Gua para

Principiantes de
Biologa Molecular
Aplicada a la
Acuicultura

Karl Andree
IRTA Sant Carles de la Rapita

Investigant el present, apropant el futur www.irta.es

Introduccin
Estructura del ADN y Terminologa
Metodologa Bsica
Clonacin / Secuenciacin
Marcadores Gnica
Deteccin Gnica
Southern / northern blots
Microarray
PCR y RFLP

Expresin Gnica
qPCR (PCR a tiempo real)
northern blots

PCR: Cmo y Porqu Funciona

Diferentes sabores de PCR
Componenets del cocktailde PCR
Importancia de la Cuantificacin de ADN
Higiene en el Laboratorio

X-ray Crystalography 1953

Single DNA Crystal 1990s
Scanning Tunneling Microscopy 2003

DNArt

Detalle de una litografa de

Salvador Dal- 1960s

Pster del Festival de Cine de

Los Angeles 2007

x 147 = 587!!!

Estructura del ADN

Hlice alfa de doble cadena en
configuracin antiparalela.
3

5
5

Estructura del ADN

Extremo 5 - grupo fosfato
Extremo 3 - grupo hidroxilo
Necesario para la extensin de la
molcula de ADN.

Puentes de H en forma de
cremallera
Las dos hebras se mantienen
unidas por puentes de H.
T/A = 2 enlaces
G/C = 3 enlaces

Purinas: Adenina, Guanina

Anillo doble

Pirimidinas: Citosina, Timina

Anillo sencillo

Terminologa Bsica
Coding Strand (sentido) - la secuencia se muestra de izquierda a
derecha de 5a 3
Non-coding Strand (antisentido) - la secuencia normalmente se
representa de izquiera a derecha de 3 a 5, aunque puede mostrarse
en sentido contrario
El ARNm se copia a partir de esta cadena de forma que la secuencia final del
ARNm es la misma que la de la cadena codificante
El ADNc se sintetiza a partir del ARNm, usando transcriptasa inversa, por
tanto es un duplicado de la cadena no codificante
5- CAATGATGGTATGGAATTCCTGCAGGGGCCCTAG -3
3- GTTAC TACCATACCTTAAGGACGTCCCCGGGATC -5

Reverse Complement Strand (o Complement Strand) es la secuencia

opuesta que se aparea a la cadena de referencia, mientras que la
Reverse Strand es la misma secuencia que la cadena de referencia
escrita con la polaridad opuesta
5- CTAGGGCCCCTGCAGGAATTCCATACCATCATTG -3

Taxonomy/Phylogeny

Gene Detection/Expression

Collect Sequences from GenBank or EMBL

Do Computer Alignment of Sequences

Collect Biological Samples

Extract DNA or RNA

Design primers for YFG

from consensus of alignment
PCR Amplification of YFG
Clone PCR products
Sequence clones
Edit sequences and
add to alignment
Phylogenetic Analysis

Analyze & Compare Sequences

to identify mutations, etc

Write Results

Design primers or probes

Publish / Present Data

Test primers/probes

Become Rich & Famous!

Create Assay for Testing Hypothesis

(Q-PCR, ISH, Microarray, etc)

Write Results
Publish / Present Data

BioInformatics Consortium:
Design microarrays,
Create transgenic animals,
Whole genome comparisons,
Etc...
Archive samples for later testing

Clon
Def.: - una clula, producto celular u organismo que es genticamente
idntico a la unidad o individuo del que procede.
Los clones se pueden guardar en genotecas que representan la totalidad
o una fraccin del genoma de un organismo.
Las tcnicas de PCR o DNA splicing son mtodos para el aislamiento
de fragmentos especficos de ADN clonado.
Los plsmidos, los virus, y cromosomas artificiales (YACs, BACs) se
usan como vectores para la duplicacin de ADN clonado y para
asegurar un archivo estable de la secuencia.
DNA splicing (mediante enzimas de restriccin) es un mtodo
comn para la insercin de ADN clonado en un vector.
tambin los vectores TA, basados en la actividad polimerasa no
especfica de la polimerasa de ADN Taq, son comunes.

Enzimas de Restriccin
(la R en RFLP)

Aisladas a partir de bacterias que las usan como una forma

de sistema inmunolgico molecular para destruir ADN vrico
El Premio Nobel de Medicina de 1978 fu concedido por su
descubrimiento
Inici la poca del ADN recombinante

El nombre de cada enzima proviene del de la bacteria a partir

de la que se aisla (ej. Sex AI
Streptomyces exfoliata)
Las enzimas ms comunes en biologa molecular son las que
reconocen secuencias de nucletidos palindrmicas de 4-6 pb
G AATTC- 3
(ej. Eco RI 35--CTTAA
)
G- 5
Cada enzima slo corta en su sitio de reconocimiento
especfico
Restriction Fragment Length Polymorphism ..ms despus

Felicidades! Ya Tienes Clones!

Despus de la clonacin Secuenciacin
La secuencia de ADN se puede emplear para:
Localizar regiones de ADN distintivas tales como:
Secuencias microsatlite
SNPs (single nucleotide polymorphisms)
Sitios de restriccin
or identificar YFG
- Todo ello es til para disear sondas / cebadores
(primers) para northern blots, southern blots, PCR o
microarrays

Bibliotecas de Genes y Secuencias de ADN

Diferentes tipos de genotecas de ADN
genoteca genmica muchos clones, cada uno contiene un
fragmento de ADN genmico de un organismo
genoteca de cDNAADN complementario derivado de ARN
genoteca EST expressed sequence tag, a partir de una genoteca de cDNA

genoteca de microsatlites (ms despus.)

La secuenciacin puede ser de una cadena o de doble cadena

Secuencia consenso - Se secuencian ambas cadenas y el consenso
consiste en aquellas bases que se leen por igual en ambas cadenas
ESTs son ejemplos de lectura de una sola cadena
CDS (coding sequence) ADN transcrito a proteina
ORF (open reading frame) igual a CDS pero incluye
porciones del gen que no son traducidas

Secuenciacin de ADN
Las secuencias de 5
ADN son
generadas por
mquinas
Las mquinas
tambin cometen
errores
Lee ambas
cadenas y
comprueba
visualmente tus
datos!

Filogenia y Secuenciacin de ADN

Identificar la secuencia BLAST
(Basic Local Alignment Search Tool)

GenBank del NCBI

Usa la secuencia consenso

Alinear la secuencia - Clustal W

Corregir manualmente
transicin vs. transversin
Huecos extras

Anlisis Filogenticos
Neighbor Joining
Maximum Parsimony
Maximum Likelihood
Bayesian Method

Alineamiento de Secuencias
Las secuencias consenso se analizan en un editor de alineamientos
Todas las secuencias se alinean mecnicamente y se editan manualmente
BioEdit y otros freeware contienen Clustal W para alineamientos mecnicos
hand alignments, o edicin manual, necesarios para la revisin de transversiones y
transiciones con el fin de corregir los errores de alineamiento producidos por la mquina

I. Deteccin de Genes
Southern Blot & Northern Blot
Hoy qPCR prcticamente ha reemplazado a los northern blots

Microarray
puede detectar diferencias grandes de expresin gnica entre
muestras a baja resolucin
a menudo se usa para identificar genes de inters para experimentos
de alta resolucin o estudios de expresin gnica con qPCR

PCR y Marcadores de Genes

muchos tipos: anidada (nested), RT (reverse transcription),
cuantitativa (qPCR), inversa, etc
Puede estar seguida por anlisis RFLP, secuenciacin o
trasnferencia (blotting)

Southern y Northern
Blots
Southern - ADN (Edwin Southern:1975)
northern - ARN
Ambos mtodos:
separacin electrofortica
transferencia mediante absorcin a
una membrana cargada para blotting
Hibridacin de sonda marcada para
la deteccin de YFG

Hibridacin In Situ (ISH)

Emplea tejidos enteros en lugar de
cidos nucleicos separados en un gel

Microarrays - DNA Chips

Matrices de alta densidad
para genoma completo
Dos matrices (chips) son
suficientes para el genoma
humano B
(70,000 ESTs /chip)

Usados para la identificacin

de genes que se expresan de
forma diferente
Caro de desarrollar porque
requiere:
Equipo especializado
Conocimiento previo sobre
todo el genoma, o una
genoteca de ADNc completa

Diseo Experimental
del Microarray
Purificacin del ARN de cada
poblacin celular o grupo de
tratamiento
Obtencin de ADNc mediante
transcripcin inversa usando
marcaje fluorescente
Hibridacin al chip que contiene
70,000 fragmentos de genes
Inspeccin mediante excitacin
por lser de tags fluorescentes y
una cmara CCD de alta
resolucin
Anlisis asistido por ordenador de
los resultados (eg: Bio-LIMS)
Biological Laboratory Information Management System

ADN Microsatlite
Secuencias de ADN altamente
repetitivas descubiertas usando
curvas Cot (Britten & Davidson 1960s)
Romper el ADN en fragmentos de
400 - 500 pb
Calentar el ADN para
desnaturalizarlo y obtener cadenas
sencillas
Enfriar lentamente y tomar muestras
a distintos tiempos

Slo una inflexin en una curva

Cot creada con ADN bacteriano
no microsatlites!
Debido a la alta incidencia de
mutacin y la mutltiplicidad de los
alelos

Mecanismo para la Diversificacin de

Alelos: Slip-strand Mispairing
Antes: 9 copias
5 CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG 3
3 GTCGTCGTCG TCGTCG TCGTC GTCGTC 5

Despus: 13 copias
5 CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG 3
3 GTCGTCGTCG TCGTCG TCGTC GTCGTC GTCGTCGTC GTC 5

Microsatlites
tambin llamados Simple Sequence Repeats (SSRs) o Variable Number Tandem
Repeats (VNTRs), son loci polimrficos presentes en ADN nuclear y organelar que
consisten en unidades repetidas de 1-4 pares de bases de longitud
debido a la alta incidencia de mutacin y la mutltiplicidad de los alelos son tiles para
realizar comparaciones genticas intra-especies de alta precisin
los ensayos pueden resultar caros de desarrollar si no se conoce la sccuencia genmica
constituyen una herramienta relativamente barata de usar para estudios de poblaciones
o de paternidad
Son tiles como marcadores en Quantitative Trait Loci (QTL) para reproduccin
selectiva
Forward Primer
0 - GAATTCCGGGGTCCTTCCCAGACACGTGTGTGTGTGTGAGTGTGTGTGTG -50
51- TGTGAGTGTGGTGGTTTGCCTTATTCAGTGGTGCCACTCCATCATGCGAG -100

Reverse Primer

Alelos
Microsatlite
el tamao de los alelos es
normalmente pequeo: 50500 pb
la existencia de un nmero
alto de alelos hace que sean
muy tiles en estudios de
poblaciones
la tcnica analtica se basa
en PCR
fcilmente adaptable a la
mayora de laboratorios,
tambin puede ser
subcontratada a travs de
diversas compaias de
biotecnologa

Repeat No.

primer A

primer B

6
9
5
7
1

9
7
2

6
7
3

6
5

Simple Sequence Repeat en Vibrio vulnificus

Aislado de Ostras de la Baha Alfaques

C- type

E- type

El biotipo 1 de V. vulnificus se divide en los genotipos Clinical y Environmental

Un SSR aparece al final de una regin genmica asociada con virulencia
Existe una correlacin entre el bajo nmero de copias del SSR y el genotipo clinical
La primera copia del SSR en todos los genotipos clinical es imperfecta sin dos bases
Existe algn tipo de presin slectiva para conservar la repeticin imperfecta en las
cepas clinical, aun cuando el nmero de copias cambia con el paso de generaciones
SSR = (AGCGAGA) x n

Restriction Fragment Length Polymorphism

(RFLP)

Las secuencias gnicas pueden ser inferidas mediante el uso de enzimas de

restriccin y sus secuencias de restriccin correspondientes
Se comparan fragmentos de ADN procedentes del ADN genmico
completo o fragmentos amplificados mediante PCR
se compara ADN cortado vs. ADN sin cortar, y se compara entre especies realizando
digestiones con diferentes enzimas de restriccin

Diferenciacin de Maja spp. M.b. contiene el sitio Ase I, pero no M.sq.

M.b. CO1 fragment: 680 bp Ase I = 210 bp + 470 bp

Ase I

Whole Genome RFLP

Limitado a virus y bacterias
White Sturgeon Herpes Virus
WSHV 1 & WSHV 2
1g ADN para cada digestin
Cortado con Hind III & Sst I

Estimacin del tamao

genmico:
WSHV 1 =132,770 pb
WSHV 2 =123,590 pb

M WSHV1 WSHV2 M
Hind Sst Hind Sst

ADN Ribosomico
De

TEM Imagen de transcripcin

18S

ETS

5.8S
ITS-1

ITS-2

5.8S

18S

28S

ETS

gra
Int
da
ac
do
to

ITS-1

28S
ITS-2

ETS

ADN Ribosomico
Large Subunit
-30 proteins
-24S rRNA
-5.8S rRNA

Small
Subunit
rRNA

18S

ETS

Small Subunit
-20 proteins
-18S rRNA

5.8S
ITS-1

ITS-2

5.8S

18S

28S

ETS

ITS-1

28S
ITS-2

ETS

Secuenciacin Mitocondrial
Heredado slo a travs de la linea materna

AF42
AF43
AF40

secuencias altamente conservadas, pero tambin

alta tasa de mutacin dentro de linajes

AF39
AF38
AF36
AF30
AF28
AF25
AF12

http://mitofish.ori.u-tokyo.ac.jp/

AF8
AF1 Afallax

A. fallax

AF51
AF22

base de datos de ADN mitocondrial para

especies de peces

AF3
AF15
AF16
AF18
AF19
AF20
AF27
AF49
AF2
AF6

Alosa fallax del Ro Ebro

AF14
AF31
AF29
AF33

Demostrada la hibridacin con Alosa alosa

usando secuenciacin ND1

AF7
AF9
AF26
AF24
AF32
AA13 Aalosa
AA14 Aalosa
AA12 Aalosa
AA11 Aalosa
AA10 Aalosa
AA9 Aalosa
AA8 Aalosa
AA4 Aalosa
AA2 Aalosa
AA1 Aalosa
AA3 Aalosa
AA5 Aalosa
AA7 Aalosa
AF37
AA6 Aalosa
AA15 Aalosa
AF5
AF23
AF46
AF47

A. fallax morphometry
A. alosa ND1 genotype

AF48
AF50
AF41
AF4
AF21
AF34
AF35
AF44
AF45

0.002

A. alosa

II. Expresin de Gnes

Medida del gen target y del gen control endgeno (house-keeping) para su comparacin
Diferentes tipos de anlisis:
Cuantificacin absoluta
Cuantificacin relativa
Diferentes mtodos para
clculos de espresin relativa:

-actin

Vasa

R = 2 Ct
Mtodo de la Curva
Standard Relativa:
R=

C1

(E T) CtT
(E R) CtR

C1

ZI

Centollo (Maja brachydactyla)

Expresin de vasa asociada con el
inicio de la diferenciacin de la
lnea de clulas germinales y el
desarrollo gonadal
La expresin vara desde la
eclosin hasta la primera juvenil

ZII

ZI

Cycle number

ZI = zooea I
ZII = zooea II

M = megalopa
C1 = first crab

ZII

Expresin Gnica Relacionada con la

Formacin del Esqueleto en Dorada

= R450 (dieta control normal)

= R900
= R2250
= R4500

Aumento de 11.5 veces en la

expresin del receptor de cido
retinoico alfa

Relative gene expression.

La expresin relativa muestra varios genes bajo la influencia de

los niveles de vitamina A en la dieta
Muestras de larvas a los 18 dph 14
Comparacin de 3 dietas con
12 18 dph *
concentraciones diferentes de
10
vitamina A y dieta normal
8
6
4

0
-2
R
A
R

R
A
R

R
A
P

tin
n
o

n
p
o
o
e
e
st
st
O
O

tin
c
e

Resumen

Aislamiento y Secuenciacin de ADN

Estudios de historia vital: - identificacin de fases del desarrollo

Filogentica / Sistemtica
Decubrimiento / descripcin de genes
Deteccin de mutaciones

YFG

Deteccin / expresin gnica

Deteccin de patgenos YFG
Estudios de paternidad y de poblaciones
microsatlites, mitocondrial, genes ribosmicos, etc

Respuestas fisiolgicas (estrs, nutricin, estado del desarrollo, interacciones

huesped/parsito, etc)
Microarray detectar diferencias grandes de expresin gnica entre muestras a baja
resolucin

Expresin de gnes alta resolucin de estados de expresin gnica alterada

Manipulacin de gnes RNAi, genes anti-sentido, mutagnesis dirigida, gene
knock-outs usando animales transgnicos

Resources
GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
tambin EMBL (European Molecular Biology Laboratory) & DDBJ (DNA Data Bank of
Japan)
Bsqueda y descarga de secuencias de ADN y proteinas
Anlisis BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) para comparacin de secuencias

New England Biolabs NEB

http://www.neb.com/
mucha informacin sobre enzimas de restriccin

Barcode of Life Initiative - BOLI

http://www.dnabarcodes.org/
Informacin sobre sistemtica molecular con enlaces muy tiles

Freeware for Windows

http://molbiol-tools.ca/molecular_biology_freeware.htm
ejemplos:
Bioedit anlisis de secuencias
MEGA anlisis filogenticos
Tree-Puzzle composicin de rboles filogenticos

Polymerase Chain Reaction

C

T T G C
A A C G T T C A G T

95oC
55oC
72oC

Nmero de ciclo
0
1
2 3

Reaccin en Cadena de la Polimerasa

(Polymerase Chain Reaction)
Amplificacin logartmica de un segmento especfico de
ADN genmico
Dos subconjuntos de molculas se amplifican a diferentes
velocidades
Signal = amplificacin logartmica
- obtenida a partir de molculas de nueva sntesis (molculas de
tamao especfico formadas slo despus del segundo ciclo)
Noise = amplificacin lineal
- obtenida a partir de la muestra original (tamao variable)

Amplificacin Lineal y Logartmica

1000000000
100000000
10000000
1000000

ADN de novo

100000

DNA original

Nmero de Copias 10000

1000
100
10
1
10

20

30

40

Nmero de Ciclos

Cuantificacin del ADN

Demasiado ADN puede tener un efecto inhibitorio
La cantidad de ADN usada en la PCR depende de la
secuencia target
Las secuencias ricas en G/C pueden ser ms difcil de amplificar
Genes de alto nnero de copia requieren menos ADN
(eg. - genes ribosmicos, ADN mitocondrial)

El uso de espectrofotometra
A260 = 1 = 50 g/ml de AND genmico; o
[DNA] = A260 x Dilucin x 50 g/ml

0.1 < A260 < 1

A260 / A280 ~ 1.9

33 g/ml primers
40 g/ml RNA

Cuantificacin de ADN por Espectrofotometra

1.5

A260 / A280 value = 1.9 = Pure DNA

1
DNA
P rotein

Absorbance
0.5

0
260 nm 280 nm

Wavelength

Componentes de PCR - Primers

ADN corto sinttico de cadena sencilla
llamados oligonucletidos, primers, o sondas segn la aplicacin

Esenciales para el inicio de la amplificacin

Define los extremos finales para rondas de amplificacin sucesivas
Los primers son:
De cadena sencilla
normalmente 15 - 30 pb de longitud
~50 % G/C J estabiliza la unin del primer
Acabado en el extremo 3 con una G/C J estabiliza el inicio de la
polimerizacin

Existen muchos proveedores comerciales de primers, incluido

SIGMA
Simplemente enva la secuencia que necesitas

Componentes de PCR - Primers (cont.)

Diseo del Primer : evita la autocomplementariedad
INTRA-molecular: formacin de hair pin & primer- dimer
5

GCTAGCATGACCTCGTGAATGGGCTAG 3

GCTAGCAT GACCTC
GTGAATGGGCTAG 3

INTER-molecular: formacin de primer- dimer

5

GTGTATCATGACGTAGATTCGGGCCC 3

Componentes de PCR - Primers (cont.)

Temperatura de Desnaturalizacin del Primer
(Primer Melting Temperature, Tm)
Temperatura a la que el primer se cae
Se calcula as: [G/C] X 4 + [T/A] X 2 = Tm

Temperatura de desnaturalizacin vs. Temperatura

de apareamiento
La temp. de apareamiento es de 5 a 15oC por debajo de
la temp. de desnaturalizacin.

Hay que usar el espectrofotmetro para comprobar

los stocks del primer
A260 = 1 = 33 g/ml
[primer] = A260 x Dilucin x 33 g/ml

Efectos de la Concentracin - Primers

Titrate [DNA]
Change [primer]

0.4 M
100 10 1 0.1

0.8 M
100 10 1 0.1

RT-PCR
Reverse Transcription PCR (PCR con Transcripcin inversa)
Requiere sntesis previa de ADN a partir de un ARN plantilla
(template).
La transcriptasa inversa es una ADN-polimerasa dependiente de
ARN.
La polimerizacin de ADN puede tener lugar en el mismo tubo de
reaccin o separadamente.

La Higiene en el Laboratorio es MUY importante!

El ARN se degrada rpidamente por nucleasas que hay en tu piel, la
poyata, partculas de polvo, etc..
La RNAsa A es muy estable y ubcua.
Usar reactivos libres de RNAsa en todos los pasos previos a la sntesis de ADN

RNAse - Away para limpiar gradillas, tubos, pipetas, etc...

PCR Cuantitativa (qPCR)

Con frecuencia llamada RT- PCR (aunque se puede confundir Real
Time con Reverse Transcription PCR)
Permite la cuantificacin de molculas de una secuencia especfica de
ADN o ARN en una muestra
Expresin de gnes
purificar ARN y convertirlo en ADNc
tomar muestras biolgicas en nitrgeno lquido, hielo seco o RNAlater
Deteccin de gnes
purificar ARN o ADN segn el organismo
tomar muestras en etanol par la purificacin de ADN

Se puede realizar usando colorante de unin a ADNds (SyberGreen), o

formas diversas de sondas fluorognicas como Taqman.
Probabilidad reducida de falsos positivos puesto que los tubos de ADN
amplificado nunca se abren para realizar geles de agarosa.
Los resultados se obtienen en menos tiempo - no hay geles de agarosa.
Rango dinmico amplio - cuantificacin precisa con ms de 7 rdenes
de magnitud.

qPCR con Colarante SYBER Green

Permite el anlisis de la curva de disociacin
Cebadores especficos
para:
Pseudo-nitzschia fraudulenta
P. multistriata
P. pungens
Protoceratium reticulatum

Anlisis cruzado usando

ADN genmico:
P. calliantha
P. delicatissima
P. fraudulenta
P. multistriata
P. pungens
Protoceratium reticulatum
Alexandrium peruvianum

P. pungens
P. multistriata
Protoceratium
P. fraudulenta
False positive
False positive

Deteccin por qPCR de Microalgas Txicas

de Agua Marina de la Baha Alfaques
Cebadores especficos para el anlisis de Pseudo-nitzschia pungens en 16
muestras de agua
P. pungens
Standards

Samples
Standards

Samples

False Positive

False Positive

Amplification Plot

Dissociation Curve

Ensayos de qPCR TaqMan

Utiliza dos cebadores y una sonda doblemente marcada para deteccin
fluorescente
las dos marcas fluorescentes en la sonda se llaman detector y quencher
el quencher absorbe energa emitida via FRET (Fluorescence Resonant Energy Transfer)
La sonda slo se une al ADN amplificado en una secuencia especfica

Se puede multiplexed usando diferentes marcas flurescentes

Altamente especfico y preciso sobre siete rdenes de magnitud

Puedes disponer de un juego entero diseado para t si se conoce la
secuencia
www.appliedbiosystems.com

El anlisis de las curvas de desnaturalizacin para la deteccin de falsos

positivos no es posible con los ensayos Taqman
Siempre que sea posible disea la sonda de manera que cubra una unin
exon/exon para evitar la deteccin de ADN genmico

Componentes de TaqMan PCR

Taq ADN Polimerasa
Primers
Sonda marcado doblemente
(Taqman probe)
dNTPs
Energa de excitacin
transferida del fluorforo
verde al rojo
Tras la hidrlisis de la
sonda mediante la actividad
exonucleasa 5- 3 de la
polimerasa de ADN Taq, el
fluorfor verde emite luz

primer F

Denature

primer F

primer F

Anneal

Extend

Higiene en el Laboratorio de Diagnstico

Realiza cada operacin por separado y en reas separadas
Preparacin del cocktail
Preparacin de la muestra de ADN
Adicin del ADN a la PCR
Ejecucin de la PCR
Carga del gel de agarosa / documentacin del gel

Cambia de guantes entre tareas

Siempre incluye un control de slo reactivo
Asigna tareas especficas a las pipetas
Preparacin del cocktail
Preparacin de ADN
Carga del gel

Contaminacin

Rompe el ciclo!
Limpia gradillas & superficies entre usos
La contaminacin de la PCR se autoperpetua

Amplificacin

A Beginners Guide to Molecular

Biology for Aquaculture

Acknowledgements:
Carles Garcia
Nacho Fernandez
Carmen Lopez
Guillermo Guerao
Enric Gisbert
Miguel Angel Lopez
Guiomar Rotllant
Ana Roque
Investigant el present, apropant el futur www.irta.es

Telescopio Espacial Hubble 2006:

Nbula en Doble Hlice

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