Tinción de Gram

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Tinción de Gram
La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo.
Bacterias Escherichia coli (Gram negativas) vistas al microscopio tras ser teñidas con la tinción de Gram.

Metodologia
• • • • Recoger muestras. Hacer el extendido en espiral. Dejar secar a temperatura ambiente. Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado 3 veces aprox.) • Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar 1 min. Todas las células gram positivas y gram negativas se tiñen de color azul-purpura. • Enjuagar con agua. • Agregar lugol y esperar entre 1 minuto. • Enjuagar con agua. • Agregar acetona y/o alcohol y esperar 4 segundos (parte critica de la coloracion) • Enjuagar con agua. • Tinción de contraste agregando safranina o fucsina básica y esperar 1-2 min Este tinte dejará de color rosado-rojizo las bacterias Gram negativas. • Enjuagar con agua. Para observar al microscopio óptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersión. Explicación El cristal violeta(colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas) a través de la pared bacteriana. El lugol es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro

Bacterias Clostridium perfringens (Gram positivas).

Bacterias Gram positivas de Bacillus anthracis (bacilos morados) que producen una enfermedad llamada Carbunco, encontrados en una muestra liquido cerebroespinal. Si hubiera una especia de bacteria Gram negativa apareceria de color rosa. El resto son leucocitos atacando la infección.

de

potasio),

el

cual

está

los mohos se tiñen con cierta irregularidad. que se deja actuar durante un lapso determinado.Tinción de Gram 2 presente para solubilizar el yodo. por consiguiente. y actúa de mordiente. 2B. el tono más oscuro es la hexametil-p-rosanilina (violeta cristal). La facultad de las células para tomar la coloración Gram no es propia de toda sustancia viviente. y se considera como el mejor colorante primario para teñir por el método de Gram. En este método de tinción. ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Habitualmente es un colorante de color rojo. Basándonos pues. se refieren al número de grupos metilo contenidos. puede variar con el tiempo del cultivo y el pH del medio. la extensión bacteriana se cubre con solución de uno de los colorantes de violeta de metilo. y los que pierden la primera coloración y retienen la segunda. haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la célula bacteriana. tonos azules. Sigue a tal tratamiento una coloración de contraste. se verán rosas (si no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó. violeta de metilo es el nombre atribuido al compuesto tetrametil-p-rosanilina. fucsina fenicada diluida. y la letra B. como safranina. Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas. En realidad. por ejemplo. Los que fijan el violeta. y quizá por otras causas. R. podemos clasificar a los microorganismos en uno de los dos grupos. Sirve para hacer una tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. sirve para realizar la decoloración. Los organismos Gram positivos no se decoloran. las Gram positivas se verán azul-violáceas y las Gram negativas. La mezcla de alcohol-acetona que se agrega. la tetrametil-p-rosanilina (violeta de metilo). Al término del protocolo. de los tres grupos. etc. como la safranina o la fucsina. sino que se limita casi en absoluto a hongos y bacterias. y toman el segundo.. Así vemos que las células de plantas y animales superiores no conservan la primera coloración. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta. mientras que las Gram positivas permanecen azules. El matiz de color de la p-rosanilina se intensifica al aumentar el número de grupos metilo en la molécula. pironin B o hasta inclusive verde de malaquita. después se lava el portaobjetos con alcohol hasta que éste no arrastre más colorante. Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste. de gramnegativos. Los nombres violeta de metilo 3R. se califican de grampositivos. . La reacción de Gram no es infalible ni constante. La letra R indica matices rojos. Esta importante coloración diferencial fue descubierta por Hans Christian Gram en 1884. 3B. los gránulos de micelios propenden retener el colorante. otros pierden con facilidad el primer tinte. Algunos microorganismos retienen el colorante violeta. en la reacción Gram. y el color no se modifica al añadir éste. Una tinción Gram en la que observamos un mezclado de Staphylococcus aureus (Coco Gram positivo) y Escherichia coli (bacilo Gram negative) La safranina puede o no utilizarse. pardo Bismarck. y el tinte más ligero. El violeta de cristal contiene seis grupos metilo. no es crucial para la técnica. aún después de tratarlos con un decolorante. 2R. B. que se deja durante el mismo tiempo que la anterior. Los colorantes de p-rosanilina son los que mejores resultados dan en la coloración Gram. Se escurre luego el exceso de violeta de metilo y se añade luego una solución de yodo. safranina). Los representantes más usados de este grupo son violeta de metilo y violeta cristal o de genciana. mientras que los Gram negativos sí lo hacen.

Otra explicación de la reacción de Gram puede ser la posible existencia de una capa exterior alrededor de un núcleo gramnegativo. en soluciones ácidas. Luego se desarrollaba la sustancia grampositiva debajo de la pared celular. • Los microorganismos de reacción positiva a los colorantes ácidos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la alcalinidad. sino más bien una débil combinación de sustancias proteínicas con otras lipoideas o grasas. consiste en dar a la sustancia oxidada un carácter más ácido. tratados con mordiente. esto es. Esto indica la importancia de la pared para la retención o el escape del colorante. han comunicado que si la reacción grampositiva depende de que se forme una combinación compleja entre los componentes de la coloración de Gram y las proteínas de la pared celular. Las proteínas y aminoácidos son cuerpos anfóteros. comprobaron que la reacción de tinción de las bacterias obedece en gran parte a su contenido proteínico. • La materia grasa extraída de los microorganismos grampositivos difiere de la obtenida de los microorganismos gramnegativos. pero es indudable la importancia general de la pared celular. lo que permite el escape del complejo de cristal violeta con yodo. Una posible teoría del mecanismo de tinción es la siguiente: El colorante básico entra al microorganismo. En las células gramnegativas. y. al combinarse con colorantes ácidos en soluciones ácidas y con los básicos en medio alcalino. sobre todo. donde forma con el yodo una laca insoluble en agua. deducen las siguientes conclusiones: • Los microorganismos grampositivos pueden hacerse gramnegativos al aumentar la acidez. y cuya reacción se vuelve ácida en el curso del desarrollo. su efecto. ese punto no tiene un valor preciso y definido. • En la zona isoeléctrica característica de cada especie es muy escasa la tendencia a retener cualquier colorante. estos microorganismos se conducen como cuerpos anfóteros. • Parece estar bien demostrado que las proteínas de las bacterias no son simples. a base de sus datos experimentales. si sufre daño de la pared por una u otra causa. Libenson y Mcllroy. La combinación con ambos tipos de colorante no se produce en el “punto isoeléctrico”. y forma una barrera que la laca no puede atravesar. • El cambio de respuesta a la coloración de Gram con el tiempo es propio. • Los microorganismos de reacción positiva a los colorantes básicos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la acidez. deshidrata las paredes de los microorganismos grampositivos. reaccionan con los ácidos. de los microorganismos débilmente grampositivos cultivados en los medios que contengan sustancias capaces de fermentar. De igual manera. Según Stern y Stearn. Varias son las teorías emitidas para explicar el mecanismo de la tinción de Gram. sería de esperar que las bacterias desintegradas por medios físicos retuviesen este tinte. sino que constituye más bien una gama o escala que comprende dos o tres unidades de pH. Esto aumenta la afinidad de un microorganismo por los colorantes básicos. anthracis tomaban negativamente el Gram cuando los cultivos databan de dos a tres horas. gracias a sus grupos amino y carboxilo. los gérmenes grampositivos desintegrados pierden su capacidad de . Todos los mordientes (como el yodo) empleados en la coloración Gram son oxidantes. los lípidos de la pared (más abundantes que en las células grampositivas) se disuelven por este tratamiento. ya que ese tratamiento no podría cambiar el carácter químico de los materiales de dicha pared. tienen la facultad de reaccionar con ácidos y con bases. Stearn (1923) basó la suya en una combinación química entre el colorante y las proteínas de las bacterias. se vuelve gram negativo.Tinción de Gram 3 Teorías Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana. en que la primera contiene una proporción mucho mayor de ácidos no saturados que muestren gran afinidad por los agentes oxidantes. Como los microorganismos contienen más de una proteína. El mismo microorganismo. para invertir la reacción. los microorganismos grampositivos tienen una escala isoeléctrica de pH inferior a la de los microorganismos gramnegativos. • Los microorganismos gramnegativos pueden hacerse grampositivos al aumentar la alcalinidad. y en soluciones alcalinas lo hacen con las bases. Gianni (1952) comprobó que los microorganismos grampositivos Bacillus subtilis y B. Por el contrario. El alcohol o la acetona empleados para aclarar. en general. Algunos autores objetan esta teoría.

como para lograr cubrirla por completo. • Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para fijar la muestra. y el libre acceso del disolvente al complejo constituido. :) Es por eso que las bacterias se visten de colores :) 4 Técnica de la coloración gram Fijar un frotis • Con la ayuda de un mechero. • Una vez obtenida una pequeña cantidad de la muestra (con el asa).Tinción de Gram retener el colorante primario y toman negativamente el Gram. Esta tinción de 1 minuto está dada para trabajar a una temperatura ambiente de 25 °C. El calor deseable es aquél en el que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser colocado sobre el dorso de la mano... • Tomar el asa (previamente flameada) y con ésta tomar un poco de muestra. violeta de genciana. También el enjuague se debe realizar poniendo la lámina portaobjetos en posición inclinada hacia abajo. Para realizar el lavado. de tal forma que al terminar la extensión. y el disolvente eliminará sin dificultad el complejo formado después del tratamiento con yodo. de una cantidad apreciable de complejo de yodo y colorante difícil de eliminar con el disolvente. La pared celular de los microorganismos grampositivos y gramnegativos es permeable al violeta cristal. se recomienda sea al 1% . La solución de cristal violeta. Enjuague Al transcurrir el minuto. ésta debe caer sobre la parte superior de la lámina que no contiene muestra. la de los primeros no lo es al complejo de yodo y colorante formado en el interior de la célula. tengamos como producto una espiral en la parte media de la lámina. la escasa solubilidad del complejo de yodo y colorante en alcohol y acetona. aproximadamente de medio a un milímetro de espesor. a diferencia de la de los gramnegativos. sería prácticamente impermeable al violeta cristal. Los microorganismos aparecerán teñidos después de tratarlos con violeta cristal. • Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lámina portaobjetos. la cual servirá para depositar la muestra contenida en el asa. hacer que ésta tenga contacto con una lámina portaobjetos. flamear un asa bacteriológica y esperar que enfríe un poco. El chorro debe ser un chorro delgado. son los principales factores que intervienen en el mecanismo de esa coloración. Se deja actuar al colorante por 1 minuto. y la escasa solubilidad del complejo de yodo y violeta cristal en alcohol y acetona. se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra. teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (sólo se pasa por la llama). La pared celular de los microorganismos grampositivos. parecen sustentar la opinión de que la reacción grampositiva consiste esencialmente en la formación. dentro de la célula. puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfología celular de las bacterias a observar. por ser absorbido el colorante en la superficie externa de la pared celular. proceder a realizar la extensión de la muestra en el portaobjetos mediante movimientos giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la lámina. se debe enjuagar la lámina conteniendo la muestra con agua corriente. Los resultados experimentales obtenidos con una difusión celular exenta de proteínas. azul de metileno o en todo caso tinta china utilizando una cantidad suficiente de dicho colorante sobre la muestra. Libenson y Mcllroy han sostenido que la permeabilidad de la pared celular al violeta cristal. Ni los grupos sulfhidrilo ni las proteínas básicas han influido específicamente en el mecanismo del colorante de Gram. Tinción Con violeta cristal. Sin embargo.

. procedemos a teñir nuevamente. es decir. El mordiente es cualquier sustancia que forme compuestos insolubles con colorantes y determine su fijación a las bacterias. En general suelen agruparse en forma de cadena (Estreptobacilos) o en empalizada. se aplica como mordiente yodo o lugol durante 3 minuto más. También pueden distinguirse los espirales. Para esto se utiliza el gotero del frasco del decolorante. Bacterias resistentes a la tinción Gram La siguientes bacterias de naturaleza grampositiva. A partir de la tinción de Gram pueden distinguirse varios morfotipos distintos: Los cocos son de forma esférica. Protoplastos y esferoplastos (eliminación total y parcial de la pared. hasta lograr que éste salga totalmente transparente. Lavado y secado Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la lámina al aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la forma anteriormente descrita. poseen forma de "coma". dejar actuar durante 1 minuto. Se van añadiendo cantidades suficientes del decolorante. Pueden aparecer aislados después de la división celular (Micrococos). o agruparse de manera irregular (Estafilococos). entonces se los designa vibrios. Mycoplasmas (no tienen pared). formar cadenas (Estreptococos). Formas L (pérdida ocasional de la pared). o curvados. aparecer por pares (Diplococos). que se clasifican en espirilos si son de forma rígida o espiroquetas si son blandas y onduladas. De esta manera. tiñen como gramnegativas: • • • • Mycobacterias (están encapsuladas). Si se observan mayor número de formas bacterianas que las aisladas hay que reconsiderar los medios de cultivos empleados así como la atmósfera de incubación. Si por el contrario. ya tendremos listo el frotis para su respectiva observación microscópica.Tinción de Gram 5 Mordiente Una vez enjuagado el portaobjetos. Decoloración Pasado el minuto de haber actuado el mordiente. Los morfotipos bacterianos identificados en la tinción de Gram se deben de corresponder con aislamientos bacterianos realizados en los cultivos. etanol al 95 %. Los bacilos poseen forma alargada. Nuevo enjuague Pasado el minuto correspondiente. se procede a enjuagar la lámina con agua. Utilidades En el análisis de muestras clínicas suele ser un estudio fundamental por cumplir varias funciones: • Identificación preliminar de la bacteria causal de la infección. el frotis se decolora con etanol al 75 %. hasta que ya no escurra más líquido azul. hasta que ya no escurra más líquido azul. respectivamente). Tinción de contraste Una vez que la lámina ya secó. acetona o alcohol-acetona. pero esta vez se va a utilizar un colorante de contraste como por ejemplo la safranina. se escurre el agua sobrante y se seca en la forma anteriormente descrita. • Utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano.

La membrana exterior está hecha de proteína. MT. Peter H. • Søgaard M. al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos. Elsevier España. y manteniendo la coloración azul-violácea. Lippincott Williams & Wilkins. 2004. por ella junto a la muestra deben teñirse controles con grampositivas y gramnegativas. las Gram positivas. . • Bergey. ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana. el ácido teicoico que está anclado solamente en el peptidoglucano (también conocido como mureína) Por el contrario..). La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración. Schønheyder H (2007). • Madigan. sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos. ya que la reacción puede variar según la edad de las células y la técnica empleada. se encuentra el ácido lipoteicoico.A. se debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos. perdiéndose la coloración azul-violácea. Holt. Fuentes Bibliografía • Aulton Michael E. ISBN 0-13-066271-2. Lippincott Williams & Wilkins. y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas. Parker J (2004). Por lo tanto. este método debe ser valorado con precaución. y por lo tanto este complejo se escapa. Sneath (1994). Nørgaard M. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (9th ed. y más en la superficie. Causas que alteran la tinción de Gram • I: Edad de la bacteria. Martinko J. Noel R. • III: Uso de antibióticos A pesar de la gran utilidad del la tinción de Gram. ISBN 0-683-00603-7.Tinción de Gram 6 Fundamentos de diferenciación de Gram positivo y Gram negativo Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglucano. Pero por el contrario. J Clin Microbiol 45: 1113. "First notification of positive blood cultures: high accuracy of the Gram stain report (Epub ahead of publication)". La clave es el peptidoglicano. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoproteínas. La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente. Krieg.. 2° edición. no son susceptibles a la acción del solvente orgánico.). lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo. además de dos clases de ácidos teicoicos: Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmática. y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. • II: Errores del operador. ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas direrencias constitutivas de su pared. John G. como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. fosfolípido y lipopolisacárido. David H. Brock Biology of Microorganisms (10th ed. la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada. Ciencia y diseño de formas farmacéuticas. Ed.

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