Tcnicas de congelacin y sexado del semen bovino y su importancia en reproduccin

bovina
Claudia Jimnez Escobar MV MSc S DVSc DACT
Profesor Asociado UN-FMVZ

Congelacin de semen
El proceso de congelacin de semen bovino incluye los siguientes pasos: colecta, evaluacin del semen, clculo del
nmero de pajillas posibles, dilucin del semen al volumen requerido y finalmente el proceso de criopreservacin.
El proceso de colecta debe ser higinico y evitando el shock trmico de los espermatozoides (para una revisin
completa del teme refiernse a Baracaldo et al., 2006) .
La colecta se realiza con vagina artificial (VA) o por electroeyaculacin (EE; Palmer et al., 2005). Los toros Bos
taurus (mansos) se pueden colectar con vagina artificial con la ayuda de una vaca en celo (aunque pude no estar en
celo e inclusive puede ser un buey), mientras que los toros indicus, de ganadera de carne (que se consideren
peligrosos) deben ser colectados por medio de la EE para proteger a los operarios.
Existen varios equipos para EE que dependen del operario o tienen un programa automtico que inicia con presionar
un botn. Estos ltimos son muy tiles sobre todo cuando hay poca ayuda de personal. El EE consiste en un
transductor con tres electrodos ubicados centralmente y que se coloca por va rectal una vez se evalan las heces. El
operario colecta el semen en una bolsa e inmediatamente el semen debe ser evaluado.
La evaluacin del semen incluye la determinacin del volumen, color, la motilidad (masal e individual progresiva) y
la morfologa. Con esta informacin se calcula el nmero de espermatozoides viables en la muestra. Despus se
divide este nmero por el nmero deseado por pajilla (generalmente de 20 millones) y se calculan el total de pajillas
posibles con el semen obtenido. Tambin se calcula el volumen de diluyente que se requiere para ese nmero de
pajillas.
Parmetros

Volumen:
3 a 6 cc

Olor:
Suigeneris

pH:
6,4 a 6,9

Apariencia:

Cremosa
Muy buena

Lechosa
Buena

Blanquecina lechosa Regular

Traslcida
Mala

mayor a 750 x 106

400 a 750 x 106
250 a 400 x 106
menor a 200 x 106

Motilidad masal (4x o 10x)

Semen muy bueno: ondas oscuras marcadas con rpido movimiento.
Semen bueno: ondas menos oscuras que el anterior, marcadas con movimiento moderado.
Semen regular: ondas claras con movimiento muy ligero.
Semen malo: no hay ondas, se observan los espermatozoides inmviles
Motilidad individual: diluido (400x)
Muy bueno:
> 80 %
Bueno:
60 79%
Rregular:
40 59%
Malo:
< al 40%
Morfologa
Anormalidades Primarias
Total
Muy bueno
<10
< 25%
Bueno
10 - 19%
26-39%
Regular
20 - 29%
40-59%
Malo
> 29%
>59%

Ejemplo
Volumen:
Concentracin
Morfologa normal
Motilidad

10 ml
800 millones
80%
80%

TOTAL DE ESPERMATOZOIDES VIABLES

10 x 800 x 0.8 x 0.8 = 5120 millones totales
TOTAL DE PAJILLAS
5120 millones / 20 millones = 256 pajillas
VOLUMEN FINAL PARA PAJILLAS DE 0.5 ML
256/2= 128 ml
VOLUMEN DE DILUYENTE
128-10 (del semen) = 118ml
El diluyente que se aade para congelacin generalmente es del tipo TRIS (buffer), El diluyente debe contener
sustancias inicas o no inicas que mantengan la osmolalidad del medio (TRIS), una fuente de lipoprotena de alto
peso molecular (yema de huevo, leche descremada), una fuente de energa como fructosa o glucosa, y un
crioprotector. Existen varios tipos de crioprotectores: Los que penetran la membrana como son el 1,2-Propanodiol
(PROH), el Dimetilsulfxido (DMSO), el Etiln-Glicol (EG) y el Glicerol; los que no penetran la membrana como,
Sacarosa, Glucosa, Dextrosa, Polivinil-pirrolidona (PVP), Dextran, Polietilen-glicol (PEG). De estos el ms
utilizado para la criopreservacin de semen bovino es el glicerol a una concentracin final en el diluyente del 7%.
El diluyente puede venir en dos fracciones o en una fraccin. Si viene en una fraccin (glicerol 7%) simplemente se
aade el diluyente al semen (lo ms rpido posible despus de la colecta). Si son dos fracciones, lo que implica es
que una fraccin es simplemente buffer (Fraccin A) y la otra contiene el crioprotector que generalmente es glicerol
al 14% (fraccin B). Cuando son dos fracciones la mitad del diluyente es A (ej 64 ml) y la otra mitad es B (ej 64
ml). La primera fraccin se aade a temperatura ambiente y la segunda fraccin se aade a 4-5C.
Independiente de si es una fraccin o dos el semen, una vez diluido debe empezar una curva de fro lenta para que
ste llegue a 5C en un lapso de 2 horas. Una vez se logran los 5C, si hay que aadir la fraccin B, sta se aade
tambin a 5C. Despus de diluido completamente el semen viene el siguiente paso que es el periodo de equilibrio
que puede durar de 2-24 joras y se realiza a 5C. En este tiempo el crioprotector penetra las membranas del
espermatozoide para protegerlo de los daos que se pueden generar durante la criopreservacin y la descongelacin.
Despus de alcanzado el equilibrio, se congela el semen a vapores de nitrgeno lquido (-120C) por un lapso de 10
minutos y luego se sumergen las pajillas en el nitrgeno para ser almacenadas.
Muy importante el proceso de evaluacin del semen postdescongelacin. Se considera que el semen apto para usar
en inseminacin artificial convencional, debe tener al menos 10 millones de espermatozoides viables a la
descongelacin, y este semen debe tener una motilidad progresiva mnima del 30-35%. Tambin se le debe realizar
una prueba de resistencia que consiste en evaluar la motilidad del semen por dos horas. El semen debe tener al
menos 5% de motilidad a las dos horas de descongelado. Tambin se debe tomar una pajilla y enviarse para cultivo
microbiolgico.
Despus de aprobado, las pajillas se empacan en escalerillas que pueden contener entre 10-20 pajillas. Aun que
tambin hay goblets que permiten el empaque a granel.

Sexado de semen
Una de las demandas ms grandes en la produccin bovina actual es la de poder controlar el sexo de la cra. En
general, la produccin bovina se ve favorecida con la produccin de terneras y solo en contadas ocasiones son
econmicamente rentables los terneros (machos). Inicialmente el sexaje fue una tcnica asociada a la produccin de
embriones, donde se realizaba una biopsia del embrin, se realizaba PCR de las clulas extraidas y de esta manera se
decida solo transferir las hembras. Esta tcnica no cumpli las expectativas debido a que la tasa de preez despus
de la biopsia del embrin era significativamente menor y se prefera entonces transferir todos los embriones. La
tcnica del ultrasonido (US) tambin permiti la determinacin del sexo fetal (ya no del embrin) hacia los 60-70
das de gestacin. Sin embargo, una vez se detecta un macho, ya la gestacin est avanzada y la induccin del aborto
sera indeseable en trminos econmicos porque se incrementaran significativamente los das abiertos.
Recientemente (2001), lleg la tecnologa del semen sexado de forma comercial, que parecera ser el sueo hecho
realidad. Sin embargo estamos lejos de que est tecnologa sea utilizada de rutina pues todava el sistema es costoso
e ineficiente. El propsito de esta revisin es explicar cmo se realiza el sexaje del semen bovino y discutir sus
aplicaciones en al produccin bovina actual.
Mtodos de sexaje del semen
Hasta este momento el nico mtodo que se considera aceptable para el sexaje del semen es el de citometra de flujo
(Sharpe and Evans, 2009). El proceso consiste en la utilizacin de un colorante que se adhiere al DNA, Hoechst
33342, y que permite diferenciar la cantidad de DNA presente en el cromosoma Y o X (un 4% ms de DNA) de
cada spz (Garner, 2009). El citmetro de flujo permite separar uno a uno los spz para as poder detectar con el rayo
ultravioleta (UV) la cantidad de DNA a travs de la cantidad de luz emitida por el colorante. Adicionalmente se
aade otro colorante, yoduro de propidio (PI) que permite determinar los spz muertos o daados y de esta manera
separarlos de los spz sexados y viables (Figura 1).

Figura 1. Proceso de sexaje del semen (Tomado de Seidel, 2007)

La tecnologa ha dado pasos gigantes, logrndose una eficiencia del 85-90% para el bovino, que es la especie con
mejores resultados. Con las modificaciones tecnolgicas, hoy en da se producen diez dosis seminales cada una con
dos millones de spz, por hora (Garner, 2006). Esto se podra considerar significativamente mejor que los ensayos
inciales, pero solo el 50% de los spz se logran sexar y el resto debe ser descartado (Seidel, 2007).

Se han reportado diferencias entre la cantidad de DNA que separa el spz Y o el spz X siendo ms marcada en la
Chinchilla y dentro de los bovinos, la raza Jersey es la que ms diferencias muestran entre la cantidad de DNA entre
el cromosoma Y versus el X. Por consiguiente la tcnica de sexaje requiere ser estandarizada para cada especie y
raza (Garner, 2006).
Se cuestiona si el colorante que se adhiere al DNA pueda crear alteraciones genticas en el embrin resultante; sin
embargo los estudios muestran que, a pesar de que el colorante persiste en el embrin hasta la etapa de 8 clulas, no
se han detectado anomalas genticas en los terneros nacidos por esta tcnica. Vale la pena resaltar que faltan
estudios epidemiolgicos que realmente confirmen esta aseveracin (Tubman et al., 2004).
Inconvenientes del semen sexado
El principal inconveniente del proceso es el costo del equipo. El equipo cuesta alrededor de 350.000.oo dlares y
adicionalmente su mantenimiento tambin es costoso.
Con relacin al proceso, un inconveniente importante es la baja velocidad con la que se separan los spz y la
alteracin en el potencial fertilizable de cada spz. Inicialmente la tcnica era muy lenta y para poder tener resultados
aceptables, se empleaban tcnicas como la inyeccin intracitoplasmtica (ICSI) muy utilizada en humanos,
inseminacin oviductal (humanos) y la produccin de embriones sexados por tcnicas in vitro (bovinos). Hoy en da
la tcnica se ha vuelto ms eficiente logrndose que la inseminacin artificial (IA) convencional alcance niveles
comerciales interesantes; sin embargo, solamente se consiguen tasas de preez aceptables en novillas (de Graaf et
al., 2009).
El proceso no se ha podido generalizar con todos los toros debido a que solo los toros de alta fertilidad pueden ser
sexados, ya que las dosis seminales deben ser de 2-5 millones de spz para que el proceso sea comercialmente
factible.
La razn por la que el spz sexado tiene menor fertilidad aun no es clara. Se discute que la dilucin del semen durante
el proceso de sexado es deletrea debido a la remocin de lpidos y protenas protectoras del spz presentes en el
plasma seminal. Adicionalmente se considera que la adicin del colorante para deteccin del cromosoma X o Y, la
exposicin a la luz UV, as como las altas temperaturas y los cambios de presin durante el sexaje alteraran dicha
capacidad fertilizante. Por esta razn la capacidad fertilizante de los spz sexados est afectada tanto por los daos
que sufre el spz per se y la dosis seminal tan baja que se utiliza (de Graaf et al., 2009).

Resultados en campo
La principal aplicacin de campo es la IA de novillas. Se logra un mejoramiento significativo superior al la tcnica
tradicional, se incrementa el nmero de hembras producidas, reduciendo el despaje de terneros macho recin nacidos
(Weigel, 2004). Tambin se reduce la tasa de distocia y de problemas puerperales asociados a stas (Seidel, 2003).
Seidel et al., (1999) realiz un estudio en novillas, evaluando las tasas de preez para diferentes dosis seminales y
diferentes sitio de deposicin del semen (cuerpo o punta del cuerno). Segn ese estudio no hubo diferencias
significativas en tasas de preez con dosis bajas, versus dosis tradicionales (20 millones) ni tampoco hubo
diferencias entre los dos sitios de deposicin del semen.

Tabla 1. Resultados de tasas de preez con semen sexado (Seidel et al., 1999).

En Dinamarca se realiz un estudio con un nmero significativo de hatos (N=60). En dicho estudio la dosis seminal
fue de 2 millones de espermatozoides (spz) con una motilidad mnima del 35%. Solo se inseminaron novillas en
excelente condicin corporal. Las tasas de preez fueron un 5-10% menores comparada con la de las novillas
inseminadas con 15 millones de spz no sexados y el 90% de los partos fueron de terneras (Borchersen and Peacock,
2009).
No se recomienda la utilizacin de semen sexado en novillas sincronizadas para inseminacin a tiempo fijo (IATF)
ya que las tasas de preez tambin son menores. Por consiguiente para lograr la mejor eficiencia se deben inseminar
novillas en buena condicin corporal y a celo detectado (Seidel, 2007).
Dentro de las mltiples aplicaciones del semen sexado estara en la industria de transferencia de embriones (ET). Un
estudio japons report el uso de semen sexado en novillas y vacas Holstein superovuladas. Las novillas
superovuladas fueron inseminadas con 10 millones de spz a las 12 y 24 horas de iniciado el celo. En este estudio no
se encontraron diferencias significativas en el nmero de embriones recuperados ni en la calidad de los mismos. En
ese mismo estudio se compar a nivel de campo, la produccin de embriones con semen sexado entre vacas y
novillas. Se encontr que las novillas produjeron un mayor nmero de embriones fertilizados que las vacas.
Tambin se encontr que inseminar dos veces (cada una con 5 millones de spz daba ms embriones que inseminar
una sola vez. Otro importante hallazgo en este estudio, es la diferencia que se encontr con cada uno de los Toros.
Es decir que hay toros cuyos spz sobreviven mejor al sexaje que otros y por consiguiente los toros deben ser
evaluados en su potencial fertilizante despus del sexaje, tanto para programas de IA convencional como para
programas de ET o de produccin de embriones in vitro (Hayakawa et al., 2009).
Un estudio en Finlandia, similar al anterior, evalu los resultados de ET en novillas y vacas Holstein, pero esta vez
utilizaron dosis de 2 millones de spz sexados inseminando cada 12 horas por 2-4 veces. En este estudio nuevamente
se encontr que en las novillas no haba diferencias significativas en el nmero o calidad de los embriones obtenidos
pero en las vacas si hubo una reduccin sustancial (de alrededor de un 50%) en el nmero de estructuras fertilizadas.
En este estudio tambin se compar si las tasas reproduccin de embrioines mejoraban si el semen se depositaba en
la punta del cuerno de cada lado o si se depositaba todo el semen en el cuerpo del tero. Este estudio no encontr
diferencias significativas a este respecto (Peippo et al., 2009).
El efecto de la dosis seminal sobre las tasas de preez tambin ha sido evaluado. Se evaluaron dosis desde 1 a 6
millones de spz y se compar la deposicin de semen en el cuerpo del tero o en la punta del cuerno uterino
ipsilateral a la ovulacin. No hubo diferencias entre los dos sitios de deposicin del semen, ni tampoco hubo
diferencias significativas en las tasas de preez con dosis desde los 1.5 millones de spz (Seidel et al., 1999; Seidel y
Schenk, 2008).
Comentarios finales
La criopreservacin de semen puede tener dos propsitos: para uso interno o para comercializacin. Si es para uso
interno el procedimiento puede ser efectuado a nivel de finca, pero si es para uso comercial este proceso debe ser

realizado en centros de colecta y congelacin de semen debidamente acreditados por el ICA.

En cuanto a la utilizacin de semen sexado, a pesar de que se ha avanzado mucho en el proceso, todava las tasas de
preez son bajas en vacas y por consiguiente su uso se restringe principalmente a novillas frtiles. Tambin se ha
explorado su uso a nivel de produccin de embriones in Vitro, donde existe mucha variacin entre los toros. El
semen sexado no es para todos los toros y por ende no se encuentra disponible semen sexado de todos los toros.

Referencias
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