ESTANDARIZACIN DE UNA METODOLOGIA ANALITICA POR

ESPECTROFOTOMETRIA ULTRAVIOLETA PARA LA DETERMINACIN DEL

HIDROXIMETILFURFURAL EN MIELES DE ABEJA
STANDARDIZATION OF AN ANALYTICAL METHODOLOGY FOR
HYDROXYMETHYLFURFURAL DETERMINATION IN HONEY
BY ULTRAVIOLET SPECTROMETRY
Natalia HINCAPIE V.1*, Mnica J. LPEZ S.1, Catalina VICTORIA A.1
RESUMEN
En este trabajo se presentan los resultados del desarrollo y estandarizacin de una metodologa
analtica para la determinacin del HMF en miel de abeja por la tcnica de espectroscopia de
absorcin ultravioleta, UV. El procedimiento consiste en evidenciar la presencia de este aldehdo
cclico con incrementos de temperatura, utilizando un mtodo de correccin de fondo, con medidas
de absorbancia a longitudes de onda de 284 nm y 336 nm para la muestra y referencia
respectivamente.
Los resultados obtenidos son tratados de manera estadstica para hallar la linealidad,
reproducibilidad, repetitividad, incertidumbre y sensibilidad del mtodo realizado como parmetro
fundamental en un proceso de estandarizacin.

Palabras clave: Espectrofotometra ultravioleta, miel, hidroximetilfurfural, HMF,

ABSTRACT
This work presents the results of development and standardization of analytical methodology for the
determination of HMF in honey by means of ultraviolet absorption spectroscopy (UV).
The procedure consists in evidence the presence of this cyclical aldehyde with increases in
temperature, using a method of background correction, with measurements of absorbance at
wavelengths of 284 and 336 nm for the sample and reference, respectively.
The results are treated statistically to find the linearity, reproducibility, repititividad, uncertainty and
sensitivity of the method performed as parameters in a process of standardization .

keywords: spectrophotometry ultraviolet, honey, hydroxymethylfurfural, HMF

INTRODUCCION

Estudiantes, Facultad de Qumica Farmacutica, Universidad de Antioquia, Ciudad Universitaria, Calle 67

53-108. A.A. 1226, Medelln, Colombia
*
Autor a quien se debe dirigir la correspondencia: nathiva17@gmail.com

Desde el punto de vista composicional, la miel de abejas es bsicamente una solucin

acuosa concentrada de azcar invertido, que contiene adems, una mezcla muy compleja de
otros hidratos de carbono, diversas enzimas, aminocidos, cidos orgnicos, minerales,
sustancias aromticas, pigmentos, ceras, granos de polen, entre otros. Los azucares son el
componente mayoritario de la miel, representando, el 99-95% de la materia seca. La mayor
parte de estos no se encuentran en el nctar, sino que se forman durante la maduracin y
almacenamiento de la miel. Las numerosas propiedades biolgicas encontradas en la miel,
la convierten en un producto complementario de la alimentacin humana y muy til en
otros campos que nada tienen que ver con la alimentacin. La miel es considerada un
producto natural por excelencia, sin embargo en los ltimos aos ha sufrido los efectos de
la industrializacin y de la produccin agrcola. Los elementos objetivos de la calidad de la
miel de abejas son extremadamente simples y se pueden reducir a tres fundamentales como
son:
La higiene: la miel de abejas no debe contener sustancias nocivas, su presencia se debe
fundamentalmente a los tratamientos con sustancias qumicas, llevados a cabo durante su
produccin.
Genuinidad: la miel de abejas no debe adulterarse.
Frescura: la miel debe mantener sus caractersticas naturales intrnsecas, su prdida se debe
fundamentalmente a las prcticas de manejo en la colmena, los procesos de
industrializacin con tratamientos trmicos excesivos y a las condiciones de temperatura y
tiempo de almacenamiento.
La miel comercializada, entre otras caractersticas de calidad, deber tener determinadas
cualidades apreciables a simple vista por el consumidor que la distingan como son:
limpieza, nitidez, fluidez, coloracin, homogeneidad y cristalizacin.
El proceso de industrializacin de la miel, aunque es un proceso sencillo, presenta una serie
de inconvenientes que pueden tener una gran repercusin en la calidad de la miel
procesada, por tanto se hace un control exhaustivo de los tiempos y temperaturas de los

tratamientos industriales y del almacenamiento posterior, ya que no siempre estos son

controlados con la rigurosidad necesaria, repercutiendo en la calidad final de las mieles
comercializadas mermando en gran medida las propiedades beneficiosas de estas (1).
El hidroximetilfurfural es un aldehdo cclico (HMF, vase Figura 1) que se origina
espontneamente a partir de la fructuosa en medio acido (valor medio de pH 3.9) en un
proceso lento. Este proceso es acelerado fundamentalmente por el calor: almacenamientos
de pocos das a 50C tienen el mismo efecto sobre el aumento de HMF en miel que varios
meses a 20C. Tambin los calentamientos para la licuefaccin o pasteurizacin de la miel
elevan los niveles de HMF. El HMF no es una sustancia toxica, ni altera la miel a no ser
que se encuentre en cantidad excesiva, lo que provocara el oscurecimiento de la misma por
interacciones con compuestos aminados y azucares, sufriendo polimerizacin y
reordenacin, tanto en presencia como en ausencia de oxigeno.

Figura 1. Estructura molecular del hidroximetilfurfural.

Fuente: Biblioteca Digital de la Universidad de Chile. Sistemas de Informacin de
Servicios

Bibliotecas.

Disponibe

en:

http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/ap/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/apfisquim-farm11/c17.2.html.
Entre otros parmetros la formacin de HMF esta correlacionado directamente con la
humedad y contenido inicial de HMF en la miel. Tambin la acidez ejerce un efecto
positivo en su formacin, comprobndose la existencia de una baja tasa de HMF en mieles
calentadas debido a su ms alto pH (4.5-5.0).
El aumento del contenido de HMF de la miel es un proceso paralelo a la degradacin de
vitaminas, protenas y enzimas de este alimento, as como a la perdida de sabor y aroma por
lo que se ha convertido en el mejor parmetro indicador de la frescura de la miel y permite

juzgar sus condiciones de procesado y almacenamiento (2). Una miel natural, recolectada
en calentamiento particular, no contiene ms de 5 mg de HMF por Kilogramo, el
recalentamiento, indispensable para la refundicin antes del acondicionamiento, por
ejemplo, puede desarrollar algunos miligramos de HMF. Se deben tener en cuenta las
condiciones de comercializacin, los tiempos y temperaturas de almacenamiento. En
resumen la presencia de HMF en la miel es siempre reveladora de las degradaciones
trmicas que sufri el producto y es un indicador muy importante de la calidad y de la
frescura. As la norma tcnica colombiana (NTC) permite un mximo de 40 mg/Kg de
HMF, valores superiores a este indican mieles viejas de baja calidad y/o excesivamente
calentadas o adulteradas (3).
El hidroximetilfurfural de determina por el mtodo propuesto por White basado en utilizar
dos porciones alcuotas de la muestra previamente clarificada mediante la adicin de
reactivos Carrez y posterior filtracin. Una de ellas, a la que se le adiciona 5 ml de agua
destilada, se lee frente a la otra, a la que se aade igual volumen de solucin de bisulfito de
sodio el cual hace desaparecer la absorcin debida al hidroximetilfurfural por rotura del
doble enlace conjugado, con lo que otras absorbancias inespecficas son corregidas (4).
DESARROLLO EXPERIMENTAL
Materia prima
El presente estudio se ha realizado con miel procedente de Carmen de Bolvar la cual es
distribuida por productos alimenticios el Alpolen.
Equipos
Espectrofotmetro Agilent serie 8453 UV-VIS. Mewlett Packard. Rango de longitud de
onda 190-1100nm.
Balanza analtica Sartorius CP2245.
Bao mara Memmert

Material volumtrico
Tubos de ensayo
Embudos
Celdas de cuarzo
Papel filtro Whatman
Reactivos y soluciones
Agua para anlisis
Etanol
Solucin de ferrocianuro de potasio (Carrez I)
Solucin de acetato de zinc (Carrez II)
Solucin de bisulfito de sodio
Preparacin de las soluciones
Solucin Carrez 1: pesar 15 g de Ferrocianuro de potasio, transferir a un baln volumtrico
de 100 ml, aforar con agua destilada.
Solucin Carrez II: Pesar 30 g de Acetato de zinc, transferir a baln volumtrico de 100 ml,
aforar con agua destilada.
Solucin de Bisulfito de sodio: Pesar 0.20 g de bisulfito de sodio, adicionar 100 ml de agua
destilada.
Determinacin del Hidroximetilfurfural
Se pesan 5 gramos de muestra de miel, a los cuales se le agregan 25 mL de agua destilada,
agitando para lograr total disolucin de la miel, transferir esta solucin a un baln
volumtrico de 50.0 mL. Adicionar luego 0.5 mL de solucin Carrez I y mezclar, a
continuacin agregar 0.5 mL de solucin Carrez II y mezclar. Estas soluciones se utilizan
para eliminar la turbidez. Se pueden agregar gotas de etanol para suprimir la espuma si se
requiere. Aforar con agua hasta completar 50 ml.

Agitar y filtrar el contenido del baln con papel de Whatman. Los primeros 10 ml del
filtrado son eliminados, y el resto se colecta para su respectivo anlisis. Se toman dos tubos
de ensayo: Colocar 5 ml del filtrado en cada uno de los dos tubos de ensayo, agregar al
contenido de uno de los tubos de ensayo 5 ml de solucin de bisulfito de sodio y al otro
tubo de ensayo agregar 5 ml de agua destilada. El bisulfito de sodio destruye el HMF, por
lo que el contenido del primer tubo se usa como solucin de referencia para medir la
absorbancia. El contenido del segundo tubo constituir la solucin de muestra a medir.
Nota: una vez agregado el bisulfito de sodio leer inmediatamente, ya que este fuera de
reducir el HMF puede reducir otras sustancias presentes en la miel.
Colocar las soluciones en celdas de 1 cm y medir la absorbancia a 284 y 336 nm para
muestra y estndar respectivamente, correspondientes a las longitudes de onda del espectro
de luz UV.
Si la absorbancia de la solucin de muestra es mayor de 0.6, diluirla con agua y diluir la
solucin de referencia con solucin de bisulfito de sodio al 0.1% en la misma proporcin y
corregir la absorbancia para esa disolucin. Por ltimo se determinan los miligramos de
HMF presentes en la muestra. (mg/Kg).
Todo el procedimiento de la metodologa se realiz por triplicado sometiendo la muestra a
diferentes temperaturas y los respectivos resultados fueron analizados (4).
Anotaciones al mtodo

Antes de proceder con el desarrollo de la metodologa se verifica la idoneidad del

sistema analtico. El material volumtrico y el instrumental empleado se calibran

debidamente.
Para evaluar el incremento del Hidroximetilfurfural con la temperatura, una
cantidad suficiente de muestra se somete a la temperatura que se va a analizar
durante un tiempo de 45 minutos con agitacin de la misma cada 10 minutos para

garantizar la transferencia de calor en toda la muestra; esta se enfra y se procede

con la metodologa anteriormente descrita.

A la solucin de referencia inmediatamente se le adicione la cantidad de bisulfito

establecida por el mtodo realizar la lectura de la absorbancia.

Antes de proceder con la lectura de absorbancia tanto de la muestra como la de la
referencia se deben someter las celdas de cuarzo a un proceso de lavado con una
mezcla sulfocrmica para evitar posibles interferencias y obtencin de resultados

negativos.
La metodologa utilizada es un mtodo de correccin de fondo, por lo cual no
necesita un blanco para realizar las lecturas de absorbancia; en caso tal que el

equipo necesite ste, se utilizar agua destilada para tal fin.

Para lograr reproducibilidad y repetibilidad en el mtodo se debe tener cuidado con
el manejo del material volumtrico, para que no se vean afectados tales parmetros.

Clculo para determinar el contenido de HMF en la muestra

Calcular la cantidad de Hidroximetilfurfural (HMF) en la miel con los datos de absorbancia
a 284 nm (A284) y 336 nm (A336), usando la siguiente frmula: (4)

Factor = 14.97 = (126/16,830) (1000/10) (100/5).

Donde:
126 = peso molecular del HMF
16,830 = absortividad molar () del HMF a 284 nm.
1000 = mg/g
10 = centilitros/L
100 = g de miel reportados
5 = peso nominal de la muestra.
Los resultados son expresados en mg/Kg, con una cifra decimal.
RESULTADOS Y DISCUSIN

Con la ecuacin arriba presentada se calcularon los miligramos de HMF que aparecen en la
tabla 1, que corresponden a los obtenidos por cada analista a diferentes temperaturas.
Los resultados obtenidos del anlisis de HMF en miel, son tratados con Excel 2007, para
hallar los parmetros de desviacin estndar, coeficiente de variacin y la ecuacin de la
recta. Tambin se usa Start Grafic Plus 5.1, ste para hacer las comparaciones muestrales,
en procura de obtener las tablas de ANOVA y el grfico de caja y bigotes. Todos los anlisis
son aplicados con un grado de confiabilidad de 95 %.
Se compararon los resultados obtenidos por los tres analistas los cuales se presentan en las
figuras 1, 2 y 3, de all se sacaron: los coeficientes de correlacin (R2), las pendientes de las
curvas (B) y los interceptos (A) y stos aparecen de manera resumida en la figura 4 y en la
tabla 2 con sus respectivas medias, desviaciones estndar y coeficiente de variacin.

Tabla 1. Miligramos de HMF obtenidos por cada uno de los analistas a diferentes
temperaturas.

Temperatura

25C

45C

55C

65C

75C

85C

Figura 1

Analista 1

Analista 2

Analista 3

mg HMF

mg HMF

mg (HMF)

31,838

31,7326

31,8023

31,853

31,8673

31,8772

31,853

31,7925

31,6976

35,0768

36,6194

36,9748

36,3029

36,1261

36,7803

35,8394

36,8436

36,885

37,9705

38,2445

38,0385

38,5692

38,5888

38,0984

37,761

38,7235

37,9188

39,0978

39,5048

39,5899

39,6365

39,1911

39,9786

39,6215

39,0865

39,9637

42,41

42,6068

42,2636

42,3053

42,3225

42,1141

42,3202

42,3973

42,4729

45,0312

44,7757

45,1877

44,4925

45,2095

44,9034

45,0462

44,8205

45,1428

Figura 2

Figuras 1 y 2. Resultados obtenidos por los analistas, 1y 2 respectivamente

Grfico X-Y Mltiple

46

46

Figura 3

Variables
CURVA 1
CURVA 2
CURVA 3
CURVA 4
CURVA 5
CURVA 6
CURVA 7
CURVA 8
CURVA 9

Figura 4

43

43

40

40

37

37

34

34

31

31

25

35

45

55

65

75

85

TEMPERATURA EN C
Figuras 3. Resultados obtenidos por el analista, 3
.
Figura 4. Resumen de todos los resultados de los tres analistas, y all se puede observar que dichos
resultados no se encuentran muy dispersos entre s.
Tabla 2. Magnitudes halladas por cada analista, de los parmetros: coeficiente de correlacin (R 2),
el intercepto (A) y la pendiente (B). Al final (fila de total) se presenta la media (X), la desviacin
estndar (S) y el coeficiente de variacin (CV) de cada parmetro.
R2
ANALIST
A1
ANALIST
A2
ANALIST
A3
TOTAL

0.982

0.994

0.993

25.75

26.82

26.11

0.219

0.206

0.216

0.990

0.976

0.983

26.56

26.88

26.39

0.211

0.214

0.206

0.989

0.992

0.983

26.43

26.81

26.64

0.215

0.208

0.211

X= 0,987; S= 0,00613; CV=0.62%

X= 26,43; S= 0,340; CV=1.29%

X= 0.212; S= 0,0046; CV= 2,16%

Para comparar dichos estadgrafos, se aplic el test de ANOVA, planteando las siguientes
hiptesis:

1. Hiptesis nula: los tres analistas trabajaron de manera igual

2. Hiptesis alternativa: los tres analistas trabajaron de manera diferente

Los resultados del test aparecen (vase tabla 3)

Tabla3. ANOVA para los tres estadgrafos: coeficientes de correlacin, pendientes e interceptos de
las curvas, donde GL son los grados de libertad y CM son los cuadrados medios.
Fuente

ANOVA para
comparacin de
R2

Entre
grupos
Intra
grupos
Total

ANOVA para
comparacin de
la pendiente

Entre
grupos
Intra
grupos
Total

ANOVA para
comparacin del
intercepto

Entre
grupos
Intra grupos
Total

Suma de
cuadrados
0,0000722
0,0002287
0,0003009
0,00001756
0,00015
0,00016756
0,307222
0,789133
1,09636

GL
2
6

CM

Cociente F

Valor P

0,95

0,4398

0,00003611
0,00003811

8
2
6

0,00000878
0,000025

0,35

0,7175

8
2

0,153611

0,131522

1,17

0,3729

ANLISIS DE LA REPETIBILIDAD Y REPRODUCIBILIDAD

Las ANOVAs que fueron presentadas antes, y particularmente los valores p de las pruebas,
confirman la hiptesis nula de igualdad en los resultados reportados por los tres analistas.
De modo que no hay diferencia estadsticamente significativa entre esos resultados, con un
grado de confiabilidad del 95 %. Con esto se puede decir, que la reproducibilidad del
mtodo es adecuada bajo las condiciones de trabajo realizado y que los resultados
obtenidos siempre sern similares.
La reproducibilidad y repetibilidad fue analizada como funcin de la dispersin entre los
resultados obtenidos por cada uno de los analistas y de todos ellos a cada temperatura. Para
ello, se aplic el clculo de desviacin estndar y coeficiente de variacin a cada
temperatura en la que se trabaj. (Vase tabla 4.)

Y de manera grfica el CV (Vase la

figura 5.) En la figura 6 se presenta el grfico de caja y bigotes para los resultados
reportados a 45 0C que es la temperatura a la que se dio la mayor dispersin en los datos.
Tabla 4. Magnitudes de las medias y de algunos valores de dispersin: desviacin estndar (S) y
coeficiente de variacin (CV).

Temperatura en 0C

Media

CV

25

31,8126

0,062459816

0,19633665

45

36,3831

0,62271469

1,7115472

55

38,2126

0,339660175

0,88887009

65

39,5189

0,33736391

0,85367666

75

42,3569

0,138412147

0,32677566

85

44,9566

0,233210326

0,51874534

Figuras 5. Se grafican las magnitudes de CV a diferentes temperaturas

Grfico de Caja y Bigotes

35

35,4

35,8

36,2

36,6

37

T 45 a 45 0C.
Figura 6. Caja y bigotes para los resultados reportados
En la figura 5 se observa que el valor mayor para CV es el obtenido a 45 0C, concordando
con la figura 4 en la que tambin se puede observar una mayor dispersin a esa
temperatura. Sin embargo el CV no llega al 2% que es el valor lmite para este estadgrafo
reportado por algunos autores; incluso otros aceptan hasta un CV de 5 %. Para ampliar el

anlisis, en la figura 6 se presenta el grfico de caja y bigotes a 45 0C, en el cual se observa

una ligera asimetra del lado izquierdo pero ningn dato atpico.
Por esto, se puede decir que el mtodo es reproducible con un CV mximo de 1.71 % a las
condiciones del laboratorio.
ANLISIS DE LA LINEALIDAD
Partiendo de que todos los resultados reportados por los tres analistas deben ser tenidos en
cuenta ya que no hay datos atpicos y todos ellos son similares con una confianza de 95%.
Con esto se calcula la relacin de linealidad entre concentracin de HMF en mg y
temperatura en grados centgrados; encontrndose un R2 = 0.987 0.018 para un grado de
certeza de 95%. La figura 7 presenta las magnitudes de los R2, y como se puede observar
ninguno de ellos tiene un valor estadsticamente diferente a los dems.

Grfico de Caja y Bigotes

0,97

0,974

0,978

0,982

0,986

0,99

0,994

todos
Figura 7. Caja y bigotesR2
para
las magnitudes de R2
Ecuacin de la recta
De la tabla 1, asumiendo que la pendiente, el intercepto y el coeficiente de correlacin
tienen una distribucin normal, teniendo en cuenta que la ecuacin de la recta es: y = bx +
a; se obtiene para anlisis de HMF en miel con la correccin de fondo y la lectura hecha a
la longitud de onda y segn el procedimiento descrito, la siguiente ecuacin:
mg HMF = (0,2120,0138) * T + 26,431.02mgHMF con R2 = 0.987 0.018
Donde la temperatura (T) es en 0C.
CONCLUSIONES

Se encontr reproducibilidad adecuada con la que se puede asegurar resultados similares

cada vez que se realiza el mtodo. De igual manera, tambin se considera que la
repetibilidad es aceptable, ya que ningn resultado reportado es atpico.
Hay una relacin lineal directa (R2= 0.987), entre el incremento de temperatura y la
concentracin de hidroximetilfurfural presente en la muestra de miel; resultado que lleva a
concluir que a mayor temperatura de conservacin de la miel, habr mayor cantidad de ese
derivado de degradacin.
La temperatura a la que se encontr mayor dispersin entre los datos, manifestado por
mayor magnitud en el valor del CV, fue a 45 0C, cuyo valor fue de 1.71 %. Por lo que esa es
la incertidumbre del mtodo aplicado bajo las condiciones propias del laboratorio; estando
dentro de lo permitido.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen a Jhon Fredy Urrego, profesor de laboratorio de anlisis de
alimentos y bromatologa por su ardua colaboracin, a la profesora Rosario Echeverry,
tcnica y coordinadora del laboratorio de anlisis de alimentos y bromatologa por facilitar
los equipos e instalaciones requeridos para el desarrollo de dicha estandarizacin.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
1. Visquert M, Escriche I, Andrs A, Fito P. Cambios en parmetros de la calidad de la
miel ocasionados por los procesos trmicos. Aliment. equipos tecnol. 2004;
23(188): 87-92.
2. Sanz Cervera S, Sanz Cervera MM. ndice de diastasas y contenido en
Hidroximetilfurfural en las mieles de la Rioja. Zuba. [base de datos] 1994 [citado
2009
Abr
20];
12:
10
pantallas.
Disponible
en:
http://dialnet.unirioja.es/servlet/revista?
tipo_busqueda=CODIGO&clave_revista=1493
3. ICONTEC. Norma Tcnica Colombiana NTC 1273 [base de datos] Bogot:
ICONTEC; 1998. [acceso 24 de abril de 2009]. Disponible en:
http://infomed.udea.edu.co/icontec/TecnologiaAlimentos/NTC1273.pdf
4. Clarke M.A. Ed. Sugar and sugar products. En: Cunniff P. Official methods of analysis
of AOAC International. 16a ed. Garthersburg, Maryland: AOAC International; 1996. p.
44-144-43.