PRACTICA : TINCIN DE GRAM

1. OBJETIVOS Y FUNDAMENTOS TEORICOS

En el estudio de la ciencia que nos ocupa, la microbiologa, es fundamental

la observacin de los microorganismos. Esta observacin se hace necesaria
para su clasificacin e identificacin.
Para ello se usa el microscopio tanto ptico como electrnico, y en sus
diversas variantes (microscopio de rayos UV, electrnico de barrido, de
contraste de fase, de campo oscuro). Nosotros abordaremos nicamente
el microscopio ptico compuesto de dos lentes (condensador y objetivo).
Un microscopio suele tener cuatro objetivos, pero en microbiologa se usa
preferentemente el objetivo de inmersin, aunque para visualizar una
preparacin siempre se recomienda empezar por el objetivo de x10 y una
vez localizada la muestra ir subiendo poco a poco el nivel de aumentos.
Al microscopio ptico hay dos formas de ver las preparaciones:
Preparaciones en fresco con el objetivo seco. Tiene el inconveniente de
que las preparaciones son muy difciles de ver debido al poco contraste del
medio que les rodea.
Preparaciones fijadas y teidas con el objetivo de inmersin. Se matan
las bacterias, pero son ms visibles y su contraste es superior y de mayor
calidad.
Entre los tipos de preparaciones del segundo tipo, hay un mtodo de tincin
que se usa universalmente para distinguir a las bacterias en dos grandes
grupos: se trata de la Tincin de Gram. Es una tincin diferencial que basa
su distincin en la estructura diferente de la pared bacteriana de las
bacteria Gram + (pared ms gruesa, y una sola capa de peptidoglucano ) y
de las Gram- ( pared ms delgada y dividida en dos partes). El
procedimiento y sustancias usadas son:
Colorante bsico Cristal Violeta o Violeta de Genciana. Es el primer
colorante que se echa sobre el frotis previamente preparado. Es un
colorante selectivo que tie a todos los microorganismos. Se deja actuar
durante un minuto y se lava con agua a continuacin.
Lugol. Producto compuesto de yodo y yoduro potsico. Es un mordiente,
que intensifica al Cristal Violeta haciendo que precipite. Se deja actuar un
minuto y se lava con alcohol, el tiempo justo para que no se arrastre el
colorante del todo.

 Alcohol 96. El alcohol retira el colorante de las gram- debido a su

diferente estructura de la pared celular (tamao de los poros).
Safranina. Colorante bsico diferenciador. Tie a las bacterias gram-. Se
deja actuar treinta segundos y se lava con agua.
Como puede verse una vez finalizada la tincin las bacterias gram- estarn
teidas de un color rosceo, y las gram+ de un color violeta. Esto sirve para
diferenciarlas claramente al microscopio ptico.

2.DESARROLLO PRCTICO.
En primer lugar encendemos el mechero, ya que para realizar cualquier
estudio de una muestra bacteriana, debemos usar la tcnica asptica para
evitar la contaminacin de la muestra.
Usamos un asa de siembra, aparato fundamental en la preparacin de frotis
y cultivos. La calentamos al rojo en el mechero y a continuacin cogemos
una gota de agua el asa y la depositamos en el portaobjetos que
previamente habremos preparado. Volvemos a esterilizar el asa y con otra
mano abrimos un tubo de ensayo tapado con un algodn donde se
encuentra el inoculo a sembrar. Con cuidado introducimos el asa, evitando
que el asa mate por excesivo calor a los microorganismos, dando unos
golpecitos dentro del tubo y mojando el asa en el tubo un poco.
Cerramos el tubo y colocamos el inculo en el portaobjetos, haciendo un
frotis con l. Fijamos a la llama cuidadosamente con ligeros pases con el
mechero y dejamos secar.
A continuacin hacemos la tincin de Gram de la forma antes explicada,
usando un barreo para evitar el desparramamiento de los colorantes y el
agua por el laboratorio. Hay que tener cuidado en la cantidad de colorantes
a usar, con una gota suele ser suficiente. Una vez hecha la tincin dejamos
secar de nuevo.
Ahora nos dirigimos al microscopio. Preparamos el objetivo de inmersin
echando un poco de aceite de cedro al cubre. Esta gota de aceite crea una
fina pelcula entre objetivo y muestra , que disminuye el ndice de refraccin
de la luz, mejorando la visin de la muestra.

En la practica observamos estreptobacilos, en forma de bastoncillos,

algunos de ellos representados con manchas blancas en su interior que se
identificaban con esporas y ttradas de cocos, bacteria de forma
redondeada.
Observamos tambin a las bacteria lcticas de una muestra de yogur.
Todas las bacterias observadas eran gram+.
MATERIAL USADO
Un vaso lavador
Un asa de siembra
Una gradilla con tubos de ensayo con el microorganismo en medio slido
(Agar como coloide.)
Una placa de Petri
Barreo para los restos de los colorantes por los lavados
Portaobjetos
Microscopio

PRACTICA II:
SIEMBRA, RECUENTO Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS.
OBJETIVOS Y FUNDAMENTOS TEORICOS
Esta prctica se caracteriza por ser uno de los procedimientos ms usados
en un laboratorio de microbiologa. Se trata de la siembra de un inculo y el
posterior recuento y aislamiento de unos microorganismos.
Refirindonos a la siembra de un inoculo y su proliferacin creando un
cultivo hay diversos mtodos y formas. Nosotros nos ceiremos a cultivos
semisintticos generales. Segn el medio fsico podemos ver cultivos:
Slidos: En ellos el coloide se echa en forma de gel que se solidifica ms
tarde. El agente solidificante suele ser el agar. El cultivo slido puede ser en
placas de Petri o en tubos de ensayo.

 Lquidos o caldos: Son soluciones acuosas de nutrientes diversos para

que proliferen las bacterias.
Como puede deducirse los mtodos de siembra para formar colonias solo
pueden hacerse en medio slido, ya que en medio lquido las bacterias
estn dispersadas.
Entre los mtodos ms destacados encontramos:
Siembra por agotamiento en estras oblicuas: Con el asa de siembra se
coge el material y se hacen estras en el agar. A continuacin se esteriliza
por flameado y se vuelven a hacer estras cruzadas, con el objetivo de poner
en estas estras el excedente de las primeras estras.
Siembra por agotamiento en zigzag: Con el asa de siembra sembramos
el inculo en zigzag de manera que conforme avancemos en la placa o el
tubo de ensayo habr menos inculo y ser ms fcil luego distinguir y
aislar las colonias.
Siembra en masa: Es un tipo especial de siembra indicada para el
recuento de microorganismos. Se usa una mezcla de medio de cultivo y
agar fundido a 45C, donde se echa tambin una solucin de
microorganismos, que deben estar diluidos varias veces anteriormente, ya
que luego para contar las colonias, el nmero debe estar entre 30 y 300.
Para conocer el factor de dilucin exacto que debemos usar en una siembra
en masa se hacen varias diluciones, que se explicaran ms tarde en los
procedimientos prcticos.

2.DESARROLLO PRCTICO.

Para realizar nuestro cultivo partimos de una muestra biolgica,

concretamente pimentn en polvo. Cogemos 0,1 gramos a un tubo y
echamos 9,9ml de agua. Este ser el tubo A. Agitamos con el vortex la
muestra y posteriormente ( todo esto en las consabidas condiciones
aspticas) cogemos 0,1ml del tubo A con una pipeta. Lo echamos a un tubo
B con otros 9ml de agua. Repetimos la operacin echando 0,1ml del tubo B
a un tubo C con 9ml de agua. Repetimos la operacin en un tubo D.
En nuestro caso vamos a usar la dilucin del tubo C. Como puede verse
hemos diluido la muestra en un factor 1/100 en la dilucin al tubo A, y un
factor 1/10 en las sucesivas diluciones. Para la dilucin C el factor de
dilucin es igual a 1/10000.
Una vez hecho esto sembramos en masa, como se ha explicado
anteriormente, vertiendo el contenido del tubo C en la placa de Petri, junto
con el agar lquido.
Esperamos a que solidifique, y aqu ya podemos contar el nmero de
bacterias refirindonos a unidades formadoras de colonias (UCF). Debemos
esperar dos das, incubando la placa a 28C.
Obtuvimos 217 UCF, Por lo que multiplicamos por 10.000 ya que es el factor
de dilucin. Luego multiplicamos por 10, para obtener las colonias que hay
en un gramo, y tambin multiplicamos por 100 ya que haba 0,1 gramos de
pimentn en
10ml. En total nos da 217x105 UCF.
Los resultados de otros grupos fueron:
217 millones; 127 millones; 253 millones; 212 millones; 136 millones;
88 millones; 186 millones.
Total: 1219
Media: 174,14
Ahora podemos proceder a aislar diversas colonias, para hacerles pruebas
bioqumicas, con el fin de descubrir la especie de la colonia a aislar.
MATERIAL USADO
Asa de siembra
placa de Petri
Un mechero
Probeta con el inculo

Probetas diferentes para hacer las diluciones

Pimentn
Agar fundido como coloide

prctica iii.
Pruebas bioqumicas
1.OBJETIVOS Y FUNDAMENTOS TERICOS.
Las pruebas bioqumicas son un til instrumento para el investigador, ya
que mediante diferentes procedimientos de deteccin de metabolitos o
productos de excrecin bacteriana, podemos descubrir la especie bacteriana
que estamos observando. Las ms utilizadas en el campo de la
microbiologa son:
1.HIDROLISIS DEL ALMIDN.
Esta prueba nos indica si un germen es capaz de hidrolizar o no el almidn.
Esto se debe a la presencia o no de una enzima amilasa. Podremos
distinguir entre las bacteria que hidrolizan almidn y las que no:
Si el microorganismo asimila e hidroliza el almidn se ver en la placa de
Petri y alrededor de las colonias un halo negro, violeta o azul (zonas donde
no ha llegado la amilasa).
Si el microorganismo no hidroliza el almidn, toda la placa de Petri se ver
negra violeta o azul, (debido a la ausencia de amilasas).
Para que se tia el almidn que queda en la placa se echa lugol que forma
un complejo de color negro, violeta o azul.
El agar en el que se inocula el germen es un agar nutritivo compuesto de:
-Pectona como fuente de nitrgeno.
-ClNa como fuentes de sales.
-Extracto de carne como fuente de carbono (levadura)
-Agar

-Agua
Junto con un Agar almidn compuesto de (En 100ml):
-2 gr. agar
-0,2 gr. de almidn
-97,8 ml. De agua.
USO DE LA GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO:
Esta prueba se basa en los productos que surgen como resultado del
metabolismo de la glucosa. Se usa un caldo nutritivo, con glucosa como
fuente de carbono, y tambin pectonas. A la glucosa se le aade el prpura
de bronocresol que le da diferentes colores al cultivo segn sea el pH, es
decir, si como resultado del metabolismo no se crean cidos, baja el pH y el
color que se ve es prpura. A pH neutro el color es violeta y a pH alcalino es
color es amarillo ( no hay secrecin de cidos)
Adems, en el cultivo en probeta, aadimos una campana de Durhan para
saber si la fermentacin de Durham produce gas. Si produce gas, en la
campana habr una burbuja, si no produce gas no habr burbuja.
TEST DE VOGES-PROSTKAUER:
Esta prueba se basa en dos rutas del metabolismo de la glucosa que usan
diferentes tipos de bacterias. Las rutas son la fermentacin cido-mixta con
un intermediario que es la acetona, y la fermentacin 2, 3 butanoldioica,
que no produce acetona como producto intermediario.
Si la bacteria sigue la ruta de fermentacin cido-mixta, el pH final ser
cido ya que formar diversos cidos orgnicos como lctico, succnico y
actico, con lo que la concentracin de hidrgeno se igualar a la del
dixido de carbono.
Al echar una solucin A (naftol) al tubo de cultivo y ms tarde una
solucin B (KOH al 40%), el lquido de la probeta formar un precipitado y se
volver de color rojo ladrillo. Este precipitado se forma al reaccionar la
acetona con los reactivos de las soluciones, que dan diacetilo, que se une a
la guanilina de la pectona que llevaba el cultivo, dando el consabido color
rojo ladrillo.
Si la bacteria sigue la otra ruta, el cultivo permanecer del mismo color
que tena, ya que al no poseer acetona, no reacciona con los reactivos
usados.
Su pH ser neutro y la concentracin de dixido de carbono ser mayor que
la de hidrgeno.

2.DESARROLLO PRCTICO.
Antes de todo, habremos aislado una colonia, sembrandola en zigzag en una
placa de Petri con agar nutritivo (12ml) y agar almidn por encima (8-10ml),
incubndolo durante 48 horas a 24 C, para la prueba del almidn. Para las
otras pruebas bioqumicas, se ver en cada apartado por separado.
1.HIDROLISIS DEL ALMIDN:

En la placa de Petri que habamos preparado aadimos el lugol para ver si la

bacteria es amilasa+. En nuestro caso se vean halos negros alrededor de
las colonias, por lo tanto nuestra especie es amilasa+.
2. USO DE LA GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO:
Al caldo nutritivo que habamos formado se le aade un inculo de la
probeta donde tenamos el cultivo bacteriano (siempre con la tcnica
asptica).
El caldo inoculado se incuba durante 24 horas. En nuestro experimento se
produjo cido y el color vir a prpura, por tanto nuestra bacteria es cido+.
Adems en la campana no se vea burbuja de gas y por tanto la especie era
gas-.
TEST DE VOGES-PROSTKAUER:
En un tubo de hemolisis y en un medio de Voges-Prostkauer con glucosa
como fuente de carbono y como indicador, rojo de metilo.
Ahora inoculamos, con la consabida tcnica asptica, en el tubo e
incubamos a 28C durante 72 horas. Una vez pasado el tiempo, se le aplica
al tubo el reactivo A, se mezcla por inversin, y despus se aade el
reactivo B.
En nuestro caso obtuvimos un precipitado de color rojo ladrillo, por tanto
esta bacteria sigue la ruta de fermentacin cido-mixta.
Viendo el resultado de las pruebas bioqumicas y sus caractersticas fsicas
del cultivo, que habamos observado en el microscopio, previa tincin de
Gram.
La bacteria era elipsoidal, con la espora central, que no deformaba a la
bacteria.
Las especies posibles son Bacillus cereus, Bacillus subtitulus y Bacillus
lidieniferuns.
MATERIAL USADO.
Probeta con el cultivo

Placa de Petri con Agar almidn y Agar nutritivo

Medio nutritivo con glucosa en un tubo
Campana de Durham
Tubo con medio Voger-Prostkauer

Reactivo A (-naftol)
Reactivo B (KOH al 40%)
Asa de siembra Mechero Incubadora

prctica iv. Antiobiograma

1.OBJETIVOS Y FUNDAMENTOS TERICOS
Los antibiogramas nos sirven para conocer la diferente sensibilidad que
tiene un microorganismo a diversos antibiticos. El antibiograma se hace en
una placa de Petri con un medio Meller-Hinton, donde los antibiticos se
propagan de forma homogenea por toda la placa con una concentracin
decreciente conforme se va propagando el antibiticos.
Los antibioticos estan embebidos en discos de papel. El modelo, para
conocer cada antibitico es:
Ej: TOB 10. TOB representa las siglas del antibitico, en este caso es
Tobramicina y el nmero 10 representa los microgramos de antibiotico que
hay en ese disco. Para saber si una bacteria es sensible o no a un antibitico
debemos conocer el diametro mnimo de la calva que produce en el cultivo
bacteriano. Si este diametro es mayor del indicado para cada antibiotico la
bacteria es sensible a ste.
Los antibiticos pueden ser bacteristticos (inhibe el crecimiento
bacteriano) o bactericda (destruye al microorganismo).
Para sembrar el cultivo en la placa de Petri usaremos un asa de Drigalsky,
de forma especial, que reparte uniformemente el cultivo por toda la placa.

2.DESARROLLO PRCTICO
Un cultivo puro de bacterias patgenos que ha sido incubado durante 18-24
horas a 37C se inocula en una Placa de Petri en un medio Meller-Hinton,
siempre con tcnica asptica. Vamos a poner cinco discos de antibioticos
diferentes, colocadas de forma equidistante en la placa. En nuestros casos
los antibioticos son:
1. CRO 30. Ceftriazone. Halo de sensibilidad >18mm

 ATM 30. Aztreonam. Halo de sensibilidad >18mm

MA 30. Cefamandol. Halo de sensibilidad >18mm
C 30. Clorafenicol. Halo de sensibilidad >18mm
CAZ 30. Celtazidime. Halo de sensibilidad >18
Hay que recordar que si el halo o calva producido es menor del 10% de la
distancia de cada antibitico el microorganismo es resistente.