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EN SUELOS CONTAMINADOS
DESIGN AND VALIDATION OF A PROTOTYPE RESPIROMETER
Qumico, Magister en Consultora y Gestin Medioambiental, Investigador de los grupos: ciencias qumicas y
tecnologas sostenibles- QUIMISOST y grupo ambiental de investigacin aplicada GAIA. Universidad de SantanderUDES- , Bucaramanga, Colombia.
2
Estudiante Ingeniera Ambiental. Joven Investigadora Grupo Ambiental de Investigacin Aplicada GAIA. Universidad
de Santander- UDES- , Bucaramanga, Colombia.
3
RESUMEN
Esta investigacin est enmarcada como la primer etapa de un proyecto aprobado y en curso de la facultad de
ciencias exactas fsicas y naturales en la Universidad de Santander (UDES) llamado Diseo y construccin
de un prototipo de respirometro multiparametrico sistematizado la cual pretende ser una herramienta pionera
en la universidad para afianzar conocimientos tericos y prcticos en cuanto a la respirometria, llevarlos a la
prctica y mostrar su aplicabilidad mediante modelos experimentales que permitan observar la eficiencia y
proximidad en la medicin de sus parmetros. Se desarroll, valor y optimiz un prototipo en vidrio nico en
la UDES basado en cinco respirometros modificados de Bartha y cinco de Warburg [8]. Se realizaron
ensayos usando 100 gramos de suelo contaminado con gasolina corriente y se validaron usando muestras
ambientales de suelos contaminados con pesticidas, para este estudio, el diseo experimental se apoya en el
programa Stat Graphics Centurion versin XVI.I este modelo de prototipo basa su confiabilidad en la
reproducibilidad de los datos obtenidos.
Palabras clave: respirometro, prototipo, Warburg, Bartha.
ABSTRACT
This research is framed as the first stage of a project approved and in progress of the faculty of natural and
physical sciences at the University of Santander (UDES) called "Design and construction of a prototype
multiparameter respirometer systematic" which purports to be a pioneering tool in college to consolidate
knowledge and skills regarding the respirometry, put them into practice and show its applicability using
experimental models that allow us to observe the efficiency and proximity to the measurement of its
parameters. Developed, evaluated and optimized a single glass prototype based on the five respirometers
UDES of Bartha and five Warburg (bibliograf.) tests were using 100 grams of soil contaminated with fuel
flow and validated using environmental samples from contaminated soils pesticides, to study the experimental
design is based on the Centurion program Stat Graphics version XVI.I this prototype model reliability based
on the reproducibility of the data.
Words key: respirometric, prototype, Warburg, Bartha.
1.
INTRODUCCION
La Respirometra es una tcnica basada en la medicin del consumo de oxgeno por parte de microorganismos
que trabajan sobre un sustrato orgnico, el cual es degradado y oxidado a CO2. Este mtodo mide el consumo
de oxgeno ms o menos continuamente en el tiempo y es til para: evaluar biodegradacin de sustancias
qumicas especficas; tratabilidad de residuos orgnicos industriales; el efecto de cantidades conocidas de
compuestos txicos en la reaccin de consumo de oxgeno en una muestra de agua residual o de sustancias
qumicas orgnicas; la concentracin medible a la cual un contaminante o un agua residual inhibe la
degradacin biolgica; el efecto en las ratas de oxidacin de varios tratamientos tales como desinfeccin,
adicin de nutrientes, y ajuste de pH; los requerimientos de oxgeno para completar la oxidacin de materia
oxidable biolgicamente; la necesidad de usar cepas adaptadas en otras mediciones bioqumicas de consumo
de oxgeno, tales como la prueba de dilucin de la demanda bioqumica de oxgeno (DBO); y la estabilidad de
los lodos [14].
Los datos respiromtricos se usan como comparacin directa entre el consumo de oxgeno de dos muestras de
ensayo o entre una muestra y un control. Debido a las diferencias entre los usos, cultivos de cepas,
aplicaciones de resultados y entre instrumentos, no se puede definir un procedimiento sencillo para pruebas
respiromtricas que aplique para todos los casos.
La diversidad de mtodos existente, sumada a las diferentes formas de expresar los resultados obtenidos y a
las diferentes interpretaciones de lo que es biolgicamente estable se genera confusin en su uso. Partiendo de
esta base, el objetivo de este trabajo es hacer un prototipo y discusin de las diferentes tcnicas que han sido
propuestas por diferentes autores basados en los ndices respiromtricos.
A nivel regional existe inters por parte del sector industrial en incorporar prcticas que estn de acuerdo con
las polticas Nacionales y mundiales en cuanto a la mejora del medio ambiente, especficamente el inters
radica en el tratamiento de residuos slidos que dejan estas grandes industrias. Un posible candidato que
cumple con estas condiciones es el compostaje, el cual hace posible la revalorizacin de estos desechos
hacindoles reutilizables no slo por la industria que los genera sino tambin pueden ser tiles a nivel
agricola.
Para llegar a un nivel en que se pueda garantizar el xito de este tipo de procedimientos, es necesario hacer
una cuantificacin de los parmetros que intervienen en el proceso de compostaje y no solamente es suficiente
la cuantificacin, es necesario ir ms all. En el proceso de compostaje intervienen varios parmetros fsicos,
qumicos y biolgicos, que constantemente se deben evaluar para hacer una toma de decisiones apropiada,
entonces es indispensable contar con dispositivos que se puedan direccionar a travs de un PC, para as poder
monitorear estos parmetros y as hacer eficiente el proceso.
Por tal razn en esta investigacin en la culminacin de todas sus etapas se propone contruir un prototipo de
respirometro multiparmetrico sistematizado, que permita medir simultnemaente ndices respirometricos
tales como oxgeno consumido, dixido de carbono emitido, pH, temperatura y humedad en un compostaje de
prueba.
1.2 Qu es un Respirmetro?
Un respirmetro es un instrumento que consiste en un pequeo reactor biolgico que sirve para medir
velocidades de respiracin aerobia de una poblacin microbiana en unas determinadas condiciones. El
respirmetro determina la cantidad de oxgeno consumida por unidad de tiempo y de volumen. Algunos
autores consideran al respirmetro como un sensor, ya que consiste en una unidad fsica con una entrada de
muestra externa y una salida de resultados (OUR u otros parmetros) obtenida despus de un procedimiento
interno [17]. Por otra parte, y debido a su condicin de reactor biolgico, los resultados son extremadamente
dependientes de las condiciones de trabajo, por tanto, puede existir una variabilidad en la salida. Esta
variabilidad cuestiona el hecho de que se considere al respirmetro un reactor y obliga a que los resultados de
las respirometras se acompaen de las condiciones de operacin tales como:
La IWA (International Water Association) propuso una clasificacin de los respirmetros en funcin de tres
parmetros bsicos designados por las siguientes letras:
1.3.2 Respirmetro discontinuo (Batch): El aporte de oxgeno depende de dos valores de consigna, un
mximo y un mnimo de concentracin de oxgeno dentro del recipiente donde se lleva a cabo la
respirometra. Se inyecta aire hasta alcanzar el valor mximo de concentracin de oxgeno establecido. Una
vez alcanzado se deja inyectar oxgeno y se espera a que los microorganismos lo consuman, hasta llegar, esta
vez a la consigna mnima y se volver a airear. Se mide el tiempo que emplean los microorganismos en
consumir el oxgeno, con lo que se obtiene la velocidad instantnea de consumo de oxgeno. Este proceso se
repite cclicamente. En cada ciclo este respirmetro funciona como un GSS, si la medida de la concentracin
de oxgeno se hace en el gas, o un LSS, si la concentracin de oxigeno se realiza en el medio lquido.
1.3.3 Respirmetro manomtrico o de Warburg: El oxgeno utilizado se mide con respecto al tiempo
anotando la disminucin de presin en el recipiente donde se est realizando la respirometra, que tiene
volumen constante, es hermtico y se ha de mantener a una temperatura constante. En el recipiente se
introduce la muestra a analizar dejando una cmara de aire y adems, se ha de colocar un vaso con una
solucin de hidrxido potsico (o sdico) para que absorba el anhdrido carbnico producido (Figura 2) de tal
forma que la disminucin de la presin sea una medida del oxgeno consumido. Este es otro ejemplo de
respirmetro GSS, en el que la medida de la concentracin de oxgeno se realiza de manera indirecta y tanto
la muestra lquida como el gas permanecen de manera esttica en el interior del recipiente, sin que exista
renovacin alguna de ambos durante la determinacin respiromtricas.
1.3.5 Respirmetro electroltico: Est formado por el recipiente donde se lleva a cabo la respiracin dotado
en su interior de un absorbedor de CO2 (recipiente con sosa), una clula electroltica y un manmetro, todos
interconectados (Figura 3). A medida que los microorganismos consumen el oxgeno para la oxidacin de la
materia orgnica, se produce una disminucin de presin en el sistema, que es registrada por el manmetro.
ste, a su vez, a travs de un sistema de control, activar la clula electroltica en funcin de dicha
disminucin de presin, tratando as de mantener la presin constante. La cantidad de oxgeno liberado en la
electrlisis es proporcional a la cantidad de energa elctrica que ha sido necesaria suministrar. Registrando
esta energa se puede inferir directamente el consumo de oxgeno. Este sistema nos proporciona un registro y
ajuste automtico y semicontinuo de los cambios de presin que ocurren dentro del vaso de reaccin a causa
del consumo de oxgeno por los microorganismos.
El respirmetro electroltico proporciona una medida directa y continua del consumo de oxgeno en muestras
de efluentes hdricos, aguas residuales, suelos contaminados, disoluciones de compuestos qumicos, etc.
1.3.6 Respirmetro de Bartha: La evolucin de CO2 es usada como un indicador de la actividad microbiana
y descomposicin relativa del contaminante. A tal fin se utilizan equipos segn lo descripto por Pramer y
Bartha (1965) [20].
Estos equipos estn constituidos por un Erlenmeyer, el cual tiene adosado un tubo lateral. El erlenmeyer
contiene el suelo que esta siendo evaluado, y el tubo lateral NaOH 0,097 N donde es retenido el CO 2 liberado
por el metabolismo de los microorganismos presentes. Ambos recipientes deben permanecer cerrados
mediante tapones de goma. El tapn correspondiente al Erlenmeyer, esta atravesado con una jeringa para
inyeccin de agua , y un filtro de aire que permite el libre intercambio gaseoso reteniendo el CO2 del aire que
ingresa en el sistema (ver figura 4). El tapn el tubo lateral, est atravesado tambin, por una jeringa para
inyeccin de NaOH.
2.
2.1
METODOLOGIA
3.
PARTE EXPERIMENTAL
Para la escoger el mejor respirometro modificado de Warburg y Bartha las muestras fueron trabajadas por
triplicado as:
T = 25 C
MUESTRA 1
MUESTRA 2
MUESTRA 3
MUESTRA 4
MUESTRA 5
En todos los experimentos se usaron 100 gramos de suelo y se determin el CO2 para todos los
respirometros; los resultados que se muestran en este articulo son un promedio de los anlisis realizados; para
el filtro de aire presente en algunos modelos se usaron dos perlas de soda caustica (NaOH) y algodn en los
extremos.
El anlisis de las muestras se hizo cada 18 horas, y en algunos prototipos se us el azul de metileno para
registrar el desplazamiento del mismo con el tiempo. Se usaron siempre 30mL de hodroxido de sodio (NaOH
Como agente secuestrante) para luego transferirlo a un beaker de 250mL y complementar con la adicin de
30mL de cloruro de Bario al 1% para posteriormente aforar a 100mL. La titulacin se hizo con cido
clorhidrico (HCl), en el clculo de dixido de carbono se uso la siguiente frmula:
mg de CO2 producido= ((mililitro de hidroxido x Normalidad del hidroxido) - (mililitro de cido x
normalidad del cido)) x 22.
(Ecuacin 1) Fuente: [11].
3.1
3.1.1 Warburg
3.1.1.1 Hiptesis:
La concentracin del contaminante no representa una variacin significativa en la Produccin de CO 2,
medida de la actividad microbiana.
No hay diferencia significativa en las medidas que Proporciona cada uno de los respirometros.
mg CO2
Respirometro 1
mg CO2
Respirometro 2
mg CO2
Respirometro 3
mg CO2
Respirometro 4
mg CO2
Respirometro 5
1000
15,66
15,85
18,4
19,72
24,43
1000
14,76
15,53
12,11
13,63
12,03
1000
14,74
18,64
11,9
11,86
11,63
2000
12,67
17,62
11,9
11,75
12,59
2000
3,78
4,51
3,86
3,09
4,23
2000
3,01
3,87
3,75
2,98
5,85
3000
3,11
3,96
3,68
2,15
3,78
3000
3,78
3,56
2,4
2,77
3,56
3000
2,90
2,41
2,11
1,65
3,98
4000
3,36
2,99
2,46
2,17
4,15
4000
3,16
2,92
1,56
1,24
3,12
4000
2,58
1,54
1,36
0,79
2,52
5000
2,98
1,44
1,67
0,11
2,95
Respirometro
Respirometro de
Warburg
F-Ratio
P-Value
457.699
0,9989
212,21
0,7853
7961,28
0,969666
36,91
0,243112
457,70
0,9989
T = 25 C
MUESTRA 2
MUESTRA 3
MUESTRA 4
MUESTRA 5
3.1.2.1 Hiptesis:
La concentracin del contaminante no representa una variacin significativa en la Produccin de CO 2, medida
de la actividad microbiana.
No hay diferencia significativa en las medidas que Proporciona cada uno de los respirometros.
Con.
Contaminante
mg CO2
Respirometro
1
mg CO2
Respirometro
2
mg CO2
Respirometro
3
mg CO2
Respirometro
4
mg CO2
Respirometro
5
10000
37,86
36,73
36,82
38,88
41,64
10000
38,01
35,63
36.025
37,99
39,91
10000
37,01
35,57
35,88
38,67
39,62
20000
28,65
25,43
26,95
29,11
30,87
20000
24,83
23,76
25,93
29,17
30,87
20000
25,64
24,01
24,83
28,73
31,73
30000
24,83
24,72
26,95
27,62
27,01
30000
28,65
25,84
24,87
27,67
27,73
30000
27,37
26,23
21,76
27,62
27,21
40000
24,92
25,43
21,76
25,91
26,89
40000
24,83
26,79
25,83
25,63
25,63
40000
22,83
21,55
22,55
25,73
26,42
50000
22,74
20,54
22,76
22,04
23,99
50000
12,82
26,23
19,03
22,96
23,01
50000
22,74
18,93
18,67
12,87
24,45
ppm
Fuente: Autores.
Tabla 4 Resultados p-value para el respirmetro de Bartha
Respirometro
Respirometro de
Bartha
Fuente: Autores.
F-Ratio
P-Value
19,59
0,522338
162,43
0,662929
58,31
0,869941
23,09
0,354382
245,73
0,893081
Tabla 5 Obtencin de CO2 en muestras de suelo con el cambio de Herbicida, pH y sacarosa para el mejor respirometro
de Warburg
HERBICIDA
SACAROSA
CO2
pH
mL
gr
mg/kg
ADIMENSIONAL
0,01
245,0
5,6
0,06
253,8
5,8
0,06
253,3
5,7
0,06
251,9
5,8
0,01
244,2
5,5
0,01
244,7
5,6
0,10
219,3
5,1
0,10
222,9
5,0
0,10
219,9
5,1
0,06
253,8
5,8
0,06
253,3
5,7
0,10
219,3
5,1
0,01
245,0
5,6
0,06
251,9
5,8
0,01
244,2
5,5
0,10
222,9
0,10
219,9
5,1
0,01
244,7
5,6
0,06
253,8
5,8
0,01
245,0
5,6
0,06
253,3
5,7
0,01
244,7
5,6
0,06
251,9
5,8
0,1
219,9
5,1
0,1
222,9
5,0
0,01
244,2
5,5
0,10
219,3
5,1
Tabla 6 Obtencin de CO2 en muestras de suelo con el cambio de Herbicida, pH y sacarosa para el mejor respirometro
de Bartha
HERBICIDA
SACAROSA
CO2
pH
mL
gr
mg/kg
ADIMENSIONAL
0,01
251,1
5,6
0,055
248,5
5,8
0,055
247,3
5,7
0,055
246,9
5,8
0,01
250,8
5,5
0,01
251,0
5,6
0,10
242,7
5,1
0,10
242,8
5,0
0,10
243,1
5,1
0,055
248,5
5,8
0,055
247,3
5,7
0,10
242,7
5,1
0,01
251,1
5,6
0,055
246,9
5,8
0,01
250,8
5,5
0,10
242,8
5,0
0,10
243,1
5,1
0,01
251,0
5,6
0,055
248,5
5,8
0,01
251,1
5,6
0,055
247,3
5,7
0,01
251,0
5,6
0,055
246,9
5,8
0,10
243,1
5,1
0,10
242,8
5,0
0,01
250,8
5,5
0,10
242,7
5,1
4.
ANLISIS DE RESULTADOS
CO2 con la concentracin del contaminante (gasolina o round up) con su respectivo error respecto a los lmites
superiores e inferiores de la funcin.
Se realizaron comparaciones para la varianza de los datos obtenidos en la produccin de mg de CO2 en cada
uno de los respirometros 1,2,3,4,5, tanto para el respirmetro Bartha como el Warburg el anlisis de la
varianza en todas las mediciones de un respirmetro con respecto al otro report un P-value mucho mayor a
0,05 demostrando que el tipo de respirmetro ya sea 1,2,3,4,5 no marcan una diferencia el uno respecto del
otro en las mediciones de CO2. Con respecto a la concentracin del contaminante en ambos casos se encontr
un valor del P value menor a 0,05 Considerando que tomamos el 5% de error como porcentaje atribuido al
azar, esto demuestra una relacin estadsticamente significativa entre la concentracin del contaminante y la
produccin de CO2. Se encontr un polinomio de grado 2 con un Porcentaje de exactitud del 98,6 %para el
respirometro Warburg.
Polinomio: mg CO2 Respirometro 5 = 13,1607-0,0105928*Conc Contaminante + 0,00000255857*Conc
Contaminante^2
(Ecuacin 2)
mg CO2 Respirometro 5
25
20
15
10
5
0
0
2
3
4
5
(X 1000,0)
Conc Contaminante
Figura 7 Modelo Aproximado de la Funcin de la Actividad microbiana con Respecto a la Concentracin del
contaminante para el respirmetro Warburg. Nota: La lnea azul representa la funcin que describe al Polinomio.
Standard
Parametro
Estimado
Error
Lmite Inferior
Limite Superior
CONSTANTE
13,1607
1,27718
10,3779
15,9434
Conc Contaminante
-0,0105928
0,000973295
-0,0127134
-0,00847213
Conc Contaminante^2
0,00000255857
1,59151E-7
0,00000221181
0,00000290533
mg CO2 Respirometro 1
16
12
0
0
2
3
4
5
(X 1000,0)
Conc Contaminante
Figura 8 Modelo Aproximado de la Funcin de la Actividad microbiana con Respecto a la Concentracin del
contaminante. Fuente: Autores.
Estimado
26,42
Error
1,57332
Lmite Inferior
22,992
Limite Superior
29,848
Conc Contaminante
-0,00304462
0,00119897
-0,00565696
-0,000432276
Conc Contaminante^2
0,00000114071
1,96053E-7
7,13551E-7
0,00000156788
Nota: La lnea azul representa la funcin que describe al Polinomio. 95,0% de confianza en los intervalos. Fuente:
Autores.
4.2 Anlisis para validacin de los mejores prototipos con muestras Ambientales
Para el anlisis se usaron muestras de suelo contaminadas con round up, se utiliz como nutriente
sacarosa y variacin del pH para determinar su influencia de cada uno respecto a la produccin de
CO2, es de anotar que como son ms de dos variables no fue posible su anlisis con el paquete
estadstico usado anteriormente, se hizo necesario la relacin matemtica de cada variable a travs
de derivadas parciales e integracin mltiple, para lograr este objetivo se utiliz programacin en el
mtico Mat Lab. Todos los anlisis matemticos se corroboran realizando la grfica del valor
observado versus valor predicho en el modelo con resultados confiables para aceptacin d elos
modelos mostrados a continuacin.
4.1.1 Anlisis respirometro de Bartha 1
Se obtuvo la siguiente funcin:
f(x,y) = p00 + p10*x + p01*y + p20*x^2 + p11*x*y + p02*y^2 (Ecuacin 4)
R-cuadrado: 0.9865
R-cuadrado-Ajustado: 0.9832
Figura 9 Modelo Aproximado de la Funcin de la medida de CO2 respecto al cambio de Herbicida y pH. Donde X=
HERBICIDA Y=PH.
Figura 10 Modelo Aproximado de la Funcin de la medida de CO2 respecto al cambio de Sacarosa y pH. Donde
X=pH Y=sacarosa
(Ecuacin 6)
Figura 11 Modelo Aproximado de la Funcin de la medida de CO2 respecto al cambio de Herbicida y pH del
respirmetro de Warburg. Donde X= HERBICIDA Y=pH
(Ecuacin 7)
Figura 12 Modelo Aproximado de la Funcin de la medida de CO2 respecto al cambio de sacarosa y pH del
respirmetro de Warburg. Donde X=PH Y= SACAROSA
5.
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Para todos los respirometros Warburg del 1 al 5, el P-Value es menor que 0,05 demostrando que si influye
notablemente la concentracin del contaminante en la produccin de CO 2, luego, rechazamos nuestra
hiptesis inicial. - La concentracin del contaminante si representa una variacin significativa en la
Produccin de CO2, medida de la actividad microbiana.
Ningn Respirometro muestra desviaciones estndar significativas en las mediciones de los diferentes niveles
de Contaminante para todos el P-Value es mayor de 0,05. Luego, Aprobamos nuestra Hiptesis inicial. - No
hay diferencia significativa en las medidas que Proporciona cada uno de los respirometros.
Nota: Aunque escogera el respirometro 5 o 1 cualquiera de los dos como el mejor respirometro warburg, los
cambios en precisin no sern realmente significativos con respecto a los Otros repirometros 2,3,4.
Para todos los respirometros Bartha del 1 al 5, el P-Value es menor que 0,05 demostrando que si influye
notablemente la concentracin del contaminante en la produccin de CO 2, luego, rechazamos nuestra
hiptesis inicial. La concentracin del contaminante si representa una variacin significativa en la Produccin
de CO2, medida de la actividad microbiana.
Ningn Respirometro muestra desviaciones estndar significativas en las mediciones de los diferentes niveles
de Contaminante para todos el P-Value es mayor de 0,05. Luego, Aprobamos nuestra Hiptesis inicial. No
hay diferencia significativa en las medidas que Proporciona cada uno de los respirometros.
Nota: Aunque escogera el respirometro 5, como el mejor respirometro Bartha, los cambios en precisin no
sern realmente significativos con respecto a los Otros respirometros 1,2,3,4.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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