosomas bacterianos y
transcripcin inversa in situ.

55

PCR: relacionando genes especficos con organismos

especficos.
Muchos estudios en ecologa no necesitan aislar los
organismos, ni siquiera identificarlos por microscopa con
tinciones especficas. A menudo el objetivo del estudio es
evaluar la biodiversidad de un hbitat sin emplear tcnicas de
cultivo, ni observar clulas. Con este objetivo se han aislado y
caracterizado genes especficos como medida de la
biodiversidad de la comunidad microbiana. Como los genes
especficos estn ligados frecuentemente a organismos
especficos, la deteccin del gen implica la presencia del
organismo. Las principales tcnicas en este tipo de anlisis de
comunidades microbianas son la reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR), la electroforesis en gel desnaturalizante en
gradiente (DGGE), la clonacin molecular y la secuenciacin y
el anlisis del DNA.

56

PCR. La reaccin en cadena de la polimerasa llamada

PCR puede multiplicar molculas de DNA hasta miles de
millones de veces proporcionando grandes cantidades de
genes para su clonacin, secuenciacin o mutagnesis. La
tcnica de PCR hace uso de la DNA polimerasa. Se
requiere que se conozca la secuencia nucleotdica de una
regin del gen deseado para poder disear oligonucletidos
iniciadores cortos o primers, complementarios de
secuencias presentes en el gen o genes de inters. Las
etapas de amplificacin son las siguientes: 1- En un
sintetizador de nucletidos se fabrican los dos
oligonucletidos iniciadores que flanquean al gen diana, y
se aaden en un gran exceso al gen diana desnaturalizado
por calor. 2- Cuando se ha enfriado la mezcla, el exceso de
iniciadores relativos al DNA diana asegura que la mayor
parte de las cadenas diana hibriden con iniciadores y no
entre s. 3- La DNA polimerasa alarga los iniciadores
usando las bandas diana como moldes. 4- Despus de un
perodo de incubacin adecuado, se calienta de nuevo la
mezcla para separar las cadenas. Luego se enfra la
mezcla para permitir que los iniciadores se hibriden con las
regiones complementarias del DNA recin sintetizado, y se
repite el proceso.

57

Anlisis de la comunidad microbiana.

Para el anlisis de comunidades microbianas un gen diana que se amplifica
frecuentemente es el que codifica el RNA ribosmico 16S (rRNA 16S). De
esta manera, el anlisis de la secuencia de genes de rRNA 16S amplificados
a partir de una comunidad microbiana puede ofrecer una imagen
filogentica de esa comunidad. Alternativamente tambin se pueden usar
como dianas los genes metablicos que codifican protenas particulares del
metabolismo de un organismo especfico (o de un grupo de organismos
relacionados). El imprescindible que el diseo de los cebadores tenga una
especificidad elevada. Si la fuente de DNA es una muestra natural , el
diseo de los cebadores es crtico para que los resultados no sean ambiguos
y difciles de interpretar. Se dispone de reactivos comerciales (kits) para
obtener el DNA puro, sin restos de sustancias que pueden interferir con la
PCR. El DNA obtenido es una mezcla del DNA genmico de todos los
microorganismos presentes originalmente en el hbitat. La tarea de la PCR
es capturar el o los genes diana que interesan en la mezcla y hacer las
copias suficientes para anlisis posteriores. El producto de la PCR es
corrido en un gel donde se obtienen bandas de los genes diana amplificados

58

Pasos en el anlisis de una comunidad microbiana mediante

sondas filogenticas.

(a) Se utiliza el DNA total de la comunidad

para amplificar los genes del rRNA 16S
utilizando cebadores (primers)
universales conservados para los
microorganismos del dominio Bacteria.
Las bandas producidas por la PCR se
cortan y los diferentes genes rRNA 16S se
separan o por clonacin o por DGGE
(electroforesis en gel desnaturalizante en
gradiente) y se secuencian. A partir de las
secuencias obtenidas se construye un
rbol filogentico.

59

Anlisis por PCR (reaccin en cadena de la polimerasa) y DGGE

(electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente) coordinados.
Por la divergencia evolutiva del gen diana
elegido en las diferentes especies, la banda
obtenida en el gel (a) puede estar compuesta
de varios genes diana, los cuales difieren en
la secuencia de nucletidos entre los lugares
de unin de los cebadores escogidos. Para el
anlisis filogentico de las secuencias de los
genes amplificados , se necesita un paso
extra para distinguir las diferentes formas
del gen antes de iniciar la secuenciacin. Un
mtodo es mediante la clonacin molecular y
la otra posibilidad es la electroforesis en gel
desnaturalizante en gradiente (b). La DGGE
es un mtodo de electroforesis que separa los
genes del mismo tamao que difieren en la
secuencia de bases. La tcnica utiliza un
gradiente de urea y formamida que
desnaturaliza el DNA. Un fragmento de
DNA bicatenario se desplaza por el gel y
cuando
llega
a
una
determinada
concentracin
desnaturalizante
las
cadenas de DNA se separan y el
desplazamiento se interrumpe.

60

Las bandas individuales obtenidas por DGGE se pueden cortar y secuenciar.

Usando como gen diana el rRNA 16S, el anlisis por DGGE proporciona una
visin detallada del nmero de filotipos (genes rRNA 16S distintivos) presentes
en el hbitat. Secuenciando estas bandas , es posible determinar las especies
presentes en la comunidad por comparacin con las secuencias de las especies
conocidas disponibles a partir de bases de datos apropiadas. Con otros genes
(por ejemplo, genes metablicos) se obtiene informacin acerca del nmero de
tipos diferentes de organismos presentes en la comunidad que contiene el gen
especfico. El anlisis por DGGE revela la biocomplejidad de un hbitat con
respecto a un gen especifico.
El anlisis filogentico por PCR de las comunidades microbianas ha dado
resultados sorprendentes. Con el rRNA 16S como diana, se ha comprobado que
la mayora de las comunidades microbianas contienen varios organismos
filogenticamente distintos, cuyas secuencias de RNA ribosmico no se
emparejan con ninguno de los cultivos de laboratorio. Hay que sealar que en
muchos casos los miembros ms abundantes de las comunidades microbianas
son especies que hasta ahora no han podido ser cultivadas en el laboratorio. Este
problema indica que nuestro conocimiento de la diversidad microbiana a partir
de los cultivos de enriquecimiento es todava muy incompleto y que el
enriquecimiento presenta sesgos, lo cual supone un serio problema para los
estudios de biodiversidad.

61

Medicin de la actividad microbiana en la naturaleza

La actividad microbiana in situ se puede medir mediante la
utilizacin de:
(1) Radioistopos
(2) Microelectrodos
(3) Istopos estables
Los anlisis usando radioistopos son:
-

Muy sensibles y muy especficos para medir procesos qumicos

Usan tiempos cortos de incubacin

Las mediciones obtenidas son mas representativas de las

muestras como existen en la naturaleza

Hay que hacer control con clulas muertas para verificar que
ocurre un proceso bioqumico y no una transformacin qumica

62

Medida de la actividad microbiana en la naturaleza

a) Anlisis qumico para
lactato y H2S
durante la reduccin
de sulfato.
b) Uso de radioistopos:
fotosntesis medida
en un ambiente
natural de agua de
mar con 14CO2
c) Reduccin de sulfato
en un lodo medido
con 35SO42d) Produccin de 14CO2
de 14C-glucosa.

63

Esquema de un microelectrodo de oxgeno

MICROELECTRODOS
- Electrodos de vidrio muy finos que miden
pH, oxgeno, N2O, CO2, H2 o H2S.
- Usado para el estudio de transformaciones
qumicas y fotosntesis en tapetes microbianos.
- Los tapetes microbianos son comunidades
microbianas estratificadas conteniendo
usualmente cianobacteria en las capas
superiores, bacterias fototrficas anoxignicas
en las capas subsiguientes y bacterias
quemoorganotrofas en las capas inferiores.
- Los tapetes microbianos son encontrados a
menudo en las zonas intermareales y junto a
fuentes termales.

64

Tapetes microbianos y el
uso de microelectrodos
para su estudio.
b) microperfiles de pH,
sulfhdrico y oxgeno en
un tapete microbiano de
una fuente termal.

65

ISTOPOS ESTABLES
Muchos elementos qumicos tienen diferentes istopos, que
difieren en el nmero de neutrones. Algunos son inestables y se
degradan liberando radioactividad y otros son estables.
- Los istopos estables no son radioactivos y se utilizan para el
estudio de diversas transformaciones microbianas en la
naturaleza.
- Los elementos mas comnmente usados para estudios con
istopos estables en la ecologa microbiana son el carbono y el
azufre.
- En la naturaleza, el carbono se encuentra principalmente
como 12C, y en pequea cantidad (alrededor del 5%) como 13C.
Lo mismo sucede con el azufre, cuya forma principal es el 32S,
pero que tambin se encuentra en menor cantidad como 34S.
- Las reacciones bioqumicas tienden a favorecer el istopo ms
liviano, los mas pesados son discriminados negativamente.

66

ISTOPOS ESTABLES
-Fraccionamiento isotpico: las molcula producidas
bioqumicamente son mas livianas que los compuestos
producidos geoqumicamente.
- Cuando el CO2 es atrapado por un organismo fototrfico, el
carbono celular se enriquece en 12C y se empobrece en 13C.
-El sulfuro producido por la reduccin bacteriana del sulfato
es mas ligero que el de origen geoqumico.
-Este fenmeno se conoce como fraccionamiento isotpico.
-El fraccionamiento es el resultado de la actividad de algunas
enzimas que discriminan la forma ms pesada de un
elemento cuando se unen a sus sustratos.

67

Medicin de la actividad microbiana por el uso de istopos estables

Los istopos estables pesados 13C, 18O, 34S tienen un nmero distinto de neutrones
que la forma isotpica principal.
Los geoqumicos y los microbilogos forman equipos para el estudio de las
transferencias biogeoqumicas usando istopos estables.
La mayora de los procesos bioqumicos favorecen el istopo mas liviano
discriminando el ms pesado. Esto es particularmente cierto para las enzimas que
fijan CO2 o que metabolizan SO4=.
Los organismos fototrficos utilizan el CO2 de
composicin isotpica conocida como alimento y
las enzimas fijadoras de CO2 lo hacen
preferentemente con el istopo mas ligero (12C).
De esta manera , el carbono fijado como carbono
celular aumenta la cantidad de 12C y disminuye la
de 13C en relacin con el sustrato inicial. El grado
de disminucin de 13C se acumula como un
fraccionamiento isotpico. El tamao de las
flechas indican la abundancia relativa de cada
istopo del carbono.

68

Fraccionamiento isotpico en ecologa microbiana

La composicin isotpica de una muestra contiene un registro de su actividad
biolgica pasada. El anlisis isotpico del carbono permite distinguir entre la
materia orgnica biognica de la abiognica. Se pueden hacer registros evolutivos
a) Composicin isotpica de carbono de varias
sustancias. Los valores estn dados en partes
por mil y fueron calculados usando la frmula
(13C/12C muestra)-(13C/12C estndar) x 1000
13C/12C estndar
El estndar del C es el belemnite de la
formacin rocosa PeeDee. Ntese que el C
fijado por los organismos autotrficos est
enriquecido en 12C.
b) Resumen de la geoqumica isotpica del
azufre con indicacin del margen de valores
para 34S y 32S en varias sustancias que
contienen azufre. Los valores se dan en partes
por mil y se calculan mediante la frmula
(34S/32S muestra)-(34S/32S estndar) x 1000
34S/32S estndar
El estndar del S es el SFe procedente del
meteorito Canyon Diablo. El sulfuro y azufre
de origen biognico tienden a tener menos 34S.

69

EL USO DEL FRACCIONAMIENTO ISOTPICO EN

ECOLOGA MICROBIANA.
- La composicin isotpica de una muestra contiene un
record de su actividad biolgica pasada.
-El anlisis del istopo de carbono en las rocas tiene prevista
la existencia de vida sobre la tierra 3.500 millones de aos
atrs.
-El anlisis del oxgeno (18O/16O) de rocas se usa para
determinar la transicin de la Tierra de un ambiente
anxico a un ambiente xico (fotosntes oxignica de las
cianobacterias).
-El anlisis del istopo de azufre tambin ha sido usado
como evidencia de la carencia de vida sobre la luna.
-La composicin isotpica de un organismo animal superior
tiende a aproximarse a la composicin isotpica de su
principal alimento. Esto permite rastrear el flujo de C a
travs de un ecosistema.

70

FIN

71

ECOSISTEMAS MICROBIANOS

72

HBITAT MICROBIANOS TERRESTRES Y DE AGUA DULCE

Los suelos y las aguas varan en su estructura fsica, composicin de
nutrientes, temperatura y potencial de agua. Todos estos factores se
combinan para influir en los tipos y nmero de microorganismos
presentes en cada caso.

Ambientes terrestres
material original
Interaccin

(roca, arena, sedimentos)

compleja

topologa del terreno

formacin del suelo

clima
seres vivos
La interaccin involucra procesos fsicos, qumicos y biolgicos.

73

Formacin del suelo. Los suelos pueden clasificarse en dos grandes grupos: suelos
minerales y suelos orgnicos segn procedan inicialmente de la fragmentacin de rocas
y otros materiales inorgnicos , o de la sedimentacin de turberas y marismas.
roca expuesta a la intemperie
humedad

algas

Se desarrollan
MOs fototrficos

lquenes musgo

Producen materia
orgnica que permite el
crecimiento de
bacterias
quimioorganotrficas y
hongos

El nmero de bacterias quimioorganotrficas aumenta en forma proporcional a la

extensin de la cubierta vegetal de la roca. El CO2 que producen los organotrofos
durante la respiracin se convierte en cido carbnico, que es un agente importante en
la disolucin de rocas, especialmente en las que son calizas. Muchos
quimioorganotrofos secretan adems cidos orgnicos que disuelven la roca en
partculas de menor tamao.
Heladas y deshielos

grietas en las rocas

formacin del suelo primitivo

74

Hendidura de roca formacin de suelo primitivo desarrollo de plantas superiores

Las races de las plantas van penetrando por las hendiduras y aumentan la
fragmentacin de la roca y sus excreciones causan el desarrollo de una rizosfera.
Planta muere

suelo

nutriente para un desarrollo microbiano mas extenso

Los minerales se solubilizan an ms y el agua al filtrarse arrastra los mismos hacia

capas mas profundas. A medida que avanza el proceso de meteorizacin del suelo,
ste se hace mas profundo y permite el desarrollo de plantas y rboles de mayor
tamao. Los animales se estabilizan y desempean un papel importante en el
mantenimiento de la aireacin y mezcla de las capas superiores del suelo.
Finalmente, el movimiento de materiales hacia el interior origina la formacin de
distintas capas y aparece un perfil de suelo tpico, cuya velocidad de formacin
depende del clima, de otros factores. Es un proceso lento que puede llevar cientos
de aos.
Horizonte O : capa de materia vegetal sin descomponer
Horizonte A: suelo superficial (rico en materia orgnica), alta actividad microbiana.
Horizonte B: subsuelo (se acumulan minerales, humus, etc), pobre en materia
orgnica, actividad microbiolgica pobre.
Horizonte C: suelo base, actividad microbiana muy baja.

Roca slida

75

Ambiente terrestre: formacin del suelo

Agregado de suelo

Microscopa electrnica de barrido

Microorganismos sobre una partcula de suelo

76

EL SUELO COMO HBITAT MICROBIANO

-El crecimiento mas importante se da en la rizosfera (suelo que rodea las races).
-Un pequeo agregado de suelo contiene microambientes muy diferentes y diferentes
tipos de MOs.
Partcula de suelo

tincin fluorescente
naranja de acridina

observacin de distintos MOs

microscopio

tincin con anticuerpos

fluorescentes

MOs especficos
microscopio

de fluorescencia
microscopio electrnico de barrido

MOs sobre superficies opacas (suelos)

(morfologa, recuento de viables)

-La actividad microbiana depende de la disponibilidad del agua, que es variable y

depende de: (a) la composicin del suelo, (b) la lluvia, (c) el drenaje, (d) la cubierta
vegetal.
- El agua permanece en el suelo : (a) adsorvida sobre superficies, (b) libre formando
lminas o pelculas entre las partculas del suelo.

77

Solucin del suelo: es el agua del suelo con diversos materiales disueltos
En terrenos bien drenados el aire penetra con facilidad y la concentracin
de O2 es alta. En suelos encharcados, el O2 disponible es el disuelto en el
agua y es pronto consumido por los MOs. Este tipo de suelo se vuelve
pronto anxico, por lo que experimenta profundos cambios en sus
actividades biolgicas.
El estado nutricional ( los recursos) es otro factor importante que afecta
a la actividad microbiana, la mayor parte de la cual se lleva a cabo en las
capas superiores ricas en materia orgnica (rizosfera).
El nmero de MOs del suelo y su actividad dependen del equilibrio
entre los nutrientes presentes (orgnicos e inorgnicos).
La disponibilidad de agua es lo que ms influye en la actividad
microbiolgica que tiene lugar en la superficie del suelo, mientras que en
el interior del suelo la disponibilidad de nutrientes es el factor principal.

78

79

MICROBIOLOGA DE LA SUBSUPERFICIE PROFUNDA

metangenos

Suelos profundos

MOs anaerobicos estricto

homoacetgenos

MOs aerobios facultativos

bacterias SO4= reductoras

MOs anaerobios facultativos

En muestras tomadas a 300 m se han aislado una gran variedad de microorganismos.

Tienen actividades metablicas bajas, inferiores a las que tienen en sus hbitat naturales
Comparado con los MOs de las capas superiores del suelo, la importancia
biogeoqumica de los MOs de ambientes profundos puede ser mnima. No obstante
pueden causar la mineralizacin de compuestos orgnicos y liberar productos a las
aguas subterrneas.
El potencial que representan estas bacterias para la Biorremediacin in situ de las
sustancias txicas que alcanzan las aguas subterrneas por lixiviacin (por ej. bencenos
y productos qumicos utilizados en agricultura) tiene un gran inters en la actualidad.

80

Vida microbiana en las profundidades de la Tierra

Los microbilogos han hallado procariotas viables a varios metros de profundidad bajo la superficie
En algunas formaciones de basalto de hasta 1500 m de profundidad se han encontrado una gran
cantidad de bacterias anaerbicas quemolitotrficas que son sulfato reductores, metangenos y
homoacetgenos. Estos anaerobios estrictos comparten una gran apetencia por el H2. El anlisis del
istopo estable del carbono del CH4 presente en las rocas y aguas circundantes indica una gran
abundancia del istopo ms ligero (12C), lo que es tpico de la metanognesis biolgica
demostrando que estos organismos son metablicamente activos. El H2 del basalto parece originarse
de la interaccin , estrictamente qumica, del agua con los minerales de hierro de las rocas y es el
que permitira el crecimiento de las poblaciones de procariotas anaerbicos encontrados en las
profundidades. Estos quimiolittrofos subterrneos son independientes de la produccin primaria
fotosinttica la cual genera O2 y/o materia orgnica sugiriendo que pueden ser agentes
biogeoqumicos importantes en estos ambientes.

81

Ambientes de agua dulce

Lagos

Distintos hbitat acuticos. Difieren en sus propiedades

Estanques

fisicoqumicas y consecuentemente en la composicin

Ros

de las especies microbianas que viven en ellos, que

Manantiales

predominantemente son los organismos fototrficos.

Zona xica

Cianobacterias
algas

que flotan (fitoplancton)

que se adhieren al fondo o a los lados (bnticas)

Zona anxica

bacterias fototrficas anoxignicas

E
Luz

materia orgnica
organismo fototrfico

productor primario

82

Los organismos fottrofos oxignicos producen nuevo material orgnico

y O2. Cuando la actividad quimioorganotrfica es muy elevada, la
materia orgnica lleva al agotamiento de O2 y a condiciones anxicas.
-La actividad biolgica de un ecosistema acutico depende de la tasa de
produccin primaria que llevan a cabo los organismos fototrficos.
-Los recursos y las condiciones ambientales afectan la actividad de los
productores primarios. Hay mayores tasas en los ros y manantiales.
-En los mares abiertos hay baja concentracin de nutrientes para el
fitoplancton y por lo tanto baja productividad.
-Las zonas mas frtiles son las cercanas a la costa por los aportes de
nutrientes de los ros y de las aguas continentales contaminadas.
-Las zonas costeras tienen alta produccin primaria y son los mejores
lugares para el crecimiento y recoleccin de pescados y mariscos.

83

Relaciones con el oxgeno en lagos y ros

-Concentracin de O2 en el aire 21%, su solubilidad en el agua es
limitada
-El intercambio entre el O2 disuelto y el O2 atmosfrico en las grandes
masas de agua es lento.
-La produccin fotosinttica significativa de O2 en mares y lagos se lleva
a cabo slo en las capas superficiales, donde hay luz disponible.
-La materia orgnica que no se consume en estos estratos superiores va a
parar al fondo, donde se descompone por la accin de MOs facultativos,
que utilizan el O2 disuelto en el agua.
-En los lagos, cuando se ha consumido el O2 disuelto, las capas mas
profundas se vuelven anxicas donde slo pueden crecer bacterias
anaerbicas y organismos microaeroflicos. Se produce un cambio del
metabolismo respiratorio al fermentativo y al metanognico.
Metanognesis 4H2 +CO2

CH4 + 2H2O
84

Mar

capas mas

Lago superficiales

O2

consumida

luz organismos materia

quimioorganotrofos

biosintticos orgnica
no consumida
excedente al fondo
organismos facultativos
que utilizan el O2 disuelto
En lagos
Cambio del metabolismo

capas mas profundas anxicas

del respiratorio al fermentativo

bacterias anaerbicas y organismos

y al metanognico

microaeroflicos
no plantas superiores ni animales

85

Que una masa de agua quede o no desprovista de O2 depende de muchos

factores.
Hay O2 en la masa de agua:
(a) si la materia orgnica es escasa (lagos poco productivos o mar abierto)
(b) si no hay suficiente materia orgnica disponible para que los organismo
quimioorganotrficos consuman todo el O2,
(c) si la velocidad de intercambio del agua entre las capas profundas y la superficie es
alta (corrientes, turbulencias, etc) que mezclan bien y el O2 puede alcanzar las capas
profundas.
En muchos lagos de climas templados la masa de agua permanece estratificada
durante el verano con capas superficiales menos densas y mayores temperaturas
llamadas epilimnion y separadas de capas inferiores mas pesadas y fras llamadas
hipolimnion. Cuando se produce la estratificacin, normalmente a principios del
verano, las capas inferiores se vuelven anxicas. Al final del otoo o al principio del
invierno, las capas superiores se enfran y se vuelven mas densas que las capas
inferiores, producindose un intercambio que causa la aireacin del fondo. Por ello
la mayora de los lagos de zonas templadas muestran un ciclo anual en el que las
capas inferiores pasan de xicas a anxicas y de nuevo a xicas. Estos cambios y
especialmente tambin la temperatura afectan la actividad microbiana.

86

Interrrelaciones del oxgeno en lagos y ros

O2

temperatura
Epilimnion
Termoclina
Hipolimnion
SH2

Desarrollo de condiciones anxicas en las profundidades de un lago de clima

templado, como resultado de la estratificacin estival. Las aguas mas fras del
fondo son mas densas y contienen SH2 procedente de la reduccin del sulfato. La
zona que presenta un cambio brusco de la temperatura se denomina termoclina. A
medida que las aguas superficiales se enfran en otoo y en invierno, la densidad
de las mismas aumenta y, al hundirse, desplazan a las del fondo, dando lugar a la
mezcla del lago.

87

Ros
El O2 es un factor importante, especialmente en los ros que reciben mucha materia
orgnica procedente de aguas residuales y de contaminacin industrial. Si hay mucha
materia orgnica, se produce un dficit de O2 debido a la respiracin bacteriana. A
medida que el agua se aleja del lugar donde se produce la descarga de residuos, la
materia orgnica es consumida gradualmente y la concentracin de O2 se acerca a la
normalidad. En condiciones de anoxia, aunque sean temporales, los animales se
mueren y adems empiezan a crecer bacterias anaerbicas que producen compuestos
con olor fuerte (SH2, mercaptanos, ac. grasos)
Efecto de la incorporacin de aguas residuales o de materia orgnica a los ros
O2

bacterias, C orgnico y DBO (demanda biolgica de O2)

algas y cianobacterias
O2

Aporte de aguas

NO3-

NH4+ y PO43-

residuales Distancia corriente abajo

88

Demanda biolgica de O2 (DBO)

Es la capacidad de consumir O2 que tienen los MOs en una masa de agua determinada.

Muestra de agua se airea bien

se coloca en
botella precintada

incubacin 5 das
a 20oC

se mide el O2
residual

La DBO es una medida indirecta de la cantidad de materia orgnica del agua que puede
ser oxidada por los MOs. Cuando un ro se recupera de la contaminacin producida por
compuestos orgnicos, hay una disminucin de la DBO que se acompaa con un
aumento de la concentracin de O2 disuelta en el agua.
En una masa de agua, los ciclos de C y O se encuentran interrelacionados y la
concentracin de cada uno de los elementos suele ser inversamente proporcional a la
del otro. Esto se hace especialmente evidente en los ambientes anxicos, donde hay
abundancia de C.

89

Microbiologa de las profundidades marinas

-Los ocanos ocupan partes de la superficie terrestre de all la importancia de la
microbiologa marina.
-Las zonas alejadas a las costas son pobres en nutrientes y la actividad microbiana no es
intensa.
-Los MOs marinos son interesantes porque: crecen a concentraciones de nutrientes

Mar

300 m

Animales y

luz solar

MOs quimio-

intensa actividad biolgica

crecen a

temperaturas

crecen a

presiones

zona ftica

organotrficos
1000 m
mas abajo zona biolgicamente inactiva
profundidades marinas 75% del volumen del agua de mar
La presin atmosfrica 1 atm cada 10m de profundidad. A 5000 m tenemos 500 atm.

90

Distribucin de Archaea/Bacteria en mar abierto

El nmero de procariotas en mar abierto
disminuye con la profundidad. En la superficie
el promedio es de 105-106 clulas/ml. Por debajo
de los 1000 metros el nmero desciende a 103105 clulas/ml. Las tinciones filogenticas han
revelado que en general las especies de Bacteria
predominan en las aguas superiores (<1000
metros), mientras que los nmeros son iguales o
muestran un ligero predominio de Archeae en
las aguas profundas. Extrapolando los datos de
la figura se ha estimado que en el conjunto de
los ocanos de todo el mundo existen 1,3 x 1028
y 3,1 x 1028 clulas de Archeae y Bacteria,
respectivamente. Esto indica que los ocanos
contienen la mayor cantidad de biomasa
microbiana que existe en toda la superficie de la
Tierra.

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Bacterias barotolerantes y baroflicas

Bacterias barotolerantes son aquellas que toleran altas presiones.
Bacterias baroflicas son aquellas que necesitan altas presiones para crecer.
La distribucin de ambos tipos de bacterias dependen bsicamente de la profundidad.
Las bacterias barotolerantes no crecen a presiones superiores a las 500 atm (pero
pueden crecer tambin a 1 atm).
Los organismos aislados a mas de 500 atm son baroflicos, con un crecimiento ptimo a
400 atm. A ms de 10.000 m de profundidad se obtienen los barfilos extremos o
estrictos (necesitan mas de 400 atm para crecer). En general la temperatura ptima es de
aproximadamente 2oC. Por enzima de 10 oC disminuye su viabilidad.
La presin puede afectar la expresin de genes en las bacterias baroflicas. Las
protenas de la pared celular y las estructuras relacionadas con la pared celular, as
como los transportadores parecen ser los componentes con mayor variabilidad. La
presin acta de manera selectiva para regular la transcripcin de genes especficos que
codifican las protenas necesarias para el crecimiento a alta presin.

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Crecimiento de bacterias barotolerantes, baroflicas y baroflicas extremas

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FIN

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