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Rodrigo A. Moreno y Marco A. Mndez. 2009. Mtodos de reconstruccin filogentica

para caracteres morfolgicos y moleculares. Gua de pasos metodolgicos para
principiantes en sistemtica filogentica. Versin 1.1. Laboratorio de Gentica y
Evolucin, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile. 33 pp.

Este documento es propiedad intelectual del Laboratorio de Gentica y Evolucin, Facultad

de Ciencias, Universidad de Chile.

-2009-

RA Moreno & MA Mndez

Introduccin
La presente gua que ponemos a disposicin como material docente para el curso de
postgrado Procesos Evolutivos: Mtodos de Reconstruccin Filogentica de la
Universidad de Chile, tiene como objetivo brindar apoyo metodolgico a los estudiantes
que recin se inician en el estudio de la sistemtica filogentica. Hemos querido
ejemplificar de forma simple los mtodos rutinarios que se aplican en las reconstrucciones
filogenticas para evaluar hiptesis en ecologa y evolucin. En esta gua se presentan
detalladamente los pasos metodolgicos y los programas computacionales informticos ad
hoc para reconstruir hiptesis filogenticas basadas en caracteres o rasgos morfolgicos y
moleculares (secuencias nucleotdicas).
Esperamos que este material contribuya a desarrollar en trminos pedaggicos la habilidad
de los estudiantes de comprender el uso adecuado de cada herramienta y su potencial
utilidad y restriccin metodolgica e interpretativa desde el punto de vista estadstico y
biolgico. Finalmente, entregamos las directrices como realizar anlisis filogenticos
utilizando mtodos como Neighbor Joining, Mxima Parsimonia, Mxima Verosimilitud
(Maximum Likelihood) e Inferencia Estadstica Bayesiana en distintas plataformas
computacionales en su mayora de libre distribucin.
A continuacin se procede a mostrar con ejemplos tipos la forma de iniciar el anlisis de los
datos en una seccin dedicada a caracteres morfolgicos y una segunda a caracteres
moleculares. Cabe destacar que esta gua esta desarrollada exclusivamente para efectuar
anlisis en ambiente Windows XP.

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1.- Reconstruccin filogentica para caracteres morfolgicos

Procedimiento

1) Abrir bloc de notas

2) Proceda a crear un archivo (matriz) en lenguaje #NEXUS
Ejemplo tipo: Vertebrados

3) Defina el grupo externo outgroup [por convencin se puede rellenar con ceros]
4) guarde su archivo como Vertebrados. nex
5) Este archivo con extensin nexus podr ser utilizado en la plataforma del software PAUP
[Phylogenetic Analysis using Parsimony *and other methods]

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Anlisis Filogentico de Mxima Parsimonia en Software PAUP

Citas
Swofford, D.L. 2002. PAUP*: Phylogenetic analysis using parsimony (*and other
methods). Version 4. Sinauer, Sunderland, Massachusetts.
Page, R. 2001. TREEVIEW 1.6.6. Tree drawing software for Apple Macintosh and
Windows. Disponible en http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html.
Procedimiento
1) Abrir PAUP
2) Abra el archivo tipo Vertebrados. nex

3) Ejecute los siguientes comandos

_ = un espacio
3.1. Defina su tipo de Bsqueda
alltree
Bsqueda Exhaustiva: <12 taxa
hsearch
Bsqueda Heurstica
bandb
Bsqueda Heurstica: [Branch and Bound]

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3.2. outgroup _celacanto [definir Outgroup - ver archivo Nexus]

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3.3. describetree

Descripcin de los datos [estadsticos: Largo rbol, IC, IR]

3.4. ACCTRAN

Algoritmo de Optimizacin del estado del carcter por

defecto de PAUP
comando para cambiar el criterio de Optimizacin
[Optimizacin del estado del carcter por DELTRAN]
Mostrar los rboles

3.5. pset_opt=deltran
3.6. showtree

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3.7. contree

rbol de Consenso

3.8. savetree
Guardar rbol [archivo queda con la extensin. tree]
3.9. bootstrap_nrep=10000 Soporte de los nodos (rbol de consenso del 50% de la regla
de la mayora)

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3.10. savetree_file= Vertebrados.tree_from=1_to=1_brlens=yes Salvar el rbol como

archivo con largo de ramas
(filograma)

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En su carpeta aparecer Vertebrados con extensin tree para ser desplegado en el software
Treeview. Recuerde ir al men Tree y seleccione show internal Edge labels para que
despliegue los valores de soporte de los nodos obtenidos en su anlisis de Bootstrap.
Guarde la figura como Save as Graphics y seleccione la extensin Enhaced metafile
(emf).

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Otros comandos de utilidad
3.11. set_criterion=dist

Cambio de criterio a mtodo de distancia

nj

Neighbor-Joining [vecino ms cercano]

set_criterion=parsimony

Cambio de criterio a mtodo de Mxima Parsimonia

3.12. exclude_uninf

Excluir caracteres no informativos

3.13. includeall

Incluir todos los caracteres

3.14. showmat

Mostrar matriz de datos

3.15. describetree/apolist

Muestra la lista de apomorfas de la matriz

4) utilize el software TREEVIEW para desplegar grficamente el(los) rbol(es)

recuperados.
5) Cierre PAUP.

Nota: El procedimiento es similar cuando se utiliza una matriz con secuencias

nucleotdicas.

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2.- Reconstruccin filogentica para caracteres moleculares

Procedimiento
1) Para obtener secuencias nucleotdicas utilize la plataforma de Genbank
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html
2) Seleccione en el men Search Nucleotide
3) Posteriormente en el buscador For coloque el taxn de inters y el tipo de
marcador(es) molecular(es).

4) Realice click en el n de acceso de Genbank y baje download la secuencia en formato

FASTA

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5) Genere una carpeta con las secuencias recuperadas en GenBank

6) Cierre la pgina.
7) Una vez obtenida las secuencias nucleotdicas se procede a generar una base de
secuencias en las plataformas CLUSTALX y BIOEDIT para realizar los alineamientos de
secuencias nucleotdicas.
Procedimiento CLUSTALX
Extensin .fas (formato FASTA)
Cita
Thompson, J.D., Gibson, T.J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D.G. 1997. The
CLUSTAL X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided
by quality analysis tools. Nucleic Acids Research 25: 4876-4882.
Para cada archivo realizar el siguiente procedimiento:
1) Abrir el Programa CLUSTALX y dentro de ste, abra el archivo .fas.
2) Proceder a alinear las secuencias utilizando la opcin que viene por defecto
Multiple Aligment Mode y vaya al men alignment y ejecute Do complete
alignment.
3) En su carpeta aparecer el alineamiento efectuado con la extensin .aln
4) Cierrar el programa CLUSTALX

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Procedimiento BIOEDIT
Cita
Hall, T.A. 1999. BIOEDIT: a user-friendly biological sequence alignment editor and
analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series, 41: 95-98.
1) En su carpeta aparecer el alineamiento efectuado con la extensin .aln
2) Abrir Bioedit
3) Seleccionar Edit para cortar secuencias y elimine en el men edit delete sequence la
secuencia Clustal Consensus.
4) Guardar y cerrar Bioedit

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Procedimiento MEGA4
Cita
Tamura K, Dudley J, Nei M & Kumar S (2007) MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics
Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 24: 1596-1599.
1) Abrir el Programa MEGA4
2) En el men File elegir la opcin Convert To MEGA Format. Esta opcin permite
convertir el archivo .aln en un archivo .meg

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3) Abrir el archivo .meg (Open Data en el men File); ocupar la opcin Neighborjoining en el men Phylogeny

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4) Volver a realizar este anlisis pero utilizando adicionalmente la opcin Bootstrap

5) Guardar los rboles correspondientes

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Software PAUP (Phylogenetic Analysis using Parsimony *and other methods)

1.- Anlisis Filogentico de Mxima Parsimonia en Software PAUP (idem a pgina 4)

2.- Anlisis Filogentico de Mxima Verosimilitud (Maximum Likelihood)

Archivo Tipo: Grupo 16s [secuencias nucleotdicas de especies de anfibios del gnero
Bufo]

Procedimiento
1) Buscar el mejor modelo de evolucin molecular que se ajusta a los datos para ello
utilizar el software MODELTEST (incluye 56 modelos). Para el uso en ambiente Windows,
utilizar WINMODELTEST.
2) Abrir matriz de datos originales en formato nexus en PAUP.

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3) Abrir adems en PAUP el archivo modelblock4.txt que se encuentra en la

carpeta System files de WINMODELTEST; esto permite calcular los
parmetros de los modelos evolutivos en PAUP creando el archivo model.scores
en la carpeta System files de WINMODELTEST.

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4) Abrir WINMODELTEST, hacer click en New Outfile y luego en Run Modeltest;

esto crear un archivo outfile en la carpeta System files en que aparecern los
parmetros de los modelos escogidos con los criterios de hLRT (Likelihood Radio TestPrueba de Razn de Verosimilitud) y AIC (Criterio Informativo de Akaike).

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5) Agregar al final del archivo Nexus original las lneas de comandos que aparecen en
el archivo outfile bajo el modelo escogido (Seleccione el Criterio de Akaike)

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6) Ejecutar el archivo Nexus modificado en PAUP; cambie el criterio a likelihood y realizar

una bsqueda exhaustiva o heurstica y un bootstrap no-paramtrico. Guarde las salidas
(outputs) y cierre PAUP.

set_criterion=likelihood. [Cambio de criterio a mtodo de Mxima Verosimilitud].

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7) Recuerde de seguir los mismos pasos que se utilizaron para la reconstruccin por
Mxima Parsimonia y grabe su rbol el cul aparecer en su carpeta como grupo16s con
extensin tree para ser desplegado en el software Treeview. Recuerde ir al men Tree y
seleccione show internal Edge labels para que despliegue los valores de soporte de los
nodos obtenidos en su anlisis de Bootstrap.
Outgroup Barenarum

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Anlisis Filogentico de Inferencia Estadstica Bayesiana

Plataforma: MRBAYES
Cita
Huelsenbeck, J.P. & F. Ronquist. 2001. MRBAYES: Bayesian inference of phylogenetic
trees. Bioinformatics 17: 754-755.
Procedimiento
1) Copie el archivo Nexus (original) y trasladelo a la carpeta de MRBAYES. Ahora ejecute
MRBAYES con los comandos que se indican ms abajo.
Ejemplo archivo Tipo: Rag1CCQ [secuencias nucleotdicas del gen nuclear Rag 1 recombination activating gene (RAG) - de gneros de anfibios]
exe Rag1CCQ.nex

2) Defina el outgroup
Outgroup Leiopelma

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3) Especificar la estructura del modelo

lset_nst=6_rates=propinv

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4) Especifique algunos parmetros del anlisis

mcmcp_ngen=500000_samplefreq=1000_savebrlens=yes

5) Iniciar el anlisis: mcmc

Para detener el anlisis: n

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6) Una vez terminado el anlisis realizar un burnin

sump_burnin=10

sumt_burnin=10

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7) Ir a la carpeta de MRBAYES y seleccionar el archivo. CON

8) Visualizar el rbol de consenso del 50% de la regla de la mayora desplegado en

Treeview donde se observan las probabilidades a posteriori.

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