Curso Validación de Métodos Analíticos Con Formulas

VALIDACIN DE MTODOS VALIDACIN DE MTODOS
ANALTICOS, FISICOQUMICOS Y
MICROBIOLGICOS MICROBIOLGICOS
Licda. Lucrecia Arriola
Guatemala, 11 de septiembre de 2012
1
VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS
I. GENERALIDADES
2 Licda. Lucrecia Arriola 2
OBJETIVOS DEL CURSO OBJETIVOS DEL CURSO
1. Intentamos contestar las siguientes preguntas:
Q lid ? Qu es validar?
Por qu valido?
Para qu valido? Para qu valido?
Cundo valido?
Cmo valido? mo val do?
2. Conocer la diferencia entre Validacin y
Verificacin
3 C l d l 3. Conocer los requisitos de las normas
internacionales sobre la validacin de mtodos
3
VALIDACIN??
4 Licda. Lucrecia Arriola
LA VALIDACIN DE MTODOS
Por qu es necesaria la
validacin analtica? validacin analtica?
Cul es el propsito de
la validacin analtica? la validacin analtica?
5
Qu es validacin de mtodos analticos?
Validacin: Confirmacin mediante el suministro
de evidencia objetiva de que se han cumplido los de evidencia objetiva de que se han cumplido los
requisitos para una utilizacin o aplicacin
especfica prevista. p p
Validacin de un procedimiento analtico:
Procedimiento para establecer pruebas Procedimiento para establecer pruebas
documentales que demuestren cientficamente que
un mtodo analtico tiene las caractersticas de
desempeo que son adecuadas para cumplir los
requerimientos de las aplicaciones analticas
pretendidas
6
pretendidas.
Qu es validacin de mtodos analticos? Qu es validacin de mtodos analticos?
Es realizar un conjunto de pruebas de manera de:
a) Comprobar varios aspectos del comportamiento
del mtodo.
b) E bl i l fi i b) Establecer que sirve para el fin previsto.
L lid i i li l d t i d l La validacin implica la demostracin de la
determinacin de las fuentes de variabilidad y del
error sistemtico y al azar de un procedimiento no error sistemtico y al azar de un procedimiento, no
slo dentro de la calibracin sino en el anlisis de
muestras reales.
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Qu es verificacin de mtodos? Qu es verificacin de mtodos?
Verificacin: Confirmacin mediante la
aportacin de evidencia objetiva de que se han
cumplido los requisitos especificados.
Indicar el proceso que lleva a cabo el
laboratorio con el fin de demostrar su
capacidad para ejecutar correctamente un
mtodo normalizado cuando lo realiza
d i l exactamente como est descrito en la norma.
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Para qu valido un mtodo analtico? Para qu valido un mtodo analtico?
Para cumplir con requisitos de las
normas internacionales: normas internacionales:
a) BPM (Industria Farmacutica)
b) Norma ISO 17025 (Acreditacin ) m (
de Laboratorios de Ensayo y de
Calibracin)
) N ISO 15189 (A dit i c) Norma ISO 15189 (Acreditacin
de Lab. Clnicos)
d) Organismos Internacionales como d) Organismos Internacionales como
FAO, USP y otras farmacopeas,
OMS, ICH (Conferencia
Internacional Tripartita sobre
9
Internacional Tripartita sobre
Armonizacin)
Para qu valido un mtodo analtico? Para qu valido un mtodo analtico?
Para emitir resultados exactos y Para emitir resultados exactos y
precisos que sean reproducibles precisos, que sean reproducibles
para generar la confianza en p g
nuestros clientes.
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Cules son los tipos de mtodos?
1.Mtodos Normalizados:
p
Mtodo analtico desarrollado
por un organismo de
li i t is normalizacin u otro organismo
reconocido cuyos mtodos son
generalmente aceptados por el generalmente aceptados por el
sector tcnico correspondiente.
(Ref. ILAC-G18).
NOTA: El desarrollo del mtodo
incluye la etapa de su validacin.
11 11 Licda. Lucrecia Arriola
2. Mtodos No Normalizados:
p
Mtodo analtico desarrollado por
un tercero o que ha sido adaptado un tercero o que ha sido adaptado
por el laboratorio a partir de un
mtodo normalizado. (Ref. ILAC-
G18) G18).
NOTA: El desarrollo del mtodo,
d i i l l as como su adaptacin, incluyen la
etapa de su validacin.
3. Mtodos Desarrollados por
p
p
el Laboratorio:
Mtodo analtico que no se Mtodo analtico que no se
encuentra en normas u otras
colecciones de mtodos, ni en
publicaciones de terceros,
habiendo sido desarrollado por
el propio laboratorio el propio laboratorio.
NOTA: El desarrollo del mtodo
incluye la etapa de su validacin
13 13
incluye la etapa de su validacin.
Qu mtodos se validan?
1. Los Mtodos No Normalizados.
2. Los Mtodos diseados por el Laboratorio.
3.Los Mtodos Normalizados que han sido
modificados por el Laboratorio o utilizados fuera del
alcance previsto.
La validacin de los mtodos de ensayo debe:
La val dac n de los mtodos de ensayo debe
Reflejar las condiciones reales de ensayo.
L xt si d l lid i s i d p d La extensin de la validacin necesaria depender
del mtodo y su aplicacin.
L d b li p s n l lifi d p s La debe realizar personal calificado para esa
actividad.
En t d s l s c s s un p rm tr p r l v lid cin En todos los casos un parmetro para la validacin
de ensayos es la descripcin del mtodo de ensayo.
Qu mtodos se verifican?
1.Los Mtodos Normalizados.
Qu mtodos se verifican?
2. Los Mtodos Oficiales.
3 Los Mtodos de Org Nacionales o Internacionales 3. Los Mtodos de Org. Nacionales o Internacionales
Reconocidos.
Es d bl l tili i d t d s li d s Es recomendable la utilizacin de mtodos normalizados
cuando stos estn disponibles y sean apropiados.
El l b t i d b fi m d li "El laboratorio debe confirmar que puede aplicar
correctamente los mtodos normalizados antes de las
pruebas o calibraciones. Si el mtodo normalizado cambia,
16 16
p
la confirmacin se repetir ". USP
Cmo se dividen los mtodos segn el
RTCA 11 03 39: 06?
C I
RTCA. 11.03.39: 06?
1. Categora I
2 Categora II 2. Categora II
3 Categora III 3. Categora III
4. Categora IV . g V
5. Mtodos Microbiolgicos
Qu procedimientos analticos se validan
segn el RTCA 11 03 39: 06?
Se deben validar los siguientes procedimientos analticos
segn el RTCA. 11.03.39: 06?
g p
qumicos, fsicos y microbiolgicos:
Categora I: pruebas cuantitativas del contenido del
d principio activo, son procedimientos qumicos o
microbiolgicos que miden el analito presente en una
muestra determinada. m m
segn el RTCA 11 03 39: 06?
Categora II: pruebas para
segn el RTCA. 11.03.39: 06?
la determinacin del
contenido de impurezas o de
valores lmites para el control valores lmites para el control
de impurezas. Pueden ser
pruebas cuantitativas o una pruebas cuantitativas o una
prueba cualitativa para
determinar si la impureza p
est presente en la muestra
por encima o por debajo de un
l l it ifi d
19 19
valor lmite especificado.
segn el RTCA 11 03 39: 06?
Las categoras I y II miden con exactitud las
segn el RTCA. 11.03.39: 06?
Las categoras I y II miden con exactitud las
caractersticas de pureza de la muestra. Los
parmetros de validacin requeridos por una
b tit ti dif t l d prueba cuantitativa son diferentes a los de una
prueba cualitativa de cumplimiento de lmite.
segn el RTCA. 11.03.39: 06?
Categora III: son pruebas fisicoqumicas que miden
caractersticas propias del desempeo del
segn el RTCA. 11.03.39: 06?
caractersticas propias del desempeo del
medicamento, por ejemplo la prueba de disolucin. Las
caractersticas de la validacin son diferentes a las de
l t b l d i l i las otras pruebas, aunque las pueden incluir.
segn el RTCA 11 03 39: 06?
Categora IV: pruebas de identificacin. Aquellas que se
li s l id tid d d lit
segn el RTCA. 11.03.39: 06?
realizan para asegurar la identidad de un analito en una
muestra. Esto normalmente se realiza por comparacin de
una propiedad de la muestra, contra la de un estndar de p p
referencia, por ejemplo espectros, comportamiento
cromatogrfico, reactividad qumica y pruebas
microcristalinas microcristalinas.
segn el RTCA 11 03 39: 06?
Pruebas microbiolgicas: aquellas que se realizan para
segn el RTCA. 11.03.39: 06?
Pruebas microbiolgicas aquellas que se realizan para
asegurar la calidad microbiana del medicamento.
Cmo seleccionar e implementar un mtodo
analtico nuevo?
1. De preferencia, que sea un mtodo
n rmalizad de versin reciente
analtico nuevo?
normalizado de versin reciente.
2. Que el mtodo sea apropiado para el
tipo de muestra a analizar tipo de muestra a analizar.
3. Determinar si el Laboratorio cuenta
con personal capacitado para el con personal capacitado para el
anlisis a realizar.
4 Determinar si el Laboratorio cuenta 4. Determinar si el Laboratorio cuenta
con las instalaciones y condiciones
ambientales requeridas para el
lisis
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anlisis.
analtico nuevo?
5. Descripcin del procedimiento
incluyendo el alcance del mtodo
analtico nuevo?
incluyendo el alcance del mtodo
(aplicabilidad, tipo), tipo de
compuestos y de matriz.
6. Detalle de reactivos, estndares de
referencia que se utiliza.
7. Lista de equipos y requisitos de
funcionamiento y rendimiento.
8. Definir los parmetros del mtodo.
9. Detalle de condiciones e
i l t i d l t d i l d
25 25
implementacin del mtodo, incluyendo
la preparacin de la muestra.
analtico nuevo?
10. Definir los procedimientos
estadsticos y clculos
analtico nuevo?
estadsticos y clculos
representativos.
11 Definir los procedimientos para 11. Definir los procedimientos para
el control de calidad en la rutina.
12. Definir los grficos 12. Definir los grficos
representativos, cromatogramas,
espectros y curvas de calibracin.
13. Definir los criterios de
aceptacin / rechazo de los datos.
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14. Consideraciones de seguridad.
Etapas para desarrollar un mtodo analtico Etapas para sarro ar un m to o ana t co
Qu requisitos debo cubrir antes de validar q
un mtodo analtico?
Qu son los parmetros del desempeo del Qu son los parmetros del desempeo del
mtodo analtico
S l s i d d s t sti s id d s Son las propiedades, caractersticas o capacidades
cuantificables del mtodo que indican su grado de
calidad; incluyen exactitud, efecto matricial, cal dad; ncluyen exact tud, efecto matr c al,
repetibilidad, precisin intermedia, reproducibilidad,
especificidad, lmite de deteccin, lmite de
tifi i li lid d ibilid d cuantificacin, linealidad, rango, sensibilidad,
robustez, fortaleza y otras caractersticas
relacionadas con los resultados obtenidos por el relacionadas con los resultados obtenidos por el
mtodo.
Qu parmetros del desempeo se
determinan en cada mtodo analtico?
Parmetros de los procedimientos analticos fisico-
qumicos y potencia microbiolgica, segn ICH. q y p g g
Segn la USP 34:
Parmetros de desempeo de los procedimientos
microbiolgicos g
Extensin de la Validacin Extensin de la Validacin
Qu son los parmetros del desempeo del
t d lti mtodo analtico
S l s i d d s t sti s id d s Son las propiedades, caractersticas o capacidades
cuantificables del mtodo que indican su grado de
calidad; incluyen exactitud, efecto matricial, cal dad; ncluyen exact tud, efecto matr c al,
repetibilidad, precisin intermedia, reproducibilidad,
especificidad, lmite de deteccin, lmite de
tifi i li lid d ibilid d cuantificacin, linealidad, rango, sensibilidad,
robustez, fortaleza y otras caractersticas
relacionadas con los resultados obtenidos por el relacionadas con los resultados obtenidos por el
mtodo.
EXACTITUD DE LOS RESULTADOS
ANALTICOS
EXACTITUD: P ximid d d l n d n i nt EXACTITUD: Proximidad de la concordancia entre
el resultado de una medicin y un valor verdadero
del mensurando m u
Estimacin de la Exactitud Estimacin de la Exactitud
Estimacin de la Exactitud
1. Agregando cantidad conocida del estndar al
producto
a. Determinar por duplicado el contenido
promedio del analito en la muestra con el promedio del analito en la muestra con el
mtodo a validar.
b Enriquecer las muestras con estndar: para b. Enriquecer las muestras con estndar: para
preparar las soluciones, se mantiene
constante la cantidad de muestra tomada y c nstant a cant a mu stra t ma a y
se agregan cantidades variables del
estndar.
Agregando cantidad conocida del estndar al producto
c. La exactitud es evaluada utilizando un mnimo de nueve L m m
determinaciones, tres concentraciones y tres
determinaciones de cada concentracin. (por ejemplo:
concentraciones de 80% 100% y 120% de la concentraciones de 80%, 100% y 120% de la
concentracin normal de trabajo del mtodo; o 100%,
125% y 150% cuando no se puede reproducir la matriz
d l li ) del analito)
d. Calcular el % de Recuperacin con la frmula:
% Rec.= (valor encontrado / valor verdadero o de
referencia) * 100%
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referencia) 100%
Agregando cantidad conocida del estndar al
producto producto
Criterio de Aceptacin y Documentacin:
El porcentaje de recuperacin puede estar entre
90 y 110% del valor terico. Una recomendacin
es usar +/ 4 veces la desviacin estndar es usar +/- 4 veces la desviacin estndar
relativa.
Para Disolucin: 97% - 103% Para Disolucin: 97% 103%
Para Muestras biolgicas: 15% del valor
verdadero
Agregando cantidad conocida del estndar al producto
Criterio de Aceptacin y Documentacin: p y
Para Trazas: Menor a 100 ppb: 60% - 110% de
recuperacin
Mayor a 100 ppb: 80% - 110% de Mayor a 100 ppb: 80% 110% de
recuperacin
Menos de 1 ppb: 70% - 120% de
recuperacin p
Para cada muestra, reportar el valor terico, el valor del
ensayo y el porcentaje de recuperacin. Calcular el
di l d i i t d d i i t d promedio, la desviacin estndar, desviacin estndar
relativa (coeficiente de variacin) y el porcentaje de
recuperacin para todas las muestras. Llevar un registro
de los resultados en una hoja de datos.
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de los resultados en una hoja de datos.
2. Comparando los resultados de un estndar o Material
de Referencia Certificado
Determinar por duplicado el valor promedio del estndar
o material de referencia certificado por el mtodo a
lid C l lt d bt id l l validar. Comparar el resultado obtenido con el valor
declarado.
Tomar en cuenta la disponibilidad y estabilidad del Tomar en cuenta la disponibilidad y estabilidad del
estndar o MRC, as como la incertidumbre que tenga el
valor verdadero.
La exactitud es evaluada utilizando un mnimo de 30
determinaciones: 5 concentraciones y 6 determinaciones
de cada concentracin
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de cada concentracin.
2. Comparando los resultados de un estndar o Material de
Referencia Certificado
El porcentaje de recuperacin puede estar entre 98 y 102%
del valor terico o 2% de error relativo. Se calcula con la
siguiente frmula: siguiente frmula:
% Rec.= (valor encontrado / valor verdadero o de
referencia) * 100% referencia) 100%
ensayo y el porcentaje de recuperacin Calcular el ensayo y el porcentaje de recuperacin. Calcular el
promedio, la desviacin estndar, desviacin estndar
recuperacin para todas las muestras. Llevar un registro de
l s s lt d s n n h j d d t s
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los resultados en una hoja de datos.
3. Comparando los resultados con un mtodo oficial
con exactitud bien definida con exact tud b en def n da
La muestra debe ser analizada utilizando el mtodo
a validar y un segundo mtodo bien caracterizado a validar y un segundo mtodo bien caracterizado,
el cual debe tener una exactitud bien definida y
establecida.
Se analizan 6 muestras por duplicado a la
concentracin normal de trabajo por ambos concentracin normal de trabajo por ambos
mtodos.
3. Comparando los resultados con un mtodo oficial con
exactitud bien definida
Se lleva a cabo un anlisis de varianza, del porcentaje de
recuperacin o del error relativo en porcentaje, para
determinar si hay o no diferencia significativa entre la
exactitud de los mtodos comparados. p
ensayo y el porcentaje de recuperacin. Calcular el
di l d i i d d i i d promedio, la desviacin estndar, desviacin estndar
recuperacin para todas las muestras. Llevar un registro de
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los resultados en una hoja de datos.
PRECISIN DE LOS RESULTADOS
ANALTICOS ANALTICOS
PRECISIN: Es el grado de concordancia entre
los resultados independientes de una medicin los resultados independientes de una medicin,
obtenidos en condiciones estipuladas, ya sea de
repetibilidad o de reproducibilidad y depende de p p y p
la distribucin de los resultados sin estar
relacionada con el valor verdadero.
PRECISIN DE LOS RESULTADOS ANALTICOS
Hay 3 niveles para determinar la Precisin del Mtodo:
1.REPETIBILIDAD: Coincidencia entre los resultados de
di i i li d l i mediciones sucesivas realizadas en las mismas
condiciones de medicin.
2.REPRODUCIBILIDAD: Coincidencia entre los
resultados de mediciones realizadas en diferentes
condiciones de medicin en un mismo laboratorio o
entre 2 laboratorios entre 2 laboratorios.
3.PRECISIN INTERMEDIA: Medida de la precisin de
los resultados de un mtodo en condiciones diferentes
d li t d i l t d ti d t de analista, da, equipo y lote de reactivos, dentro
del mismo laboratorio. No es necesario determinar
precisin intermedia, cuando se ha determinado
p ,
reproducibilidad.
PRECISIN- REPETIBILIDAD
Para determinar la precisin entre ensayos o
repetibilidad, se trabaja con submuestras de una
muestra homognea, bajo las mismas condiciones
medicin: el mismo procedimiento de medicin, el
mismo observador el mismo instrumento de medicin mismo observador, el mismo instrumento de medicin,
en un perodo corto de tiempo. Hay 2 formas de
determinarla:
1. Hacer un mnimo de 9 determinaciones: 3
rplicas a 3 concentraciones diferentes o 9
determinaciones al 100% de la concentracin determinaciones al 100% de la concentracin
normal de trabajo.
2. hacer un mnimo de 6 determinaciones a una
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2. hacer un mnimo de 6 determinaciones a una
concentracin que corresponda con la de la
muestra problema.
PRECISIN- REPETIBILIDAD
Se establece de acuerdo a un valor mximo
aceptable para el parmetro escogido, segn el aceptable para el parmetro escog do, segn el
tipo de anlisis y su propsito especfico.
Registrar los resultados en el formato de datos,
as como los clculos de la media y los
parmetros de dispersin escogidos: s SDR parmetros de dispersin escogidos: s, SDR,
CV o intervalo de confianza.
PRECISIN INTERMEDIA
Se determina realizando un mnimo de seis
determinaciones al 100% de la concentracin esperada. determinaciones al 100% de la concentracin esperada.
(Diferentes das, analistas y equipo).
Criterio de Aceptacin y Documentacin: p y
RSD < 2,0% para macrocomponentes
RSD < 10,0% para componentes menores
RSD 3 0% t d l d di l i RSD < 3,0% para mtodos empleados en disolucin
RSD < 10% para muestras biolgicas
Registrar los resultados, as como los clculos de la media,
la desviacin estndar, la desviacin estndar relativa
(coeficiente de variacin) y el intervalo de confianza
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(coeficiente de variacin) y el intervalo de confianza.
PRECISIN- REPRODUCIBILIDAD
Se determina realizando un mnimo de seis
determinaciones al 100% de la concentracin esperada.
( li l d i i li d dif (Se realiza las determinaciones analizando en diferentes
das, por diferente analista, horas del da, equipos).
Criterio de Aceptacin y Documentacin: Criterio de Aceptacin y Documentacin:
Se espera una variabilidad mayor, que para el caso de la
repetibilidad repetibilidad.
Registrar los resultados, as como los clculos de la media,
la desviacin estndar, la desviacin estndar relativa
(coeficiente de variacin) y el intervalo de confianza.
No se realiza precisin intermedia cuando se estima la
d ibilid d
50
reproducibilidad.
ERROR EN LOS RESULTADOS ANALTICOS
ERROR: Resultado de una medicin menos un
valor verdadero del mensurando.
Determinacin de Exactitud y de
Precisin del mtodo analtico Precisin del mtodo analtico
La norma ISO- 5725 nos describe las
consideraciones que se deben tomar en cuenta para cons derac ones que se deben tomar en cuenta para
determinar la exactitud y la precisin de una
medicin:
Contar con un mtodo establecido.
El nmero de factores que cambiarn en la
d t min in determinacin.
El alcance de medicin.
El nmero de puntos a realizar El nmero de puntos a realizar.
La disponibilidad de los materiales y quipos.
El nmero de repeticiones
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El nmero de repeticiones.
Cronograma para realizar las mediciones.
ESPECIFICIDAD ESPECIFICIDAD
Es la habilidad que muestra un mtodo para
distinguir entre un analito e impurezas conocidas distinguir entre un analito e impurezas conocidas,
precursores sintticos, metabolitos, o productos
de degradacin. Esta se muestra en su resolucin
hacia estos componentes.
Documentacin
Imprimir cromatogramas o datos que muestren la
resolucin de un mtodo.
Criterio de Aceptacin Criterio de Aceptacin
Los componentes contaminantes no deben
interferir con el anlisis del analito en cuestin
53
interferir con el anlisis del analito en cuestin. .
LMITE DE DETECCIN
Determinar la menor concentracin a la que se detecte el
analito en la matriz de la muestra.
D t i Documentacin
Imprimir el cromatograma o registrar la menor
concentracin detectable en una hoja de registro. concentracin detectable en una hoja de registro.
Criterio de Aceptacin
No hay un lmite de deteccin mnimo. Sin embargo, para y g p
mtodos cromatogrficos el lmite superior suele ser un
valor de al menos tres veces la lnea base (o nivel de
ruido) Para otros instrumentos puede ser el lmite de ruido). Para otros instrumentos puede ser el lmite de
operacin del instrumento, segn lo haya establecido el
fabricante.
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Canadian Health Protection Branch (CHPB) establece una
razn de 3:1 entre la seal y el ruido.
LMITE DE DETECCIN
Para Mtodos No Instrumentales:
Se preparan 10 blancos independientes y 10 blancos
enriquecidos a la concentracin ms baja aceptada.
Una vez preparadas las soluciones se llevan a cabo Una vez preparadas las soluciones, se llevan a cabo
las mediciones de cada una y posteriormente se
calcula la desviacin estndar de cada grupo de g p
datos.
Con estos datos se puede calcular el lmite de Con estos datos se puede calcular el lmite de
deteccin:
LD = Valor promedio del blanco + 3S
55
LD = Valor promedio del blanco + 3S
LMITE DE CUANTIFICACIN
Determinar la menor concentracin en la que un
analito en la matriz/muestra puede ser determinada anal to en la matr z/muestra puede ser determ nada
con la exactitud y precisin requeridas para el
mtodo en particular. Este valor puede ser la menor
t i l d l t concentracin en la curva del patrn.
Documentacin
Imprimir el cromatograma o anotar el dato de la
menor concentracin cuantificable en la hoja de j
datos. Proveer datos que demuestren exactitud y
precisin requeridas en el criterio de aceptacin.
LMITE DE CUANTIFICACIN
Criterio de Aceptacin
El lmite de cuantificacin para mtodos cromatogrficos
es la concentracin que proporciona una razn seal a
ruido con una relacin de 10 a 1 y que es menor o igual a ruido, con una relacin de 10 a 1 y que es menor o igual a
10% de la precisin, o una relacin de 20 a 1 y es menor o
igual a 5% de la precisin.
En el lmite de cuantificacin, se deben cumplir los
criterios de aceptacin de exactitud y linealidad. CHPB
bl l l i d ifi i l j establece que el lmite de cuantificacin es el mejor
estimado de una concentracin baja, que derive en una
desviacin estndar relativa de aproximadamente 10%,
57
p ,
en, al menos, seis rplicas.
LINEALIDAD
Capacidad de un mtodo analtico para generar resultados
directamente proporcionales a la concentracin del
analito o valor del parmetro de la muestra dentro de un analito o valor del parmetro de la muestra, dentro de un
rango.
H 2 f d d t i l li lid d Hay 2 formas de determinar la linealidad:
1. Preparar soluciones patrn de por lo menos cinco
diferentes concentraciones del estndar, que estn
distribuidas regularmente y que cubran del 80%-120% o
50%-150%, del intervalo de trabajo esperado, con 5 5 , nt r a o tra ajo sp ra o, con
diluciones a partir de una misma solucin madre y
analizando en duplicado para cada dilucin, o realizando
por duplicado la solucin madre y analizando 1 vez cada
58
por duplicado la solucin madre y analizando 1 vez cada
dilucin.
LINEALIDAD
2)Usar seis rplicas por concentracin. Analizar las
soluciones conforme el mtodo en cuestin.
L d lib i fi l d l La curva de calibracin se grafica colocando las
concentraciones de las soluciones en el eje horizontal (x)
y las respuestas del instrumento en el eje vertical (y), y p j (y),
esta relacin debe ser lineal con un coeficiente de
determinacin (r2) de por lo menos 0.98. (Es preferible
0 99) Los valores deben caer dentro de una zona 0.99). Los valores deben caer dentro de una zona
horizontal angosta, los que queden fuera no son
aceptables para ser incluidos en el intervalo normal de
t b j
59
trabajo.
En donde:
LINEALIDAD
CV menor o igual a 2.0% (desviacin estndar relativa o
coeficiente de variacin)
r mayor o igual a 0.99 (el coeficiente de correlacin es
una medida del grado de asociacin entre las mediciones y
la concentracin del analito) la concentracin del analito)
r2 mayor o igual a 0.98 (el coeficiente de determinacin
mide la exactitud con la que se ajusta la curva de
regresin a los valores experimentales de y)
b aproximadamente igual a 0 (intercepto de la lnea)
m igual a la sensibilidad del sistema (pendiente de la m igual a la sensibilidad del sistema (pendiente de la
lnea)
Evaluacin de la Linealidad
Evaluacin de la Linealidad
RANGO O INTERVALO RANGO O INTERVALO
Intervalo entre la concentracin mxima y mnima de
analito en la cual se puede determinar al analito con anal to en la cual se puede determ nar al anal to con
un nivel adecuado de precisin, exactitud y linealidad
utilizando el mtodo en cuestin.
a) Procedimiento:
V ifi l t d lti i Verificar que el mtodo analtico proporciona
linealidad, precisin y exactitud aceptables cuando
se aplica a muestras que contienen el analito en los se aplica a muestras que contienen el analito en los
extremos y dentro del intervalo.
Deben considerarse los rangos especificados mnimos
que se indican a continuacin: que se nd can a cont nuac n
Valoracin de macrocomponentes 80-120% de la
concentracin de prueba concentracin de prueba
Uniformidad de contenido 70-130% o el
i t l i d l M f intervalo ms apropiado segn la Monografa.
Prueba de disolucin 20% por encima p
del intervalo especificado.
Cuantificacin de impurezas LC o 50%- 120%
Cuantificacin de impurezas LC o 50% 120%
Determinar que los niveles de precisin, exactitud y
linealidad de las mediciones utilizando el mtodo a
validar, en el rango de las concentraciones del analito
cumple con su respectivo criterio de aceptacin.
VALIDACIN DE MTODOS
MICROBIOLGICOS
VALIDACIN DE MTODOS
MICROBIOLGICOS
Validar mtodos microbiolgicos requiere: Validar mtodos microbiolgicos requiere:
1. Comparar con un MTODO DE REFERENCIA. 1. Comparar con un MTODO DE REFERENCIA.
2. Usar cepas de referencia y cepas de referencia
certificadas.(Material de referencia).
3. LA EVALUACIN SISTEMTICA DE
FACTORES.
4 Ensayos Interlaboratorios 4. Ensayos Interlaboratorios.
5. La estimacin de la incertidumbre.
VALIDACIN DE MTODOS
MICROBIOLGICOS
Lmite de deteccin Lmite de deteccin
El nmero ms bajo de microorganismos que
pueden ser detectados, pero en nmeros que no pueden ser detectados, pero en nmeros que no
pueden ser estimados exactamente.
Lmite de cuantificacin
Aplicado a pruebas microbiolgicas cuantitativas. El
nmero ms bajo de microorganismos dentro de nmero ms bajo de microorganismos, dentro de
una variabilidad definida, que pueden ser contados
bajo las condiciones experimentales del mtodo bajo
bajo las condiciones experimentales del mtodo bajo
evaluacin.
VALIDACIN DE MTODOS
MICROBIOLGICOS
Cultivos de referencia Cultivos de referencia
Termino colectivo para la cepa de referencia y los
stocks de referencia. stocks de referencia.
Material de referencia
Material suficientemente homogneo y estable en
relacin a una o ms propiedades especificadas, el
cual ha sido establecido como idneo para el uso cual ha sido establecido como idneo para el uso
previsto, en un proceso de medicin.
VALIDACIN DE MTODOS
MICROBIOLGICOS
Sensibilidad Sensibilidad
La fraccin del nmero total de cultivos positivos o
colonias correctamente asignadas en una presunta colonias correctamente asignadas en una presunta
inspeccin (7).
Especificidad (selectividad)
La habilidad del mtodo para detectar el rango
requerido de microorganismos que podran estar requerido de microorganismos que podran estar
presentes en la muestra.
VALIDACIN DE MTODOS
MICROBIOLGICOS
Los mtodos de ensayos estandarizados se Los mtodos de ensayos estandarizados se
consideran validados. Sin embargo, el mtodo de
ensayo especfico para ser utilizado por un ensayo especfico para ser utilizado por un
determinado laboratorio para el anlisis de un
producto especfico necesita mostrar que es
adecuado para su uso en la recuperacin de
bacterias, levaduras y mohos en la presencia del
producto especfico producto especfico.
VALIDACIN DE MTODOS
MICROBIOLGICOS
El laboratorio debe demostrar que los criterios de El laboratorio debe demostrar que los criterios de
desempeo del mtodo de ensayo estndar pueden
ser satisfechos por el laboratorio antes de introducir ser satisfechos por el laboratorio antes de introducir
el ensayo con propsitos de rutina (mtodo de
verificacin) y que el mtodo de ensayo especfico
para el producto especfico es adecuado
(adecuacin del mtodo de ensayo incluyendo
controles positivos y negativos) controles positivos y negativos).
VALIDACIN DE MTODOS
Los mtodos de ensayo no basados en compendios
u otras referencias reconocidas deben ser validados u otras referencias reconocidas deben ser validados
antes de su uso. La validacin debe incluir, cuando
sea apropiado, determinacin de la exactitud, sea apropiado, determinacin de la exactitud,
precisin, especificidad, lmite de deteccin, lmite de
cuantificacin, linealidad y robustez. Potenciales
efectos inhibitorios de la muestra deben ser tomados
en cuenta al ensayar los diferentes tipos de
muestra Los resultados deben ser evaluados con muestra. Los resultados deben ser evaluados con
mtodos de estadstica apropiados, como se
describe en las farmacopeas nacionales regionales
describe en las farmacopeas nacionales, regionales
o internacionales.
VALIDACIN DE MTODOS
Control de calidad interna
El laboratorio debe contar con un sistema de
aseguramiento de calidad interna o control de aseguramiento de calidad interna o control de
calidad (por ejemplo: manejo de desviaciones, uso
de muestras adicionadas, rplicas de ensayos,
participacin en ensayos de aptitud) para asegurar la
consistencia de resultados rutinarios y su
conformidad de acuerdo a un criterio establecido conformidad de acuerdo a un criterio establecido.
VALIDACIN DE MTODOS
Control de calidad interna
La validacin de mtodos microbiolgicos se realiza
especialmente utilizando los resultados del control especialmente utilizando los resultados del control
interno de la calidad, se estima la repetibilidad y la
reproducibilidad.
VALIDACIN DE MTODOS
MICROBIOLGICOS
Validar mtodos microbiolgicos requiere: Validar mtodos microbiolgicos requiere:
1. Comparar con un MTODO DE REFERENCIA. 1. Comparar con un MTODO DE REFERENCIA.
2. Usar cepas de referencia y cepas de referencia
certificadas.(Material de referencia).
3. LA EVALUACIN SISTEMTICA DE
FACTORES.
4 Ensayos Interlaboratorios 4. Ensayos Interlaboratorios.
5. La estimacin de la incertidumbre.
Definiciones y Frmulas usadas en la
Validacin de Mtodos
1 Desviacin Estndar 1. Desviacin Estndar
Es la medida de cmo se dispersan los valores
alrededor de la media en la distribucin de valores. alrededor de la media en la distribucin de valores.
Se calcula con la frmula:
( ) x -
x
1
1
= s
i
2
n = i
En donde: n es el nmero de valores

( )
x
1 - n
i
=0 i

Validacin de Mtodos
2 DESVIACIN ESTNDAR DE LA REPETIBILIDAD 2. DESVIACIN ESTNDAR DE LA REPETIBILIDAD
Es la desviacin estndar de los resultados de los anlisis
obtenidos bajo condiciones de repetibilidad.
( ) =

k
i i I
s n
k N
s
2
1
1
En donde n es el nmero de valores
= i
k N
1
En donde n es el nmero de valores
N es el nmero de repeticiones
k es el factor de cobertura, se utilizar k = 2, con
i l d fi d l 95%
un nivel de confianza del 95%
es el cuadrado de la desviacin estndar
2
i
s
Validacin de Mtodos
3 DESVIACIN ESTNDAR DE LA REPRODUCIBILIDAD (total) 3. DESVIACIN ESTNDAR DE LA REPRODUCIBILIDAD (total)
La desviacin estndar de los resultados de anlisis obtenidos bajo
condiciones de reproducibilidad.
( ) ( )
1
1
2 2
+
=
N
s k s k N
s
Z I
En donde N es el nmero de repeticiones
1 N
k es el factor de cobertura, se utilizar k = 2, con un nivel
de confianza del 95%
es el cuadrado de la desviacin estndar
2
i
s
es el cuadrado de la desviacin estndar entre las
repeticiones o series
2
Z
s
Validacin de Mtodos
4 DESVIACIN ESTNDAR RELATIVA (RSD) 4. DESVIACIN ESTNDAR RELATIVA (RSD)
Es la comparacin de la desviacin estndar con respecto a la media,
generalmente se expresa en % y se denomina como Coeficiente de
Variacin Se calcula con la siguiente frmula: Variacin. Se calcula con la siguiente frmula:
%
s
CV 100 =
x
En donde es la desviacin estndar
es el promedio de las mediciones
s
x
Validacin de Mtodos
5 PRECISIN INTERMEDIA 5. PRECISIN INTERMEDIA
Medida de la precisin de los resultados de un mtodo de ensayo en
condiciones diferentes de analista, da, equipo y lote de reactivos, dentro
del mismo laboratorio con la misma muestra homognea del mismo laboratorio con la misma muestra homognea.
( )
=
k
i i Z
x x n s
2
1
En donde
( )
i
i i Z
k
1
1
n es el nmero de valores
k es el factor de cobertura, se utilizar k = 2, con un nivel
de confianza del 95%
l d i i t d t l ti i i
s
es la desviacin estndar entre las repeticiones o series
es el promedio de las mediciones
x
Z
s
Protocolo de Validacin Protocolo de Validacin
Componentes de la Calidad de los
anlisis anlisis
MUCHAS GRACIAS MUCHAS GRACIAS

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En donde: n es el nmero de valores

77 Licda. Lucrecia Arriola

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