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Protocolo y Tcnicas
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ELISA Directo.
Consta de las siguientes etapas:
Fijacin al soporte insoluble (tapizado) de antgenos especficos. Lavado para eliminar los antgenos fijados deficientemente o no fijados.
Adicin de anticuerpos marcados (conjugados) con una enzima; si los anticuerpos reaccionan con los antgenos, el complejo quedar
solubilizado. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea.
Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.
ELISA Indirecto.
Consta de las siguientes etapas:
Fijacin al soporte insoluble de antgenos especficos para los anticuerpos objeto de estudio. Lavado para eliminar los antgenos fijados
deficientemente o no fijados.
Adicin del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarn especficamente con los antgenos fijados al soporte. Lavado para
eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
Adicin de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los anticuerpos especficos aadidos en el paso anterior y
que se encuentran fijados a los antgenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea.
Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.
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Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes grupos:
ELISAs para detectar antgenos: ELISAs sndwich.
ELISAs para detectar anticuerpos: ELISAs indirectos.
La fase slida debe ser de un tipo que permita un fcil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unin de
antgenos o anticuerpos sobre su superficie. Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350L son especialmente ventajosas para procesar
un elevado nmero de muestras y un vez tapizadas, el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco
y a baja temperatura. Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse estriles y con o sin tapa.
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Dilucin del antgeno o anticuerpo en tampn carbonato (pH 9,6) e incubacin posterior durante 3h a 37C o 16h a 4C.
Tratamiento a 40-50C en tampn fosfato (PBS) o en agua fisiolgica tamponada pH 7,2-7,4 hasta desecacin.
Solucin de lavado.
Solucin salina con Tween 20 como agente tensioactivo:
ClNa ...................................................
Tween 20 ...........................................
Agua destilada ....................................
8,5gr
0,5mL
1000mL
Conjugados.
La enzima escogida como marcador debe unirse fcilmente a antgenos y anticuerpos, encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener
un substrato cromognico o fluorognico conveniente y de fcil preparacin. Las enzimas ms utilizadas son fosfatas alcalina, peroxidasa de
rbano y -galactosidasa; a continuacin se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una as como los substratos que se
emplean con cada una de ellas.
Las operaciones de marcado o conjugacin, llevan implcitas dos etapas:
Purificacin de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacin generalmente salina de las protenas del antisuero,
seguida de una dilisis y purificacin de la fraccin de anticuerpos mediante filtracin molecular, cromatografa o separacin en gradiente de
densidad mediante ultracentrifugacin. Finalmente, se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mg/mL.
Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehdo o el del mperiodato sdico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales).
VENTAJAS
presencia de alcoholes.
DESVENTAJAS
SUBSTRATOS
Producto insoluble
Producto soluble
y
y
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MUG (fluorescente)
; em=440nm
AMPGD (luminiscente)
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VENTAJAS
y
Fosfatasa alcalina
DESVENTAJAS
y
y
y
adecuadamente.
Puede almacenarse a +4C durante ms
de 6 meses.
Disponible como enzima libre o como
conjugado.
Ms estable que la peroxidasa.
Pequeo tamao ( 86kDa).
Amplia variedad de substratos comerciales
disponibles.
SUBSTRATOS
Producto insoluble
Producto soluble
BCIP/NBT
y
y
p-NPP:
; Amarillo: =405-410nm
4-MUP (fluorescente)
; ex=360nm; em=440nm
AMPPD (luminiscente)
VENTAJAS
y
y
y
y
y
y
Peroxidasa
DESVENTAJAS
adecuadamente.
Puede almacenarse a +4C durante ms
de 6 meses.
Disponible como enzima libre o como
conjugado.
Bastante barata.
Pequeo tamao ( 40kDa).
Relacin de conjugacin 4:1.
No causa impedimento estrico.
Amplia variedad de substratos comerciales
disponibles.
interfieren en su actividad.
SUBSTRATOS
Producto insoluble
y
y
y
TMB:
; Azul: =650nm
; Amarillo: =450nm
DAB
4CN
Producto soluble
y
y
y
y
y
y
y
y
y
TMB:
; Azul: =650nm
; Amarillo: =450nm
ABTS:
; Azul verdoso: =405-410nm
OPD
; Amarillo: =490nm
HPPA (fluorescente)
; ex=320nm; em=404nm
HPA (fluorescente)
Luminol (quimioluminiscente glow)
Polifenoles (quimioluminiscente flash)
Esteres de acridina (quimioluminiscente
flash)
Luciferina (bioluminiscente glow)
Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccin de IgGs y es la utilizacin de protena A o G
marcadas con peroxidasa.
Una vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacin; esta conservacin se suele realizar mediante
liofilizacin, congelacin a 70C o filtrado estril y conservacin a -20C mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado estril.
La bsqueda de la concentracin ptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado; para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados, se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1:100 hasta 1:2000) frente a sucesivas diluciones de
antisuero en placas tapizadas con antgeno a concentracin idnea. Aquella dilucin del conjugado que produzca menor reaccin inespecfica
(menor color de fondo o background) con muestras negativas e implique una clara distincin de las muestras positivas, ser la ptima. La
eleccin de una concentracin de conjugado ptima va completamente ligada a planteamientos econmicos en los que se ha de procurar el
mayor ahorro del conjugado an a costa de aumentar el tapizado.
La eleccin del substrato es de gran importancia para la estandarizacin del mtodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta, como son
sensibilidad, especificidad, repetibilidad, facilidad de lectura y complejidad de preparacin, as como estabilidad despus de la parada de la
reaccin.
Hoy en da existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y, por lo tanto, el mtodo de deteccin de los complejos antgeno-anticuerpo
y as tenemos sistemas de deteccin colorimtricos, fluorescentes y luminiscentes que a continuacin pasamos a desarrollar:
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Colorimetra. Los ensayos colorimtricos dan un producto de reaccin coloreado que absorbe luz en el espectro visible, siendo la densidad
ptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medido.
Para todos los ensayos enzimticos, la etapa final es la adicin del substrato enzimtico, el cual da lugar a productos de reaccin solubles o
insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccin. Para ensayos colorimtricos, la tasa de desarrollo de color es
proporcional, dentro de un cierto rango, a la cantidad de conjugado enzimtico presente.
Tanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina, tienen substratos que dan productos de reaccin coloreados solubles. La decisin de qu
substrato es el mejor para cada tipo de ensayo, depende de la sensibilidad deseada, los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccin
que se vaya a utilizar. Para ensayos que necesitan ser muy sensibles, el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccin
muy rpida; sin embargo, para ensayos que requieren un rango dinmico amplio, son deseables substratos que den producto de reaccin en
un perodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio, dependiendo de la cantidad de muestra presente.
Para ensayos que se vayan a parar (se vaya a aadir a la reaccin, tras una cantidad de tiempo definido, un inhibidor qumico que pare el
desarrollo de color y permita la deteccin dentro de un perodo razonable de tiempo), es necesario la utilizacin de un substrato que tenga
una tasa de reaccin lenta (15-30 minutos hasta su finalizacin); sin embargo, cuando se vayan a realizar ensayos cinticos de la reaccin,
debera usarse un substrato que tenga una tasa de reaccin rpida (5 minutos o menos).
Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimtica (temperatura, pH, fuerza inica, composicin del tampn,
reduccin del substrato, formacin de productos inhibidores, feed-back por formacin del producto final, desnaturalizacin de la enzima y, en
algunos casos, exposicin a la luz), los que ms afectan al ensayo, hoy en da, son el tiempo de reaccin, la temperatura y la exposicin a la
luz.
Antes de leer la DO y/o tras la adicin de la solucin de parada, es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para
asegurar el cese por completo de la reaccin (ensayos de punto final solamente) y la total dispersin del producto de color. La precisin del
ensayo puede ser drsticamente mejorada aadiendo este simple paso al protocolo. El efecto fsico que la agitacin de la placa antes de la
lectura tiene en la DO resultante es muy importante. Los colormetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo, lo cual
implica que una placa no agitada tendr pocillos que se asemejarn ms al formato A de la figura, ya que, debido a que la disolucin del
producto de la reaccin es lenta, si no es mecnicamente agitada o mezclada, el producto coloreado de la reaccin estar concentrado en la
superficie del pocillo (donde la enzima est localizada) y el lector no estar midiendo la verdadera DO del pocillo. Cuando s se mezcla, el
producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato B de la figura), y el lector detectar la verdadera DO del
pocillo.
Hay varias formas de realizar esta mezcla: hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez, de tal manera que esas placas puedan ser
agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector; hoy da, muchos, si no la mayora, de los lectores de microplaca llevan incorporados
agitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser ledas. Ambos mtodos (agitadores internos o externos),
cuando son usados correctamente, pueden tener efectos positivos en la precisin del ensayo.
Fluorescencia. Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacin de los colorimtricos; la enzima convierte el substrato
en un producto de reaccin que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda, siendo las unidades relativas de
fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizado.
En comparacin con los mtodos colorimtricos, los ensayos de fluorescencia son ligeramente ms sensibles y, lo que es ms importante,
amplan el rango de medida, en oposicin al lmite de 2,0-4,0 DO impuesto en los ensayos colorimtricos.
Un substrato fluorognico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacin, la cual debera ser proporcional a la cantidad de
conjugado enzimtico presente. El substrato debera ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz. Asimismo, el producto de la
reaccin enzima-substrato debera tener distintas longitudes de onda de emisin y de excitacin, ya que el substrato, por si mismo, no
debera ser fluorescente.
Los ensayos fluorimtricos estn sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la seal inespecficamente. La deteccin por
fluorescencia es susceptible a cambios en el pH, temperatura, concentracin inica, concentracin de detergente, secado, y a la matriz slida,
lo cual puede conducir a distorsin de luz, un elevado background, y fenmenos de apagamiento y/o blanqueamiento. El fenmeno de
light scattering (dispersin de luz) est ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con molculas, partculas en
suspensin o la superficie de la microplaca. Por esta razn, es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillos y utilizar
reactivos qumicos de elevado grado de pureza. Las placas negras opacas y las tiras de la ms alta calidad estn diseadas para reducir esta
dispersin de luz, ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detector.
El background (fluorescencia de fondo) y/o la autofluorescencia son el principal problema para la realizacin de ensayos en placas de 96
pocillos. Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina, bilirrubina, partculas de celulosa,
drogas), los componentes de los diluyentes (iones metlicos), el material de la placa (tipo de plstico utilizado) y la contaminacin variable
(partculas de polvo, huellas digitales). El background puede ser eliminado de tres formas: mediante el diseo del ensayo (dilucin de la
muestra para ensayos homogneos y filtrado de los reactivos a travs de una membrana de 0,45m para ensayos heterogneos), mediante
la instrumentacin y mediante una estricta limpieza. El fenmeno de apagamiento (quenching) se caracteriza por una reduccin
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inespecfica de la seal y es causado por la absorcin de la emisin por el oxgeno disuelto, por lo que los reactivos pueden ser desgasificados
antes de su utilizacin para eliminar este efecto. El fenmeno de blanqueamiento (bleaching) o decoloracin (fading) est tambin
caracterizado por una reduccin en la seal, pero est causado por un exceso en el tiempo de excitacin. Actualmente, no suele ser un
problema debido a la baja energa y corto tiempo de excitacin de los fluormetros actuales.
Otras interferencias que pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura, la estabilidad de la fuente
de luz y el ancho de la banda de excitacin. La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura, por lo que es importante mantenerla
constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos, ya que, pequeas variaciones de un ensayo a otro, pueden ocasionar cambios en la
sensibilidad del mismo.
Muchos de los plsticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes; por ello, es importante elegir una placa que est fabricada
especficamente para fluorescencia. Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos
fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda ms altas), ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y
absorben la luz dispersada) y se eliminan, prcticamente, las contaminaciones cruzadas. Estas placas negras pueden tener fondo opaco o
transparente. Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en clulas, lo cual permite su
visualizacin durante el crecimiento de las mismas, al mismo tiempo que reducen la transmisin de luz lateral o la contaminacin cruzada
durante la deteccin. Con la llegada de los fluormetros para placas de 96 pocillos, que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o
desde la parte superior del pocillo, estas placas han permitido aumentar la versatilidad asociada con el diseo del experimento, p.e., usando
una placa de fondo transparente, se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado
colorimtricamente con TMB) para la primera parte del ensayo, y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado
fluorimtricamente con 4-MUP) para la segunda parte.
Luminiscencia. Al igual que la fluorescencia, la luminiscencia es una variacin del mtodo estndar de ELISA. Una enzima transforma un
substrato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible. La luminiscencia se describe como la emisin de luz por parte de
una sustancia, que regresa desde un estado electrnicamente excitado a su estado original. Las diferentes formas de luminiscencia difieren,
precisamente, en la forma en que se alcanza dicho estado excitado:
8 Fotoluminiscencia: la excitacin se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda, es decir, igual que en la fluorescencia.
8 Bioluminiscencia: la excitacin se alcanza mediante la utilizacin de un compuesto que emite luz al ser degradado, por ejemplo,
luciferina o luciferasa.
8 Quimioluminiscencia: la excitacin se alcanza mediante una reaccin qumica.
Actualmente, es el mtodo disponible ms sensible debido a la posibilidad de multiplicacin y amplificacin de la seal. Las reacciones de
luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz), que son tpicamente proporcionales a la cantidad de muestra presente.
El substrato luminiscente debe ser estable a temperatura ambiente durante todo el perodo que dure el ensayo, y debe ser elegido por su
baja luminiscencia de fondo en estado basal (background), por su capacidad para producir luz intensa en estado activado, por su capacidad
de emitir luz estable durante un perodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia).
Existen dos mtodos de deteccin de luminiscencia:
8 FLASH: es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad mxima de luz en segundos o milisegundos, por lo que es necesario
comenzar la reaccin mientras los reactantes estn frente al sistema de deteccin (fotomultiplicador). Es de capital importancia que el
intervalo de tiempo transcurrido entre la adicin de los reactivos y el proceso de deteccin sea siempre constante.
8 GLOW: consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una seal constante. La luz emitida, a diferencia del color o
la fluorescencia, no se acumula, por lo que la sta debe ser intensa y la reaccin enzimtica prolongada para obtener suficiente seal.
Los aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son: la reaccin puede ser iniciada fuera del aparato de deteccin, por lo que se elimina
la necesidad de dispensacin interna y mezcla dentro del propio lector, la simplicidad del procedimiento, la elevada sensibilidad, la posibilidad
de incrementar la seal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos. Adems, este tipo de reaccin
luminiscente puede ser medido usando un luminmetro, capturando la imagen en una pelcula fotogrfica o mediante sistemas de anlisis de
imagen.
Aunque en teora estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos, los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son ms
homogneos cuando el tiempo de incubacin enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un perodo de estabilizacin de 2 minutos
tras la adicin del substrato y entonces leer inmediatamente las placas).
Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable, y sta ha de estar diseada especficamente para
luminiscencia. Habitualmente son blancas y opacas, con el fondo transparente u opaco; ambas versiones estn diseadas para reducir
contaminacin cruzada y el background ocasionado por la composicin de la resina blanca. Las placas con fondo transparente se utilizan
habitualmente para ensayos luminiscentes basados en clulas, tales como ensayos de proliferacin celular, ya que permiten la visualizacin
de las clulas durante su crecimiento y tambin previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccin.
Tambin son tiles para ensayos dobles con un producto colorimtrico para un primer anlisis y otro luminiscente para un segundo.
Finalmente, se debe optimizar el tiempo de incubacin, realizndose lecturas seriadas hasta encontrar el ptimo, que ser aquel en el que se
encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia. Las reacciones enzimticas colorimtricas siguen curvas del tipo
del que se muestra en la grfica para muestras positivas y negativas, por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia
colorimtrica entre muestras positivas y negativas es mximo.
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Patologa Vegetal
; Enfermedades producidas
En frutales
PPV
CLSV
TRSV
En ctricos
CTV
En patata
PLRV
PVY
PVX
PVA
TRV
En cereales
En guisante
En lpulo
En soja
En ornamentales
En plantas hortcolas
; Enfermedades producidas
; Enfermedades producidas
; Enfermedades producidas
por virus
por bacterias
por Micoplasmas
por hongos
Para descargar el archivo pdf sobre la optimizacin de todos los parmetros de un ELISA pinche sobre el link correspondiente:
Optimizacin de la eleccin de la superficie de la placa.
Optimizacin del tapizado de la placa con la protena/anticuerpo de inters.
Optimizacin del paso de bloqueo de los sitios de unin inespecficos.
Optimizacin de los pasos de lavado para la eliminacin de las uniones inespecficas.
Optimizacin del mtodo de deteccin: colorimetra, luminiscencia y/o fluorescencia.
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