Identificacin Bioqumica

6 - PRUEBAS BIOQUMICAS
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6. PRUEBAS BIOQUMICAS PARA IDENTIFICACIN BACTERIANA

6.1. INTRODUCCIN
La identificacin bacteriana se realiza tras el estudio de las caractersticas tintoriales,
morfolgicas y bioqumicas de los microorganismos. La identificacin bioqumica se basa en
la habilidad de las bacterias de producir enzimas fcilmente detectables, en las caractersticas
metablicas especficas de cada microorganismo, etc. Con este fin, existen en el mercado
una enorme variedad de medios de cultivo diseados no slo para permitir el crecimiento y
multiplicacin de los microorganismos, sino tambin para inhibir los de otros (medios
selectivos) o resaltar determinadas caractersticas metablicas (medios diferenciales).
Como la mayor parte de los seres vivos, las bacterias son capaces de modificar el ambiente
que las rodea, captando sustancias necesarias para su multiplicacin y liberando al medio
productos de desecho, enzimas, exotoxinas, etc. Las interacciones que cada tipo bacteriano
establece con el entorno son propias y caractersticas. Esta especificidad depende del
genotipo de la bacteria y se expresa en un determinado equipo enzimtico. La caracterizacin
de dichas enzimas es una til herramienta para la identificacin y clasificacin bacteriana.
6.2. ACTIVIDAD BIOLGICA
Un ser vivo se define principalmente por desarrollar una serie de actividades biolgicas,
durante su ciclo vital. sta actividad biolgica consiste en un variedad de reacciones fsicoqumicas que transcurren en el marco de las clulas y denominamos como bioqumica.
El conjunto de reacciones que puede realizar un ser vivo se llama metabolismo y engloba
tanto las reacciones de degradacin (catabolismo) como de sntesis (anabolismo).
Las reacciones parten de una base denominada nutriente o sustrato, a partir de la cual se
obtiene la energa y las molculas necesarias para formar sus propios compuestos.
Las bacterias forman un grupo muy heterogneo, ya que la diversidad de especies existentes,
pueden realizar todo tipo de metabolismo. Algunas especies poseen dos tipos de
metabolismo diferente que utilizan facultativamente, dependiendo de la abundancia nutritiva
del medio.
Requerimientos qumicos
Carbono. Los microorganismos son extraordinariamente diversos tanto respecto a la clase
como al nmero de compuestos orgnicos que pueden usar como fuente principal de carbono
y energa. Esta diversidad, se manifiesta en el hecho de que no hay ningn compuesto
orgnico que exista en la naturaleza que no pueda ser utilizado como fuente de carbono y
energa por algn organismo.
Los organismos que realizan la fotosntesis y las bacterias que obtienen la energa a partir de
la oxidacin de compuestos inorgnicos (quimiolittrofas) usan tpicamente la forma mas
oxidada del Carbono, el C02, como nica o principal fuente de Carbono celular.
70
Todos los dems organismos obtienen el carbono principalmente a partir de nutriente

orgnicos.
Algunas bacterias son capaces de utilizar sustancias muy sencillas como cido actico,
alcohol, citrato sdico, etc. En otras ocasiones, la mayor parte de los casos, la fuente de
carbono corresponde a azcares en forma de mono o disacridos, como glucosa, lactosa,
maltosa, etc., e incluso hay microorganismos que pueden utilizar azcares ms complejos
para obtener energa, como es el caso del almidn.
Otros microorganismos pueden crecer a expensas del metano, benceno e, incluso,
hidrocarburos como fuente de energa.
Por ltimo, existen especies, como por ejemplo Pseudomonas, que pueden utilizar como
fuente de energa un gran nmero de componentes hidrocarbonados diferentes.
En general, conocer el tipo de azcar utilizado por cada bacteria es muy til para su
identificacin bioqumica y consiguiente clasificacin taxonmica.
Nitrgeno, azufre, fsforo
El nitrgeno y el azufre se encuentran en los compuestos orgnicos de la clula
principalmente en forma reducida como grupos amino y sulfhidrilo. La mayora de los
organismos fotosintticos, as como muchas bacterias no fotosintticas y hongos, asimilan
estos dos elementos en estado orgnico oxidado, como nitratos y sulfatos, su utilizacin
implica, pues, una reduccin preliminar.
Los requerimientos de nitrgeno y azufre pueden satisfacerse tambin con frecuencia, con
nutrientes orgnicos que contengan estos dos elementos en combinacin orgnica reducida
(aminocidos o productos ms complejos de la degradacin de las protenas, como las
peptonas). Existen muchos tipos de peptonas y son excelentes fuentes de nitrgeno. Entre las
ms frecuentes y conocidas se encuentran los extractos de levadura que son extractos
hidrosolubles preparados a partir de un lisado de levadura que se utiliza en muchos medios de
cultivo.
Fsforo, la fuente habitual de este elemento lo constituyen los fosfatos.
Iones metlicos (K, Mg, Fe, Zn, Mn, Co, etc.)
RESPIRACIN. El oxgeno se encuentra a disposicin de las clulas en forma de agua. Est
contenido adems en el anhdrido carbnico y en muchos compuestos orgnicos. Muchos

microorganismos necesitan adems oxgeno molecular (O2).
En funcin del requerimiento de oxgeno para la respiracin celular:
a. aerobios obligados o estrictos, slo pueden obtener energa mediante la respiracin y
necesitan O2. Entre los microorganismos que son aerobios estrictos, algunos crecen
mejor a presiones parciales de oxgeno considerablemente mas bajas que las presentes
en el aire. Se denominan mcroaerfilos.
b. anaerobios obligados, slo crecen en un medio exento de O2, el O2 es txico para
ellos.
71
c. anaerobios facultativos crecen tanto en presencia como en ausencia de O2. Entre

ellos hay que distinguir dos tipos:
aerotolerantes, bacterias del cido lctico, aunque pueden crecer en
presencia de O2, no pueden utilizarlo, sino que obtienen energa
exclusivamente por fermentacin.
anaerobias facultativas (Enterobacteriaceas) y muchas levaduras pueden
obtener energa tanto por respiracin (en presencia de O2), como por
fermentacin (en ausencia de O2).
6.3 RESPIRACIN Y FERMENTACIN
Una vez que la glucosa se ha degradado a cido pirvico, este cido puede seguir oxidndose
por la va de la respiracin o la fermentacin.
La RESPIRACIN (fosforilacin oxidativa) es un proceso, en el que funciona una cadena
transportadora de electrones mediante coenzimas que se reducen, hasta llegar a una molcula
inorgnica, que acta como aceptor final de electrones (generalmente el O2). La oxidacin
produce energa en forma de ATP.
Respiracin aerbica se llama as cuando el aceptor final de hidrgeno (electrones) es el
oxgeno molecular O2.
Respiracin anaerbica es aquella en la que el aceptor final de hidrgeno (electrones) es
una molcula inorgnica distinta del oxgeno molecular, como iones nitrato, sulfato o
carbonato.
FERMENTACIN Este proceso se inicia a partir del cido pirvico, tiene como
caractersticas fundamentales:
1. No requiere oxgeno (aunque a veces puede ocurrir en su presencia)
2. No necesita cadenas transportadoras de electrones (ciclo de Krebs)
3. Utiliza molculas orgnicas como aceptor final de electrones
4. Libera energa a partir de azcares u otras molculas orgnicas como aminocidos,
cidos orgnicos, etc.
5. Tiene un rendimiento menor que la respiracin
En la respiracin toda la energa de la glucosa se aprovecha, ya que los productos finales
CO2 y H2O estn exentos de energa. En cambio, en la fermentacin; al dar como productos
finales CO2 y un compuesto orgnico (etanol, cido lctico) todava dotado de energa,
significa un aprovechamiento incompleto de las posibilidades energticas de la glucosa.
La fermentacin es un sistema utilizado frecuentemente por algunos m.o. como, levaduras y
determinadas bacterias). Tambin en algunas clulas animales y plantas en condiciones
especiales.
Algunas clulas (anaerobias estrictas) realizan la fermentacin porque carecen de la
dotacin enzimtica precisa para la respiracin; pero es frecuente que esta se produzca
cuando las clulas no tienen a su disposicin el oxgeno (anaerobia facultativas). Esta
circunstancia se da en las levaduras.
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Las levaduras actan sobre el mosto, degradando la glucosa por va respiratoria. Cuando en
los lagares, por efecto de la acumulacin del CO2 encima del mosto, el aire no entra en
contacto con la levadura, se inicia entonces la fermentacin de la glucosa con la
correspondiente formacin de alcohol.
Hay que remarcar, respecto al papel que desempea el oxgeno en la respiracin, que el
proceso respiratorio, al igual que la fermentacin, es un proceso de oxidacin, pero en el que
esta oxidacin sucede no por ganancia de oxgeno, sino prdida de hidrgeno. El oxgeno es,
simplemente, el aceptor final de hidrgeno en la respiracin, como lo son otros compuestos
orgnicos en la fermentacin.
Metabolismo: Los conceptos heterotrofo y autotrofo pensados para denominar los tipos
de nutricin de animales y plantas, no son suficiente para caracterizar la variedad de tipos
nutricionales que se dan en los microorganismos. Los tipos nutricionales en este reino, se
clasifican segn sea:
a. Fuente de energa
Fototrofas (Foto) obtienen la energa directamente de la luz.
Quimiotrofas (Quimio) obtienen la energa por reacciones red-ox
degradando sustancias independientemente de que realizen respiracin
o fermentacin.
b. Dadores de hidrgeno y fuentes de carbono
Organotrofos Utilizan sustancias orgnicas como dadores de
hidrgeno
Litotrofos Utilizan dadores de hidrgeno inorgnicos (H2, NH3, H2S,
S, CO, Fe2+...)
Estos trminos organotrofos y litotrofos sustituyen a los tradicionales:
Autotrofo obtienen la mayora del carbono por fijacin del CO2.
Heterotrofo extraen el carbono celular de sustancias orgnicas.
Energa
Foto (luz)
Quimio
Fuente de C
auto (CO2)
Hetero
dador de electrones
Lito (comp. inorg.)
rgano (comp. org)
En general, basta con indicar el proceso de obtencin de energa y el dador de hidrgenos.

1. Foto lito trofoh Fotoautolitotrofo (plantas, cianobacterias, bacterias rojas del S)
2. Foto rgano trofo h Fotoheterorganotrofo (Piloodobacterias, bacterias rojas no S)
3. Quimio lito trofo h Quimioautolitotrofo (bacterias nitrificantes)
4. Quimio rgano trofo h Quimioheterorganotrofo (animales, hongos, bacterias)
(1 y 4 ------------> Eucariotas)
73
Bacterias fototrficas. La capacidad de utilizar la luz como fuente de energa para el

crecimiento es propia de dos grupos de bacterias:
1. Cianobacterias. Utilizan agua como dador de hidrgenos y liberan oxgeno en
presencia de la luz solar (fotosntesis oxignica).
2. Bacterias rojas y verdes. No pueden utilizar el H2O como dador de hidrgenos, sino
que necesitan un dador de [H] fuertemente reducido (H2S, H2, materia orgnica).
Como consecuencia estas bacterias no liberan oxgeno durante la fotosntesis
(fotosntesis anoxignica). Se las considera como reliquias de los primeros tiempos de
la fotosntesis. Son bacterias unicelulares acuticas , de color rojo, naranja o verde, en
funcin del contenido que posean de pigmentos fotosintticos: bacterioclorofilas y
carotenoides.
74
En las zonas anaerbicas de los lagos (10-30 m. de profundidad) se da un crecimiento

estacional de las bacterias rojas del azufre por darse condiciones para su crecimiento:

Radiacin solar en la zona del espectro azul, verde-azul (450-500 nm) que
corresponde a la zona de absorcin de los carotenoides.
H2S (descomposicin sulfatos y protenas)
CO2 y materia orgnica.
El metabolismo de las bacterias fototrficas representa el grupo de organismos

metablicamente ms verstil. Hay grupos con capacidades de desarrollo diversas:

anaerbicamente con luz y aerbicamente en la oscuridad

anaerbicos estrictos y fototrofos obligados
Dador de hidrgenos: H2S, H2, S (segn grupos).
Fuente de carbono: CO2, materia orgnica (segn grupos).
Bacterias aerbicas quimiolitotrofas.

Bacterias de suelos y aguas con capacidad de utilizar compuestos o iones inorgnicos como
dadores de hidrgenos y CO2 como fuente de carbono.
La Nitrobacterias (Nitrosomas, Nitrobacter),
son bacterias nitrificantes que oxidan el NH4+ (liberado en el proceso de descomposicin
microbiana de la materia orgnica) a NO2- y ste a su vez de NO2- a NO3NH3 ------ -----> NO2-
Nitrosomas
NO2- -----------> NO3-
Nitrobacter
S0, S2-, S2O32--------------> SO42-
Thiobacillus thiooxidans
Fe2+ --------------> Fe3+
Thiobacillus ferrooxidans
La obtencin de energa tiene lugar, por lo general, a travs de la respiracin con O2 y slo
escasos m.o. pueden utilizar NO3-, NO2-, N2O como aceptor de electrones (R.anaerobia).
Fijacin del nitrgeno molecular: Solo algunos procariotas son capaces de captar y fijar el
nitrgeno atmosfrico (N2). En parte en formas de vida libre, en parte en simbiosis con
plantas superiores, pueden pasar al N2 inerte a una combinacin orgnica, incorporndolo
directamente (Rhizobium) o a travs de las sustancias celulares a la protena del suelo.
N2 + 8 [H] -------> 2 NH3 + H2
La fijacin simbitica del N2 por leguminosas (Rhizobium) produce 100-300 Kg N/(Ha.a.)
Los microorganismos de vida libre fijadores de N2 aportan al suelo entre 1-3 Kg. N/(Ha.a.)
Las lluvias pueden aportar al suelo entre 3-30 Kg N/(Ha.a.)
75
Respiracin anaerobia: En sedimentos, lagunas y suelos permanentemente inundados

(condiciones anxica) se desarrollan bacteria que utilizan como fuente de carbono y dadores
de hidrgeno los compuestos producidos por las bacterias fermentadoras, o que estas no han
utilizado (final cadena alimentaria).

NO3sulfato, azufre
CO2, CO32Fe3+
-------> N2, N2O (xido nitroso)

-----> H2S
-------> CH4, CH3COOH
--------> Fe2+
Los respiradores anaerbicos tienen gran importancia por:

Ciclos de los elementos y mantenimiento de los equilibrios en la biosfera.
Respiracin anaerbica como forma predominante en las primeras etapas de
formacin de la biosfera en la Tierra (almacenamiento de carbono orgnico en los
sedimentos arcaicos).
Cuando los campos no estn bien aireados se produce un proceso de desnitrificacin
por la respiracin de los nitratos.
Tipos de fermentaciones anaerbicas puesto que la vida surgi en una atmsfera carente de
oxgeno, la fermentacin anaerbica constituye el mecanismo biolgico mas primitivo
destinado a obtener energa de los alimentos.
6.4 VAS FERMENTATIVAS DEL CIDO PIRVICO:
1. Lctica. Se produce cido lctico en la fermentacin del pirvico.
a. Homolctica se produce nicamente cido (Lactobacillus, Streptococcus en la
produccin de derivados de la leche1 : yogur, queso, leche cida..., )
b. Fermentacin heterolctica. aparecen ademas del cido lctico, otros
compuestos como etanol o dixido de carbono.
I. cido mixta.
II. Butanodilica
1. Fermentacin alcohlica el cido pirvico se transforma en etanol y dixido de
carbono (tpica en levaduras muy rara en bacterias). Esta fermentacin la realizan
levaduras del tipo Saccharomyces y, dependiendo de la cepa de levadura y del
proceso de fabricacin, se originan gran variedad de bebidas alcohlicas: wisky,
cerveza, sidra, vino... La fermentacin de los polisacridos de la harina en el proceso
de fabricacin del pan es tambin un ejemplo de fermentacin alcohlica. El dixido
de carbono es el responsable del ahuecamiento de la masa y tanto el como el alcohol
desaparecen en el proceso de coccin.
2. Fermentacin propinica. Va lenta. (Corynebacterium)
3. Fermentacin butrica - butlica (tpica de anaerobios)
4. Fermentacin ptrida o PUTREFACCIN
Consiste en la desintegracin de las grandes molculas proteicas de los residuos vegetales
y cadveres animales llegando a formarse aminocidos. En este proceso se liberan
gases como el amonaco, dixido de carbono, hidrgeno, metano y otros de olor
ftido, como el sulfuro de hidrgeno, el nidol y el escatol. se producen tambin
ptomanas (muy txicas).
la enzima -galactosidasa permite a estos m.o. hidrolizar la lactosa en glucosa-galactosa
76
Fermentacin actica
El trmino fermentacin se suele utilizar en un sentido ms amplio, al aplicarlo tambin, para
referirse a una serie de procesos en los que s interviene oxgeno, aunque el producto final es
un compuesto orgnico y por tanto no hay degradacin completa de la materia orgnica
(fermentaciones oxidativas).
La fermentacin actica la realizan bacterias del gnero Acetobacter transformando el etanol
en cido actico, por un proceso de oxidacin en presencia de oxgeno (vino en vinagre).
Los m.o. aerbicos que producen el vinagre forman una telilla sobre la superficie del vino,
para poder permanecer en contacto con el aire.
6.5. CARCTERES BIOQUMICOS.
Basadas en el estudio del metabolismo de diferentes tipos de sustrato, las reacciones
bioqumicas son un carcter taxonmico, que permite la clasificacin de las bacterias por su
posesin de enzimas.
1.
ENZIMAS EXTRACELULARES:
Las biomolculas de estructura polimerizada como almidn, protenas y lpidos, tienen

un peso molecular excesivo para atravesar la membrana celular. Para que la clula
pueda utilizar dichas sustancias como sustrato, ser preciso que disponga del equipo
enzimtico adecuado.
Estas molculas deben ser primero hidrolizadas por enzimas extracelulares especficas,
en sus respectivas unidades de construccin. Estas molculas de bajo peso molecular
podrn ser entonces transportadas al interior de las clulas y utilizadas en el
metabolismo celular.
77
Almidn ------- amilasa --------> Maltosa ---------- maltasa ----------> Glucosa

Triglicridos ---- lipasas --------> cidos grasos + glicerol
Protenas -------- proteasas (protelisis) --------> Peptonas ----------> Aminocidos
2. HIDRATOS DE CARBONO
A. Polisacridos: Almidn: La amilasa hidroliza el almidn. si aadimos al
medio una pequea cantidad de Lugol, este reacciona con el almidn, dando
color azul intenso. Alrededor de las colonias que poseen amilasa, aparece una
zona clara que indica que el almidn ha sido consumido.
B. Disacridos. Lactosa: La bacterias que poseen la encima -galactosidasa son
capaces de desdoblar la lactosa (medios Mc Conkey, KIA...) en glucosa y
galactosa. La glucosa es fermentada y acidifica el medio. La disminucin del
pH del medio se evidencia por el uso de indicadores. Las bacterias que carecen
de la enzima galactosidopermesasa dan fermentacin tarda de la lactosa
(prueba ONPG2).
C. Monosacridos Capacidad de metabolizar (GLU, ARA3).
3.
PRTIDOS.
a. Protenas completas: Gelatina. Protena derivada del colgeno, uno de los
componentes del tejido conjuntivo. La enzima gelatinasa hidroliza la gelatina
y la lica, sobre todo en la superficie del medio. La prueba se realiza a 22 C
(la gelatina funde a 30 C y dara falsos "+")
b. Aminocidos. Se pueden degradar de tres formas:
I. Desaminacin: Eliminacin del grupo amino (-NH2). La prueba de la
fenilalanina consiste en desaminar este aminocido (fenilalanina
desaminasa) dando cido fenilpirvico. Aadiendo FeCl3 forma un
complejo verde intenso.(TDA 4)
II. Descarboxilacin: Ruptura del grupo carboxilo (-COOH), por la
enzima descarboxilasa, producindose la alcalinizacin del medio y
formacin de CO2. Son importantes las descarboxilaciones
anaerbicas. Aminocidos lisina 5, ornitina 6 .
ONPG - Las bacterias que poseen -galactosidasa pero no galactosidopermeasa dan (-)
en la prueba de la lactosa. La ONPG (ortonitrofenolgalactosido) atraviesa fcilmente la
pared bacteriana y es desdoblada por la -galactosidasa en galactosa ms un radical de
color amarillo. Se utiliza esta prueba bioqumica para la identificacin de las bacterias
fermentadoras tardas de la lactosa (entre 2-15 das en fermentar la lactosa).
3
GLU, ARA capacidad de metabolizar los monosacridos glucosa y arabinosa
4
TDA- Se detecta la presencia de la enzima TDA (triptofano desaminasa)
La enzima produce la desaminacin del sustrato (triptfano)
Identificacin: la adicin de FeCl3 da verde obscuro si esta presente TDA
5
LDC - En la degradacin proteica intervienen numerosos hongos y bacterias (Bacillus
cereus, Mycoides, Pseudomonas, Proteus vulgaris...). Las bacterias que poseen la
enzima lisina descarboxilasa pueden catabolizar anaerbicamente aminocidos
(lisina) segn la siguiente reaccin de descarboxilacin:
Lisina H2N - (CH2)4-CHNH2-COOH ------->H2N-(CH2)4-CH2-NH2 (cadaverina) + CO2
78
III. Degradacin total del aminocido (descarboxilacin +

desaminacin)
Indol 7
H2S 8
a. Derivados de aminocidos: Urea 9
1. LPIDOS La lipasa acta sobre los lpidos dando cidos grasos . Las sales de estos
cidos grasos se emplean como nica fuente de carbono (agar citrato10) . La
produccin de sustancias alcalinas provocan el viraje del azul de bromotimol
(amarillo pH<6 y azul pH>7,6)
2. VAS DE OBTENCIN DE ENERGA:
a. Respiracin (enzimas respiratorios: Oxidasa11, Catalasa12, reduccin de
nitratos13)
b. Fermentacin (amplia variedad de tipos)
I. cido mixta. Prueba de RM
II. Butanodilica. Prueba VP
ODC - Degradacin anaerbica de aminocidos. La enzima ornitina descarboxilasa

permite degradar:
Ornitina ------(descarboxilacin)---------->H2N-(CH2)4-NH2 (putrescina) + CO2
7
IND - La degradacin total del aminocido triptfano por la enzima triptofanasa
Triptofano-------descarboxilacin + desaminacin-------> indol+ piruvato+amonaco
Indol + p-dimetilaminobenzaldehdo (R. Kovaks) ----------------> anillo color rojo
8
H2S - La fermentacin de aminocidos sulfurados: cistena, metionina (generalmente se

aade al medio de cultivo una fuente adicional de azufre en forma de tiosulfato de
sodio) puede dar H2S. Al unirse a las sales de hierro da un precipitado de color negro
9
URE - H2N-CO-NH2 -----------------ureasa------------> CO2+NH3+H2O (+ rojo fenol)
10
CIT. La capacidad de metabolizar lpidos se evidencia utilizando cidos grasos (o mejor sus
sales) como nica fuente de carbono. La produccin de sustancias alcalinas provocan el viraje
del azul de bromotimol (amarillo pH<6 y azul pH>7,6)
11
OX - Deteccin de la enzima respiratoria citocromo c. Realizar la prueba de la Oxidasa
con una colonia, en un papel de filtro, antes de empezar con la galera. De esta forma si
da un resultado positivo, se descarta el grupo de enterobacterias. El test API 10S est
pensado para identificar enterobacterias y otros bacilos Gram (-)
12
Catalasa Capacidad de eliminar el perxido de hidrgeno 2 H2O2 --------> H2O + O2
13
NO2 - Detecta la presencia de la enzima nitratoreductasa que permite a las bacterias

reducir los nitratos a nitritos (aceptor final de electrones)
NO3- -------> NO2- ---------> N2, NH3, N2O3 Se visualiza mediante el reactivo de
Griess (-naftilamina y cido sulfanlico) (+ color rojo).
79
1. OTRAS PRUEBAS BIOQUMICAS

a. Coagulasa: Lo poseen las bacterias que coagulan el plasma, al inhibir el
efecto anticoagulante del EDTA o del oxalato presente en el plasma.
b. DNAasa: La desoxiribonucleasa desdobla el DNA en sus nucletidos
constituyentes.
c. Hemlisis: Capacidad de producir la lisis de los hemates de la sangre.
d. Motilidad Observacin de la difusin lateral de la turbidez, en la siembra por
picadura en un tubo con agar blando (0,4 % de agar).
e. Produccin de pigmentos: Determinados medios estimulan a las bacterias a
producir pigmentos.
6.6
DESCRIPCIN DE ALGUNAS PRUEBAS BIOQUMICAS.
A.
PRESENCIA DE OXIDASA
Fundamento
La prueba se basa en comprobar la existencia de protenas citocromo c que forman parte de
algunas cadenas transportadoras de electrones propias del metabolismo respirador. La
presencia de citocromo c se manifiesta por la capacidad del colorante tetrametil-pfenilendiamina de oxidarse al ceder electrones al citocromo c, apareciendo una coloracin
azul (forma oxidada). Fig. 6.1
Esta prueba permite diferenciar el grupo Enterobacteriacea (que carece de citocromo c) del
gnero Pseudomonas (que posee citocromo c).
Reactivos
Tetrametil-p-fenilen diamida en solucin de alcohol isoamlico al 1,1 %.
El reactivo, una vez preparado, no tiene color o es ligeramente rosado. A causa de la
capacidad de autooxidacin que tiene, se debe guardar a 4 C y preservarlo de la luz.
Procedimiento
1. Sembrar en estra escocesa, para obtener colonias aisladas, dos placas de agar sangre
o TSA (no utilizar medios glucosados) con inculos de Escherichia coli y
Pseudomonas aeruginosa.
2. Incubar a 37 C durante 48 h.
3. Tomar una colonia y extenderla encima de un papel de filtro Whatman n 1 (utilizar
asa de platino, pipeta de plstico, torunda algodn impregnada, palillo de madera).
4. Dejar caer una gota de reactivo sobre la colonia a determinar.
5. Las bacterias productoras de oxidasa, oxidan rpidamente el reactivo y la colonia se
vuelve de color violeta (durante los primeros 30-60 seg)
80
B. PRUEBA DE LA CATALASA
Fundamento. En los ambientes acuosos, que contienen oxgeno disuelto, como el citoplasma
de las clulas, aparecen formas txicas derivadas del oxgeno. Las bacterias que viven en
ambientes aerobios necesitan un equipo enzimtico capaz de neutralizar estas formas txicas.
Entre estas enzimas se encuentra la catalasa, que convierte el perxido de hidrgeno en agua
y oxgeno molecular.Fig. 6.1. Son ejemplos de catalasa positivo Escherichia coli y catalasa
negativo Enterococcus faecalis.
Procedimiento
1. Tomar una colonia con un palillo de madera y depositarla en el centro de un porta.
2. Aadir una gota de perxido de hidrgeno (3%).
3. Si la reaccin es positiva, se produce inmediatamente un apreciable burbujeo de O2.
C. PRUEBA DEL INDOL
Fundamento. Esta prueba se emplea para detectar la presencia de la enzima triptofanasa en
las bacterias. Esta enzima degrada el aminocido triptfano a indol, compuesto que se
determina en el ensayo. Para realizar esta prueba, la bacteria se cultiva en un caldo de triptona
con NaCl al 0,5 % (medio especialmente rico en triptfano). Si la bacteria tiene la enzima
triptofanasa, al aadir al medio el reactivo de Kovacks, este formar un complejo con el indol
y se producir un anillo de color rojo en la superficie del caldo y la prueba ser considerada
positiva. El genero Enterobacter da negativo en la prueba del indol y Escherichia coli
positivo. Fig 6.1
Procedimiento
1. Sembrar en 2 tubos con 5 ml. caldo de triptona (BTW) sendos inculos de
Enterobacter y Escherichia coli.
2. Incubar 24 h. a 37 C
3. Aadir a 1 ml. de los tubos incubados 5 gotas de reactivo de Kovacks, dejndolo caer
por la pared interior del tubo.
Lectura de resultados. En caso dudoso incubar hasta un mximo de 5 das.
81
Fig. 6.1
D-E. PRUEBAS DEL ROJO DE METILO (RM) Y VOGES-PROSKAUER (VP).
Fundamento. Las bacterias que en anaerobiosis fermentan los azcares pueden realizar esto
por distintas rutas. Las enterobacterias son anaerobios facultativos que utilizarn la glucosa
en dos fases: primero la metabolizarn aerobiamente, consumiendo rpidamente el oxgeno
del medio, para, en segundo lugar, continuar metabolizndola por va anaerobia
(fermentacin). Esta fermentacin puede ser de dos tipos:
a. Fermentacin cido-mixta. Los productos finales son cidos orgnicos (frmico,
actico, lctico y succnico) y etanol. Fermentacin caracterstica de los gneros
Escherichia, Salmonella, Shigella, Proteus, Yersinia.
b. Fermentacin butiln-gliclica. Los productos finales son compuestos neutros como
el butanodiol y el etanol, producindose acetona como intermediario. Fermentacin
caracterstica de los gneros Enterobacter, Serratia y la mayora de especies Erwinia.
La liberacin de cidos orgnicos en el primer tipo de fermentacin (cido-mixta) generar
un acusado descenso del pH que podr ser detectado aadiendo al medio un indicador de pH
como el rojo de metilo (rojo a pH de alrededor 4,0). Si la fermentacin que se ha llevado a
cabo es del tipo butiln-gliclica, la produccin de acetona puede ser detectada aadiendo al
medio KOH y alfa-naftol (prueba Voges-Proskauer) que reaccionar con este compuesto
produciendo un color rojo caracterstico.Fig. 6.2 y 6.3.
82
Fig. 6.2. Fermentacin cido-mixta
Fig. 6.3 Fermentacin butano-dilica
83
Prueba del Rojo de metilo (RM).

Procedimiento:
1. Sembrar en 2 tubos con 5 ml. de de caldo RMVP, sendos inculos de Enterobacter
aerogenes y de Escherichia coli.
2. Incubar 48-72 h a 37 C.
3. Aadir a 1 ml. de los tubos incubados cinco gotas de rojo de metilo.
4. Observar el color resultante: En caso de duda incubar 48 h. ms.
5. Interpretacin: El medio de cultivo toma color rojo: (+). El medio permanece amarillo
o color amarillo naranja (indica que hay productos cidos dbiles): (-)
Prueba de Voges-Proskauer
Glucosa --> c. pirvico -->Acetona --->Diacetilo ---->Complejo rojo + KOH (aire)+ naftol
Procedimiento:
1. Sembrar en 2 tubos con 5 ml. de de caldo RMVP, sendos inculos de Enterobacter
aerogenes y de Escherichia coli.
2. Incubar 48 h a 37 C
3. Aadir a 1 ml. de los tubos incubados 10 gotas de -naftol al 5 % y 10 gotas de KOH
al 40 % (por este orden)
4. Agitar para mezclar y colocar los tubos en posicin de mxima inclinacin durante
10-15 min. (facilita la difusin del O2 atmosfrico).
5. Observar a las 2, 12 y 24 horas.
6. Observar el color resultante: Interpretacin: Aparicin del color rosa eosina: (+).
En caso de duda incubar 48 h. ms.
Los productos finales neutros (butanodiol y en menor cantidad etanol) predominan sobre los
cidos; como consecuencia, la cantidad total de cido que se forma por mol de Glucosa
fermentada es considerablemente ms pequea en una fermentacin butanodilica que en una
fermentacin cido-mixta.
Productos de la fermentacin de glucosa por bacterias entricas

PRODUCTOS, MOLES POR CADA 100 MOLES DE GLUCOSA
FERMENTADA
FERMENTACIONES CIDOFERMENTACIONES
MIXTAS
BUTANODILICAS
Esch Aeromonas
Vibrio
Enterobacter Serratia
erich punctata
cholerae
aerogenes
marcescens
ia
coli
Etanol
2,3 butanodiol
cido actico
cido lctico
cido succnico
cido frmico
H2
CO2
Total cidoformado
50
36
79
11
2,5
75
88
129
64
62
43
22
105
232
51
39
53
28
73
193
70
66
0,5
3
17
35
172
20
46
64
4
10
8
48
116
70
84
Fermentacin de la lactosa
Lactosa C12H22O11 ------(hidrlisis por enzima lactasa)------->
d Glu cos a (fermentacion)

+
d Galactosa
La capacidad de fermentar la Lactosa (disacrido formado por dos monosacridos, unidos por
el enlaces -1,4, entre la glucosa y la galactosa), depende de la presencia de la enzima galactosidasa. La utilizacin efectiva de la Lactosa, tambin requiere la presencia de la
Galactsido permeasa que favorece la entrada de la lactosa en el interior de la clula.
Las bacterias que producen -galactosidasa pero les falta permeasa no pueden incorporar
Lactosa a una velocidad suficiente para producir una fermentacin rpida y vigorosa, y
generalmente, se clasifican como NO fermentadores de lactosa. La fermentacin de Lactosa
es especialmente caracterstica de Escherichia y Enterobacter, y ausente de Shigella,
Salmonella y Proteus.
La formacin de Gas en la fermentacin de azcares es un carcter de valor considerable para
la diferenciacin taxonmica de estos grupos, ya que permite diferenciar entre los formadores
de gas del gnero Escherichia y los patgenos del grupo Shigella y Salmonella typhi, que
fermentan sin producir gas. En una fermentacin cido-mixta simple, solamente se puede
formar gas por descomposicin del cido frmico. La produccin de gas refleja la presencia
de Hidrogenoliasa frmica. Esta enzima no es esencial para el metabolismo fermentativo;
existen colonias de Escherichia coli (especie tpicamente productora de gas) que no son
productoras de gas.
Las bacterias que realizan la fermentacin Butanodilica tambin presentan diferencias
respecto a la presencia de la Hidrogenoliasa frmica. La colonias del gnero Enterobacter
casi siempre tienen esta enzima y son intensos productores de gas; los del gnero Serratia no
lo presentan y en ellos la produccin de gas es inapreciable.
Resumen de los patrones de fermentacin del grupo entrico
FERMENTACIN CIDO-MIXTA
A. Producen CO2+H2 (poseen hidrogenoliasa frmica):
Escherichia
Proteus
Salmonella (la mayora de especies)
Photobacterium (algunas de las especies)
B. No producen gas (carecen de hidrogenoliasa frmica):
Shigella
Salmonella typhi
Yersinia
Vibrio
Aeromonas (algunas especies)
Photobacterium (algunas especies
Beneckea (la mayora de las especies)
85
MODIFICACIN BUTANODILICA DE LA FERMENTACIN CIDO-MIXTA

A. Producen CO2 + H2 (poseen hidrogenoliasa frmica):
Enterobacter, Aeromonas hydrophila, Photobacterium phosphoreum
B. Producen nicamente CO2 (carecen de hidrogenoliasa frmica); formacin de
gas ligeramente apreciable o indetectable:
Serratia, Erwinia herbicola, E. carotovara...
F. AGAR MC CONKEY. Es un medio selectivo por contener sales biliares y cristal violeta
que inhiben el crecimiento de bacterias no entricas. Es tambin un medio diferencial,
porque contiene lactosa y un indicador de pH. Las bacterias capaces de fermentar este azcar
producirn un cambio en el pH del medio por la liberacin de productos cidos. Como
consecuencia sus colonias aparecern de color violeta, contrastando con la coloracin
amarillenta de las colonias de bacterias no fermentadoras de lactosa.
G. AGAR SANGRE. Es un medio general rico en nutrientes, por lo que permitir el
crecimiento de una amplia variedad de bacterias. Adems es un medio diferencial, ya que
permite comprobar si la bacteria es capaz de hemolizar los eritrocitos del medio de cultivo.
Algunas bacterias, sobre todo los estreptococos, pueden romper los hematies de la sangre
(Hemlisis). Si la hemlisis que se produce es total , se denomina betahemlisis; si es parcial
alfa-hemlisis, y cuando no existe, se habla de hemlisis tipo gamma.
Los tres tipos de hemlisis se manifiestan de la siguiente manera:
-hemlisis: Halo verde alrededor de la colonia, debido a una destruccin parcial de
los hemates.
-hemlisis: Halo intensamente claro alrededor de la colonia por la lisis total de los
hemates.
-hemlisis: Ausencia de halo claro.
H. AGAR CITRATO DE SIMMONS. Este medio indica la capacidad de las bacterias de
metabolizar el citrato. Contiene citrato como nica fuente de carbono, fosfato de amonio
como nica fuente de nitrgeno y azul de bromotimol como indicador de pH. nicamente
las bacterias capaces de metabolizar el citrato (indica presencia de la enzima citrato
permeasa) podrn multiplicarse en este medio y, al hacerlo, utilizarn los fosfatos presentes
liberando iones amonio. Estos iones amonio que evolucionan a amonaco, junto con la
eliminacin del citrato (cido), generar una fuerte basificacin del medio que se manifestar
por un cambio de color del indicador de pH, de verde a azul. Incubar a 37 C 18-24 h.
I. AGAR FENILALANINA. La mayora de las bacterias poseen enzimas capaces de
hidrolizar especficamente algn aminocido, liberando al medio los grupos amino
(desaminacin). En este medio el aminocido presente es la fenilalanina, y es empleado para
determinar la presencia de la enzima fenilalanina desaminasa en las bacterias. La accin de
esta encima se evidencia por la aparicin en el medio del producto resultante (cido
fenilpirvico), que se detecta mediante la adicin de cloruro de hierro (III), resultando un
compuesto de coloracin verde oscura.
Procedimiento:
1. Efectuar una siembra en estra de un cultivo fresco.
2. Incubar 18-24 h a 37 C
3. Aadir varias veces cloruro de hierro (III) al 10 %. Esperar hasta 5 min.
4. Resultados: Color inicial del medio (-). Color verde intenso (+).
86
J. AGAR KLIGLER (KIA).

Este medio diferencial complejo (de color rojo) es muy til, ya que demuestra varias
caractersticas enzimticas de la bacteria. Esta compuesto principalmente por dos azcares en
distinta proporcin (glucosa al 0,1 % y lactosa al 1 %), tiosulfato sdico, citrato frrico y
rojo fenol como indicador de pH. Para estudiar el comportamiento de las bacterias en
condiciones de aerobiosis y anaerobiosis, la siembra en este medio de cultivo se realizar
tanto en la superficie del agar (aerobiosis) como en la profundidad de este (anaerobiosis). La
informacin que podemos obtener es la siguiente:
a. Fermentacin de la glucosa: viraje a color amarillo en el fondo del tubo inclinado.
Si la bacteria fermenta slo la glucosa, en la superficie del tubo inclinado la utilizar
por va respiratoria, y, donde la tensin de oxgeno disminuya lo suficiente, emplear
una pequea proporcin por va fermentativa. Esto generar una pequea cantidad de
cidos que sern neutralizados por las aminas derivadas de la descarboxilacin
oxidativa de las protenas (proceso que depende del oxgeno). Como resultado, el
medio mantendr su color rojo en la superficie, al no haber cambio de pH. Por el
contrario, las bacterias crecidas en la profundidad del tubo inclinado emplearn desde
el primer momento la glucosa por va fermentativa, generando cidos que no sern
neutralizados, provocndose un descenso de pH y el color del medio en el fondo del
tubo cambiar a amarillo.
b. Fermentacin de la lactosa: viraje a color amarillo en la superficie del tubo
inclinado. Si la bacteria, adems, fermenta la lactosa, los cidos producidos modifican
tambin el pH de la superficie del medio. En este caso las aminas no son capaces de
neutralizar la cantidad de cidos producidos en esta fermentacin, ya que la lactosa se
encuentra en el medio a mayor concentracin que la glucosa. Como consecuencia, el
color del medio en la superficie cambiar a amarillo.
c. No fermentacin de los azcares: el tubo inclinado no cambia de color. Si la
bacteria es aerobia estricta (no fermentadora), como, por ejemplo, el gnero
Pseudomonas, el medio permanecer de color rojo. En este caso, los azcares son
respirados, degradndose completamente hasta CO2, que se elimina y no modifica el
pH.
d. Produccin de gas en la fermentacin: aparicin de burbujas, rotura o elevacin del
agar del fondo del tubo. Enzima hidrogenoliasa frmica.
e. Produccin de cido sulfhdrico: aparicin de un precipitado de color negro en el
fondo del tubo. Algunas bacterias respiradoras anoxibinticas son capaces de emplear
el tiosulfato sdico como aceptor final de electrones de la transportadora. Como
consecuencia, este compuesto se reduce a cido sulfhdrico, que, a su vez, reacciona
con el hierro Fe2+ presente en el medio formando un precipitado negro de sulfuro de
hierro (fig. 6.1). Los iones Fe2+ proceden de los Fe3+ del citrato frrico y aparecen
debido a los cambios en los potenciales redox producidos al someter al autoclave al
medio de cultivo.
f. La degradacin de las peptonas (aerbica o anaerbicamente) origina un proceso de
descarboxilacin que produce amonaco, produciendo el viraje del indicador a un rojo
intenso.
87
TABLA DE LECTURA E INTERPRETACIONES DE RESULTADOS EN AGAR

TRES-AZCARES-HIERRO
Gnero y especie
Fondo inclinada
Superficie Produccin de SH2
Escherichia coli
AG
Enterobacter aerogenes
AG
Enterobacter cloacae
AG
Citrobacter freundii
AG
A/AG
R/K
R/K
R/K
Proteus vulgaris
AG(1)
K/A
Proteus mirabilis
AG(1)
K/A
Proteus morganii
AG(1)
R/K
A/K
R/K
R/K
+,(2)
Salmonella typhimurium
A/G
R/K
Salmonella paratyphi B
A/G
R/K
Salmonella enteritidis
A/G
R/K
Salmonella paratyphi A
A/G
R/K
Salmonella gallinarum
R/K
A/G
R/K
Shigella flexneri
R/K
Shigella dysenteriae
R/K
Shigella boydii
R/K
Shigella sonnei
R/K
R/K
R/K
Klebsiella pneumoniae
Alcaligenes faecalis
Proteus rettgeri
Salmonella typhi
Salmonella choleraesuis
Pseudomonas aeruginosa
CLAVE
Color y aspecto
A
Amarillo
Aparicin de burbujas o
grietas
Rojo intenso
R
SH2
NOTAS:
88
INTERPRETACIN
Fondo
Fermentacin de GLUCOSA y
formacin de CIDO
Formacin de GAS a partir de
GLUCOSA
No fermentacin de GLUCOSA y
formacin de ALCALI
No hay cambio del color

No fermentacin de GLUCOSA
original (Rojo anaranjado).
+ Enengrecimiento
Formacin de SH2
- Sin ennegrecimiento
Superficie inclinada
Fermentacin de
LACTOSA y/o
SACAROSA con
produccin de CIDO
No fermentacin de
LACTOSA ni
SACAROSA. Formacin
de ALCALI.
No fermentacin de
LACTOSA ni SACAROSA
No formacin de SH2
(1) Algunas cepas son A, sin produccin de gas.

(2) Slo en parte superior de la columna, y a veces formando anillo a las 48 h.
89
K. AGAR MANITOL SAL. ste es un medio selectivo y diferencial muy utilizado para el
aislamiento e identificacin de Staphylococcus aureus. La alta concentracin de sal (NaCl al
7,5 %) le proporciona su carcter selectivo, ya que slo este tipo de microorganismos
osmotolerantes y los microorganismos osmfilos pueden multiplicarse en l. Adems, en su
composicin el nico azcar presente es el manitol, que nicamente son capaces de fermentar
las cepas patgenas de este gnero bacteriano, diferencindolas as de las que no lo son. La
produccin de cidos proveniente de la fermentacin del manitol es detectada por un viraje
del indicador de pH presente en el medio (rojo fenol) a amarillo. Staphylococcus aureus,
fermentador del manitol, crecer en el medio dando lugar a colonias grandes rodeadas de un
halo amarillo, mientras que Staphylococcus hepidermidis, que no fermenta el manitol, dar
lugar a colonias pequeas rodeadas de un halo prpura (a veces permite el desarrollo de
Enterococcus faecalis, pero con un crecimiento muy pobre).
L. PRUEBA DE LA COAGULASA.
Fundamento. Es una enzima semejante a la protrombina, que transforma el fibringeno en
fibrina, dando un cogulo visible. Lo producen las bacterias que coagulan el plasma,
inhibiendo el efecto anticoagulante del EDTA (etilendiamino tetractico) presente en el
plasma. Es ejemplo de coagulasa positivo Staphylococcus aureus.
Procedimiento
1. En tubos de 5 ml colocar 0,5 ml de plasma de conejo-EDTA rehidratado.
2. Aadir con asa Kolle 1 colonia bacteriana.
3. Homogeneizar con asa Kolle.
4. Incubar 4 h a 37 C. Lecturas a la 1/2 , 4 y 24 h.
5. Comprobar si presenta coagulacin por hemlisis del plasma de conejo
90
6.7. DIFERENCIACIN ENTRE E.COLI Y ENTEROBACTER CLOACAE.

PRUEBAS IMVIC.
Escherichia coli crece bien sobre medios de cultivo que contengan glucosa, o lactosa y
peptona. Para establecer ya desde un principio condiciones selectivas para que puedan crecer
pocas bacterias, se utiliza la lactosa. La utilizacin de lactosa supone la capacidad de escindir
la lactosa con formacin de gas, mediante la -galactosidasa, enzima utilizado por coliformes
y bacterias lcticas.
Como algunas bacterias del cido lctico son capaces de desdoblar la lactosa formando gas,
por lo que podran falsear los resultados, son necesarios otros procedimientos para la
diferenciacin. Si se siembran en placa organismos de un cultivo de este tipo sobre agar
eosina-azul de metileno Levine (lactosa-peptona-eosina-azul de metileno) las colonias de
E.coli se diferencian porque sus colonias son planas de 2-3 mm de dimetro de color violeta
oscuro y centro negro con un brillo metlico caracterstico de color verdoso con luz reflejada.
. Los organismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.
Para una diferenciacin ms exacta de las dos especies se ha acostumbrado a seguir un
mtodo rutinario denominado "IMVIC".
I: Indol
M: Rojo de metilo
Escherichia coli
I
+
-
V: Voges Proskauer
M
+
-
V
+
C: Citrato
C
+
Procedimiento:
1. Preparar dos placas de agar nutritivo.
2. Preparar un cultivo puro de E. coli y E. cloacae por siembra escocesa en las placas de
agar nutritivo.
3. Incubar 48 h. a 37 C.
4. Observar al microscopio mediante una tincin Gram los diversos tipos de colonias
aisladas.
5. Tomar una colonia y resuspenderla en un tubo de ensayo con 5 ml de solucin Ringer.
6. Realizar la batera de pruebas IMVIC. (ver 6.6.C, 6.6.D-E, 6.6.H)
91
6.8. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE UN CULTIVO MIXTO.

Procedimiento
1. Realizar en una placa de agar TSA una siembra escocesa de la muestra de partida
(cultivo mixto de un bacilo Gram negativo (E.coli) y un coco Gram positivo
S.epidermidis).
2. Incubar a 37 C durante 48 h.
3. Realizar una Tincin Gram de cada tipo de colonia aislada.
4. A partir de cada tipo de colonia, realizar un agotamiento por estras en placas de agar
sangre y de agar Mc.Conkey. Incubar a 37 C durante 24 h..
5. Comprobar el aspecto de las colonias. Verificar que en la placa de agar sangre se
multiplican ambas bacterias y en la placa de agar Mc.Conkey slo crecer el bacilo
Gram negativo. Observar en la placa de agar sangre si se ha producido hemlisis y de
qu tipo es, y en la placa de agar Mc.Conkey si ha sido fermentada la lactosa.
6. A partir de las colonias de los cocos Gram positivos se realiza la prueba de la
catalasa, que permite diferenciar entre Staphylococcus y Streptococcus. Para ello
tomar con palillo de madera una colonia Gram+ del agar sangre y colocarla sobre un
portaobjetos limpio. Aadir una gota de reactivo de la catalasa (perxido de
hidrgeno) . Si la prueba es positiva (aparicin de burbujas), sembrar en el medio agar
manitol sal . Incubar a 37 C durante 24 h.
7. A partir de las colonias de los bacilos Gram negativos se realiza la prueba de la
citocromo c oxidasa. Para ello, colocar un trocito de papel de filtro sobre un
portaobjetos limpio. Con un palillo de madera tomar una colonia Gram - del agar
sangre y extenderla en el papel de filtro. Aadir encima una gota del reactivo oxidasa
Observar si aparace coloracin azul. Confirmar que el bacilo Gram negativo es una
enterobacteria (citocromo c oxidasa negativa).
8. A partir de una colonia del bacilo Gram negativo sembrar los siguientes medios
diferenciales: agar citrato de Simmons, agar fenilalanina, caldo de triptona con NaCl
al 0,5 %, dos caldos de RMVP y agar de Kliger (KIA). Todos estos medios se
siembran tal como se explic en el captulo 4 , excepto el agar de Kliger, que se
siembre con una aguja de inoculacin como muestra la fig. 6.4.
9. Incubar todos los medios a 37 C durante 24 h.
10. Aadir los distintos reactivos (4 gotas/tubo) a sus correspondientes cultivos. Las
pruebas del citrato, manitol y KIA no requieren la adicin de ningn reactivo.
Anotar los cambios de color en las distintas pruebas. Con la ayuda de la tabla n 6-1,
y 6-2 identificar las bacterias analizadas.
92
Aislamiento e identificacin bacterianas
Tabla 6.1
Fig. 6.4
93
6.9 MTODOS MINIATURIZADOS DE IDENTIFICACIN BIOQUMICA

La batera de pruebas bioqumicas descrita es la forma clsica y general de identificacin de
enterobacterias y cocos Gram + . Sin embargo, actualmente estos mtodos estn siendo
sustituidos por micropruebas en sistemas semiautomticos, que permiten una identificacin
ms rpida y menos laboriosa, imprescindible en grandes laboratorios (sistema API, etc.).
SISTEMA API.
El sistema API comercializa diversas versiones (API 20 E, API 10 S, ...) miniaturizadas y
estandarizadas de los procedimientos convencionales para la identificacin de miembros de la
familia de las Enterobacterias y otras bacterias Gram negativas relacionadas. Consiste en una
coleccin de microtubos (pocillos) donde se puede reproducir una serie de pruebas
bioqumicas con una sola colonia de bacterias.
En un soporte de plstico estn alineados los microtubos que contienen los medios
deshidratados (liofilizados). La siembra se realiza con una pipeta a partir de una suspensin
bacteriana procedente de un cultivo puro. Algunos microtubos se cubren con parafina para
crear anaerobiosis. Procurar no producir burbujas, mezclar lquido de microtubos distintos,
ni llenar los microtubos demasiado, salvo indicacin.
API 10 S. (BIOMERIUX) Las caractersticas bioqumicas que se estudian son:

ONPG: hidrlisis del ortonitrofenolgalactosidasa por la -galactosidasa, liberando

ortonitrofenol de color amarillo.
GLU (glucosa), ARA (arabinosa): la utilizacin de hidratos de carbono por las
bacterias produce cidos, que originan una cada del pH. El indicador azul de
bromotimol virar de azul a amarillo.
LDC: actividad lisina descarboxilasa. Transforma la lisina en una amina llamada
cadaverina que incrementa el pH. El indicador virar de amarillo a rojo.
ODC: actividad ornitina descarboxilasa. la enzima transforma la ornitina en una
amina llamada putrescina, producindose un incremento del pH y un viraje de
indicador de amarillo a rojo.
CIT: utilizacin del citrato como nica fuente de carbono. Esto produce un aumento
de pH y que el indicador (azul de bromotimol) vire de verde a azul.
H2S: produccin de sulfhdrico a partir del tiosulfato. El sulfhdrico producido
reacciona con las sales de hierro, obtenindose un precipitado negro.
URE: actividad ureasa. Esta enzima libera amonaco a partir de la urea, producindose
un incremento de pH y que el indicador (rojo de fenol), vire de amarillo a rojo.
TDA: actividad triptfano-desaminasa. Esta enzima forma cido indol pirvico a
partir del triptfano. El cido producido forma un compuesto marmceo en presencia
de cloruro de hierro (III).
IND: produccin de indol a partir del metabolismo del tritfano. El reactivo de
Kovacs forma un complejo rojo con el indol.
94
Pruebas complementarias:
OXI: prueba de la oxidasa. Se basa en comprobar la produccin de la enzima

citocromo c oxidasa por parte de las bacterias. La presencia de citocromo c se
manifiesta por la capacidad del colorante tetrametil-p-fenilendiamida de oxidarse
frente al citocromo c, apareciendo una coloracin azul (forma oxidada).
NO2: nitrato reductasa. Esta enzima reduce el nitrato a nitrito. La aparicin de nitritos
se manifiesta por la coloracin de rojo que adquiere el medio tras aadir los reactivos
cido sulfanlico y N,N dimetil-alfa-naftilamina.
Procedimiento:
1. Preparar una cubeta de incubacin con tapa. Anotar n de identificacin de la muestra
2. Sacar la galera API de la envoltura y colocarla en la cubeta en posicin inclinada.
3. Con asa de Kolle se toma una colonia bien aislada de un cultivo de 24 h. y se
emulsiona en agua estril.
4. Con la pipeta Pasteur se inocula la galeria API.
5. Llenar la seccin tubular del microtubo colocando la punta de la pipeta contra el lado
de la cpula.
6. Llenar la seccin tubular y la cpula de los microtubos CIT
7. Despus de inocular, llenar completamente las cpulas DE LOS MICROTUBOS
LDC , ODC , H2S , URE , con aceite de parafina.
8. Humedecer la tapa con agua, para evitar evaporacin. Eliminar el exceso de agua,
tapar y dejarlo incubar en estufa 24 h a 37 C.
9. Anotar los resultados obtenidos segn la tabla adjunta.
10. Una vez anotados los resultados obtenidos, el sistema API 10 se complementa con las
siguientes pruebas bioqumicas:
A. TDA - aadir en el microtubo TDA 1 gota de cloruro de hierro (III) al 10 %
B. IND - aadir en el microtubo IND 1 gota de reactivo de Kovacs
C. OX - aadir 1 gota del reactivo de la oxidasa (tetrametil-p-fenilendiamina al
1 %) en el microtubo ONPG o al H2S si es negativo.
D. NO2 - aadir en el microtubo GLU 2 gotas de cido sulfanlico al 0,8 %
(NIT 1) y 2 gotas de N,N dimetil-alfa-naftilamina al 0,5 % (NIT 2).
Nota: Respetar el orden indicado para la 4 pruebas, ya que se liberan
productos gaseosos que podran interferir en otros microtubos de la galera.
95
Tabla 6.2
TEST
ONPG
REACCION O
ENZIMAS
SUBSTRATO
-galactosidasa
GLU
Ortonitrofenolgalactosido
Glucosa
ARA
RESULTADOS
NEGATIVO
POSITIVO
incoloro
amarillo (1)
fermentacin / oxidacin (4)
azul/ azul verdoso
amarillo o gris
Aarabinosa
fermentacin / oxidacin (4)
azul/ azul verdoso
amarillo
LDC
Lisina
lisina descarboxilasa
ODC
Ornitina
ornitina descarboxilasa
citrato sdico
utilizacin del citrato
H2 S
tiosulfato de sodio
produccin de H2S
URE
Urea
TDA (5)
amarillo/ naranja
rojo/ naranja
amarillo
rojo/ naranja (3)
verde palido/ amarillo
azul-verde/ azul (3)
Incoloro/ grisaceo
depsito negro (2)
ureasa
amarillo
rojo/ naranja
Triptfano
triptfano desaminasa
amarillo
marrn oscuro
IND (6)
Triptfano
produccin de indol
amarillo
anillo rojo
OXI (7)
En microtubo:
ONPG o H2S
citocromo oxidasa
incoloro / violeta claro
NO2 (8)
En microtubo:
GLU
reduccin de nitratos a NO2

reduccin a gas N2
(+Zn)
CIT
amarillo
rojo
violeta oscuro (2
min)
(2-3 min)
violeta
amarillo
(1) Un amarillo muy plido debe considerarse como positivo.

(2) La produccin de H2S puede variar de un depsito negro denso a una lnea negra muy fina alrededor del
fondo del tubo. Examinar cuidadosamente el fondo del tubo antes de considerar la reaccin negativa. Un viraje a
marrn del medio es una reaccin negativa a menos que haya un depsito negro. Esto sucede con organismos
TDA positivos.
(3) La lectura debe hacerse en la cpula (aerobiosis).
(4) La fermentacin empieza en la parte inferior de los tubos, la oxidacin en la cpula.
(5) TDA - aadir 1 gota de cloruro de hierro (III) al 10 %.
(6) IND - aadir 1 gota de reactivo de Kovacs. La reaccin se leer a los dos minutos despus de aadir el
reactivo de Kovacs. Despus de varios minutos, el HCl liberado por el reactivo de Kovacs puede reaccionar con
el material plstico de la cpula resultando un cambio de amarillo (negativo) a rojo pardusco (se contina
considerando negativo).
(7) Aadir en el microtubo H2S o ONPG 1 gota de tetrametil-p-fenilendiamina al 1 %. Esperar 20 min antes de
considerar la reaccin negativa.
(8) NO2 - aadir en el microtubo GLU 2 gotas de cido sulfanlico al 0,8 % y 2 gotas de
N,N dimetil-alfa-naftilamina al 0,5 %. Antes de aadir los reactivos, observar si el tubo GLU (positivo o
negativo) presenta burbujas. Estas burbujas son indicio de la reduccin de nitratos a N2. Despus de haber
aadido los reactivos de reduccin de nitratos, confirmar un posible test negativo aadiendo polvo de zinc. Un
color rojo despus de 10 min confirma la reaccin negativa, un color amarillo indica la reduccin de los nitratos
a un estado de nitrgeno.
96
IDENTIFICACIN DE LOS MICROORGANISMOS: A los test contenidos en API 10 S,

se suman los test de la oxidasa (OXI) y el de reduccin de nitratos (NO2), como test 11 y 12.
1. Los resultados pueden ser:
A. Positivo: Se anota el valor correspondiente (1, 2, 4)
B. Negativo: Se anota un 0.
Codificacin del germen. Sumando los 3 valores obtenidos en cada triada se obtiene un
nmero. Con la secuencia de 4 nmeros encontrados, se busca en las tablas a que bacteria
corresponde. Tabla 6.3.
Ejemplo: Citrobacter freundii
ONPG GLU ARA
+
+
+
|
|
|
1
2
4
\
|
/
/
\
|
LDC ODC CIT

+
|
|
|
0
0
4
\
|
/
\
|
/
H2S URE TDA

+
|
|
|
1
0
0
\
|
/
\
|
/
IND OX NO2
+
|
|
|
0
0
4
\
|
/
\
|
/
97
TABLA N 6.3 DIRECTORIO DE PERFILES PARA INTERPRETACIN TEST API 10 S

OO16
Pseudomonas putrefaciens
2.665
Proteus
6.514
Salmonella (2)
OO75
Proteus vulgaris
2.674
Proteus mirabilis
6.524
Klebsiella / Serratia
O206
2.675
Proteus mirabilis
6.604
O216
2.707
Vibrio
6.614
Citrob.freund./Salmon.(2)
O221
Proteus morganii
2.714
Salmonella (2)
6.674
Proteus mirabilis
O225
Proteus morganii
2.724
Serratia
6.704
Salmonella (2)
O261
Proteus morganii
2.764
Proteus mirabilis
6.707
Vibrio
O265
Proteus morganii
2.774
Proteus mirabilis
6.714
Salmonella (2)
O274
Proteus mirabilis
6.715
Salmonella (2)
O412
3.004
Shigella (2)
O416
3.005
Escherichia coli/Shigella (2)
7.000
Enterobacter agglomer
O422
3.007
Aeromonas hydrophila
7.001
O475
Proteus vulgaris
3.014
7.005
Escherichia coli
O500
Pseudomonas maltophilia
3.024
Yersinia pseudotuberculosis
7.006
O504
3.105
Escherichia coli
7.007
O616
3.107
7.014
O664
Proteus mirabilis
3.204
Shigella (2)
7.025
Yersinia enterocoltica
O674
Proteus mirabilis
3.205
Escherichia coli
7.034
3.224
7.040
1.500
3.225
7.041
1.504
3.305
Escherichia coli
7.044
3.307
Aeromonas shigell./Vibrio(2)
7.045
2.004
Shigella (2) / Klebsiella
3.402
Pseudomonas cepacia
7.105
agglomer. Enterobacter
agglomagglomer.
Escherichia coli
2.005
Shigella
3.404
7.107
2.035
Proteus vulgaris
3.406
Pseudomonas cepacia
7.115
Escherichia coli
2.045
Providencia
3.407
7.124
2.055
Proteus vulgaris
3.465
Proteus rettgeri
7.125
Kleb. pneumon. oxytec
2.064
Proteus
3.502
Pseudomonas cepacia
7.204
Shigella/Enterobacter
2.065
Proteus
3.507
7.205
Escherichia coli
2.074
Proteus
3.524
Klebsieella / Serratia
7.214
2.075
Proteus vulgaris
3.614
7.224
Yerinia enterocoltica
2.104
Salmonella typhi (2)
3.674
Proteus mirabilis
7.225
2.105
Escherichia coli
3.704
Serratia marcescens
7.234
2.114
Salmonella (2)
3.707
Vibrio (2)
7.305
Escherichia coli
2.221
Proteus morganii
3.724
Serratia marcescens
7.314
Salmon. arizonae(2)
2.224
7.315
Escherichia coli
2.234
Proteus mirabilis
4.402
Pseudomonas fluorescens
7.400
2.241
Proteus morganii
4.406
7.401
2.245
Proteus morganii
4.422
7.405
Enterobacter agglom.
agglomer.
2.254
Proteus mirabilis
4.426
7.407
2.261
Proteus morganii
7.414
98
2.264
Proteus mirabilis
6.000
Acinetobacter calcoacticus
7.415
2.265
Proteus morganii
6.004
Shigella (2)
7.425
2.274
Proteus mirabilis
6.005
Shigella (2)/Escherichia coli
7.434
2.305
Edwardsiella tarda
6.045
Providencia
7.440
2.307
Vibrio
6.065
Proteus
7.441
2.314
Salmonella (2)
6.104
Salmonella (2)
7.444
2.315
Edwardsiella tarda
6.105
Salmonella (2)/ E. coli
7.445
2.324
Enterobacter hafniae
6.114
Salmonella (2)
7.504
Enterobacter agglom
Enterobacter agglom
Enterobacter agglom
agglomer.
Enterobacter agglom
agglomer.
2.365
Proteus morganii
6.204
Salmonella (2)/Shigella (2)
7.505
2.374
Proteus mirabilis
6.205
Escherichia coli
7.507
2.402
6.214
Citrobacter / Salmonella (2)
7.524
Klebsiella pneumoniae
2.404
Klebsiella ozaenae
6.224
7.525
2.405
Providencia
6.225
7.604
Enterob. cloac/Serratia
2.422
Pseudomonas
6.261
Proteus morganii
7.605
Citrobacter
2.425
Proteus rettgeri
6.265
Proteus morganii
7.614
2.426
6.274
Proteus mirabilis
7.615
2.444
Providencia
6.304
Enterob. hafniae/Salmon(2)
7.624
2.445
Providencia
6.305
Escherichia coli
7.634
2.464
Proteus
6.307
Vibrio
7.714
Salmonella (2)
2.465
Proteus rettgeri
6.314
Salmonella (2)
7.702
Pseudomonas cepcea
2.474
Proteus
6.400
Acinetobacter calcoacticus
7.704
Enterobacter / Serratia
2.475
Proteus
6.402
7.706
Pseudomonas cepcea
2.545
Providencia
6.406
7.714
Salmon. arizonae (2)
2.624
Proteus mirabilis
6.414
Citrob. freund./Salmon.(2)
7.724
Enterobacter / Serratia
2.634
Proteus mirabilis
6.422
7.725
2.644
Proteus mirabilis
6.426
2.654
Proteus mirabilis
6.445
Providencia
2.664
Proteus mirabilis
6.475
Proteus vulgaris
99
6.10. Calculo probabilstico. Galera API 10 S

La bacteria Proteus vulgaris correspondera a cualquiera de las siguientes secuencias
numricas: 0075, 0475, 2055, 2075, 6475. La fiabilidad del resultado obtenido no es igual en
todos los casos, por lo que es preciso realizar un clculo probabilstico.
En la tabla adjunta, figuran las frecuencias con que una bacteria determinada dar positivo en
la prueba bioqumica considerada. Ello nos indica un margen de fiabilidad. Por ejemplo, si la
bacteria que queremos identificar ha dado:

POSITIVO a ONPG: descartamos como candidatas a las bacterias que nunca dan
positivo (0 % de pruebas), Edward tarda y P.vulgaris.
NEGATIVO a NO2: descartamos las que siempre dan positivo (100 % de pruebas),
E.coli, Shigella sp., Edward tarda, Salmonella sp., K. neumoniae, etc.
Este descarte de bacterias permite reducir el nmero de candidatas. Suponiendo que despus
de aplicar este criterio selectivo se centraran las posibilidades en las bacterias siguientes:
K.oxytoca, P. rettgeri y Y. enterocolitica.
Se procede entonces a completar un cuadrante con el conjunto de pruebas realizadas. A modo
de ejemplo, el cuadro siguiente lo realiza con 4 de las pruebas.
S.marcenses
P.rettgeri
Y.enterocoltica
Pruebas bioq.
S.marcenses
P.rettgeri
Y.enterocoltica
ONPG
94
1
81
CIT
97
70
0
URE
28
98
93
IND
95
90
66
+
0,94
0,01
0,81
%
%
%
0,03
0,30
0,99
%
%
%
0,28
0,98
0,93
%
0,05 = 0,0003948
%
0,10 = 0,0002940
%
0,34 = 0,2535607
Suma total =
0,2542495
Clculo de probabilidad porcentual:

S.marcenses =
P.rettgeri =
0,0003948
0,25442495
0,0002940
0,2542495
Y.enterocoltica =
% 100 = 0, 15 %
% 100 = 0, 11 %
0,2535607
0,2542495
% 100 = 99, 72 %
Conclusin: Con una probabilidad de un 99,5 % se trata de la bacteria Y.enterocoltica.
% Identificacin
% Identificacin
% Identificacin
% Identificacin
=
=
=
=
80.0 Identificacin aceptable

90,0
"
buena
99,0
"
muy buena
99,9
"
excelente
100
TABLA 6.4. CLCULO PROBABILSTICO
100
83
77
70
94
Shigella sp.
26
99
50
38
Edward. tarda
100
100
100
94
100
Salmonella sp.
100
94
96
95
74
85
C. freundii
93
100
96
32
62
65
10
0
10
0
10
0
10
0
98
K. pneumoniae
99
99
99
74
95
63
K. oxytoca
99
99
96
86
84
60
100
E. cloacae
99
100
99
96
94
H. alvei
71
99
90
100
97
13
S. liquefac.
98
100
98
87
99
85
S. marcescens
94
100
19
98
95
97
28
95
S. odorfera
95
100
95
97
43
87
99
99
P. mirabilis
96
98
57
83
99
98
93
P. vulgaris
97
31
83
98
99
94
Prov. rettgeri
99
70
98
99
90
10
0
98
Y. enterocoltica
81
99
69
90
93
66
98
3 - Proteus vulgaris
4 - Klebsiella
5 - Escherichia coli
+
+
K/A
A/A
A/A
+
+
+
+
+
+
!
+
+
-
+
+
-
+
-
!
+
+
+
-
Protelisis
95
Formacin de acetona
E. coli
Formacin de indol
N
O
H2S
O
X
I
Formacin de gas
I
N
D
A. Fenilalanina
T
D
A
Agar Citrato
H2S U
R
E
VP (F. butanodilica)
C
I
T
RM (F. cido mixta)
O
D
C
Fermentacin lactosa
L
D
C
Fermentacin glucosa
A
R
A
Agar KIA
G
L
U
Agar Mc Conkey
O
N
P
G
+
+
+
-
+
-
10
0
10
0
10
0
10
0
10
0
101
Cuestionario pruebas bioqumicas
1. En que se distinguen las bacterias segn sean:

a. anaerobias obligadas
b. anaerobias facultativas
c. aerotolerantes
2. Se siembran 2 gotas de inculo de 5 tipos de microorganismos con diferentes tipos de
requerimientos de O2, en un agar que se mantiene lquido a 45 C. Se agita hasta
homogeneizar los tubos y se enfra rapidamente. Se incuban los tubos 48 h. a 37 C.
Considerando que los medios satisfacan todos los requerimientos qumicos de los
metabolismos de los diversos microorganismos.
De acuerdo con el esquema que refleja los diversos tipos de crecimiento que ha habido en
cada tubo, explica que tipo de microorganismo ha crecido y que metabolismo ha
utilizado.
3. Distingue entre los trminos: metabolismo, catabolismo, anabolismo.

4.
Distingue entre Fototrofo y quimiotrofo
5. Efecta una asociacin entre los trminos siguientes :

fotolitotrofo
fotorganotrofo
Quimiolitotrofo
Quimiorganotrofo
Champin
Lechuga
Escherichia coli
Bacterias nitrificantes
102
6. Qu es la gliclisis? Cules son las sustancias que forma en su degradacin?

7. Describe la funcin del ATP
8. Cules son las diferencias ms significativas entre respiracin y fermentacin?
9. Porqu la fermentacin desprende menor energa que la respiracin?
10. Qu informacin del metabolismo de una bacteria nos permite conocer la siembra por
picadura en un agar KIA, respecto a:
a. Tipo de sustrato que ha fermentado
b. Exigencia de O2
Tipos de enzimas que posee la bacteria
c.
11. Qu procesos bioqumicos se pueden observar en un hemocultivo tipo Agar sangre?
12. Clasifica en selectivos o generales los siguientes medios:
a. TSA
b. A. Sangre
c. A. Mc Conkey
d. Levine
e. A. Citrato
f. Solucin Ringer
g. TSB
h. RMVP
i. A. Manitol sal
13. El medio RMVP:
A qu pruebas bioqumicas se aplica?
Qu sustancias se buscan en cada caso?Cmo las identificamos?
14. Qu informacin nos aportan las siguientes pruebas bioqumicas:
Prueba del Indol
Prueba de la Oxidasa
Prueba de la Catalasa
Agar Citrato
15. Efectuar las asociaciones adecuadas entre los trminos siguientes:
A - Fermentacin cido-mixta
B - Fermentacin de lactosa
C - Aerobios/Anaerobios facultativos
D - Fermentacin de protenas
E - Fermentacin butanodilica
F - Fermentacin de lpidos
G - Fermentadoras tardas de lactosa
H - Respiracin
I - Respiracin anaerbica
J - Hemlisis
1 - Prueba de la ONPG
2 - Agar KIA (por picadura en tubo)
3 - Prueba del Rojo Metilo (RM)
4 - Desaminacin/descarboxilacin
5 - Enzima -galactosidasa
6 - Coenzima Citocromo c
7- Prueba de Voges Proskauer (VP)
8 - Prueba de la catalasa
9 - Agar Sangre
10 - Agar Citrato
103
16. Efectuar las asociaciones adecuadas entre los trminos siguientes:

A - Fermentacin cido-mixta
B - Respiracin
C - Respiracin anaerbica
D - Fermentacin de protenas
E - Fermentacin butanodilica
F - Fermentacin homolctica
G - Fermentacin heterolctica
1 - cido lctico
2 - cidos orgnicos
3 -C02 + H20
4 - Acetona
5 - cido lctico y otros cidos orgnicos
6 - Indol
7 - N02- , SO32-......
Indicar para las siguientes afirmaciones Verdadero o Falso:
17. Las bacterias aerobias estrictas no pueden fermentar.

18. En ausencia de oxgeno molecular siempre se producir fermentacin, nunca respiracin.
19. La fermentacin no se produce en condiciones de aerobiosis.
20. La fermentacin se puede producir en condiciones de anaerobiosis.
21. Si hay produccin de cidos la bacteria ha respirado.
22. Si se produce CO2 , podemos asegurar que ha habido respiracin.
23. Las enterobacterias son anaerobias facultativas. Pueden obtener energa por respiracin y
por fermentacin.
24. Las bacterias aerotolerantes pueden respirar.
25. En una fermentacin, los nitratos pueden actuar como aceptores finales de electrones.
26. En la respiracin anaerbica el amonio no puede actuar como aceptor final de electrones.
27. Si una bacteria da positivo en la prueba de la oxidasa puede respirar.
28. Si una bacteria da negativo con la prueba de la oxidasa, no puede respirar.
29. Todas las bacterias aerobias o anaerobios facultativos darn positivo con la catalasa.
30. Las bacterias aerotolerantes nunca darn positivo en la prueba de la oxidasa.
31. Una bacteria que de negativo a las pruebas de oxidasa y catalasa ser anaerobia estricta.
32. De acuerdo con los perfiles bioqumicos correspondientes (tabla 6.4 ), justifica el
comportamiento previsto en el agar KIA (superficie/fondo/gas/H2S) , de las bacterias:
E.coli, Salmonella sp., Proteus vulgaris
104
33. Consulta los resultados que se obtienen en el agar TSI (pag. 87-88) con Pseudomona
aeruginosa. Describe los procesos bioqumicos que se habrn producido
34. Consultando la tabla pag. 83, justifica la procedencia del nombre de la bacteria
"enterobacter aerogenes".
35. Los resultados de un test API lOS han sido:
ONPG
GLU
ARA
LDC ODC CIT
H2S
URE TDA
IND OX
N02
a. Determinar el cdigo que corresponde al perfil bioqumico obtenido y buscar en la

tabla 6.3 a que bacteria corresponde.
b. Utilizando la tabla 6.4 determinar por clculo probabilstico cul sera el nivel de
identificacin obtenido.

Identificacin Bioqumica

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6 - PRUEBAS BIOQUMICAS

6. PRUEBAS BIOQUMICAS PARA IDENTIFICACIN BACTERIANA

Todos los dems organismos obtienen el carbono principalmente a partir de nutriente

contenido adems en el anhdrido carbnico y en muchos compuestos orgnicos. Muchos

c. anaerobios facultativos crecen tanto en presencia como en ausencia de O2. Entre

En general, basta con indicar el proceso de obtencin de energa y el dador de hidrgenos.

Bacterias fototrficas. La capacidad de utilizar la luz como fuente de energa para el

En las zonas anaerbicas de los lagos (10-30 m. de profundidad) se da un crecimiento

El metabolismo de las bacterias fototrficas representa el grupo de organismos

anaerbicamente con luz y aerbicamente en la oscuridad

Bacterias aerbicas quimiolitotrofas.

NO2- -----------> NO3-

S0, S2-, S2O32--------------> SO42-

Fe2+ --------------> Fe3+

Respiracin anaerobia: En sedimentos, lagunas y suelos permanentemente inundados

-------> N2, N2O (xido nitroso)

Los respiradores anaerbicos tienen gran importancia por:

la enzima -galactosidasa permite a estos m.o. hidrolizar la lactosa en glucosa-galactosa

Las biomolculas de estructura polimerizada como almidn, protenas y lpidos, tienen

Almidn ------- amilasa --------> Maltosa ---------- maltasa ----------> Glucosa

III. Degradacin total del aminocido (descarboxilacin +

ODC - Degradacin anaerbica de aminocidos. La enzima ornitina descarboxilasa

H2S - La fermentacin de aminocidos sulfurados: cistena, metionina (generalmente se

Catalasa Capacidad de eliminar el perxido de hidrgeno 2 H2O2 --------> H2O + O2

NO2 - Detecta la presencia de la enzima nitratoreductasa que permite a las bacterias

1. OTRAS PRUEBAS BIOQUMICAS

DESCRIPCIN DE ALGUNAS PRUEBAS BIOQUMICAS.

Fig. 6.2. Fermentacin cido-mixta

Fig. 6.3 Fermentacin butano-dilica

Prueba del Rojo de metilo (RM).

Productos de la fermentacin de glucosa por bacterias entricas

d Glu cos a (fermentacion)

MODIFICACIN BUTANODILICA DE LA FERMENTACIN CIDO-MIXTA

J. AGAR KLIGLER (KIA).

TABLA DE LECTURA E INTERPRETACIONES DE RESULTADOS EN AGAR

Superficie Produccin de SH2

No hay cambio del color

(1) Algunas cepas son A, sin produccin de gas.

6.7. DIFERENCIACIN ENTRE E.COLI Y ENTEROBACTER CLOACAE.

6.8. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE UN CULTIVO MIXTO.

Aislamiento e identificacin bacterianas

6.9 MTODOS MINIATURIZADOS DE IDENTIFICACIN BIOQUMICA

ONPG: hidrlisis del ortonitrofenolgalactosidasa por la -galactosidasa, liberando

OXI: prueba de la oxidasa. Se basa en comprobar la produccin de la enzima

fermentacin / oxidacin (4)

azul/ azul verdoso

fermentacin / oxidacin (4)

azul/ azul verdoso

utilizacin del citrato

rojo/ naranja (3)

verde palido/ amarillo

azul-verde/ azul (3)

depsito negro (2)

incoloro / violeta claro

reduccin de nitratos a NO2

(1) Un amarillo muy plido debe considerarse como positivo.

IDENTIFICACIN DE LOS MICROORGANISMOS: A los test contenidos en API 10 S,

LDC ODC CIT

H2S URE TDA

TABLA N 6.3 DIRECTORIO DE PERFILES PARA INTERPRETACIN TEST API 10 S

Escherichia coli/Shigella (2)

Shigella (2) / Klebsiella

Kleb. pneumon. oxytec