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de Guevara
CONTENIDO
1.
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8.
9.
10.
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INTRODUCCIN..1
TEORIA DE LA SEDIMENTACIN...2
FUERZA CENTRFUGA RELATIVA..3
COEFICIENTE DE SEDIMENTACIN.. 3
COEFICIENTE DE SEDIMENTACIN ESTNDAR... 4
DEPENDENCIA DE S CON RESPECTO A LA CONCENTRACIN...4
SEDIMENTACIN DEPENDIENTE DE LA VELOCIDAD...6
EFECTO DE LA CARGA EN LA SEDIMENTACIN....7
MEDICIN EXACTA DEL COEFICIENTE DE SEDIMENTACIN.....7
CENTRFUGAS..8
CENTRFUGAS DE BAJA VELOCIDAD....8
CENTRFUGAS DE ALTA VELOCIDAD....8
ULTRACENTRFUGAS.8
CENTRFUGA TUBULAR..11
CENTRFUGA DE CAMARA MULTIPLE.11
CENTRFUGAS DECANTADORAS O DE TORNILLOS.12
CENTRFUGAS DE DISCOS...12
TIPOS DE ROTORES...13
ROTORES DE COLUMPIO.13
ROTORES DE NGULO FIJO....14
ROTORES VERTICALES....14
ROTORES ZONAL...15
FACTOR K Y K...16
TIPOS DE CENTRIFUGACIN..17
CENTRIFUGACIN DIFERENCIAL O PELLETING...18
CENTRIFUGACIN ZONAL..18
MATERIALES PARA GENERAR UN GRADIENTE DE DENSIDAD.20
FORMAS DE GRADIENTES...22
CENTRIFUGACIN AL EQUILIBRIO...23
GRADIENTES DE DENSIDAD AUTOGENERADOS..24
MATERIALES PARA FORMAR GRADIENTES AUTOGENERADOS..24
PREPARARACIN DE GRADIENTES..25
GRADIENTES DISCONTINUOS....25
GRADIENTES CONTINUOS..26
GRADIENTES PREFORMADOS....26
GRADIENTES AUTOGENERADOS..27
DETERMINACIN DE LA FORMA DE UN GRADIENTE AUTOGENERADO..29
GRADIENTES ISOSMTICOS...29
ANLISIS DE LA DISTRIBUCIN DE LA MUESTRA EN EL GRADIENTE...29
INSPECCIN VISUAL.....29
ANLISIS RADIOQUIMICOS DE LA MUESTRA ...30
APLICACIONES...31
CROMATOGRAFA DE PRECIPITACIN CENTRFUGA.31
MICROSCOPIO DE POLARIZACIN CENTRFUGA.32
SEPARACIN DE DNA, RNA Y PROTEINAS DE NUCLEOS FIBROBLASTOS DE HAMSTER...33
SEPARACIN DE DNA EN BASE ALA COMPOSICIN GC, CON USO DE BAMD..33
SEPARACIN DE DNA NATIVO Y DESNATURALIZADO CON GRADIENTES DE DENSIDAD
DE TRICLOROACETATO DE RUBIDIO...33
FRACCIONAMIENTO DE RNA.34
SEPARACIN DE DNA PLASMDICO, EN ROTORES DE TUBO VERTICAL....34
FRACCIONAMIENTO CELULAR POR CENTRIFUGACIN DIFERENCIAL..35
BIBLIOGRAFA36
APNDICE ...37
INTRODUCCIN
La separacin de lquidos y partculas insolubles se ha dado en la naturaleza desde que se form el
universo. La aplicacin de una fuerza centrfuga ayuda a la separacin y este proceso se ha venido aplicando
recientemente. La separacin de partculas por medio de la centrifugacin tuvo aplicaciones en procesos
industriales hasta hace aproximadamente 100 aos. Los primeros usos fueron en la manufactura del azcar y
en separar la crema de la leche. Las primeras separaciones de partculas usando centrifugacin fueron
probablemente inventadas en 1877 por el ingeniero sueco Carl Gustaf Patrik DeLaval para separar crema de
leche, estas centrfugas funcionaban a velocidades de hasta 3 000 r.p.m.
El desarrollo de la ultracentrfuga se le atribuye a Svedberg quien trabaj entre 1920 y 1930, el fue
quien introdujo el termino de ultracentrfuga y debido a que era un qumico coloidal, estudiaba la estructura
de las protenas ( en esa poca todas las protenas eran consideradas coloides); su grupo utilizaba la
ultracentrfuga para determinar el peso molecular y la subunidad estructural de la hemoglobina, sus estudios
cambiaron las ideas concernientes a la estructura de las protenas que se tenan en aquel tiempo. El grupo de
Svedberg desarrollo algunas centrfugas y los primeros modelos funcionaban a velocidades de hasta 900 000
g y cuyos rotores eran pequeos; otros modelos funcionaban a velocidades de hasta 260 000 g. SPINCO
produjo en 1940 la primera centrfuga comercial, el modelo original es mostrado en la siguiente figura.
Teora de la Sedimentacin
Las partculas en disolucin pueden sufrir alteracin espacial, es decir, pueden cambiar de posicin
con el tiempo. Esto puede ser debido a procesos de difusin (en un gradiente de concentracin, las
partculas tienden a ir de la zona de mayor concentracin a la de menor concentracin) o bien a procesos
de sedimentacin.
En un proceso de sedimentacin la velocidad a la cual sedimentan las partculas en una suspensin,
no slo depende de su naturaleza, depende tambin de la naturaleza del medio en el cual estn suspendidas
as como, de la fuerza aplicada a las partculas. Intuitivamente, uno especulara que las partculas ms
grandes sedimentarn ms rpido que las ms pequeas. Un factor que afecta la sedimentacin de las
partculas es la viscosidad del medio. En 1856 Sir Gabriel Stokes propuso que la fuerza friccional, F, que
acta en una partcula esfrica de radio rp es relacionada a la viscosidad, h, por la siguiente ecuacin:
F= 6 p h rp dr/dt
Donde dr/dt es la velocidad de la partcula. La fuerza que experimenta una partcula no est slo
determinada por la fuerza gravitacional, g, sino tambin, por los efectos de flotacin que reflejan las
diferencias en la densidad del medio dm y de la partcula dp, por lo que tenemos:
(dm - dp) V g = 6 p h rp dr/dt
V= volumen de la partcula
Como se asume que la partcula es esfrica, el volumen puede ser expresado en trminos del radio:
(dm - dp) ( 4/3 p rp3) g = 6 p h rp dr/dt
en la prctica, la fuerza centrfuga que mueve a la partcula sobre su eje de rotacin es mucho mayor
que la fuerza de gravedad, se puede expresar la fuerza centrfuga de la siguiente manera:
Fuerza centrfuga = w2r / g
Donde r es la distancia radial de la partcula del eje de rotacin y w es la velocidad angular en
radianes / segundo, haciendo una sustitucin en esta frmula y simplificando la expresin en trminos de la
velocidad de la partcula, tenemos:
dr = 2rp2 (dp - dm) w2 r
dt
9h
Esta expresin es cierta para partculas esfricas. Las partculas no esfricas tienen altos coeficientes
de friccin, por lo que, la expresin se puede modificar en base a los coeficientes de friccin de una
molcula dada, f (f= 2phmD), con relacin al coeficiente de friccin de una partcula esfrica, fo.
dr = 2rp2 (dp - dm) w2 r
dt
9h (f/fo)
La fuerza centrifuga es dada en trminos de g y N esta dada en miles de r.p.m.. Si la fuerza centrifuga
es conocida, entonces la velocidad (N) requerida en r.p.m. para obtener esa fuerza centrfuga a un punto r
(cm) de el centro de rotacin puede ser calculada con solo despejar la ecuacin anterior.
Coeficiente
de Sedimentacin
Como la velocidad de una molcula es proporcional a la magnitud del campo centrfugo (w2r) es
comn discutir las propiedades de sedimentacin en trminos de la velocidad por unidad de campo, o sea:
s = (dt/dr) / w2 r
Coeficiente
de Sedimentacin Estndar
. (d - d20,w) hm
(d - dm ) h20,w
Dependencia de s con
Respecto a la Concentracin
Considrese una disolucin de macromolculas de un tamao tal que chocan frecuentemente unas
con otras. sta es una caracterstica de las molculas muy grandes y muy extendidas en disolucin (protenas
y cidos nucleicos), porque a medida que giran sobre s mismas, ocupan un volumen efectivo de la disolucin
realmente grande. Cuando se aproximan entre s, es ms fcil para las molculas del disolvente el moverse en
direccin opuesta, es decir, la viscosidad del disolvente se incrementa efectivamente en la vecindad de las
macromolculas. Esto reduce la velocidad hacia adelante de la partcula en un campo centrfugo dado y por
consiguiente se reduce s. Como la probabilidad de colisin aumenta tanto con el volumen como con el grado
de extensin de la molcula, la magnitud de la dependencia respecto a la concentracin tambin aumenta a
medida que lo hacen dichos parmetros.
En la siguiente figura se ejemplifica este punto con varias curvas de s en funcin de la concentracin
de DNA o de protena.
Protenas pequeas
y globulares
Fago
FX
174
s/s0
T7 DNA
T6 DNA
Concentracin mg/ml
Dependencia de s con respecto a la
concentracin expresada como s/so
donde s0 es el valor de s extrapolado a
concentracin cero.
60
DE
50
40
PORCENTAJE
DNA
30
20
10
0
0
20
40
60
Concentracin
80
100
(mcg/ml)
Peso molecular
CENTRFUGAS
Los experimentos de centrifugacin requieren aparatos que funcionan a velocidades exactamente
conocidas con pequeas variaciones y sin fluctuaciones de temperatura. Existen varios criterios para
clasificar las centrfugas, uno de ellos es por la mximo velocidad a la que operan, as tenemos:
Ultracentrfugas
La fuerza generada por las ultracentrfugas pueden ser significativamente mayor de los 600,000 g, los
cuales son suficientes para separar protenas pequeas.
Las ultracentrfugas son subdivididas en dos tipos: analticas y preparativas. La ultracentrfuga
analtica a menudo es confundida con la ultracentrfuga preparativa. Sin embargo, los experimentos con la
analtica son diferentes en varios aspectos. El ms importante es que cuenta con un sistema ptico, por lo
que, la muestra es visualizada en tiempo real durante la sedimentacin, permitiendo la determinacin exacta
de parmetros hidrodinmicos y termodinmicos. Adems, el propsito del experimento es para caracterizar
las propiedades claves de la muestra o para purificar la muestra para un uso posterior.
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Analtica
Preparativa
Cada sistema ptico tiene ciertas ventajas y desventajas. La ptica de absorcin es sensible para la
deteccin de macromolculas que contienen fuertes grupos cromforos. Por ejemplo, tomando la ventaja de
la intensa absorcin del grupo amida en el lejano ultravioleta (230 nm), las protenas pueden ser
caracterizadas con una buena seal a concentraciones de 10 mg/ml. Similarmente, los cidos nucleicos
pueden ser estudiados en la misma concentracin por su absorbancia a 260 nm. Para muestras que contienen
dos a ms componentes con diferente espectro de absorcin (por ejemplo protenas y cidos nucleicos) los
datos pueden ser obtenidos a mltiples longitudes de onda para detectar selectivamente las diferentes
especies en solucin.
El sistema ptico de interferencia Rayleigh es utilizado para el anlisis de macromolculas que
carecen de cromforos intensos (ejemplo polisacridos) y muestras que contienen molculas que absorben
fuertemente (ejemplo ATP, GTP, DTTOXIDADO). Este sistema ptico es utilizado para la caracterizacin de
muestras muy concentradas.
Existe otro tipo de sistema ptico utilizado en las centrfugas analticas llamado sistema Schlieren, en
el cual la luz que atraviesa las regiones de concentracin uniforme prosigue su camino sin desviarse, mientras
que la que atraviesa regiones de concentracin cambiante se desva debido al cambio del ndice de refraccin
que vara con la concentracin. El sistema ptico de las modernas centrfugas convierte estas desviaciones en
una curva que muestra el gradiente de concentracin. Se puede ajustar el sistema de modo que las curvas
sean ms o menos agudas; sin embargo, al realizar estos ajustes, el rea rodeada por la curva Schlieren y la
lnea de base debe permanecer constante y proporcional a la concentracin. Midiendo estas reas y utilizando
ciertas constantes pticas del aparato, se puede determinar la concentracin. A medida que disminuye la
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concentracin del material en la celda, tambin disminuye el rea englobada por el pico hasta que apenas
puede diferenciarse de la lnea de base. En la prctica, el limite inferior del sistema Schlieren es una
concentracin de algunos miligramos por milmetro. El valor del sistema Schlieren reside en su gran
capacidad para examinar el perfil del frente de sedimentacin y para detectar la presencia de
heterogeneidades en s. Se ha utilizado muy ampliamente, sobre todo para la determinacin del coeficiente de
sedimentacin de las protenas.
Otras variantes de centrfugas utilizadas ampliamente, son descritas a continuacin.
Centrfuga Tubular
Las centrifugas tubulares (CT) consisten bsicamente de un tubo vertical esbelto que gira a altas
velocidades por la accin de un motor elctrico, o una turbina de aire o vapor. Este tipo de centrfuga es una
de los ms eficientes y sencillos, capaz de separar partculas hasta de 0.1 mm. Las CT pueden contar con un
sistema de enfriamiento por lo que son empleadas en el manejo de caldos con enzimas o protenas.
Durante la operacin de la CT la suspensin es alimentada por la parte inferior y los slidos
sedimentan en la pared del tubo. El lquido claro se recolecta por rebosamiento en la parte superior.
Conforme se forma la precipitado el rea de flujo se reduce y el tiempo de residencia del liquido disminuye.
Esto se traduce en un aumento gradual del contenido de slidos en el sobrenadante que puede ser
determinado por mediciones de turbidez.
Un modelo tpico de laboratorio consta de un tubo de 4.5 cm de dimetro por 25 cm de longitud, el
cual puede girar a una velocidad de hasta 50 000 r.p.m., desarrollando campos de hasta 62 000 g, con una
capacidad de hasta 100 l/h. En la siguiente imagen se muestra una centrfuga tubular.
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El dimetro de los equipos de cmara mltiple vara de 335 a 615 mm, con velocidades de rotacin
entre 5 000 y 8 400 r.p.m., produciendo campos entre 5 000 y 9 000 g, respectivamente. La capacidad de
manejo de slidos vara entre 2.5 y 60 litros dependiendo del material y del nmero de cmaras. La descarga
de slidos y el mantenimiento de estos equipos es ms difcil que el de las centrfugas tubulares, ya que la
centrfuga tiene que ser desarmada para sacar los slidos.
Centrfugas
Decantadoras o de Tornillo
Las centrfugas decantadoras se caracterizan por un tazn horizontal con una seccin cilndrica y una
seccin cnica, con una relacin de longitud a dimetro entre 1.5 - 3.5. el tazn contiene un tornillo
transportador que gira en la misma direccin, pero a una velocidad ligeramente superior o inferior que el
tazn (entre 5 100 r.p.m.) de diferencia. Las velocidades de rotacin son de 1 600 a 6 000 r.p.m. por lo que
los campos centrfugos son menores que los de los otros equipos.
En las centrfugas decantadoras la suspensin es introducida a travs de perforaciones por un tubo
axial concntrico a la flecha del tornillo, al final de la seccin cnica o de compresin de slidos. Los slidos
que se depositan en la pared son transportados y descargados continuamente por el extremo cnico de la
centrfuga, donde escurren antes de salir. El lquido claro se obtiene por rebosamiento en el extremo opuesto
a travs de orificios de descarga que fijan el nivel del lquido en la centrifuga.
Existen diversos diseos de centrifugas decantadoras. Los dimetros de los tazones varan de 15 a
140 cm. Para los modelos piloto e industriales. La descarga de los slidos vara de 30 Kg/h hasta 60 Ton/h,
con alimentaciones entre 308 y 1890 l/min, respectivamente. En Internet se encuentra un movie del
funcionamiento de este tipo de centrfuga, la direccin es:
http://www.diquima.upm.es/docencia/tqg/eq_tqg.html
Centrfuga de Discos
La centrfuga de discos consta de un eje vertical sobre el cual se montan un conjunto de discos en
forma de conos truncados, uno sobre otro. El rotor de la centrifuga provoca el giro tanto de los discos como
del tazn de la centrifuga. Los discos constan de bordes internos que permiten mantener pequeas
separaciones entre ellos, del orden de 0.5 a 2.0 mm. El ngulo que forman los conos con la vertical vara
entre 35 y 500 dependiendo de la aplicacin particular. Entre la pila de discos y el tazn existe un espacio que
permite la acumulacin de slidos.
Durante la operacin de la centrifuga de discos la suspensin es alimentada continuamente en el
fondo del tazn a travs de la parte central de la flecha, y fluye hacia arriba entre las placas hacia la salida en
la parte central superior del equipo. Debido a la fuerza centrfuga, los slidos se depositan en la cara interna
de los discos, resbalando hacia la cmara colectora debido al ngulo de los discos. La siguiente imagen
muestra una centrfuga de discos. En Internet, se encuentra un archivo del funcionamiento de este tipo de
centrfugas en la direccin:
te://www.diquima.upm.es/docencia/tqg/eq_tqg.html
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TIPOS DE ROTORES
Los rotores para centrfugas preparativas pueden ser clasificados en cuatro tipos principalmente:
rotores de columpio, rotores de ngulo fijo, rotores verticales y rotores zonales.
Rotores de Columpio
En el caso de estos rotores la muestra estn en una cubeta individual el cual se mueve de forma
perpendicular al eje de rotacin del rotor, por lo tanto, en estos rotores, la fuerza centrfuga es ejercida a lo
largo del eje del tubo, y a pesar de que la fuerza centrfuga es axial, algunas partculas son sedimentadas
sobre la pared del tubo; esto se puede evitar con la sedimentacin zonal.
Estos rotores llevan de tres a seis tubos fijados a un soporte de metal que esta libremente suspendido,
la suspensin libre sirve solo para fijar la posicin de inicio del tubo con la muestra, cuando el rotor
comienza a girar, el bucket se pone de forma horizontal. Todos los buckets de un rotor son de igual masa por
lo que slo se necesita balancear los tubos con la muestra. La superficie de los buckets debe de estar seca y
limpia
Los rotores de columpio Beckman tiene un nmero que designa la mxima velocidad permitida
(r.p.m. x 1000) y por Ti si esta hecho de titanio, el digito adicional que sigue a la marca mencionada indica la
variante del rotor con la misma velocidad mxima ( 50 Ti, 50.2 Ti, etc.) seguido de las letras SW.
Estos rotores pueden ser divididos en tres grupos.
1.- Rotores de alta velocidad con tubos de 4.4 y 5 ml. Tipo SW 50.1, SW 55 Ti, SW 60 Ti y SW 65
Ti. Estos rotores son convenientes para centrifugacin zonal y al equilibrio donde no es necesaria una fina
resolucin.
2.- Rotores de velocidad moderada para tubos de 13.2 a 17 ml de capacidad, son convenientes para
la separacin de partculas de masa similar por medio de centrifugacin zonal en gradientes de densidad de
sacarosa. Este grupo incluye rotores del tipo SW 20.1, SW 40 Ti y SW 41 Ti.
3.- Rotores para tubos largos y de baja velocidad de rotacin. Incluye rotores del tipo SW 25.1 que
contiene tres tubos de 34 ml, el tipo SW 25.2 (3x 60 ml) y SW 28 con seis tubos de 38.5 ml.
A continuacin, la imagen corresponde a un rotor de columpio.
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Eje de rotacin
rmin
rmax
Rotores Verticales
Estos rotores se utilizan en la mayora de centrfugas de alta velocidad y ultracentrfugas. En estos
rotores, los tubos estn en posicin vertical y se podra considerar que es una forma extrema de un rotor de
ngulo fijo, sin embargo, las caractersticas del rotor vertical son lo suficientemente diferentes para
considerarse otra categora. Cuando el rotor gira la solucin se reorienta 900, esta reorientacin se lleva a
cabo debajo de las 1000 r.p.m. y si la aceleracin es suficientemente lenta la reorientacin no rompe el
gradiente. La caracterstica importante de los rotores verticales es la corta trayectoria de sedimentacin de las
partculas (que equivale al dimetro del tubo). El diseo de los rotores verticales permite muy altas fuerzas
centrfugas.
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Los rotores verticales no son convenientes para sedimentacin pero pueden ser utilizados para
centrifugacin isopcnica. La siguiente imagen muestra un rotor vertical.
Rotores Zonal
Los procesos de sedimentacin que se llevan a cabo en un rotor zonal son similares a los que ocurren
en los rotores de bucket, sin embargo, en lugar de tubos hay cuatro sectores en el cuerpo del rotor zonal
formados por la insercin de una cilindro de cuatro sectores que esta hecha de Noryl, un qumico inerte y
suave. El ensamble del aspa asegura la rotacin del liquido junto con el rotor y consecuentemente la
formacin de una fuerza centrfuga. La direccin de la sedimentacin es hacia la periferia del rotor.
En el interior del centro de las aspas hay canales que conectan la parte central y la regin perifrica
del rotor con un dispositivo transicional que se encuentra arriba del rotor. Esto permite que el rotor pueda ser
llenado y descargado mientras esta girando a baja velocidad (2000 a 3000 r.p.m.), esto es necesario para crear
un gradiente de densidad al inicio de la corrida y prevenir la ruptura del mismo despus del fraccionamiento.
La densidad del gradiente aumenta del centro a la periferia del rotor haciendo que la fuerza centrfuga sea
mantenida a lo largo de la corrida.
La siguiente imagen ilustra la carga de la muestra: la solucin es bombeada o inyectada con una
jeringa por un canal central, mientras el exceso de muestra es desalojado del sistema. Para asegurar la
eficiencia de separacin el volumen no debe de exceder el 10 % de la cavidad del rotor. La inyeccin de la
muestra debe de ser en forma lenta y uniforme.
El siguiente esquema muestra el paso final de una centrifugacin zonal. El rotor es cerrado con una
tapa y gira a altas velocidades, las partculas estn distribuidas a lo largo del gradiente de acuerdo a sus
respectivas constantes de sedimentacin.
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Se han desarrollado diferentes diseos de este tipo de rotores a los que se las ha agrupado en
diferentes series, de tal manera que hay de la serie A, B, C, D, F, K y J. Cada serie agrupa a rotores que
comparten caractersticas en cuanto a su velocidad.
En la siguiente tabla se muestran las aplicaciones de los rotores en los diferentes tipos de
centrifugacin.
Tipos de rotores y sus aplicaciones.
Tipo de separacin
Tipo de rotor
ngulo fijo.
Vertical.
De columpio.
Zonal.
sedimentacin zonal
excelente
Pobre
Ineficiente
Pobre
isopcnica
pobre
buena
buena
excelente
buena
excelente
adecuado
adecuado
Factor k y k
Un concepto para la seleccin o funcionamiento de un rotor es el factor k y el factor k. Estos
factores pueden ser utilizados para comparar la eficiencia de varios rotores para el material con el que se esta
trabajando. El factor k provee una estimacin del tiempo t en horas, requerido para separar la partcula de
inters con un coeficiente de sedimentacin conocido s (en unidades Svedberg), a la mxima velocidad del
rotor, por lo que tenemos:
t= k / S20,w
Si se conoce el coeficiente de sedimentacin de la partcula en el medio utilizado y el factor k del
rotor, es posible estimar el tiempo de separacin de la partcula.
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TIPOS DE CENTRIFUGACIN
El objetivo de la centrifugacin es la separacin de partculas especificas en una solucin. El trmino
partcula involucra sustancias disueltas y partculas de tamao microscpico y macroscpico que se
encuentran suspendidas en un fluido que usualmente es agua. En biologa las partculas suelen ser clulas,
organelos subcelulares o molculas grandes; en qumica, usualmente son solutos macromoleculares
disueltos. Existen tres tipos principales de centrifugacin: Centrifugacin diferencial, centrifugacin zonal y
centrifugacin al equilibrio.
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Otro mtodo de separacin es por gradiente de densidad, un mtodo que es ms complicado que la
centrifugacin diferencial pero tiene algunas ventajas: el mtodo de gradiente de densidad permite la
completa separacin de algunos o todos los componentes de la mezcla y tambin permite que se puedan
realizar mediciones analticas.
Hay dos mtodos bsicos de centrifugacin por gradiente de densidad: La centrifugacin zonal y la
centrifugacin isopcnica o al equilibrio.
Centrifugacin Zonal
Cuando se coloca una pequea cantidad de la disolucin con las molculas que se quieren
caracterizar sobre la superficie de un gradiente de densidad previamente formado a lo largo de un tubo de
centrifugacin, en la superficie siempre hay una densidad menor que la existente en la parte superior de el
gradiente y cuando se centrifuga el tubo las molculas de la capa superior sedimentan a travs de el
gradiente. Si todas ellas tienen el mismo coeficiente de sedimentacin sedimentarn en una estrecha franja,
sin embargo, si hay molculas con distintos coeficientes de sedimentacin, se separaran unas de otras a
medida que se produzca la centrifugacin y finalmente los diferentes componentes se resolvern en una serie
de zonas o bandas, de ah el nombre de centrifugacin zonal. Una vez completada la centrifugacin, se
fracciona el contenido del tubo generalmente por recoleccin de las gotas cuando se hace un orificio en el
fondo del tubo y el goteo es lo suficientemente lento para no producir turbulencias. Cada gota representa una
lamina del tubo y una fraccin est representada por una o varias gotas.
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Se pueden utilizar una gran variedad de tcnicas para medir la cantidad de los materiales y, a partir
de stas, determinar la distribucin de las concentraciones. En la centrifugacin analtica se depende
totalmente de tcnicas pticas para detectar las molculas. En cambio, las porciones obtenidas de un tubo
fraccionado por goteo, pueden titularse radiactivamente por reacciones qumicas, por actividad enzimtica,
por absorcin, fluorescencia o por una combinacin de todas estas tcnicas.
La necesidad de un gradiente de concentracin para la centrifugacin zonal se debe a lo siguiente:
considrese las consecuencias de colocar una disolucin de baja densidad sobre otra de alta densidad en la
que no existe gradiente de concentracin. Inicialmente, el sistema es estable, debido a la diferencia de
densidades en la interfase, supngase que hay pequeas fluctuaciones de temperatura en la disolucin, como
la densidad de la mayora de las disoluciones disminuye al aumentar la temperatura, estas fluctuaciones
crearn inversiones locales de la densidad lo que se traducir en un flujo local de lquido, flujo que recibe
nombre de conveccin. Esta conveccin tendr un efecto nulo sobre la interfase inicial, ya que la diferencia
de densidades en dicha interfase suele ser lo suficientemente grande como para que no se produzcan mezclas
a travs de ellas, a menos que la diferencia de temperatura sea enorme (10 oC a 20 oC). Por el contrario, tras
la sedimentacin, las molculas que se pretenden estudiar se habrn movido hacia el interior de las capas
inferiores ms densas, donde la conveccin comentada puede distorsionar cualquier tipo de banda que
pudiera formarse.
La introduccin de un gradiente de densidad pronunciado asegura que los cambios de temperatura
tengan que ser muy grandes para poder crear las diferencias de densidad suficientemente grandes para
provocar conveccin en el interior del gradiente. Una segunda funcin importante del gradiente es el impedir
las mezclas debidas a perturbaciones mecnicas; cualquier perturbacin sera contrarrestada por la tendencia
a restablecer el equilibrio en el que la densidad baja esta por encima de la alta. El gradiente tiene una tercera
funcin. Considrese un sistema sin gradiente en el que no existieran ni fluctuaciones de temperatura ni
perturbaciones mecnicas, en el que las molculas que estn sedimentando han entrado en la capa inferior y
formado una banda. En esta zona, la propia presencia de las molculas incrementa la densidad de la
disolucin, normalmente un efecto muy pequeo, pero que es muy importante cuando se utilizan
concentraciones elevadas. De modo que la densidad de la banda es superior a la de la capa inmediatamente
por debajo de ella, lo que se traduce en el flujo convectivo de la zona hacia el fondo del tubo.
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Glicerol: El glicerol est disponible como reactivo puro y sus gradientes han sido utilizados en lugar
de soluciones de sacarosa en centrifugacin zonal. Las soluciones de glicerol son menos densas y menos
viscosas que las correspondientes soluciones de sacarosa, sin embargo, las soluciones de glicerol de la misma
densidad de una solucin de sacarosa es mucho ms viscosa que la solucin equivalente de sacarosa. La
ventaja de utilizar glicerol es que ayuda a conservar la actividad de un gran nmero de enzimas adems de
ser muy barato.
Polisacridos: Para evitar el problema que se puede originar en el fraccionamiento de partculas
osmticamente sensibles (clulas y organelos) en altas fuerzas osmticas en las soluciones de sacarosa, se
han utilizado un gran nmero de polisacridos como medio para la formacin de gradientes. Se han utilizado
polisacridos como glucgeno, dextrn y otros materiales, sin embrago, el ms utilizado es el Ficoll. El Ficoll
es producido por la copolimerizacin de molculas de sacarosa con epiclorohidrina para dar un polisacrido
con un peso molecular promedio de 400 KDa.
La soluciones de Ficoll por debajo del 20% (P/V) equivalente a una densidad de 1.07 g/cm3 son
inertes osmticamente pero la desventaja que presentan es que a altas concentraciones, la osmolaridad
aumenta abruptamente. El otro problema al trabajar con estas soluciones de Ficoll es su alta viscosidad. Su
aplicacin ha sido en separaciones zonal e isopcnica. La muestra se puede separar de la solucin de ficoll
por pelleting de la fraccin diluida.
Gradientes de iodinato: la mayora de los compuestos iodinatos usados como medio para generar
gradientes tienen una estructura basada en el cido tri-iodobenzoico, en el que los grupos hidroflicos estn
unidos para aumentar la solubilidad de estos compuestos en agua.
La metrizamida y Nycodenz son solubles en medio acuoso y son estables en un rango de pH 2 a
12.5. Las soluciones de metrizoato de sodio y Nycodenz no son termolbiles por lo que pueden ser
esterilizadas en autoclave, sin embargo, el grupo glucosamida de la metrizamida la hace inestable a
temperaturas por arriba de los 55 0C , por lo que, deben ser esterilizadas por filtracin.
En comparacin con otros medios para generar gradientes, los compuestos iodinatos tienen grandes
ventajas. Por ejemplo, a todas las densidades, los gradientes de iodinato presentan menor viscosidad y
osmolaridad que los de sacarosa. Los gradientes de iodinatos pueden ser preformados y la muestra se carga
en la parte superior del gradiente. Este mtodo es preferible para la preparacin de gradientes isopcnicos y
para la separacin de partculas grandes (clulas, organelos et.) los cuales necesitan ser centrifugados por
corto tiempo (2 horas o menos). Alternativamente, para partculas pequeas es posible realizar gradientes
autogenerados durante la centrifugacin, en este caso, la muestra es mezclada con la solucin del gradiente
haciendo posible el uso de un mayor volumen de la muestra.
Suspensiones coloidales de slica: las suspensiones coloidales de slica contienen partculas en el
rango de 3-15 milimtros de dimetro y son extensamente usadas para varias aplicaciones industriales y para
separaciones centrfugas. El Percoll tiene algunas ventajas sobre las preparaciones de slica de las que
deriva. Las partculas coloidales estn cubiertas con polivinilpirrolidona (PVP) la cual minimiza sus
interacciones con material biolgico.
Las suspensiones de slica coloidal son desestabilizadas por condiciones que tienden a neutralizar las
cargas de las partculas, por lo tanto, el Percoll precipita a bajo pH y las altas fuerzas inicas tambin
desestabilizan la suspensin coloidal. El Percoll interfiere con la mayora de los tipos de los anlisis de
protenas y para algunos tipos de anlisis de cidos nucleicos y polisacridos. El uso de gradientes de Percoll
es restringido para separaciones isopcnicas y estos gradientes pueden ser usados para clulas, organelos y
algunos virus. La slica coloidal puede ser removida de las fracciones por centrifugacin diferencial para
retirar el material fraccionado de la mayora de las partculas de slice.
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Formas de Gradientes
La forma del gradiente se refiere al perfil de concentracin, es decir, a la variacin de la
concentracin en el gradiente a lo largo del tubo.
Hay dos tipos bsicos de gradientes que son representados con funciones matemticas simples y son
fciles de preparar con equipo de laboratorio, estos son: 1) Continuos que pueden tener forma lineal,
convexo, cncavo y 2) discontinuo. La siguiente imagen muestra ambos gradientes.
Los gradientes continuos pueden ser producidos por adicin continua de una solucin de alta
densidad CD desde un reservorio a un compartimento que contiene una solucin de baja densidad CL,
mientras al mismo tiempo se desplaza la mezcla al tubo que contiene el gradiente. El gradiente producido es
lineal si los dos compartimentos tienen el mismo dimetro. Cuando los compartimentos tienen diferentes
dimetros se pueden producir gradientes convexos o cncavos como se puede observar en las siguientes
figuras.
La forma del gradiente es importante para lograr la separacin deseada, y para determinar
propiedades tales como densidad de flotacin y coeficiente de sedimentacin. Los gradientes lineales en
densidad son los mas utilizados y a menudo dan la mejor resolucin de componentes de protenas, enzimas,
hormonas, subunidades ribosomales y algunos virus de plantas. En un gradiente lineal la densidad incrementa
linealmente conforme aumenta la distancia del centro de rotacin. Cuando se disea un gradiente lineal en un
rotor vertical o de columpio, la densidad en la superficie del gradiente debe soportar la muestra, mientras
que la densidad en el fondo del tubo no debe exceder la densidad de las partculas a ser separadas y en
general, a mayor pendiente del gradiente (ms pronunciado), mayor resolucin.
Para algunas aplicaciones es necesario generar gradientes cncavos o convexos. Cuando el gradiente
necesita un cambio pronunciado en la superficie para soportar la muestra y no tener un cambio abrupto
conforme se acerque al fondo, es necesario utilizar un gradiente de forma convexa. Si es necesario que en la
terminacin del gradiente haya un cambio abrupto, se puede realizar un gradiente de forma cncavo. Este
tipo de gradiente es preferido cuando se necesita un cambio brusco en la viscosidad cerca del fondo del tubo,
el cual puede ser utilizado para disminuir la sedimentacin de partculas de un tamao determinado mientras
las zonas de menor viscosidad siguen separando a las otras partculas. Los gradientes cncavos son utilizados
para separacin de lipoprotenas.
En los gradientes discontinuos, el cambio de concentracin de las soluciones en el gradiente no es
gradual. Los gradientes discontinuos se utilizan para separar clulas u organelos subcelulares de plantas u
homogenados de tejidos animales y para la purificacin de algunos virus.
Centrifugacin al Equilibrio
En la separacin isopcnica las partculas son separadas en base a su densidad, el tamao solo afecta
la velocidad con la que las partculas alcanzan su posicin isopcnica. Estas separaciones se llevan a cabo en
un gradiente de densidad en el que las partculas se mueven hasta el punto en el que su densidad es la misma
que el medio.
La tcnica de centrifugacin al equilibrio fue desarrollada por Matthew Meselson, Franklin Stahl y
Jerome Vinograd. En esta tcnica la densidad del disolvente es casi la misma que la de la molcula que se
est estudiando. Esta tcnica requiere un tercer componente (normalmente una sal de cesio), de bajo peso
molecular y elevada densidad. Cuando se centrifuga la disolucin, las sal se redistribuye y alcanza un
equilibrio, formando, un gradiente de concentracin que es menos denso en la parte superior y ms denso en
el fondo del tubo obtenindose como resultado un gradiente de densidad. Las macromolculas tambin
sedimentan, pero el material en la parte superior del tubo se mueve centrfugamente a travs del gradiente,
mientras que el mismo material en la parte baja del tubo se mueve centrpetamente. Este movimiento
continua hasta que las macromolculas forman una banda en una posicin determinada del gradiente de
concentracin, posicin en la que la densidad de la macromolcula iguala a la de la disolucin. La anchura de
la banda est determinada por el equilibrio entre la fuerza centrfuga (que tiende a estrechar la banda), la
difusin (que tiende a ensancharla) y el gradiente de densidad (un gradiente ms pronunciado dar una banda
ms estrecha).
Como se mencion anteriormente, la muestra se mezcla con la solucin del gradiente y conforme se
lleva a cabo la centrifugacin se genera el gradiente (gradiente autogenerado) a la vez que se separan las
partculas de la muestra. Sin embargo, la muestra puede ser colocada en la superficie de un gradiente
preformado de igual forma que en la centrifugacin zonal.
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Los gradientes de cloruro de cesio son utilizados para separar diferentes especies de DNA de acuerdo
a su composicin de bases. Las especies de DNA que son enriquecidas en citosina y guanina bandean denso.
El grado de separacin de diferentes especies puede ser utilizado por la adicin de drogas como la
distamicina la cual se une selectivamente a regiones del DNA que son ricas en adenina y timina y disminuye
la densidad de este DNA. En suma, en la presencia de bromuro de etidio, es posible separar DNA de
diferentes conformaciones (ejemplo, superhelicoidal y lineal) incluso teniendo la misma composicin de
bases.
Los gradientes de sulfato de cesio son utilizados para separar diferentes especies de DNA, sin
embargo, la composicin de bases tiene un efecto pequeo en la densidad de flotacin de DNA y los
gradientes deben de ser abruptos. Una ventaja de los gradientes de sulfato de cesio comparado con el
gradiente de cloruro de cesio es que ellos pueden ser utilizados para bandear RNA. Algunas especies de alto
peso molecular de RNA tienden a agregarse y precipitar en gradientes de sulfato de cesio, sin embargo, estos
se pueden minimizar adicionando urea 4 M al gradiente. Cuando se utiliza un gradiente abrupto es posible
bandear protenas, DNA y RNA en un solo gradiente de sulfato de cesio. Un problema con los gradientes de
sulfato de cesio es que los iones de sulfato reaccionan y se precipitan con la mayora de los fluidos de
centelleo.
El cloruro de cesio y el sulfato de cesio son las sales de cesio mas utilizadas para la separacin de
cidos nucleicos, sin embargo, hay otras sales de cesio que pueden ser utilizadas para obtener mejores
separaciones. Por ejemplo, las sales de tricloroacetato y trifluoroacetato se han utilizado para buenas
separaciones de cidos nuclecos. En el caso del trifluoroacetao de cesio es posible obtener una buena
separacin de plsmidos superhelicoidal y DNA lineal sin la adicin de bromuro de etidio.
Sales de sodio y potasio.
El cloruro de sodio y el cloruro de potasio son soluciones poco densas para bandear la mayora de las
macromolculas, el bromuro de sodio, el yoduro de sodio, el bromuro de potasio y el yoduro de potasio
forman soluciones densas no viscosas y han sido utilizadas para el bandeo de lipoprotenas, protenas y
cidos nucleicos. Una ventaja de los gradientes de yoduro de potasio y de yoduro de sodio es que el RNA no
se agrega y precipita como en los gradientes de sulfato de cesio. Sin embargo, las sales de yodo tienen la
desventaja de que son propensas a la oxidacin y se pueden adicionar algunos agentes reductores para
prevenir la formacin de yodo libre.
Sales de rubidio.
Estas sales han sido utilizadas para fraccionamientos isopcnicos, en particular se han utilizado
gradientes de cloruro de rubidio en lugar de gradientes de cloruro de cesio para separaciones isopcnicas de
protenas, sin embargo el uso de esta sal para la formacin de gradientes no presenta mas ventajas que las que
se obtienen al utilizar gradientes con cloruro de cesio.
PREPARACIN DE GRADIENTES
Preparacin de
Gradientes Discontinuos
Los gradientes discontinuos pueden ser hechos simplemente colocando una solucin de baja
densidad sobre otra mas densa, sin embargo una mejor interfase puede ser obtenida si la solucin mas densa
es colocada bajo la solucin menos densa utilizando una jeringa con una aguja larga o una pipeta. El
principal problema es que algunos solutos (ejemplo: cloruro de cesio) difunde rpidamente as que la
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interfase desaparece rpidamente. La siguiente imagen muestra las dos formas de hacer un gradiente
discontinuo.
A)
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El lquido denso en la cmara A se mezcla continuamente con el lquido menos denso en la cmara
B. El flujo es producido por una bomba peristltica (P) la cual coloca el lquido cada vez ms denso en el
fondo del tubo de centrifuga. La llave (T) controla el flujo del liquido de A a B . La mezcla en la cmara B se
da con un agitador magntico (SB).
Gradientes Autogenerados
En un gradiente autogenerado, las soluciones son centrifugadas y las molculas del medio tienden a
sedimentar formando un gradiente de densidad. En algunos casos, los gradientes como los de Percoll, forman
muy rpidamente un gradiente (20,000 g x 30 min.) sin embargo, hay otras soluciones como el cloruro de
cesio que toma muchas horas para alcanzar el equilibrio. Existen una serie de ecuaciones que permiten
conocer algunos parmetros tiles en una corrida de centrifugacin.
En el caso de metales alcalinos (ej. CsCl) es posible predecir el rango del gradiente y el tiempo en
que alcanza el equilibrio. Estos clculos son basados en el valor de b0 (ver valores en el apndice) que es la
constante de proporcionalidad del gradiente de densidad cuyo valor ha derivado de trabajos experimentales.
Utilizando este valor, el rango del gradiente de densidad en el equilibrio puede ser calculado como sigue.
Primero es necesario encontrar el punto de isoconcentracin de el gradiente. Este es el punto (rc)
donde la concentracin del gradiente es constante independientemente de su forma:
rc= [1/3 (rmin2 + r min x rmax + rmax2)] 1/2
Donde rmin y
respectivamente.
rmax son la distancia radial (cm) de la parte superior y del fondo del gradiente
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Determinacin de la Forma
de un Gradiente Autogenerado
Para saber la forma de un gradiente autogenerado, es necesario seguir la siguiente formula para saber
el valor de la pendiente (dd/dr):
dd = w2 r = 1.1 x 10-2 N2 r
dr b0
b0
Gradientes Isoosmticos
La separacin de clulas animales y otras partculas sensibles osmticamente requieren que el
gradiente para la centrifugacin sea conveniente osmticamente, es decir, mantengan constante la
osmolaridad a travs del gradiente. Las soluciones utilizadas son: suspensiones de slica coloidal como el
Percoll, iodonidatos como el Nycodenz y metrizamida.
Anlisis de la Distribucin
de la Muestra en el Gradiente
Inspeccin visual, anlisis flouromtricos y espectrofotomtricos: En algunos casos, la inspeccin
visual simple podra revelar la posicin de la banda de inters, por ejemplo, las bandas mitocondriales tienen
un color caf que las distingue y el DNA en gradientes de cloruro de cesio y con bromuro de etidio presenta
un color rosa. Estas bandas pueden ser removidas utilizando una jeringa o una pipeta para su anlisis
posterior. En otros casos, las partculas absorben o dispersan la luz, as que, su posicin puede ser
determinada por medicin de la densidad ptica en un espectrofotmetro. Los cidos nuclecos y las
protenas absorben en la regin ultravioleta del espectro sin embargo, hay algunos medios (NaI, Nycodenz)
que absorben fuertemente en la regin ultravioleta y otros medios que dispersan la luz (Percoll) haciendo que
sea muy difcil la medida de la absorcin de la luz.
A menudo los problemas asociados con la medida directa pueden eliminarse utilizando anlisis
colorimtrico o fluorimtrico para diferentes tipos de macromolculas, sin embargo, en estos ensayos no es
fcil remover la fraccin del gradiente lo que involucra perdida de materiales, en el peor de los casos puede
ser no selectivo y dar un fraccionamiento falso. Es posible utilizar marcadores para fraccionamiento
subcelular (ver tabla 5 Apndice) para poder distinguir su banda despus de una centrifugacin. A
continuacin se muestra un tubo de centrifuga despus de un fraccionamiento por centrifugacin zonal, en
donde podemos ver claramente las diferentes fracciones.
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APLICACIONES
Cromatografa de Precipitacin Centrfuga
Un nuevo sistema de cromatografa introduce un gradiente de concentracin generado internamente
con sulfato de amonio a travs de un conducto de separacin bajo un campo de fuerza centrfuga. Las
muestras de protenas son expuestas a un incremento gradual de concentracin de sulfato de amonio y
precipitado a lo largo del conducto, entonces se inicia la elusin cromatogrfica disminuyendo
gradualmente la concentracin de sulfato de amonio en el gradiente que causa que las protenas se
disuelvan y precipiten a travs del canal; consecuentemente, las protenas salen de acuerdo a su solubilidad
en la solucin de sulfato de amonio. La columna de separacin consiste en un par de discos equipados que
tienen dentro una membrana de dilisis de tal manera que se forman dos canales divididos por esta
membrana. El disco es ensamblado en una centrfuga de flujo continuo. Cuando una solucin concentrada
de sulfato de amonio es eluda a travs de un canal y el agua a travs de otro canal en direccin opuesta, se
forma un gradiente exponencial de sulfato de amonio.
Este nuevo mtodo elimina varias complicaciones tales como prdida de la muestra por absorcin y
desactivacin causada por el soporte slido y el arrastre de los precipitados finos a travs de la columna
cromatogrfica. En suma el mtodo ofrece varias ventajas incluyendo: la capacidad de concentrar la
muestra dentro del canal, la manipulacin mas flexible del gradiente a travs del canal y la completa
eliminacin de impurezas de bajo peso molecular.
En la siguiente figura se muestra la separacin de suero humano bajo las siguientes condiciones
experimentales: 0.05 ml en un ml de solucin de buffer, gradiente de sulfato de amonio de 95 a 0 % x 1600
min, se utiliza una centrfuga de flujo continuo a 2 000 r.p.m., la velocidad de flujo de elusin del gradiente
de sulfato de amonio de 1 ml x min y la deteccin fue a 275 nm.
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Fraccionamiento de RNA
Si es necesario separar un rango completo de molculas de RNA desde s20,w = 4S a s20,w = 28S (1:7)
en una corrida de centrifugacin se puede utilizar un gradiente abrupto con una diferencia de concentracin
de 25 %, por ejemplo 10 35 % de sacarosa a la mxima velocidad del rotor SW 40 Ti.
Se utiliz una centrifugacin a 30 000 r.p.m. x 14 hrs a 0 0C. Utilizando nomogramas ( d = 1.5) dan
una posicin de x / L = 0.45 para RNA 28 S y x / L = 0.06 para RNA 4 S.
Nota: los nomogramas son grficas que representan unas constantes (a , S ) en el eje de las
ordenadas y x/L (longitud del gradiente) en el eje de las absisas. Estas grficas ayudan a obtener los
parmetros para realizar una centrifugacin.
Separacin de DNA
Plasmdico en Rotores de Tubo Vertical
Se utilizaron cultivos de E. coli en donde los cidos nuclecos fueron separados utilizando un
procedimiento alcalino. Se llev a cabo una centrifugacin a 5 000 r.p.m. a 4 0C en una centrifuga J-6
usando un rotor JS-5.2 con varios adaptadores.
El Pellet de cidos nuclecos (plsmido y fragmentos cromosomales, RNA y algunas protenas ),
fue resuspendido en buffer TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.4). El cloruro de cesio fue adicionado a
una densidad final de 1.55 g / ml, y bromuro de etidio a una concentracin final de 0.06 mg / ml. Se
centrifug 4.2 hrs a 55 000 r.p.m. en un rotor VTi. Despus de la centrifugacin, la banda del plsmido fue
colectada, el bromuro de etidio fue removido con n butanol saturado con agua y cloruro de cesio y
finalmente, los cidos nuclecos fueron precipitados 2 veces con etanol.
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Condiciones:
primera centrifugacin: 600 g por 5 min
segunda centrifugacin: 3000 g por 20 min
tercera centrifugacin: 15 000 g por 1 h
La centrifugacin es una tcnica que no slo se utiliza en el laboratorio, sino que tambin se usa a
nivel industrial. Por ejemplo es utilizada para purificar y recuperar aceites, fluidos hidrulicos y enfriadores
ahorrando miles de dlares a la industria. Otra aplicacin es en la industria de alimentos en donde las
centrfugas son utilizadas en muchas operaciones. Por ejemplo en la extraccin de protenas comestibles de
productos vegetales y animales; en la industria farmacutica cada vez tienen ms auge en procesos de control
automatizados. Las impurezas del caf, t y jugos de fruta son eliminadas con la ayuda de centrfugas.
Cabe mencionar que cada vez son ms las aplicaciones de la centrifugacin en micro y macro escala,
sto es debido a los nuevos diseos automatizados que proporcionan mayor eficiencia y nuevas aplicaciones
en los procesos de separacin de molculas.
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BIBLIOGRAFA
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Research Tool. Journal of Biomolecular Techniques. 10. 163-176.
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APNDICE
En el siguiente apndice se encuentran algunas tablas con informacin relevante en el tema de la
centrifugacin, cada una tiene un encabezado que permite identificar su uso.
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