UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA DE
ALIMENTOS
Bioadsorción de metales pesados
mediante biomasa de
Saccharomyces uvarun extraída de
aguas residuales de una cervecería
local.

INTEGRANTES:
Erika Chicaiza
Wilson Chicaiza
Roberto Mena

OBJETIVOS:
GENERAL:

Aislar una cepa capaz de adsorber metales procedentes de aguas

residuales de una industria cervecera mediante procesos de aislamiento.

ESPECÍFICOS:

Seleccionar cepas a una temperatura adecuada para inhibir el

crecimiento de hongos y bacterias.
Preservar una cepa de levadura capaz de adsorber metales pesados
mediante criopreservación.
Determinar las cantidades de biomasa necesarias para reducir los
niveles de metales pesados en función del tiempo mediante curvas de
calibración.

INTRODUCCIÓN:

La contaminación por metales pesados se ha convertido en uno de los

problemas ambientales más graves hoy en día. La bioadsorción, con
microorganismos, tales como bacterias, hongos, levaduras y algas, es
considerada como un costo-eficaz de la biotecnología en el tratamiento de
aguas residuales. Entre los bioadsorbentes prometedores para la eliminación
de metales pesados, investigados en las últimas décadas, Saccharomyces sp.
ha recibido una creciente atención debido a la naturaleza única, a pesar de su
capacidad mediocre para la captación de metales en comparación con otros
hongos. S. cerevisiae es ampliamente utilizado en la producción alimentaria y
de bebidas, es fácil cultivar con baja economía. Es un producto que origina
grandes cantidades de desechos en la industria de la fermentación. La técnica
en el ámbito de la bioadsorción de metales pesados por S. cerevisiae, está
basada en un número considerable de referencias bibliográficas existentes.

MARCO TEÓRICO:

A partir de la revolución industrial, los avances en ciencia y tecnología ha

permitido aumentar la capacidad del ser humano para explotar los recursos
naturales, generando perturbaciones en los ciclos biogeoquímicos elementales.
Aún cuando muchos de los metales pesados son esenciales para el crecimiento
humano como el Na, K, Ca, Mg, V, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn y Mo en bajas
concentraciones y como el Cu, Zn, y Mn que son esenciales para el crecimiento
microbiano, pero algunos metales como el Au, Ag, Pb, Cr y Cd son altamente
tóxicos para las células vivas.

Sus efectos en los seres humanos son muy variados.

Metal Efectos en la salud humana

Pesado

As Fiebre, prurito, trastornos en el sistema nervioso central, nauseas,

vómitos, diarrea, heptomagalia e ictericia
Cd Dolor de cabeza, vértigo, irritabilidad, alteraciones
gastrointestinales, vómitos, dolor, fiebre, transpiración profusa, y
atrofias, anemia, fibrosis y enfisema pulmonar

Cu Rigidez, disartria, disfagia, temblor, falta de coordinación y ataxia,

insuficiencia hepática, afecciones oculares (anillo de Kayser-
Fleischer)

Hg, Zn, Trastornos gastrointestinales, respiratorios, en piel y oculares

Cr (mercurialmente y constricción de los campos visuales)

Algunos microorganismos y sus productos son de gran aplicación en procesos

de bioadsorción o bioacumulación de metales pesados en solución, los mismos
que ofrecen una alternativa a las técnicas convencionales para la eliminación o
recuperación de metales. En base a lo anterior se ha generado un gran interés
en la extracción de iones de metales pesados de aguas residuales utilizando
procesos biotecnológicos.

ANTECEDENTES:

Bibliográficamente() se ha determinado que los posibles microorganismos

capaces de adsorber metales son:

Biomasa Metales estudiados Estado Inmoviliza

biológico ción

Bacterias

Bacillus sp. Cr, Cu, Fe, Pb Muerta Inmovilizad

a

Pseudomona Cu, Ni, U Ambos Libre

aeruginosa

Hongos filamentosos

Aspergillus niger Cd, Cu, Ni, Pb Ambos Libre

Aspergillus oryzae Cd, Cu, Pb, Zn Muerta Ambos

Levaduras

Saccharomyces Ag, Au, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Muerta Ambos
cerevisiae Hg, Ni, Pb, Zn

Saccharomycetes Cd Muerta Inmovilizad

pombe a
Por otro lado, las biomasas pueden ser utilizadas de formas diferentes: libres,
en forma de suspensiones dentro de soluciones metálicas y con agitación, o
inmovilizadas, sobre algún tipo de soporte. La utilización de un tipo u otro de
biomasa depende principalmente del tipo de escala que se esté utilizando.

Debido a la diversidad de adsorción de metales de la levadura Saccharomyces

uvarun se ha elegido a ésta para el estudio en cuestión.

Bibliográficamente se ha determinado que la capacidad máxima de

bioadsorción de metales para la Saccharomyces uvarun es Cadmio 0,0623
mm/g; Plomo 0,0386 mm/g, Zinc 0.0694 mm/g, Cromo 0,0725 mm/g.

JUSFITIFACIÓN:

Existen varios investigaciones()()() las cuales hablan sobre la bioadsorción de

metales en varios tipos de microorganismos; siendo la mayoría de ellos
estudios con hongos y algas; y muy pocos con bacterias o levaduras

Dentro del distrito metropolitano de Quito la ordenanza municipal de medio

ambiente 003 expone los siguientes límites como parámetros para el
funcionamiento de cualquier empresa.

Límites máximos por cuerpo receptor()

Parámetros Expresado como Unidad Límite máximo permisible

Alcantarillado Cauce de agua

Aluminio Al mg/l 5,0 5,0

Arsénico total As mg/l 0,1 0,1

Cadmio Cd mg/l 0,02 0,02

Cobre Cu mg/l 1,0 1,0

Cromo Hexavalente Cr+6 mg/l 0,5 0,5

Manganeso Mn mg/l 10,0 2,0

Mercurio (total) Hg mg/l 0,01 0,005

Níquel Ni mg/l 2,0 2,0

Plomo Pb mg/l 0,5 0,2

Zinc Zn mg/l 2,0 2,0

Debido a lo expuesto, se aplicará este proyecto como medida de

biorremediación especialmente en aguas residuales que excedan los límites
citados como florícolas, textileras, basándonos en los metales que exigen la
ordenanza.
GRUPO TRÓFICO:

La levadura Saccharomyces uvarun pertenece al grupo trófico de

quimioorganotrofo debido a que degrada sustancias orgánicas.

MEDIO DE CULTIVO:

De acuerdo a la investigación realizada se determinó que las variables de

mayor importancia en el proceso de bioadsorción son: el pH, las
concentraciones iniciales de metales como variables independientes y el
estado de la biomasa como variable dependiente().

MARCO METODOLÓGICO:

PREPARACIÓN DE MUESTRAS:

Las muestras serán tomadas de las aguas residuales en frascos esterilizados;

se comenzará con los análisis lo más pronto posible.

Las muestras serán tomas del punto de descarga de las aguas hacia el
alcantarillado durante el mayor caudal de descarga para tener una mayor
probabilidad de la obtención de muestra homogénea.

AISLAMIENTO DE LAVADURAS (medios pre fabricados):

De las muestras tomadas, una vez homogenizadas, se tomará una muestra de

un mililitro aproximadamente y se procederá a realizar siembras en 3 medios
(MEA, YGC y ASG) los cuales deberán ser incubados por 3 días a 25°C a
25±2°C. Finalizado este período se procederá a examinar macro y
microscópicamente las colonias desarrolladas. Seguidamente se procederá al
aislamiento de colonias representativas hasta poder obtener cepas puras.
 Maestra de Agua residual

El fundamento de este método consiste en la aplicación de factores ecológicos

como lo son pH, Temperatura, degradación favorable de un determinado
sustrato, acción de antibióticos, etc, los cuales ayudan a que los medios de
cultivo se vuelvan específicos y nos permitan de esta forma aislar, conservar y
preservar una cepa de levadura la cual será de beneficio para el proyecto.

CARACTERIZACIÓN DE LEVADURAS:

Para la caracterización de las levaduras se procederá a distinguirla mediante

los siguientes métodos: ANEXO 1

1. Microscopiacamente: determinación de la morfología de la levadura.

2. Macroscopicamente:
2.1.Poder fermentativo: Mediante el método de la campana de Durham.
 2.2.Crecimiento en agar glucosa nitrato: después de 3 días a 25°C se podrá
determinar la habilidad de utilizar nitrato como única fuente de
nitrógeno.
2.3.Crecimiento en agar MEC: de 3 días a 25°C se observar la macro y
micromorfología de las levaduras.

CONSERVACIÓN DE CEPAS:

Una vez seleccionadas y aisladas las cepas elegidas se las debe sembrará en
agar GYM (debido a que la glucosa es una sola fuente de carbohidratos; con lo
que se reduce el riesgo de posibles mutaciones) de donde se tomarán
pequeñas perlas de agar para poder colocarlas en crio viales inmersas en
aceite mineral estéril conservadas con una temperatura de 4°C; con lo que la
cepa se mantendrá por un período de 15 años.()

De la cepa aislada se procede a La muestra de agar colocarla en

tomar una muestra un tubo con aceite esteril par su
crio preservación
PRODUCCIÓN DE BIOMASA: (Crecimiento en Cultivo Cerrado con
Agitación Orbital)

En matraces de 250 ml de capacidad, se deberán llenar con 150 ml del medio

de cultivo, el medio debe ser esterilizado; las condiciones del Shaker deben ser
800 r.p.m a 30°C para tener un buen desarrollo del microorganismo.

Para la determinación de biomasa se sembrarán diluciones desde 10-3 hasta 10-

8
y se incubarán a
30ºC ± 2 durante 72 h. Y también se podrá determinar las concentraciones de
biomasa mediante peso seco (que es la técnica requerida para la obtención de
biomasa que será tratada para la aplicación del proyecto)

METODOLOGÍA PARA LA DETERMINACIÓN DE BIOMASA:

Serán utilizados diferentes técnicas para determinar el crecimiento celular

según los requerimientos de cada ensayo.

Turbidimetria: En algunas ocasiones el crecimiento de los cultivos de s.

cerevisiae se ha determinado mediante la evaluación de la turbidez de los
mismos, realizándose una lectura de sus absorbancias a 600 nm (A600nm) en
un espectrofotómetro utilizando cubetas de 1 ml con un paso óptico de 1 cm.
convenientemente hasta que su absorbancia se encontrara en un intervalo de
0,05-0,5, valores a los que existe una linearidad entre la lectura de la
absorbancia y el número de células.

Recuento de células en cámara de Neubaner: Cuantificación de la

concentración celular de S. cerevisiae mediante la observación directa en un
microscopio. Con objeto de que la muestra sea estadísticamente significativa,
el número de células por cuadrado.

Recuento de colonias: Se sembrarán en cajas Petri de 50 a 100 unidades

formadoras de colonias (ufc) del cultivo analizado, y se incubarán a una
temperatura permisiva para las células. La comparación entre el número de ufc
sembradas y las colonias crecidas permitía calcular la mortalidad del cultivo.

METODOLOGÍA DE BIOADSORCIÓN():

Materiales:

Para este estudio se utilizará Saccharomyces uvarun, levadura residual de una

empresa local, subproducto del proceso de fermentación de cerveza.

Preparación de la Biomasa

Se prepararán suspensiones de biomasa. Estas suspensiones de biomasa se

agregaran a las diferentes soluciones con las que comprobará cuales son los
metales en los que se tiene más adsorción, y en las cantidades (g peso seco/L)
requeridas. Una vez determinado las cantidades de adsorción se realizará en
aguas residuales las cuales se conozcan que excedan los niveles de metales
permitidos.

Preparación de las Soluciones de Metales

Las soluciones de metales se prepararon disolviendo las sales: CrCl3·6H2O,

Pb(NO3)2, Cd(NO3)2, cada una por separado en agua destilada des ionizada
para generar soluciones stock, las cuales se combinaron posteriormente en las
proporciones adecuadas para obtener concentraciones de 50ppm y 80ppm
respectivamente de cada metal en sistemas que contenían a los tres iones
metálicos. Se ajustó el pH de las soluciones a pH 3 y 5.

Diseño de Experimentos

De acuerdo a la literatura analizada() se determinó que las variables de mayor

importancia en el proceso de biosorción son: el pH, las concentraciones
iniciales de metales y el tratamiento previo de la biomasa.
Por lo que utilizará un pH de 3 y 5 debido a que en este rango se mantiene el
punto isoeléctrico de los metales; la concentración de las soluciones es de
50ppm y 80ppm para cada metal para los niveles bajos y altos
respectivamente; siendo la variable de respuesta el porcentaje de extracción.

Experimentos de Biosorción
Las pruebas de biosorción serán efectuadas colocando 150mL de la mezcla de
soluciones (de acuerdo al diseño de experimentos) en matraces Erlenmeyer de
250mL y agitando en una incubadora con agitación a 150rpm a una
temperatura constante de 30ºC por 24hr con lo que se medirá el contenido de
metales cada dos horas para poder comprobar que disminuye su contenido.

Después de ese tiempo se tomaron muestras de 2mL de las suspensiones y se

separará la biomasa por centrifugación a filtración al vacío. Después de la
filtración se toma 1mL del filtrado el cual se diluye con agua des ionizada en
una proporción de 1:25, la muestra es acidificada con ácido nítrico concentrado
para descartar el efecto de la precipitación y así asegurar que la lectura
corresponda a la biosorción por la levadura con lo que se determinará por
Espectroscopia de absorción atómica.

Una vez realizados los experimentos y determinadas las cantidades necesarias

de biomasa requeridas para la adsorción y los metales de mayor relevancia en
la norma municipal () se procederá a realizarlo en las agua residuales de
textileras donde su descargue por el uso al que son sometidas continen
metales pesados.

Bibliografía
1. Rodriguez, M. Scielo. Efectos de las Condiciones de Operación Sobre la
biosorción . [En línea] 08. [Citado el: 11 de 11 de 09.]
http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0718-
07642008000600006&lang=pt.
2. Amaya, M. Universidad de Sonora. [En línea] 05 de 08. [Citado el: 09 de 11
de 09.] http://www.uaemex.mx/Red_Ambientales/docs/congresos/TLAXCALA
%202009/REVISTA/contaminacion/acervo/vol_24_3/2.pdf.
3. Lezcano, J. Universidad Complutense de Madrid. Efecto del pretramiento de
la biomasa en la bioadsorción de metales pesados. [En línea] 04 de 08. [Citado
el: 06 de 11 de 09.] http://eprints.ucm.es/8620/1/T30768.pdf.
4. SCIELO. Revista de la Sociedad Venezolana de Microbiología. [En línea] 01
de 2005. [Citado el: 09 de 10 de 2009.] http://www.scielo.org.ve/scielo.php?
pid=S1315-25562005000100007&script=sci_arttext.
5. Norma Técnica que regula los contaminates asociados a descargas líquidas
industriales, comerciales, y de servicios. Quito, Municipio Metropolitano.
Quito : s.n., 2009. Resolución 003.
6. Villegas, J. PatentesOnline.com.mx. PROCESO DE PRODUCCION DE
SACCHAROMYCES CEREVISIAE BAJO CONDICIONES DE CULTIVO BIEN
CARACTERIZADO. [En línea] 26 de 04 de 1995. [Citado el: 21 de 11` de 2009.]
http://www.patentesonline.com.mx/proceso-de-produccion-de-candida-utilis-y-
saccharomyces-cerevisiae-bajo-condiciones-12648.html.
7. Acosta, M. Scielo. [En línea] [Citado el: 09 de 11 de 09.]
http://www.scielo.cl/scielo.php?pid=s0718-
07642005000100003&script=sci_arttext.
8. Vullo, D. Universidad de Buenos Aires. Revista Qímica viva. [En línea] 12 de
11 de 03. [Citado el: 09 de 11 de 09.]
http://redalyc.uaemex.mx/redalyc/pdf/863/86320303.pdf.
9. Sanchez, E. Universidad Autónoma de nuevo León. [En línea] 2008. [Citado
el: 10 de 11 de 09.] http://redalyc.uaemex.mx/redalyc/pdf/402/40211208.pdf.
10. Flores, V. Scielo Perú. [En línea] 2001. [Citado el: 10 de 11 de 2009.]
http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1561-
08882001000100007.
11. Mossel, D A. Microbiología de los alimentos. segunda edición. Saragoza :
Acribia S.A., 2003. pág. 703.
12. REDALYC. REDALYC. Red de Revistas Científicas de América Latina y el
Caribe, España y Portugal. [En línea] 12 de 2006. [Citado el: 7 de 10 de 2009.]
http://redalyc.uaemex.mx/redalyc/src/inicio/ArtPdfRed.jsp?iCve=49911205#.
13. Merck. Registro de propiedad Industrial España. [En línea] [Citado el: 23
de 10 de 2009.] http://www.espatentes.com/pdf/8300004_A1.pdf.
14. SCIELO. Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717-3458. Biosorción
de metales pesados en aguas residuales mediante Pseudomonas sp. [En línea]
15 de 04 de 2004. [Citado el: 16 de 11 de 2009.]
http://www.scielo.cl/scielo.php?pid=S0717-
34582004000100006&script=sci_arttext.
15. Fernández, T. Dialnet. AISLAMIENTO Y EVALUACIÓN DE CEPAS
TERMOTOLERANTES DE Saccharomyces. [En línea] 28 de 10 de 2007. [Citado
el: 20 de 11 de 2009.] http://www.somenta.org/journal/index.php/Revista-
cyta/article/view/36/39.
 ANEXO 1: Caracterización microbiológica de Levaduras

Crecimient C. C. C. C. C. K. T. C.
o: lusita guillierm humic
inter famat niae pulcher ondii apiculat mucoid olus
media a rima a e

M.E.A. Blancas Blancas Blancas. Blancas, Blancas, Pardas, Opacas, Blancas,

(UFC) , , rosa
T, S (1) lobuladas cremosas. opacas. cremosa
cremos brillant . pálido. s.
as. es. T (1) S (1)
M.E.C. V, S (1) V, s (1) V (1)
V, S (1) V (1)

Morfología (células Esférica Esférica Ovales Gemantes, Apiculada Ovales, Esférica

): s, φ: 4 s, φ: 4 aisladas. 5 μm s. s, 5
M.E.A. gemantes
Esférica μm (2). μm (2). Ovales en × 4 μm (2) Germinaci Artrospor μm × 6
M.E.C. s. Gemantes, ón as. μm (2)
Gemaci Gemaci racimos. Gemant
Gemant ón ón turgentes Terminal es,
es
irregula multipol turgente
r. ar s

Esporas: - - - - - - - -

A.A. - - - - - - - -

A.G.

Pseudomic - - - + + (4) + (5) + (6) -

elio

C.M.A.

Fermentaci
ón:
+ + + + d (7) + - -
Glucosa
+ + + + d (7) + - -
Fructosa
+ + - - - - - -
Sacarosa
- - - - - - - -
Maltosa
- - - - - - - -
Galactosa
- - - - - - - -
Lactosa

Rafinosa

Asim.NO3 - d (7) - - - - - -

(1) V: velo; S: sedimento; T: turbidez; s: sedimento escaso. (2) Medidas obtenidas con micróme
con una ascospora. (4) Pseudomicelio con blastosporos. (5)

Pseudomicelio. (6) Micelio verdadero. (7) Escasa fermentación.

M.E.A.: Agar extracto de malta. M.E.C.: Caldo extracto de malta. A.A.: Agar acetato de sodio. A.G
C.M.A.: Agar harina de maíz.