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Cultivo in Vitro Casero
Cultivo in Vitro Casero
CASERO
OBJETIVOS
-
FUNDAMENTO TERICO
El cultivo in vitro el desarrollo y crecimiento de plantas o partes de
MATERIAL
Material de
Laboratorio
Leja.
cido clorhdrico.
Hidrxido sdico.
Lavajillas.
MEDIO DE CULTIVO: FRMULA DEL PLTANO (para 1
litro)
100g de pltano maduro hecho pur o licuado
10 g de agar-agar.
15 g de azcar.
900 ml de agua destilada.
1,2 g Tiamina *
Cpsula semillas orqudea u otra semilla.
Reactivos
Material biolgico
*4 comprimidos de algn remedio compuesto de Tiamina (vitamina B1) de 300 mg. Puede ser
substituido por complejos polivitamnicos (Teragram M o Supradyn).
MTODO
Poner en una olla los 180 ml de agua destilada, 20g de pltano maduro hecho pur o licuado, 1 g
de azcar y 0.24 g Tiamina. Una vez disuelto se aaden 2 g de agar agar y se hierve el medio. (lo
ideal es hacerlo en el microondas o en un hornillo con agitacin continua para que el agar no se
estropee). Si se hace en una olla, usar una cuchara de madera o de plstico hasta disolver todos
los componentes.
2.
Mide el pH y ajstalo (usa HCL para disminuirlo y NaOH para incrementarlo). Debe de quedar
entre 5.5 y 6.
3.
Distribuye el medio de cultivo en los tubos de ensayo y frascos, para ello utiliza un embudo de
vidrio. Ten especial cuidado en que el medio de cultivo no entre en contacto con la apertura de
los frascos, ya que esto puede ayudar a la contaminacin por hongos y bacterias.
4.
Vierte en cada frasco en el fondo una cantidad de preparado de ms o menos 1 centmetro (45 a
50 ml). Por cada litro de preparado podemos llenar ms o menos 20 frascos.
c)
Los frascos se esterilizan en una olla a presin, la cual se puede considerar como un pequeo
autoclave. Nos sirve para esterilizar medios o material sometindolos a temperatura y presin
elevadas. Los pasos para la esterilizacin son los siguientes:
Se pone un pedazo de tela en el fondo de la olla (un trapo cualquiera) para impedir as que los
frascos toquen el fondo de la olla y se revienten con el calor.
Se aaden dos o tres centmetros de agua.
Colocamos los frascos (con el medio) tapados, pero sin cerrar del todo, la tapadera debe
quedar suelta o de lo contrario los botes acumularn presin y estallarn.
Cerrar y calentar en un fogn a fuego fuerte hasta que la pesa comience a moverse y liberar
vapor o el medidor marque 15 PSI.
Dejar a 15 PSI unos 20 o 30 minutos a fuego suave.
Apagar una vez trascurrido el tiempo y esperar a que la olla baje y est totalmente enfriada.
No se debe abrir la olla antes porque la diferencia de presin o temperatura har que entre
aire no estril a los frascos, creando un peligro de contaminacin.
Se dejan enfriar hasta que el medio gelifique (se solidifique) por accin del agar. Con guantes
desinfectados con alcohol, se terminan de cerrar los botes para evitar la entrada de aire no estril.
Los frascos se pueden guardar por varios das y meses en la nevera o congelados.
Abre cuidadosamente un poco el bote, sin destapar el bote del todo, y coloca las semillas sobre el
medio de cultivo. Este paso debe hacerse cerca de la llama del mechero. Cierra rpidamente la tapa
para que no entre ningn microrganismo.
-Una vez se han puesto de 4 o 5 semillas por bote. Se cierran los frascos hermticamente cerca del
mechero y se sellan con cinta adhesiva o film de parafina. Etiqueta los botes con la fecha y tipo de
semilla cultivado, tambin puedes anotar los nombres de los componentes del grupo.
-Estos botes se mantienen en oscuridad hasta que se observe la germinacin de la semilla, que puede
tardar de uno a diez das.
- En ese momento, se colocan los frascos en un sitio con bastante luz, pero sin sol directo a
temperatura constante (de unos 22-24 C) evitando una exposicin directa al sol, sin embargo son
necesarias de 16 a 18 horas de luz al da, as pues, ser preciso prever una iluminacin de apoyo
como un fosforescente.
Se debe esperar aproximadamente entre 5 y 6 semanas (dependiendo de la especie) hasta que
se vea la primera alfombra verde sobre el medio de cultivo. Si germinan demasiadas plantas en una
botella o frasco hay que trasplantar las plantitas a otros frascos. Tambin hay que decir que muchas
no sobreviven. El trasplante debe hacerse con las mismas medidas de higiene que el procedimiento
anterior y dividindolas en varios frascos con las mismas condiciones. Hay que tener mucha
paciencia y calma y no tocar mucho los botes de
cultivo.
Despus de un ao o ao y medio se pueden
retirar las plantitas de los frascos y sembrarlas en
macetas. Como sustrato se recomienda usar musgo
serrano, con arena de ro y fina. Es conveniente
esterilizar este nuevo medio con agua hirviendo y
dejar enfriar. El momento de sacar las plantitas de los
frascos es el ms peligroso ya que fcilmente pueden
contaminarse con hongos del ambiente. Conviene
baar las plantitas con un funguicida antes de
sembrarlas.
La espera y la paciencia te dar una gran satisfaccin de conseguir germinar la semilla de la
orqudea, despus para ver su flor tardars varios aos en verla. Una catleya tarda entre 6 y 8 aos
en dar flor desde que se sembraron sus semillas. Una Phalaenopsis 4 aos pero es un sueo llegar a
tener tantas orqudeas y saber que el tiempo que le has dedicado ha valido la pena.