Está en la página 1de 35

Tinción de Gram

Bacterias gram positivas deBacillus anthracis (bacilos morados) que producen una enfermedad
llamada Carbunco, encontrados en una muestra de líquido cerebroespinal. Si hubiera una especie
de bacteria gram negativa, aparecería de color rosa. El resto son los leucocitos que atacan la
infección.

Una tinción gram en la que se observa un mezclado deStaphylococcus aureus (coco gram positivo)
y Escherichia coli (bacilo gram negativo).

La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencialempleado
en bacteriología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe
su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram(1853-1938), que desarrolló la técnica en
1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana, como para
poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana,
considerándose bacterias gram positivas a las que se visualizan de color morado,
y bacterias gram negativas a las que se visualizan de color rosa, rojo o grosella.
Índice
[ocultar]

1Metodología
o

1.1Explicación

2Teorías

3Pasos para realizar la tinción

4Bacterias resistentes a la tinción gram

5Utilidades

6Fundamentos de diferenciación de gram positivo y gram negativo

7Factores que alteran la tinción de Gram

8Bibliografía

Metodología[editar]

Recoger muestras.

Hacer el extendido con un palillo de madera.

Dejar secar a temperatura ambiente o fijarlas utilizando un mechero.

Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado tres veces
aproximadamente).

Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar un minuto.

Enjuagar con agua no directamente sobre la muestra

Agregar lugol y esperar un minuto aproximadamente.

Agregar alcohol acetona y esperar entre 5 y 30 segundos según la concentración
del reactivo (parte crítica de la coloración). (las gram - se decoloran, las gram + no)

Enjuagar con agua.

Tinción de contraste agregando safranina o fucsina básica y esperar un minuto.
Este tinte dejará de color rosado-rojizo las bacterias gram negativas.

luego lavar levemente con agua

Para observar al microscopio óptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de
inmersión.
Explicación[editar]
El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto gram
positivas como gram negativas) a través de la pared bacteriana. El lugol es un compuesto
formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio) y Sl (Siulterio), los cuales
están presente para solubilizar el yodo, y actúan de mordiente, haciendo que el cristal
violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la célula bacteriana. El I 2 entra en las
células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta..
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que en
la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos gram positivos no se
decoloran, mientras que los gram negativos sí lo hacen.
Para poner de manifiesto las células gram negativas se utiliza una coloración de contraste.
Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Después de la

coloración de contraste las células gram negativas son rojas, mientras que las gram
positivas permanecen violetas.
La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve para hacer una
tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias gram negativas. Al término del
protocolo, las gram positivas se verán azul-violáceas y las gram negativas, se verán rosas
(si no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó, por ejemplo, safranina).
Esta importante coloración diferencial fue descubierta por Hans Christian Gram en 1884.
En este método de tinción, la extensión bacteriana se cubre con solución de uno de los
colorantes de violeta de metilo, que se deja actuar durante un lapso determinado. Se
escurre luego el exceso de violeta de metilo y se añade luego una solución de yodo, que
se deja durante el mismo tiempo que la anterior; después se lava el portaobjetos con
alcohol hasta que éste no arrastre más colorante. Sigue a tal tratamiento una coloración de
contraste, como safranina, fucsina fenicada diluida, pardo Bismarck, pironin B o hasta
inclusive verde de malaquita.
Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, aún después de tratarlos con un
decolorante, y el color no se modifica al añadir éste; otros pierden con facilidad el primer
tinte, y toman el segundo. Los que fijan el violeta, se califican de grampositivos, y los que
pierden la primera coloración y retienen la segunda, de gramnegativos. Basándonos pues,
en la reacción gram, podemos clasificar a los microorganismos en uno de los dos grupos.
Los colorantes de p-rosanilina son los que mejores resultados dan en la coloración gram.
Los representantes más usados de este grupo son violeta de metilo y violeta cristal o de
genciana. En realidad, violeta de metilo es el nombre atribuido al compuesto tetrametil-prosanilina.
El matiz de color de la p-rosanilina se intensifica al aumentar el número de grupos metilo
en la molécula; por consiguiente, de los tres grupos, el tono más oscuro es la hexametil-prosanilina (violeta cristal), y el tinte más ligero, la tetrametil-p-rosanilina (violeta de metilo).
Los nombres violeta de metilo 3R, 2R, R, B, 2B, 3B, etc., se refieren al número de grupos
metilo contenidos. La letra R indica matices rojos, y la letra B, tonos azules. El violeta de
cristal contiene seis grupos metilo, y se considera como el mejor colorante primario para
teñir por el método de Gram.
La facultad de las células para tomar la coloración gram no es propia de toda sustancia
viviente, sino que se limita casi en absoluto a hongos y bacterias. Así vemos que las
células de plantas y animales superiores no conservan la primera coloración; los mohos se
tiñen con cierta irregularidad; los gránulos de micelios propenden retener el colorante. La
reacción de Gram no es infalible ni constante; puede variar con el tiempo del cultivo y el pH
del medio, y quizá por otras causas.

Teorías[editar]

sino que constituye más bien una gama o escala que comprende dos o tres unidades de pH.  En la zona isoeléctrica característica de cada especie es muy escasa la tendencia a retener cualquier colorante. en soluciones ácidas. La combinación con ambos tipos de colorante no se produce en el «punto isoeléctrico». . donde forma con el yodo una laca insoluble en agua. tienen la facultad de reaccionar con ácidos y con bases. comprobaron que la reacción de tinción de las bacterias obedece en gran parte a su contenido proteínico.  Los microorganismos gramnegativos pueden hacerse grampositivos al aumentar la alcalinidad. deshidrata las paredes de los microorganismos gram positivos. Según Stern y Stearn. al combinarse con colorantes ácidos en soluciones ácidas y con los básicos en medio alcalino. En las células gram negativas. Como los microorganismos contienen más de una proteína. los lípidos de la pared (más abundantes que en las células grampositivas) se disuelven por este tratamiento. pero es indudable la importancia general de la pared celular. ese punto no tiene un valor preciso y definido. De igual manera. Varias son las teorías emitidas para explicar el mecanismo de la tinción de Gram. El mismo microorganismo. Algunos autores objetan esta teoría. Las proteínas y aminoácidos son cuerpos anfóteros. se vuelve gram negativo. y en soluciones alcalinas lo hacen con las bases. a base de sus datos experimentales. reaccionan con los ácidos. gracias a sus grupos amino y carboxilo. Una posible teoría del mecanismo de tinción es la siguiente: El colorante básico entra al microorganismo. tratados con mordiente. los microorganismos grampositivos tienen una escala isoeléctrica de pH inferior a la de los microorganismos gramnegativos. y.  Los microorganismos de reacción positiva a los colorantes básicos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la acidez. lo que permite el escape del complejo de cristal violeta con yodo. deducen las siguientes conclusiones:  Los microorganismos grampositivos pueden hacerse gramnegativos al aumentar la acidez. si sufre daño de la pared por una u otra causa.  Los microorganismos de reacción positiva a los colorantes ácidos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la alcalinidad.Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana. esto es. Stearn (1923) basó la suya en una combinación química entre el colorante y las proteínas de las bacterias. Esto indica la importancia de la pared para la retención o el escape del colorante. El alcohol o la acetonaempleados para aclarar. estos microorganismos se conducen como cuerpos anfóteros. y forma una barrera que la laca no puede atravesar.

 La materia grasa extraída de los microorganismos grampositivos difiere de la obtenida de los microorganismos gramnegativos. sería prácticamente impermeable al violeta cristal. parecen sustentar la opinión de que la reacción grampositiva consiste esencialmente en la formación. La pared celular de los microorganismos grampositivos y gramnegativos es permeable al violeta cristal. . han comunicado que si la reacción grampositiva depende de que se forme una combinación compleja entre los componentes de la coloración de Gram y las proteínas de la pared celular. Los resultados experimentales obtenidos con una difusión celular exenta de proteínas. de los microorganismos débilmente grampositivos cultivados en los medios que contengan sustancias capaces de fermentar. para invertir la reacción. Por el contrario. La pared celular de los microorganismos grampositivos. y cuya reacción se vuelve ácida en el curso del desarrollo. Todos los mordientes (como el yodo) empleados en la coloración gram son oxidantes. ya que ese tratamiento no podría cambiar el carácter químico de los materiales de dicha pared. la de los primeros no lo es al complejo de yodo y colorante formado en el interior de la célula. los gérmenes grampositivos desintegrados pierden su capacidad de retener el colorante primario y toman negativamente el gram. a diferencia de la de los gramnegativos. y el disolvente eliminará sin dificultad el complejo formado después del tratamiento con yodo. sería de esperar que las bacterias desintegradas por medios físicos retuviesen este tinte. Sin embargo. dentro de la célula. Otra explicación de la reacción de Gram puede ser la posible existencia de una capa exterior alrededor de un núcleo gramnegativo.  El cambio de respuesta a la coloración de Gram con el tiempo es propio. sobre todo. su efecto. Libenson y Mcllroy. Luego se desarrollaba la sustancia grampositiva debajo de la pared celular. por ser absorbido el colorante en la superficie externa de la pared celular. Esto aumenta la afinidad de un microorganismo por los colorantes básicos. en general. Parece estar bien demostrado que las proteínas de las bacterias no son simples. Los microorganismos aparecerán teñidos después de tratarlos con violeta cristal. de una cantidad apreciable de complejo de yodo y colorante difícil de eliminar con el disolvente. sino más bien una débil combinación de sustancias proteínicas con otras lipoideas o grasas. Gianni (1952) comprobó que los microorganismos grampositivos Bacillus subtilis y Bacillus anthracis tomaban negativamente el gram cuando los cultivos databan de dos a tres horas. consiste en dar a la sustancia oxidada un carácter más ácido. en que la primera contiene una proporción mucho mayor de ácidos no saturados que muestren gran afinidad por los agentes oxidantes. y la escasa solubilidad del complejo de yodo y violeta cristal en alcohol y acetona.

Pasos para realizar la tinción[editar] Los pasos que se han de seguir para realizar la tinción son los siguientes: 1) Se fija la muestra mediante calor. 3) Se fija con Lugol.Ni los grupos sulfhidrilo ni las proteínas básicas han influido específicamente en el mecanismo del colorante de Gram.  Formas L (pérdida ocasional de la pared). Utilidades[editar] En el análisis de muestras clínicas suele ser un estudio fundamental por cumplir varias funciones:  Identificación preliminar de la bacteria causal de una infección. y las gram negativas de color rosa.  Protoplastos y esferoplastos (eliminación total y parcial de la pared. Los tiempos para aplicar cada colorante son orientativos. Libenson y Mcllroy han sostenido que la permeabilidad de la pared celular al violeta cristal. Si se observan mayor número de . 5) Safranina (colorante de contraste. y el libre acceso del disolvente al complejo constituido. En la tinción. gram positivas y gram negativas) durante 1 minuto. respectivamente). 4) Se decolora con una mezcla de alcohol y cetona (los gram negativos se decoloran). las gram positivas se observarán de color azul-violeta. la escasa solubilidad del complejo de yodo y colorante en alcohol y acetona. Los morfotipos bacterianos identificados en la tinción de Gram se deben de corresponder con aislamientos bacterianos realizados en los cultivos. 2) Cristal Violeta (tiñe todas las bacterias.  Mycoplasmas (no tienen pared). 1 minuto. son los principales factores que intervienen en el mecanismo de esa coloración. que tiñe a los gram negativos).  Utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano. 1 minuto. Bacterias resistentes a la tinción gram[editar] Las siguientes bacterias de naturaleza grampositiva se tiñen como gramnegativas:  Mycobacterias (están encapsuladas).

Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoproteínas. Si por el contrario. y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración. como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. las gram positivas. Pueden aparecer aislados después de la división celular (micrococos). Los bacilos poseen forma alargada. o agruparse de manera irregular (estafilococos). La clave es el peptidoglicano. el ácido teicoico que está anclado solamente en el peptidoglicano (también conocido como mureína). La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente. Pero por el contrario. y por lo tanto este complejo se escapa. no son susceptibles a la acción del solvente orgánico. fosfolípidoy lipopolisacárido. cerrándolos. poseen forma de «coma» (o curvados) entonces se los designa vibrios. ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas diferencias constitutivas de su pared. ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana. aparecer por pares (diplococos). formar cadenas (estreptococos). También pueden distinguirse los espirales. La membrana exterior está hecha de proteína. Por el contrario. A partir de la tinción de Gram pueden distinguirse varios morfotipos distintos: Los cocos son de forma esférica. y más en la superficie. sino que este actúa deshidratando los poros. y las gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las gram negativas. lo que impide . la capa de peptidoglucano de las gram negativas es delgada.formas bacterianas que las aisladas hay que reconsiderar los medios de cultivos empleados así como la atmósfera de incubación. perdiéndose la coloración azulviolácea. que se clasifican en espirilos (si son de forma rígida) o espiroquetas (si son blandas y onduladas). Por lo tanto. al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos. se encuentra el ácido lipoteicoico. se debe a que la membrana externa de las gram negativas es soluble en solventes orgánicos. En general suelen agruparse en forma de cadena (estreptobacilos) o en empalizada. además de dos clases deácidos teicoicos: anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmática. Fundamentos de diferenciación de gram positivo y gram negativo[editar] Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias gram positivas y gram negativas La pared celular de las bacterias gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglicano.

en el año 1884. Escherichia coli). orina. Después de eso puede que el colorante permanezca en la pared bacteriana o que se haya ido. por eso es una técnica útil para seleccionar el fármaco antimicrobiano inicial ante una infección. El objetivo de Gram era conseguir una prueba con la que fuera posible diferenciar diferentes grupos de bacterias para así poder estudiarlas y clasificarlas. también conocida como coloración de Gram. Cada uno de los grupos responde de forma diferente a cada tipo de antibióticos. Factores que alteran la tinción de Gram[editar]  Edad de la bacteria. al igual que los virus. por eso la tinción de Gram se pide de urgencia en muchas ocasiones. y no se podrán identificar. un científico danés. La tinción de Gram también tiene ciertas limitaciones. Los colorantes tiñen la pared de las bacterias de color morado y. y se trataría de bacterias Gram positivas y. en el segundo. pus. se realiza un lavado del colorante. ya que la reacción puede variar según la edad de las células (cultivos viejos de bacterias grampositivas pueden perder capas de peptidoglicanos y teñirse como gram negativos) y la técnica empleada (al decolorar por un tiempo muy prolongado se puede correr el riesgo que bacterias gram positivas se tiñan como gram negativas). junto a la muestra deben teñirse controles con bacterias gram positivas (por ejemplo Staphylococcus aureus) y gram negativas (por ejemplo. Por esta situación. y manteniendo la coloración azulvioleta.wikipedia. sino también para poder identificarlas rápidamente en una infección yseleccionar el antibiótico más adecuado para tratarla. La prueba resultó todo un éxito y pronto se convirtió en una técnica muy útil no solo para el estudio de las bacterias. La técnica se basa en aplicar una serie de colorantes a una muestra de cualquier origen (esputo. En el primer caso permanecería el color morado. Algunas bacterias no tienen pared. Fue diseñada por Christian Gram.  Errores del operador. https://es. Otro aspecto negativo de la prueba es que no . este método debe ser valorado con precaución.que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo. tras unos minutos. etcétera) que supuestamente contenga bacterias no identificadas.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Gram Tinción de Gram La tinción de Gram. y serían Gram negativas. Hay que tener en cuenta que en ciertas situaciones (como la sepsis) es muy importante iniciar un tratamiento antibiótico adecuado de forma precoz. En esos casos la tinción no coloreará ningún germen. la pared tendría un color rosado. como por ejemplo lasChlamidias. es una técnica de laboratorio que se utiliza rutinariamente en los estudios microbiológicos de las bacterias. Estos dos grupos de bacterias son los pilares en los que se basa la clasificación de la amplía mayoría de las bacterias.  Uso de antibióticos A pesar de la gran utilidad de la tinción de Gram.

Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram. http://www. (solo una unidad de espesor) únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos.com/pruebas-medicas/tincion-de-gram-13399 LA TINCIÓN NDE GRAM La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio bacteriológico y con el que el lector debe estar perfectamente familiarizado. La tinción de Gram es capaz de predecir el tipo de bacteria que está causando la infección. las bacterias pueden dividirse en dos grupos. Para ello es necesario realizar un cultivo microbiológico que se acompaña siempre de un antibiograma para estudiar de forma exacta el antibiótico más efectivo. Las bacterias Gram. lipopolisacáridos. Su utilidad práctica es indiscutible y en el trabajo microscópico de rutina del Laboratorio de Microbiología las referencias a la morfología celular bacteriana (cocos. etc.) se basan justamente en la tinción de GRAM Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram. negativos.webconsultas. La pared de la célula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. Las bacterias Gram + retienen el cristal violeta después de la decoloración y aparecen de color azul intenso. positivos. contiene una capa mucho más delgada. Los virus no pueden detectarse mediante tinción de Gram puesto que carecen de la pared que capta el colorante. conociéndolo La diagnostica y la trata más fácilmente. La pared de la célula bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al organismo así como para crear una barrera física contra el medio ambiente externo. y son teñidas de rojo con el colorante de contraste safranina dando un color rosa suave. bacilos. La pared de la célula gram-negativa. grampositivas y gramnegativas (simplemente designan dos grupos morfológicos distintos de bacterias). por otro lado.no son capaces de retener el cristal violeta después de la decoloración.puede identificar el tipo exacto de bacteria responsable de la infección. El material de la pared celular que le da rigidez es el peptidoglicano. y lipoproteínas. EL MICROSCOPIO . Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. quien la desarrolló en 1844.

Por esto se denominan ácido-alcohol resistentes. en cuanto a su tamaño real. para su funcionamiento utiliza varias lentes. sin la ayuda de algún aparato. marinum se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. . un bacteriólogo. tuberculosis o el género Apicomplexa (coccidios intestinales) entre otros. La tinción de Ziehl-Neelsen es una técnica de tinción diferencial rápida y económica.mx/2009/09/tincion-de-gram-resumen. es el de tipo óptico. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua. un patólogo. asimismo. como M. sería incapaz de ver estos objetos. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Fundamento[editar] Las paredes celulares de ciertas bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracíón con alcohol-ácido. El microscopio más utilizado. funcionan por medio de la refracción. Este microscopio. con las cuales se consigue ver un objeto amplificado. después de la tinción con colorantes básicos. fue el primero en ser desarrollado. y Friedrich Neelsen. usada para la identificación de bacterias ácido-alcohol resistentes (BAAR) . Fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes: Franz Ziehl. los cuales no pueden ser observados a simple vista.blogspot.TINCIÓN DE GRAM Citado el 12 de septiembre de 2009 http://erikaquiceno.Este instrumento. O sea. el ojo humano. Estos microscopios. sirve para observar objetos muy pequeños. BIBLIOGRAFIA . Las micobacterias como Mycobacterium tuberculosis y M. Este.html Tinción de Ziehl-Neelsen Visualización de Mycobacterium tuberculosis usando la tinción de Ziehl-Neelsen.

resisten el tratamiento orgánico y se verán teñidas de rosado/fuscia. Franz Ziehl. el calentamiento aumenta la energía cinética de las moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a las bacterias. por ejemplo M. Las bacterias que resisten la decoloración son de color rojo y las que no.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Ziehl-Neelsen Esta tinción demuestra la capacidad de bacterias teñidas de resistir a la decoloración por ácidos y alcoholes. Mezcla en carbol-fuscina capaz de teñir las células en caliente. Esto se correlaciona con su alto contenido en lípidos de su pared celular y presencia de ácidos micólicos que aumentan el carácter hidrófobo. no significa que esos bacilos sean necesariamente de M. para la identificación de microorganismos patógenos.telmeds.provoca una nueva solidificación de lo ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado. un bacteriólogo y Friedrich Neelsen. Fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes.org/atlas/bacteriologia/mycobacterias-nocardia-yactinomyces/muestra-de-esputo-baar-con-tincion-de-ziehl-neelsen/ miércoles. 8 de junio de 2011 Ziehl-Neelsen La tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una técnica de tinción diferencial rápida y económica.wikipedia. mezcla de ácido y alcohol. El resto de las bacterias se decolorarán y se contrastarán con azul de metileno. El observar BAAR (+) en una muestra de esputo. tuberculosis. https://es.  Fundamento Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad . un patólogo. tuberculosis. Decolorante orgánico. Citar http://www. Azul de metileno como colorante de contraste. El carbol facilita la penetración de fuscina en la envoltura celular. se ven de color azul ya que se utiliza azul de metileno como tinción de contraste. Los Bacilo Alcohol Ácido Resistente (BAAR) tras la unión de la fucsina.

html Técnicas de tinción. Se deja reposar y se lava con agua. Coloración en frío (Técnica de Kinyoun): utiliza un reactivo especial que además de fuscina agrega una ↑ [Fenol]. Esta técnica permite obtener resultados diferenciales ya que no es posible la decoloración en caliente. así se forma el complejo colorante-pared. Las micobacterias como M. La principal desventaja consiste en que se puede llevar a cabo una decoloración en caliente (tiempo prolongado). ya que se utiliza azul de metileno como tinción de contraste Fundamento: los BAAR poseen una pared celular rica en lípidos y ácidos carboxílicos (ácido micólico) que tienen la propiedad de unirse excepcionalmente fuerte al colorante 1rio (fuscina de Ziehl) cuando se usa el calor como mordiente. Las bacterias que resisten la decoloración son de color rojo y la que no se ven de color azul.blogspot. ya que las paredes retienen el colorante en forma "resistente". provoca una nueva solidificación de lo ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Esta consiste en aplicar el decolorante ácido-alcohol y luego calentar la muestra. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua. Fundamentos . Se aplica el colorante 2rio.de resistir la decoloracíón con alcohol-ácido. la capa lipídica se ablanda y el decolorante puede atravesar la pared celular retirando el decolorante 1rio y revirtiendo el proceso de formación del complejo colorante-pared. Coloración en caliente (Técnica de Ziehl-Neelsen): emplea el calor como mordiente para formar el complejo colorante-pared. Una vez que se forma este complejo colorante-pared. después de la tinción con colorantes básicos. Las bacterias que no han formado el complejo en su pared (no BAAR) no retendrán el colorante. Se aplica el colorante 1rio sobre la muestra y se deja reposar. ni siquiera la acción conjunta del ácido y del alcohol pueden deshacerlo. tuberculosis y M. Luego se emplea la llama de un mechero para calentar la muestra hasta la aparición de vapores blancos. Por otro lado. Publicado por Pedro en 19:19 http://estudiemedicina. Por esto se denominan ácido-alcohol resistentes.  Técnica Se realiza el frotis. el exceso del mismo será arrastrado por el agua. El fenol disuelve los lípidos de las paredes celulares permitiendo que el colorante 1rio entre el contacto con los ácidos carboxílicos y forme el complejo ácido-alcohol resistente. El calor se emplea como mordiente. marinum y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. Por esto se dice que la coloración en caliente no brinda resultados diferenciales. el calentamiento aumenta la energía cinética de las moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a las bacterias. gracias al calor los lípidos de la pared dejan pasar el colorante para que se combine con los ácidos carboxílicos de la pared. se deja reposar y se lava con agua.mx/2011/06/ziehl-neelsen. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Es la técnica recién descrita.

Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente. de manera que las medidas de las células que han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con mucha precisión. es el perfil de las células. La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. usándose a menudo para revelar la localización de las gotículas o depósítos de grasa. la fucsina ácida y el rojo Congo. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno. por tanto. Es especialmente útil para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales. La tinción negativa es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir. Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia química. tal como la tinta china (que es una suspensión de particulas de carbono coloidal) o la nigrosina (un . La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea. la tinción. esporas. si se añade el colorante. pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Esta sustancia se denomina mordiente. Lo que se ve. ácidos y alcoholes. tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. etc. Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas. no se producen ulteriores cambios estruturales en el protoplasma. La fijación se realiza habitualmente en células que han sido fijadas sobre un portaobjetos. Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la microscopía. y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Esos colorantes incluyen la eosina. proceso llamado fijación. Para bacterias. por el contrario. La fijación produce habitualmente el encogimiento de las células. un mordiente habitual es el ácido tánìco. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares. el cristal violeta y la safranina. La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las células.El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. la fijación por el calor es lo más corriente. aunque también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido. los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula. centros de actividad respiratoria. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora sí podrá atacar el colorante. y siguiendo inmediatamente el proceso de tinción. tales como muchas proteínas. El azul de metileno es un buen colorante simple que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Otros colorantes son moléculas cargadas negativameute (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente. tratando después éste con el agente fijador. Después de la fijación. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudán. hace que las células aparezcan mayores que lo que son realmente. paredes celulares. tales como flagelos. que no es un colorante por sí mismo. son suficientes los procedimientos simples de tinción. puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe. cápsulas.

colorante negro insoluble en agua). podemos hablar de diferentes modalidades de tinción. El material se frota directamente sobre el portaobjetos. que no está estéril. Examen de muestras al microscopio Según la manipulación que efectuemos sobre la muestra a observar y según los colorantes que empleemos durante el proceso. Cuando se trata de colonias muy pequeñas que pueden perderse en una gota de líquido se emplea una varilla delgada de madera estéril con la cual se toca la colonia obteniéndose así una fracción apreciable del desarrollo. Tales estructuras se denominan artefactos. se coloca una gota del material que se va a teñir (si es líquido) o se hace rodar el hisopo con que se tomó la muestra. ya no puede ser empleado para inocular los medios de cultivo. . y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente. El material que es demasiado espeso para permitir la diferenciación de sus elementos puede diluirse con igual volumen de solución salina fisiológica estéril. ya que pueden conducir a errores. Es el montaje directo húmedo o examen en fresco: las muestras se extienden directamente sobre la superficie de un portaobjetos para su observación. Los métodos de tinción son de gran utilidad. Una vez que el hisopo ha tocado la superficie del portaobjetos. Este material es suspendido en una gota de agua o solución salina previamente colocada sobre el portaobjetos. La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las células en la microscopia óptica. El material colocado en el portaobjetos se deja secar al aire o bien se pasa varias veces por la zona azul de la llama de un mechero de Bunsen hasta que el vidrio esté tan caliente que moleste al tacto pero no queme. Examen microscópico directo de las muestras clínicas Sin Tinción No se utiliza ningún tipo de colorante. Las moléculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares auténticas. Preparación de un frotis Sobre un portaobjetos de vidrio. limpio y seco. Puede usarse una aguja estéril para transferir una pequeña cantidad de un cultivo bacteriano a la superficie del portaobjetos. Se deposita suavemente un cubreobjetos sobre la superficie del material. pero deben usarse siempre con precaución. pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. donde puede visualizarse con facilidad. pero su máxima utilidad está en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas.

Examen microscópico de las muestras clínicas muy modificadas Diferencial Tinción Se utilizan varios colorantes combinados. etc En la imagen: Candida sp en un examen en fresco. Los ejemplos clásicos sería la tinción de GRAM o la de Ziehl-Neelsen En la imagen: BGN y levaduras en una tinción GRAM microfotografía: Daniel Val . El Hidróxido de potasio al 10% (solución de KOH) permite ver elementos de hongos ya que el KOH digiere parcialmente los componentes proteicos. La tinta china o Nigrosina permite observar células levaduriformes capsuladas (Cryptococcus). por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con la misma tonalidad (Tinta china. sobre todo en LCR. huevos y quistes de otros parásitos. Azul de lactofenol). Los polisacáridos capsulares rechazan la tinta china y la cápsula aparece como un halo claro alrededor de los microorganismos. Azul Metileno de Loeffler. hifas de hongos.Entamoeba. por ejemplo de la célula huésped. Examen microscópico de las muestras clínicas levemente modificadas Tinción Simple Se utiliza un solo colorante. En la imagen: Cryptococcus neoformans en una tinción con tinta china.Este tipo de preparación se emplea para detectar trofozoítos móviles de parásitos intestinales como Giardia. Las estructuras celulares se diferencian en función de los diferentes colorantes que fijan de acuerdo con su propia constitución química. pero no actúa sobre los polisacáridos de las paredes celulares de los hongos. larvas y gusanos adultos. Azul de metileno de Loeffler puede agregarse a las preparaciones en fresco de heces para observar la presencia de leucocitos. Trichomonas.

20% de la pared de la célula gram-negativa es peptidoglicano. Lavar y secar. por otro lado. únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos. 80%90% de la pared de la célula gram-positiva es peptidoglicano. bacilos. todas las células. sino simplemente designan dos grupos morfologicos distintos de bacterias). La pared de la célula bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al organismo así como para prevenir la lisis osmótica. Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 20 seg. etc) se basan justamente en la tinción de GRAM Descripta en forma breve. negativos.Examen de muestras al microscopio: la tinción GRAM La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio bacteriológico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram. el KI simplemente hace soluble el I 2 en agua. contiene una capa mucho más delgada. Generalmente. En este estado. La pared de la célula gramnegativa. están teñidas de azul. grampositivas y gramnegativas (en este caso. La pared de la célula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectandas de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. quien la desarrolló en 1844. El I2 entra en las células y . las bacterias pueden dividirse en dos grupos. Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. se lava con agua. lipopolisacáridos. decolorar con mezcla alcohol etílico/acetona. positivos. y lipoproteínas. Su utilidad práctica es indiscutible y en el trabajo microscópico de rutina del Laboratorio de Microbiología las referencias a la morfología celular bacteriana (cocos. Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram. primero con una solución de cristal violeta (otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas después para quitar el exceso de colorante. Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen. se cubre con solución Yodada durante 1 min y se lava de nuevo con agua. la secuencia de la tinción es la siguiente: el Frotis fijado con calor se tiñe 1 min con Violeta Cristal. tanto las grampositivas como las gramnegativas. Debido a su importancia en taxonomía bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias. El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo-yoduro potásico. Sólo 10% . El ingrediente activo es aquí el I2. describiremos aquí con algún detalle la tinción de Gram y las interpretaciones que actualmente se hacen sobre el porqué de su funcionamiento. los términos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga eléctrico.

mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. no son permeables al disolvente ya que éste deshidrata la pared celular y cierra los poros. es decir.forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. sustancias en las que es soluble el complejo I 2-cristal violeta. Morfología ultramicroscópica de las bacterias: estructuras internas . Se lleva a cabo después la decoloración. Habitualmente es un colorante de color rojo. De nuevo tanto las células grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la misma situación. Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran. Después de la coloración de contraste las células gramnegativas son rojas. La diferencia esencial entre esos dos tipos de células está por tanto en su resistencia a la decoloración. Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tinción de Gram: 1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El carácter de grampositivo no es siempre un fenómeno del todo o nada. la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipídico y disuelve la membrana exterior de la pared de la célula (y también puede dañar la membrana citoplásmica a la que se une peptidoglicano). como la safranina o la fucsina básica. usando una mezcla de alcohol-acetona. La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la célula se decolora. Para poner de manifiesto las células gramnegativas se utiliza una coloración de contraste. Las células grampositivas. disminuyendo así el espacio entre las moléculas y provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. mientras que las grampositivas permanecen azules. Después de la decoloración las células grampositivas son todavía azules. esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias gram-negativas.yodo. unas veces grampositivos y otras gramnegativos. Algunos organismos son más grampositivos que otros y algunos son gram-variables. El yodo por sí solo tiene poca afinidad con las células. a causa de sus paredes celulares más espesas (tienen más peptidoglicano y menos lípido). pero las gramnegativas son incoloras. EI proceso de decoloración debe ser corto y es esencial un cálculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios. 3) Cultivos más viejo de 24 horas pueden perder su habilidad de retener el complejo cristal violeta . 2) La decoloración debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tinción las células grampositivas.

La pared de la célula tiene poros llamado Porines para el transporte de substancias de peso molecular bajo. Entre la membrana citoplásmica y la pared celular hay un espacio periplásmico con enzimas hidrolíticas. grasas) están enlazadas formando el polímero complejo que forma la pared celular. que es una estructura rígida que da forma a la célula. el contenido graso es mucho más elevado en las gram-negativas que en las gram-positivas. se encuentra la pared celular. Entre los constituyentes de la pared celular de las bacterias Gram-positivas y Gramnegativas existen importantes diferencias. fosfolípido y unido a la membrana citoplásmica. enzimas inactivadoras de antibióticos y proteínas . El ácido Teicoico es el está en la superficie. y en la periferia de una delicada membrana que está en inmediato contacto con el citoplasma. Bacteria Gram Positiva Bacteria Gram Negativa Tiene una capa gruesa de peptidoglicano Tiene una capa delgada de peptidoglicano (mureina) y dos clases de ácidos teicoicos. (mureina) unida a una membrana exterior Ácido Lipoteicoico que está en la superficie. las paredes de las bacterias grampositivas contienen menos aminoácidos que las gram-negativas. La membrana exterior empotrado en la capa de peptidoglicano y está hecha de proteína. Estas sustancias (proteínas. lipopolisacárido A y es tóxico. Constituyentes importantes de la pared celular son los aminoácidos. por lipoproteínas. Hidratos de carbono. entero pero se el llama Endotoxina. Este hecho se ha propuesto como explicación del mecanismo de la reacción al gram (ver las dos imágenes juntas). como son las cápsulas y cubiertas mucilaginosas.Pared celular Debajo de las sustancias extracelulares. Las paredes celulares pueden destruirse o romperse en condiciones especiales. azúcares y grasas. En el lipopolisacárido. aminoazúcares. Por ejemplo. Y ácido lipopolisacárido. El lípido se llama responsable del determinante antigénico Lípido del organismo. la teicoico la porción de lípido está embebida en el superficie y se une sólo a la capa de de la pared que está en fosfolípido y el antígeno O polisacárido peptidoglicano.

de apariencia granular. También existen diferencias en la composición de la pared entre las células de las diversas especies. Membrana Citoplásmica (citoplasmática o protoplasmática) Inmediatamente debajo de la pared celular. y son el equivalente en las bacterias de los microsomas. y la parte líquida que mantiene disueltos los elementos nutritivos. región citoplásmica. se ha sugerido que se dé a estas estructuras las denominaciones de cuerpo cromatínico. Ribosomas Tienen estrecha relación con la síntesis de proteínas (30S y 50S para formar un complejo 70S). Citoplasma El material celular contenido dentro de la membrana citoplásmica puede dividirse en tres partes. Se trata de una membrana semipermeable. equivalentes nucleares. y aun cromosomas bacterianos. contienen en el citoplasma "cuerpos" que se consideran como una estructura nuclear. forma partículas o corpúsculos macromoleculares. selectiva. existe una membrana fina. Estas partículas de RNA-proteína se denominan ribosomas. que controla el paso de los elementos nutritivos dentro de la célula y la salida de los productos de desecho. que se denomina membrana citoplásmica o protoplásmica y está formada por una bicapa de fosfolípido integral y proteínas periféricas empotradas. o partículas que se encuentran en las células animales y vegetales. región nuclear o cromatínica. nucleoides. . Se demuestra con el método de tinción de Feulgen. Estructuras Citoplasmáticas Nucleoide (cuerpo cromatínico) Las células bacterianas no contienen el núcleo característico de las células de las plantas y animales superiores. es único y circular.de transporte. combinado con proteínas. la cual es rica en RNA. Tiene enzimas respiratorias y durante la división celular el cromosoma se une a la membrana de la célula en el sitio llamado Mesosoma. de unos 200 A de diámetro. doble hélice sin proteínas. o envoltura. El RNA. específico para el DNA. Como no se trata de un núcleo discreto. Sin embargo. porque la sustancia nuclear es menos densa que el citoplasma cincundante. el ADN de la célula bacteriana se encuentra confinado en este espacio. que es rica en DNA. que forman una masa densa y compacta en todo el citoplasma. La membrana citoplásmica tiene una significación funcional de suma importancia. y por microscopia electrónica.

Tinción GRAM: Morfología Bacteriana Ya hemos visto que la tinción de GRAM aporta dos ideas básicas para la deficinión "taxonómica" de las bacterias: el color que adquieren tras la tinción y la forma que presentan las células bacterianas. denominadas esporas. algún código para la resistencia a drogas. en parte. dentro del citoplasma. tienden a unirse formando cadenas. aparecen aislados y dispersos tras la división celular. Formas básicas en que se puede visualizar la morfología bacteriana en una tinción GRAM: Cocos Micrococos. formando largo de 2 esfér cadenas cortas planos ica: se llam División a lo largo de 3 planos diferentes: 2 cocos 4 . ya hemos explicado anteriormente que hablamos de microorganismos Gram-positivos cuando aparecen teñidos de color azul-violeta y de Gram negativos cuando se visualizan de color rojo-rosado. por su propiedad de producir esporas. porque se producen intracelularmente. En lo relativo a la coloración. aparecen por pares. pero sólo en casos aislados. Estreptococoss. a veces de gran tamaño form División a lo largo del División a lo a mismo plano.Plásmidos Lazos extracromosómicos de ADN. la síntesis de nuevo protoplasma destinado a transformarse en espora. en cierto período del desarrollo del cultivo en medio nutritivo apropiado. Sin embargo. aparecen en grupos irregulares. También tienen esta propiedad otros géneros de bacterias verdaderas. Todos los organismos de los géneros Bacillus y Clostridium se caracterizan. toxinas y otros factores.20 en juntos: cadenas: Tétradas regularmente irregularmen : Sarcinas te: . Las bacterias capaces de esporular pueden crecer y reproducirse en forma de células vegetativas durante muchas generaciones. Endosporas Algunas bacterias pueden transformarse en pequeños ovoides o esferas. se produce. que son formas celulares muy resistentes. Estafilococos. Diplococos. o endosporas.

cocobacilos Forma de Dos bacilos Cadenas de vara: se juntos: bacilos: llaman Bacilos Diplobacilos Estreptobacilos Empalizadas.. V o Y Espirales (Treponemas. Bacilos lado con lado o en figuras en X. estreptobacilos.) Forma espiral rígida se Si la espiral es flexible y ondulada llama: Espirilo se llama: Espiroqueta Utilizamos el término Pleomorfismo para referirnos a la adopción de diferentes formas en una misma especie. Borrelias . Tinción GRAM: Bacterias Gram-Positivas Cocos Gram-positivos Racimos: forma típica de Staphylococcus sp.. aureus .Diplococo a Coco s Estreptococos Estafilococos Bacilos grandes variaciones morfológicas: fusiformes. como S.

Cadenas: forma típica de Streptococcus sp. israelii típica como A.Streptococcus grupo B Tetradas: forma típica de Micrococcus sp Bacilos Gram-positivos Gruesos: forma típica de Clostridium sp. pneumoniae. C. perfringens. como S. . septicum Finos: forma típica de Listeria sp Ramificados: forma de Actinomycetes y Nocardia. como C.

y.uphs. y a veces aparece como coco Gram-positivo. a menudo. Cocobacilos: forma usual de Acinetobacter sp.edu/bugdrug/antibiotic_manual/gram.htm Tinción GRAM: Bacterias Gram-Negativas Cocos Gram-negativos Diplococos: forma usual de Neiseria sp.gráficos obtenidos de: http://www. meningitidis También Moraxella sp y Acinetobacter sp aparecen con morfología de diplococos. como N. Acinetobacter puede ser pleomórfico.upenn. Bacilos Gram-negativos . Gram-variable. que puede ser Gram-positivo o Gram-negativo.

uphs. de Haemophilus influenzae Curvados: forma usual de Vibrio sp. cholerae.Bacilos finos: forma usual de enterobacteriaceae. como V.upenn. Coli Cocobacilos: forma usual sp. yCampylobacter sp. como E. como H.edu/bugdrug/antibiotic_manual/gram.htm Otras tinciones de uso habitual . jejuni Forma de aguja fina: forma usual de Fusobacterium sp gráficos obytenidos de: http://www. como C.

una gran cantidad de estudios han demostrado que la tinción de hemocultivos con naranja de acridina es tan sensible como el subcultivo ciego para la detección inicial de hemocultivos positivos. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. En algunas preparaciones de naranja de acridina. el germen viable se inactivará poco tiempo después de la tinción. . De esta forma. el color de la fluorescencia puede variar. Estos colorantes se fijan a las bacterias. si se elimina antes el aceite de inmersión. Las micobacterias como M. evita la fluorescencia inespecífica. Un aspecto importante de la coloración rodamina-auramiria es que luego los frotis pueden ser reteñidos con la coloración de Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente sobre la tinción con el fluorocromo. que aparecen de color amarillo o naranja brillante contra un fondo verdoso. se tiñen con estos colorantes. El uso de naranja de acridina para detectar la presencia de bacterias en los hemocultivos ha sido ampliamente aceptado. Se ha desarrollado una coloración de ácido-alcohol resistencia modificada que diferencia las especies de Nocardia (bacterias ramificadas filamentosas cuyas paredes celulares contienen ácidos-grasos de unos 50 átomos de carbono). marinum y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. empleado como contraste. que da una fluorescencia verde si el microorganismo está vivo y roja si está muerto. dependiendo del pH y de la concentración. Estos microorganismos se denominan ácido-alcohol resistentes parciales o débiles.Nocardia spp son decoloradas por la mezcla ácido-alcohol estándar pero no por un tratamiento más suave con ácido sulfúrico 0. como el colorante se intercala en el ácido nucleico. Todos los microorganismos ácido-alcohol resistentes.RODAMINA-AURAMINA Los ácidos micólicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para los fluorocromos auramina y rodamina. De todos modos. los resultados positivos pueden ser confirmados con las coloraciones tradicionales. que además permiten la diferenciación morfológica. después de la tinción con colorantes básicos. De hecho. ZIEHL-NEELSEN (BAAR) Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracíón con alcohol-ácido. incluyendo los esporozoarios parásitos. tuberculosis y M. NARANJA DE ACRIDINA El fluorocromo naranja de acridina se une al ácido nucleico ya sea en su forma nativa o desnaturalizada. El permanganato de potasio.5 a 1%. de los actinomiceos (muy semejantes pero no ácido-alcohol resistentes). Por esto se denominan ácido-alcohol resistentes. El naranja de acridina ha sido empleado como colorante vital.

radiaciones. la espora germina generando una nueva forma vegetativa. Los organismos fluorescen con luz blanco-azulada o verde manzana. entre los que destacan Clostridium y Bacillus. Lavar y secar BLANCO DE CALCOFLÚOR Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de calcoflúor aumentando considerablemente su visibilidad en los tejidos y otras muestras. compuestos tóxicos. este colorante se emplea en lugar de KOH al 10% para el examen inicial de los materiales clínicos.) formándose una espora por cada forma vegetativa. Decolorar con alcohol etílico 95% con un 3% de ClH concentrado. producen en su interior formas de resistencia denominadas endosporas. Algunas de las bacterias productoras de endosporas son patógenas para el hombre. También se emplea para aumentar la visualización de los elementos morfológicos de los cultivos puros de los hongos. Cuando el ambiente es favorable. según la fuente luminosa que se utilice. Lavar y teñir durante 3060 seg con Azul de Metileno (color de contraste). etc. En algunos laboratoríos ha suplantado al azul de lactofenol en muchas aplicaciones. TINCIÓN DE ESPORAS (WIRTZ-CONKLIN) Algunos géneros bacterianos. La capacidad de germinar perdura durante años. por lo que su estudio y observación son de enorme interés. Se producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes. la célula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior.El frotis se tiñe durante unos 5 min con Carbolfucsina aplicando calor suave. Según fue descrito por Hageage y Harrington. . Lavar con agua. temperaturas extremas. Al finalizar el proceso de esporogénesis.

no perderán el colorante en el lavado con agua. Las endosporas..Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente. tras la primera tinción. que quedarán teñidas con el segundo colorante. .. estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el microscopio óptico como estructuras refringentes y de difícil tinción. Además. 2.Safranina: colorante de contraste que tiñe las formas vegetativas.FUNDAMENTO Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los factores ambientales adversos. La tinción específica de esporas requiere dos colorantes: 1. y sí lo harán las formas vegetativas.

6. Observar la preparación al microscopio. Secar la preparación. Con unas pinzas de madera colocar la muestra encima de la llama del mechero de forma que el colorante humee durante 5 min. Lavar abundante agua el con exceso de colorante. 2. Teñir con verde malaquita. 4. Preparar los frotis bacterianos indicados. Esta tinción es delicada en su realización y para poder obtener unos resultados satisfactorios hay que seguir cuidadosamente las instrucciones. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS La posición y la morfología de la endospora en el interior de la bacteria constituyen un carácter taxonómico útil para diferenciar especies dentro de un mismo género. . 7. es importante que la muestra no se seque.REALIZACIÓN Se emplearán cultivos en fase estacionaria para dar lugar a que las bacterias produzcan las esporas. Teñir con safranina 1 min. 3. 1. Nota: evitar que la muestra hierva. Añadir más colorante si éste se evapora. 5. Anotar la disposición y la morfología de las tres especies del género Bacillus. Lavar abundante agua el con exceso de colorante.

bacterias y virus. a . resistente.ar/SeminarioTinciones. OBJETIVO Realizar la tinción y observación de endosporas en una bacteria Marco teórico Una endospora es una sustancia inactiva.html http://www. La función primaria de las endosporas es sobrevivir en tiempos de tensión ambiental.danival. En este informe se distinguirán las endosporas presentes en una muestra bacteriológica y para lo cual se desarrollará el método de tinción con verde de malaquita y safranina. thuringiensis tiene localizada la endospora elipsoidal en el centro de la célula vegetativa. tamaño. hongos.qb. B. Por lo tanto son resistentes a la radiación ultravioleta y gamma. a la desecación.fcen. principalmente en las bacterias se facilita al tratarlas con colorantes o tintes los cuales facilitan también la observación de ciertasestructuras celulares y como en este caso particular las endosporas. composición entre otros aspectos. B. algas. difieren en la sphaericusposee una endospora esférica con localización terminal y deformante de la célula vegetativa. por lo que suele ser denominada "en palillo de tambor".htm Introducción  En su mayor parte los microorganismos son demasiado pequeños para observarse a simple vista: protozoos. estructura. subtilis forma una espora cilíndrica subterminal no deformante. no reproductiva producida por una pequeña cantidad de bacterias de la familia de Firmicute. lo que provoca un abombamiento característico denominado "en huso".uba. Bibliografía: http://www.org/notasmicro/tincion/_madre_tincion.Las tres bacterias disposición y empleadas morfología de las en esta práctica endosporas. B. Estos microorganismos difieren en características tales como forma de nutrición. es por ello que se emplea el estudio microscópico el facilita notablemente la observación.microinmuno. asimismo se da a conocer un análisis de los resultados obtenidos en la práctica.

Bacterias productoras de esporas Los ejemplos de bacterias que poseen este mecanismo incluyen los géneros: Bacilo Clostridium Desulfotomaculum Sporolactobacillus Sporosarcina Thermoactinomyces Materiales y métodos        Microscopio Portaobjetos Asa bacteriológica Pinzas Frasco lavador Mechero de Bunsen Toalla de papel . Estos estudios han contribuido al estudio de los genes. y la endospora es lanzada cuando se degrada la célula vegetativa. Debido a esto surgió la técnica conocida como Tinción de Moeller. Se repliega el ADN y una pared de la membrana conocida como tabique se comienza a formar. Otra técnica de tinción para el estudio de la endospora. Los tipos principales dentro de la célula son: terminales. Las endosporas son difíciles de observar al microscopio debido a la impermeabilidad de su pared que evita la entrada de las tinciones ordinarias. La endospora es resistente a la mayoría de agentes que matarían normalmente a las células vegetativas. Las endosporas se encuentran comúnmente en el suelo y el agua donde sobreviven por periodos de tiempo largos. Importancia.      lisozima. que cubre la capa de espora. Sin embargo los agentes mutagenos se encuentran aliados. el cual llega a durar cerca de 10 horas. Cuando una bacteria percibe condiciones ambientales desfavorables. mientras que el resto de la célula permanece en color azul. La esporulación es completa ahora. Las endosporas subterminales se encuentran en los extremos. lo suficientemente lejos de los polos pero no lo bastante cercanos al centro para ser considerados central. que permite que se muestre la endospora en color rojo. Formación y destrucción. a la temperatura. al hambre y a los desinfectantes químicos. Hasta el 15% de la endospora consiste en calcio en la base. pero tiene un metabolismo inactivo. Las endosporas terminales se encuentran en los polos de la célula. ni la mayoría de alcoholes. compuestos de amonio o de los detergentes. que son producidos por muchos eucariontes para propósitos reproductivos. que se piensa se utiliza para estabilizar el ADN. sugiriendo que existen otros mecanismos que contribuyen a la resistencia térmica. Localización. la endospora permanece descolorida. Estructura. La corteza se forma después entre las dos capas y la bacteria agrega una capa más a la forespora. Como un modelo simplificado para la diferenciación celular. transcripción y unidades del factor sigma de la polimerasa del ARN. los detalles de la endospora se han estudiado extensivamente. La pared de la base se encuentra debajo de la corteza y rodea al protoplasto o base de la endospora. especialmente el Bacilo subtilis. La capa de la espora es impermeable a muchas moléculas tóxicas y puede también contener las enzimas implicadas en la germinación. La corteza se encuentra debajo de la capa de la espora y consiste en peptidoglucano. comienza el proceso de esporulación. las endosporas centralmente puestos están normalmente en el centro. La posición de la endospora diferencia entre especies bacterianas y es útil en la identificación. En contraste con las esporas eucariontes. El ácido Dipicolinico podría ser responsable de la resistencia térmica de la espora y el calcio puede ayudar a la resistencia al calor y a los agentes que oxidan. Los productos de limpieza de la casa generalmente no producen ningún efecto. es la Tinción de Schaffer-Fulton con la que vemos la endospora verde y la bacteria roja. La membrana de plasma de la célula rodea esta pared formando una doble membrana alrededor del ADN y la estructura se convierte ahora en lo que se conoce como forespora. Mientras el resto de la bacteria puede teñirse. sin embargo el oxido de etileno es eficaz contra las endosporas. subterminales y endosporas centralmente puestos. La espora es a menudo cubierta por una cubierta fina conocida como exosporium. El calcio se incorpora a la forespora. las bacterias solo producen una endospora internamente en ambientes desfavorables. La base tiene estructuras normales de la célula tales como:ADN y ribosomas.

Se lavo con agua hasta retirar el exceso de colorante y se realizo la tinción con safranina durante un minuto. Posteriormente se lavó con agua y se secó con papel absorbente. luego se esterilizo el asa en el mechero. La fijación de una extensión bacteriana hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfología y bacteriana y las posibles agrupaciones de células que pudiera haber. que se componen de más de una sustancia tintórea. Tinción diferencial: Las tinciones diferenciales son aquellas tinciones que se usan para diferenciar de manera más explícita los microorganismos. se pudo observar la estructura interna de la célula bacteriana. Este frotis debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los métodos habituales de tinción que permiten la observación al microscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados. las tinciones diferenciales más importantes que se emplean en bacteriología son las de Gram y la tinción . se enfrió y se tomo la muestra de un cultivo bacteriológico utilizado con muestra y se realizo el frotis. En algunas técnicas de coloración. Finalmente se esquematizaron y anotaron los resultados obtenidos. tamaño y agrupamiento de las bacterias usando un único colorante (normalmente básico). el cual requirió del calor para la penetración.      Aceite de inmersión Verde de malaquita Safranina Agua destilada Solución salina Cultivo bacteriano Desarrollo práctico Seguido de la explicación por parte del auxiliar de laboratorio se procedió a colocar con la punta del asa bacteriológica una gota de solución salina. Azul Metileno de Loeffler. se observaron bacilos Gram positivos esporulados. Bacilos observados con la tinción de Verde de Malaquita. ¿Qué es un frotis y para que se utiliza? Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de separar lo más posible los microorganismos. c) Esporas solitarias. 1000 aumentos. 2. por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con la misma tonalidad (Tinta china. La tinción es la aplicación de un colorante sobre una muestra. Figura 1. La placa se flameo hasta que se evaporara toda el agua y se coloreo con verde de malaquita. Estas tinciones utilizan los colorantes diferenciales. asimismo se apreciaron esporas solitarias de forma circular y bacilos que no presentaban formación de esporas. En este experimento se utilizó una tinción simple debido a que la misma permite que se coloree toda la célula excepto la espora que se observa de un tamaño bien aceptable Preguntas complementarias   1. b) bacilos sin formación aparente de endospora. particularmente las endosporas. La muestra se rotuló y observó al microscopio óptico con el objetivo de inmersión. lo que permite poner en manifiesto diferencias entre las células o en partes una célula. pero no actúa sobre los polisacáridos de las paredes celulares de los hongos. o de un microorganismo. adicionando colorante cada vez que se secaba la muestra. Entre los procedimientos para la observación de células o microorganismos existen 2 fundamentalmente que son: Tinción simple: Permite observar la forma. ¿Qué es una tinción? ¿Cuántos tipos existen? Escribe la técnica de preparación de cada una de ellas. Azul de lactofenol). Las imágenes de lo visto se muestran en la figura 1. ya que si aparecen agrupados en la preparación es muy difícil obtener una imagen clara y nítida. a) Bacilos endosporados. Microscopio óptico. por ejemplo de la célula huésped. El Hidróxido de potasio al 10% (solución de KOH) permite ver elementos de hongos ya que el KOH digiere parcialmente los componentes proteicos. por medio de la tinción con verde de malaquita. Discusión y conclusiones Finalmente podemos mencionar que a pesar que la bacteria es una estructura muy pequeña. Resultados Luego del montaje al microscopio óptico. Se flameo durante 5 minutos. Se utiliza un solo colorante.

Tinción de esporas: ciertos tipos de bacterias producen esporas de resistencia cuya pared celular es característica. separadas por una fase de decoloración selectiva. 3. la fucsina ácida y el rojo Congo. (enteritis necrótica o la gangrena gaseosa. 6. Clostridium botulinum (produce botox). ácidos (el ácido tánico. El grupo auxocromo es el que facilita la unión del colorante a otras sustancias con carga eléctrica. Mycobacterium leprae (causa la lepra). gluten. los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula. etcétera. plomo. usándose a menudo para revelar la localización de las gotículas o depósitos de grasa.. usado para fijar colores básicos). la función del mordiente es favorecer la fijación del colorante en las fibras. las cuales están constituidas por un ion cargado positivamente y un ion cargado negativamente.. ¿Qué es un mordiente? Menciona tres ejemplos El mordiente es una sustancia empleada en tintorería que sirve para fijar los colores en los productos textiles. empleándose para ello diversas materias procedentes de vegetales (cúrcuma. índigo natural. Microorganismos acido alcohol resistentes: Mycobacterium tuberculosis (causa tuberculosis). albúmina. (causa la influenza). 3 microorganismos esporulados. Esos colorantes incluyen la eosina. 4. Elabora una tabla en la que señales todas las diferencias que existen entre bacterias Gram positivas y bacterias Gram negativas. Rhizobium leguminosarum (ayuda a las plantas a fijar nitrogeno). Streptococcus pneumoniae (causa neumonía). etc. el cristal violeta y la safranina.) Microorganismos capsulados: Haemophilus influenzae. Mycobacterium avium (causa fiebre. sustancias orgánicas (caseína. Este término es usado principalmente en la industria textil para designar a aquellas sales metálicas (de aluminio. moluscos.. 3 bacterias Gram positivas y 3 bacterias Gram negativas. perdida de peso y fatiga). tales como muchas proteínas. 3 microorganismos capsulados. Por ejemplo. Clostridium botulinum (produce botox). Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles. Serratia marcescens (causa de infecciones nosocomiales y urinarias. Los colorantes más usados son sales. tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos.). Zielh Neelsen. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudán.) así como distintos minerales. Bacillus cereus (Produce dos tipos de toxiinfecciones alimentarias: la forma diarreica y la forma emética. etc. hierro. Ambas tinciones se utilizan para obtener información acerca de la composición de las capas de la pared celular de las células bacterianas. Microorganismos esporulados: .. endosporas (Verde malaquita) Tinción de Gram: es un sistema de dos tinciones simples sucesivas.). azul de metileno es actualmente la sal cloruro azul de metileno.         ácido-resistente. ¿Qué factores intervienen para que los colorantes se combinen con los componentes celulares? Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente. 5. ¿Qué es un colorante? ¿Cómo esta constituido? ¿Cómo es que cambia con los diferentes componentes celulares? Un colorante es una sustancia que es capaz de teñir las fibras vegetales y animales. Los colorantes se han usado desde los tiempos más remotos. Escribe el fundamento de las siguientes tinciones: Gram.). que sirven para fijar los colores de estampados en los textiles. Esta diferencia en comportamiento refleja diferencias estructurales y fisiológicas entre ambos grupos de bacterias. . 8. Escribe correctamente el nombre de 3 microorganismos acido alcohol resistentes. Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente.). Clostridium tetani (produce tetanos) bacterias Gram negativas: Neisseria gonorrhoeae. La tinción de esporas permite detectar este tipo de células lo que tiene utilidad en la identificación del microorganismo en estudio. Permite diferenciar las bacterias que retienen el primer color (Gram-positivas) de las que no lo retienen (Gram-negativas).) y de animales (cochinilla. Cryptococcus neoformans (micosis sistemática) Bacterias Gram positivas: Bacillus anthracis (produce la enfermedad del carbunco). Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno. Tinción de Ziehl-Neelsen (ácido-alcohol resistencia): es un tipo especial de tinción que permite la identificación de microorganismos de los grupos Mycobacterium y Nocardia de gran relevancia clínica 8.. (produce la gonorrea). Señala la importancia de cada una de ellas.

aunque también puede estar presente en bacterias gram positivas y Gram.. La impermeabilidad de las cubiertas dificulta que las endosporas se decoloren una vez teñidas. El colorante de contraste (la safranina) solo puede teñir a las células vegetativas (decoloradas por el agua).monografias.Tomar con el Asa bacteriológica un pequeño fragmento del cultivo de bacterias 4. Si la bacteria pierde totalmente su cápsula.Leer más: http://www.: Dificulta la fijación de bacteriófagos e impide el pasaje su pasaje que puedan afectar a la bacteria Las cápsulas de ciertas bacterias productoras de enfermedades aumentan la capacidad infectiva de las bacterias.-Poner una gota de agua del mismo tamaño junto a la gota de tinta china 3..shtml#ixzz3yTUCHaHo Fundamentos La envuelta de la endospora es mas compleja e impermeable que la envuelta de las células vegetativas en las que se forma. Klebsiella. A las bacterias les proporcionan una cubierta protectora y además sirven de reservorio de alimento almacenado. puede perder su virulencia y por lo tanto su capacidad de producir enfermedad Algunos ejemplos de bacterias productoras de cápsulas son: neumococos.com/trabajos69/tincion-esporas-bacterianas/tincion-esporasbacterianas. 2. lo cualpotencia su virulencia ya que favorece la multiplicación y facilita la invasión. pero no de la endospora.Poner con el asa una gota pequeña de tinta china en el centro de un portaobjetos limpio. En algunos casos el grosor de la cápsula es sólo una fracción del diámetro de la célula. INTRODUCCION La cápsula bacteriana es una capa de material viscoso o mucoide. Sólo se puede teñir el contenido de la espora alterando su envuelta. Brinda Protección frente a Fagos.Hacer una suspensión ( sin extenderla) en la gota de agua . El verde de malaquita es un colorante débilmente básico (tiene una carga positiva débil) y por tanto. Las cápsulas bacterianas son importantes tanto para la bacteria como para otros organismos.. negativas Sin embargo las cápsulas tiene diversas propiedades como: Induce la producción de anticuerpos protectores (esto es útil en laproducción de algunas vacunas) y Permite la diferenciación de tipos serológicos dentro de la misma especie ya sea por aglutinación con sueros PROCEDIMIENTO TINCION DE CÁPSULA A) METODO DE DUGUID 1. en otros casos la cápsula es mucho mayor que la célula. se une débilmente a la bacteria. Cuando se calienta la preparación también penetra las endosporas. Penetra en las células vegetativa . Durante el lavado con agua. Tienen Propiedad Antifagocitaria : Dificulta o impide la fagocitosis.. el verde de malaquita se elimina de las células vegetativas. El tamaño de estas cápsulas está influenciado por el medio en el que crece la bacteria.

La cápsula le sirve a las bacterias de cubierta protectora resistiendo la fagocitosis.-¿Qué características presenta la cápsula en las bacterias? La cápsula es una capa rígida organizada en matriz impermeable que excluye colorantes como la tinta china. como tambien pueden descubrir bacterias que nos ayuden a nuestra salud 2. se denomina capa mucosa o glucocalix.. Ambas se pueden detectar con métodos como la tinción negativa o la tinción de Burri.-Lavar el frotis con agua destilada y dejarlo secar al aire 6.. es incapaz de excluir partículas y no tiene un límite definido. En cambio.-Tomar con el asa bacteriológica un pequeño fragmento de crecimiento de colonia bacteriana 3. 5. CUESTIONARIO 1. la capa de material extracelular que se deforma con facilidad. evita el ataque de los bacteriófagos y permite la adhesión de la bacteria a las células animales del hospedador... También se utiliza como depósito de alimentos y como lugar de eliminación de sustancias de desecho.Observar la preparación al microscopio con el objetivo de inmersión La cápsula se observa como una zona brillante alrededor de la bacteria de color rojo en un campo de azul oscuro.cubrir el frotis ( SIN FIJARLO A LA FLAMA DEL MECHERO) con una gotas del mordente de cápsula y dejarlo actuar durante un minuto.Mezclarla con la tinta china 6..Suspender la muestra en la gota de rojo congo y hacer un frotis 4. .. ya que contiene una gran cantidad de agua disponible en condiciones adversas.Observar la preparación al microscopio con el objetivo seco fuerte y de inmersión.5. evitando que queden burbujas 7.. Protege de la desecación. La cápsula se observa como una zona brillante alrededor de la bacteria en un campo oscuro..¿Qué importancia médica tiene la cápsula bacteriana? La importancia medica que tiene la capsula bacteriana es que mediante ellase pueden ver las diferentes bacterias cuales nos pueden afectar con enfermedades e infecciones. Además.Poner una gota pequeña de rojo congo en el centro de un portaobjetos limpio 2.Colocar un cubreobjetos sobre la suspensión. B) METODO DEL ROJO CONGO 1.

que recubren la superficie celular. por lo que a mayor tamaño de la capsula la bacteria posee mayor virulencia.Las bacterias al estar capsulada dificultan la fagocitosis además poseen un anfígeno llamadoanfígeno k. ..3. El término fue aplicado inicialmente a la matriz de polisacárido secretada por las células epiteliales y que forman una capa superficial.¿Qué sucede con las bacterias cuando estas llegan a perder la cápsula? Al perder la capsula la bacteria sigue presentando sus características patógenas pero pierden virulencia.Investiga de qué está compuesta la capa de material mucosa que forma la cápsula La capa mucilaginosa usualmente compuesta de glicoproteínas y proteoglicanos que está presente sobre la superficie exterior de los peces también se considera un glicocálix.¿Qué importancia tiene la presencia de la cápsula en las bacterias? La cápsula bacteriana es la capa con borde definido formada por una serie de polímeros orgánicos que en las bacterias se deposita en el exterior de su pared celular. casi siempre con cadenas de carbohidratos.. 5. Generalmente contiene glicoproteínas y un gran número depolisacáridos diferentes.. incluyendo polialcoholes y aminoazúcares. ya que la capsula les confiere antigeneidad o especificidad antigénica. 4. Los glicocálix son compuestos.