TEORIA EM Alumnos Janer

Anlisis Microbiolgicos Unidad Temtica 1.
Microbiologa

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Salvador Camacho Garrido

LA MICROBIOLOGA COMO CIENCIA
EXPERIMENTAL Y APLICADA.

La Microbiologa es la ciencia o conjunto
de disciplinas biolgicas que estudia los
organismos microscpicos y ultramicroscpicos -a
los que antiguamente se les denominaba microbios,
palabra ya casi en desuso, que designaba a los
organismos causantes de las fermentaciones y las
enfermedades, tambin por ello denominados
grmenes- que slo son visibles mediante el
microscopio ptico (los primeros) o el microscopio
electrnico (los ltimos).
Aunque el estudio de estos
microorganismos se inici con PASTEUR usando
las tcnicas microscpicas, los aspectos
morfolgicos que estas proporcionan no son los
nicos ni los ms importantes. La microbiologa
comprende el cultivo de los grmenes, su
filtracin, su aislamiento, su identificacin y
recuento, el aislamiento de sus productos
metablicos (las toxinas entre otros), el estudio de
las reacciones qumicas que realizan, los medios
donde viven, sus relaciones entre ellos y otros
seres vivos (ecologa) y tambin su poder patgeno
y antignico.
De ello podemos colegir que es una
ciencia experimental y aplicada, y que los campos
donde se desarrollan son tan variados, que ha dado
lugar a una serie de subdivisiones. Entre otras:
Microbiologa alimentaria: Ciencia que
trata de los microorganismos implicados en
la produccin, deterioro, conservacin y
contaminacin de los alimentos.
Microbiologa del agua: Parte de la
microbiologa que se ocupa del estudio de la
microflora (normal u ocasional) de las masas
de agua naturales y artificiales.
Microbiologa marina: Ciencia que estudia
los microorganismos marinos.
Microbiologa del suelo: Ciencia que
estudia los microorganismos presentes en el
suelo, sus funciones y las consecuencias de
su actividad en las caractersticas del suelo y
del desarrollo vegetal.
Microbiologa del petrleo: Estudia los
aspectos microbiolgicos de inters en la
industria petroqumica como la formacin
del petrleo, su prospeccin, produccin,
industrializacin, almacenamiento, la sntesis
de productos alimentarios a partir de l, y los
mtodos de destruccin de sus residuos.

Microbiologa industrial: Ciencia que
versa sobre el estudio, la utilizacin y
manipulacin de los microorganismos
capaces de producir sustancias (o cambios
en ciertos productos) de inters econmico,
reprimiendo aquellos no deseables.
Microbiologa textil: Se preocupa de
aquellos microorganismos que pueden ser
perjudiciales, tanto para las fibras como para
los consumidores, as como del uso de
algunos de ellos en algunas fases de la
produccin (como en el enfriamiento).
Microbiologa mdica: Estudio de los
microorganismos que afectan a la salud.
Y as un largo etc.

LOS SERES VIVOS. CLASIFICACIN.

Clsicamente se defina como ser vivo a
aquellos que eran capaces de cumplir unas
funciones bien definidas:
Nacer.
Crecer.
Reproducirse.
Morir.
Actualmente, esta definicin ha sido
superada; algunas entidades se reproducen pero se
duda de su nacimiento como en el caso de los
priones (proteinaceous infectious particle)
responsables de la enfermedad de KREUTFELD-
JACKOBS en humanos, de la Encefalopata
Espongiforme Bovina (EBB) o enfermedad de las
vacas locas y de la tembladera (scrapie) del
ganado ovino; otras entidades son incapaces de
crecer hasta que las condiciones le son favorables
como en el caso de las esporas; algunos linajes
celulares son considerados como eternos (clulas
cancerosas HeLa); Asimismo otros organismos son
incapaces de reproducirse como el caso de los
hbridos (como los mulos) y nadie pone en duda
que son seres vivos. Por otro lado, los cristales
nacen y crecen y no son seres vivos.
Posteriormente se defini como ser vivo
aquel que es capaz de tener la funcin de relacin
con otros seres vivos y su entorno. Pero sin
explicitar qu es la funcin de relacin la
definicin carece de precisin.
En lo que si parecen estar de acuerdo todos
los autores es que la vida, tal como la conocemos,
est representada por un cdigo gentico nico,
susceptible de transmisin y basado en los cidos
1. Microbiologa.
Anlisis Microbiolgicos Unidad Temtica 1. Microbiologa

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nucleicos, cido desoxirribonucleico (ADN) y
cido ribonucleico (ARN).

Del mismo modo que la definicin, la
clasificacin de los seres vivos ha sido objeto de
modificaciones y de controversias. La clsica
divisin en los reinos animal y vegetal hecha en
principio hubo de aumentarse por la presencia de
los hongos (gnero Fungi) y posteriormente por las
bacterias y virus.
Aunque el estudio morfolgico y
fisiolgico de los microbios ha dado lugar a
algunas clasificaciones, as se consideran vegetales
algunos hongos microscpicos (protfitos) y
algunas algas (cianofceas), y animales a los
protozoos (amebas, flagelados y rotferos entre
otros), a escala microscpica las diferencias entre
animales/vegetales pierden precisin y bacterias y
virus no pueden incluirse en ninguno de los dos.
Algunas bacterias poseen caracteres de los
vegetales pero pueden moverse, como en el caso
del bacilo de la fiebre tifoidea por medio de cilios
vibrtiles.
En cuanto a los virus, el criterio de
movilidad pierde todo su valor y unas propiedades
especiales como son el parasitismo intracelular
obligatorio y, sobre todo, la existencia de un
genoma con un nico tipo de cido nucleico los
convierte en un grupo claramente diferenciado.

DEFINICIN DE MICROORGANISMO.

Consideraremos como microorganismos a
aquellos seres que solo son visibles con ayuda del
microscopio (a veces es necesario el electrnico), y
en el que se incluyen adems de las bacterias, los
virus, las algas, los hongos, los protozoos y las
rikettsias.
Para zanjar el debate vegetal-animal,
HAECKEL los agrup en el reino de los protistos, y
puesto que los microorganismos generalmente son
seres unicelulares la clasificacin ms extendida
hace referencia al tipo de clula, que parece
denotar dos grados de evolucin:
Clulas eucariticas: cuya organizacin
es igual a la de las clulas de los
organismos superiores al poseer membrana
nuclear como en el caso de los protozoos y
hongos.
Clulas procariticas: carecen de
membrana nuclear como en el caso de
bacterias y virus.
En funcin del microorganismo objeto de
estudio la microbiologa tambin puede
subdividirse en:
Protistologa.
Micologa.
Bacteriologa.
Virologa.

Actualmente todos los seres vivos o Biota,
estn agrupados en tres dominios:
Archaea.
Bacteria.
Eukarya.
Cada uno de los cuales a su vez se dividen
en otras categoras taxonmicas:
El reino protisto fue creado por HAECKEL
(1.866) para zanjar la polmica que en su tiempo
existi sobre si los microorganismos correspondan al
reino animal o al reino vegetal
El reino de los protistos es muy heterogneo
desde el punto de vista sistemtico que incluye
organismos con una organizacin biolgica
relativamente sencilla. Son generalmente unicelulares
aunque con frecuencia forman cenobios. Lo ms
caracterstico, y lo que los diferencia esencialmente de
animales y vegetales, es que, tanto si son
pluricelulares (la minora) como si son unicelulares,
no presentan ningn tipo de diferenciacin interna.
No existe la diferenciacin celular (las clulas en los
organismos superiores se diferencian en tipos para
realizar una determinada funcin), ni mucho menos
existe diferenciacin tisular (organizacin en tejidos).
Ser vivo es un ser bien diferenciado por su
estructura del medio que le rodea, capaz de asimilar
materiales extraos, lo que le permite renovar sus
tomos con ms rapidez que sus estructuras
superiores. Tiende siempre a crecer y a multiplicarse,
sin otro lmite que las posibilidades que le ofrece el
medio ambiente, de modo que de cada ser vivo existe
un nmero elevado de ejemplares casi idnticos, cuyo
conjunto constituye una especie. Un ser vivo slo
puede provenir de otros seres vivos: Omne vivum ex
vivo.

Procaryotae: Schizomycetes Cianobacteria (antigua
(Reino) Schyzophycea)

Bacteria: Schizomycetes
Rickettsiales
(Orden)
antigua clase
Microtatobiotes

Reino: Protisto
Clase: Esquizomicetos
Orden: Eubacteriales
Familia: Enterobacteriaceae
Gnero: Escherichia
Especie: E. Coli
Cepa: Enterotoxignico
Serotipo: ATTC 25922

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Especie
Gnero
Familia
Orden
Clase
Filo
Reino

CARACTERSTICAS FUNDAMENTALES
DE LOS MICROORGANISMOS.

Las caractersticas fundamentales y
comunes a los microorganismos ms usuales en
nuestro estudio (bacterias, virus y hongos) son:
1. Las reacciones metablicas se producen a
elevada velocidad debido a sus pequeas
dimensiones, lo que hace que todos los puntos
estn relativamente prximos y, por tanto,
permite el rpido transporte de sustancias en el
interior de la clula.
2. La abundante cantidad de desechos,
consecuencia de la propiedad anterior, se
eliminan rpidamente al medio gracias a la
gran relacin superficie/volumen que
presentan.
3. Se multiplican con mucha rapidez por lo que
su nmero suele ser extraordinariamente
elevado. Algunas especies pueden llegar a
producir hasta 100 generaciones en 24 horas.
4. El tamao tan diminuto, no slo constituye el
motivo antiguo de separacin de vegetales y
animales, sino que tambin, trae consigo
consecuencias esenciales en su morfologa, su
fisiologa, su difusin ecolgica y en su
manipulacin en el laboratorio. El dimetro de
la mayora de las bacterias no supera la
milsima del milmetro por lo que
generalmente, se utiliza la micra -micrn o
micrometro (m)- como unidad de longitud.

FACTORES QUE AFECTAN A LOS
MICROORGANISMOS.

Los factores fisicoqumicos que deben
considerarse como los ms importantes al
establecer las condiciones ptimas para la vida y el
crecimiento de los microorganismos son:
La concentracin de iones hidrgeno: Tanto
para la vida como para el crecimiento de los
microorganismos tiene una importancia
decisiva la acidez (pH) del medio. Los iones
hidronio (H
+
) y los iones hidroxilo (OH
-
) son
los que ms movilidad presentan, y por lo cual
pequeas variaciones en su concentracin
presentan efectos muy importantes. En el caso
de cultivos es crtico establecer el pH ptimo y
mantenerlo constante. La mayora de los
microorganismos presentan un nivel de
crecimiento ptimo cuando la concentracin de
H
+
y la concentracin de OH
-
es
aproximadamente la misma, es decir, a pH 7.
Actividad de agua: Todos los
microorganismos, como seres vivos, tienen una
elevada proporcin de agua. Su hbitat, por
tanto, debe tener una concentracin mnima de
agua libre.
Temperatura: Aunque los microorganismos
presentan distintos comportamientos, la
mayora de las bacterias del suelo y del agua
son mesfilas y sus temperaturas de vida
ptima oscilan entre 20-45 C. Algunas
bacterias, generalmente esporuladas, presentan
un crecimiento ptimo a temperaturas
B Bi io ot ta a
D Do om mi in ni io o E Eu uk ka ar ry yo ot ta a
R Re ei in no o A An ni im ma al li ia a
S Su ub br re ei in no o M Me et ta az zo oa a
F Fi il lo o C Ch ho or rd da at ta a
S Su ub bf fi il lo o V Ve er rt te eb br ra at ta a
S Su up pe er rc cl la as se e T Te et tr ra ap po od da a
C Cl la as se e M Ma am mm ma al li ia a
S Su ub bc cl la as se e T Th he er ri ia a
I I n nf fr ra ac cl la as se e E Eu ut th he er ri ia a
O Or rd de en n P Pr ri im ma at te es s
S Su ub bo or rd de en n A An nt th hr ro op po oi id de ea a
I I n nf fr ra ao or rd de en n C Ca at ta ar rr rh hi in ni i
S Su up pe er rf fa am mi il li ia a H Ho om mi in no oi id de ea a
F Fa am mi il li ia a H Ho om mi in ni id da ae e
S Su ub bf fa am mi il li ia a H Ho om mi in ni in na ae e
T Tr ri ib bu u H Ho om mi in ni in ni i
G G n ne er ro o H Ho om mo o
E Es sp pe ec ci ie e s sa ap pi ie en ns s
S Su ub be es sp pe ec ci ie e s sa ap pi ie en ns s
rbol de la Vida

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superiores a 45 C y son denominadas
termfilas. Por contraposicin, la mayora de
los microorganismos marinos se denominan
como psicrfilos y poseen una temperatura
ptima de crecimiento inferior a 20 C. Se
denominan microorganismos termotolerantes a
aquellos microorganismos que, si bien no
corresponde a su temperatura lmite, su
temperatura ptima coincide con la de los
microorganismos mesfilos. Esta terminologa
se aplica usualmente a las bacterias como
microorganismos ms importantes.
Presin osmtica: Son seres bastante
tolerantes en los que se refiere a la presin
osmtica que ejerce el medio. Muchos crecen
en soluciones salinas cuya concentracin oscila
entre el 0,1-10,0 %. Muchas bacterias marinas
son denominadas halfilas y no pueden
desarrollarse cuando el contenido en sales es
inferior al 1,0 %.
Adems de estos factores, como
cualquier ser vivo, necesitan acceder a los
elementos nutritivos necesarios para su desarrollo
y crecimiento.

ALGUNAS CLASIFICACINES DE LOS
MICROORGANISMOS.

Para su estudio, los microorganismos en
general y las bacterias en particular, se pueden
clasificar atendiendo a sus propiedades:
1. Con respecto del aire: Pueden ser,
Aerbicos: slo crecen en presencia de aire.
Microaerfilos: crecen con menos proporin
deoxgeno.
Anaerbicos: crecen en ausencia de aire
resultndoles este ltimo txico.
Facultativos: (o Aerotolerantes) cuando existe
el aire lo utilizan para su crecimiento y
reproduccin, y cuando no, tambin lo hacen,
fermentando el substrato sobre el que viven.
2. Con respecto a la fuente de energa: Necesaria
para su supervivencia pueden ser,
Fottrofos: utilizan la radiacin
electromagntica solar como fuente de energa.
Quimitrofos: utilizan compuestos qumicos
como fuente de energa (la mayora).
3. Con respecto a la fuente de carbono: Que
todos precisan, pueden ser,
Auttrofos: utilizan el dixido de carbono
(CO
2
) como nica fuente de carbono.
Hetertrofos: utilizan la materia orgnica como
fuente de carbono (la mayora de las bacterias).

Los microorganismos poseen una gran capacidad
de adaptacin a los diversos medios, y pueden utilizar, como
nutrientes, gran variedad de sustancias, como hidratos de
carbono, protenas, vitaminas, etc.
Los microorganismos, aunque se desarrollan
especialmente donde existen materias nutritivas, humedad y
temperaturas favorables para su desarrollo y multiplicacin,
como pueden ser suelos, charcas, ros, lagos, embalses, etc.,
se encuentran en casi toda la naturaleza. As se han
encontrado especies, que sobreviven a gran altura, en las
capas altas de la atmsfera o en las cimas de las altas
cordilleras, y otras, que ocupan los fondos abisales de los
ocanos. Se han encontrado, microorganismos, en los
helados rincones de los crculos polares, y en las ardientes
chimeneas de los volcanes activos, en lo ms recndito de los
desiertos con elevadas insolaciones, y en las ms ocultas
simas, donde la oscuridad es total.
No es raro, por tanto, que cuando se quiere
buscar vida, o indicios de la misma, en la exploracin del
sistema solar, lo que se busque sean microorganismo. En
especial bacterias, por sus facultades de adaptacin, y que la
polmica de la existencia de rastros de vida, en fragmentos
de meteoritos marcianos encontrados en la tierra, se deban a
una arqueobacteria.
ENERGA Y CARBONO
Todos los seres vivos requieren C, N, P y S, adems
de sales de K, Na, Mg, Fe y Ca, que son especficas para cada
grupo bacteriano.
Tambin necesitan, en cantidades mnimas, otros
elementos diferentes que se denominan oligoelementos.

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4. Con respecto a su capacidad para sintetizar
aminocidos: Que son los factores de crecimiento
para cada microorganismo, se clasifican en,
Prottrofos: capaces de crecer en un medio que
contenga una fuente de carbono, energa y
sales minerales, pues son capaces de sintetizar
sus propios aminocidos.
Auxtrofos: no son capaces de sintetizar todos
los componentes necesarios para su desarrollo
y crecimiento.
Los microorganismos tambin pueden
clasificarse segn sus relaciones con los dems
seres vivos en:
Parsitos: Coevolucionan con el husped,
estableciendo una relacin predador-presa no
inmediata, en la que quedan alteradas las
relaciones de la cadena alimentaria, y que
pueden a su vez ser patgenos (productores de
enfermedad), o no patgenos (llamados
impropiamente saprfitos).
Saprfitos: Viven a expensas del husped.
Simbiontes: Coevolucionan con el husped
estableciendo una relacin benfica para
ambos.

LA CLULA PROCARIOTA.

La clula es la unidad elemental de vida
propia, que a su vez es unidad estructural,
fisiolgica y gentica de los seres vivos. Como
modelo tomaremos la clula bacteriana, arquetipo
de la clula procariota, en la que de fuera a dentro
podemos encontrar diferentes elementos:
1. Flagelos: A veces tambin cilios, semejantes a
los presentes en otros microorganismos y no
visibles sin tincin previa. (3)
2. Cpsula: Es una capa mucosa que envuelve a
las bacterias y que tiene una finalidad
protectora. (1)
3. Cubierta celular: Fuera de la membrana
celular, a veces se encuentra una cubierta
externa dentro de la cpsula, formada por
hidratos de carbono (peptidoglicano) que
responden de forma positiva a la tincin de
GRAM. (2)
4. Membrana citoplasmtica: Membrana muy
fina susceptible de plasmlisis. (4)
5. Citoplasma: Es un medio viscoso en estado
coloidal y es propiamente la materia viva
donde se encuentran los dems rganos
estructurales y fisiolgicos. Los ms
importantes son los condriosomas (autenticas
centrales energticas de la clula) y los
ribosomas (autenticas fbricas de produccin
de protenas). (6)
6. Ncleo: Poco diferenciado del citoplasma al
carecer de membrana nuclear por lo que a
veces se habla de regin nuclear. Contiene el
ADN bacteriano en un cromosoma nico en
forma de filamento circular, por lo que le
podemos denominar genoma ya que contiene
toda la informacin gentica. (5)
Algunos autores consideran a los virus y
a otras estructuras menores como no celulares al
carecer de algunos de los elementos descritos.

UNA CLASIFICACIN

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BACTERIAS.

Las bacterias son clulas, procariotas
(como las algas azules), que poseen como las
eucariotas ADN y ARN y no necesitan para su
reproduccin de un organismo superior (a
diferencia de los virus), y se diferencian de las
eucariotas, por carecer de membrana nuclear y
aparato respiratorio organizado.
Son polimorfas, es decir, pueden tener
diversas formas y se reproducen por escisiparidad,
es decir, por escisin, cuyos productos pueden
permanecer aislados o agrupados. Muchas de ellas
estn capacitadas para formar esporas, formas
resistentes de vida latente, cuando el medio
ambiente as lo exige por adverso.

Aunque las ms conocidas son las
bacterias patgenas, estas son slo una pequea
parte del universo bacteriano. En general las
bacterias son los agentes de las fermentaciones y
putrefacciones que transforman la materia orgnica
en gases y sustancias inertes adecuadas para
incorporarse al ciclo vital por lo que su papel es
considerable en la naturaleza. La intensa actividad
enzimtica de algunas de ellas es aprovechada por
la industria de las fermentaciones y por seres
superiores durante el proceso de digestin.
Actualmente la posibilidad de integrar en
el cromosoma bacteriano genes de clulas
productoras de sustancias de inters para el hombre
(hormonas, protenas, antgenos, etc.) constituye la
base de la ingeniera gentica.
La diagnosis de las bacterias se
fundamenta tanto en sus caracteres morfolgicos
(que a veces dependen del medio ambiente), como
en su tincin, en su cultivo, en sus propiedades
enzimticas, en sus caracteres antignicos y en su
poder patgeno experimental.
A pesar de su pequeez (0,1-6 ), son
visibles al microscopio ptico presentando, o no,
movilidad. La forma es variada, puede ser esfricas
(cocos), cilndricas (bacilos), incurvadas
(vibriones) o espiriladas (espirilos). Pueden
permanecer aisladas (micrococos), o, agrupadas en
dos (diplococos), en ttradas (tetracocos), en
cadenas (estreptococos), en forma de cubo
(sarcina) y en masas esfricas (estafilococos).

En cuanto a sus caracteres antignicos,
pueden utilizarse, adems de cmo carcter
diagnstico (serodiagnstico), para la creacin de
vacunas que activen los anticuerpos como medio
preventivo al ataque de las bacterias patgenas.
La clasificacin de las bacterias es algo
compleja, debido a su carcter polimorfo y la
relativa falta de conocimientos. Se suelen clasificar
en funcin de su aptitud o no para formar esporas
(esporgenas y no esporgenas), en funcin de una
tincin especfica (gram-positivas y gram-
negativas), en funcin de sus condiciones de vida
(aerbicas, anaerbicas, termfilas, termfobas,
etc.), segn las reacciones que provocan en el
medio (sulfobacterias, ferrobacterias, etc.)
Bacilos
Espiroquetas
Estreptococos
Vibrios

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Cualquier clasificacin debe tener en
cuenta la prxima taxonoma genotpica y la ms
utilizada es la de BERGEY, basada en una mezcla
de caracteres estructurales y fisiolgicos.

Actualmente (2001), ha surgido una
nueva clasificacin del Dominio Bacteria con 23
Filos, algunos de los cuales estn aun pendientes
de detallar.

PHYLUM
AQUIFICAE
THERMOTOGAE
THERMODESULFOBACTERIA
DEINOCOCCUS-THERMUS
CHRISYOGENETES
CHLOROFLEXI
THERMOMICROBIA
NITROSPIRAE
DEFERRIBACTERES
CYANOBACTERIA
CHLOROBI
PROTEOBACTERIA
FIRMICUTES
ACTINOBACTERIA
PLACTONMYCETES Y CHLAMYDAE
SPIROCHAETES
FIBROBACTERES
FHYLUM POR DETALLAR
ACIDOBACTERIA
BACTERIODETES
FUSOBACTERIA
VERRUMICROBIA
DICTYOGLOMI

HONGOS.

Los hongos son talofitas, puesto que pese
a su aspecto vegetal, su aparato vegetativo, el talo,
est desprovisto de raz, tallo y hojas.
Se distinguen de las dems talofitas
(algas y brifitos) por la ausencia de pigmentos
cloroflicos y, por tanto, son incapaces de sintetizar
su propio alimento, viviendo en condiciones
aerbicas sobre materia en descomposicin
(saprfitos) como los nscalos, en condiciones de
simbiosis (hongos con algas par formar los
lquenes), o como parsitos (tia sobre el cuero
cabelludo).

Clasificacin de bacterias y microorganismos afines de Bergey
Clase esquizomicetos

Orden I: Eubacteriales
Suborden I: Eubacterineas
Familia I: Nitrobactericeas (Nitrobacter)
Familia II: Seudomonceas (Pseudomonas)
Familia III: Azobacterias (Azotobcter)
Familia IV: Rizobiceas (Rhizobium)
Familia V: Micrococceas (Micrococcus)
Familia VI: Neissericeas (Meningococo)
Familia VII: Lactobactericeas (Diplococcus)
FamiliaVIII: Corinebacteraceas (B. diftrico)
Familia IX: Acromobactericeas (Alcalig.)
Familia X: Enterobactericeas (Proteus)
Familia XI: Parvobactericeas (Brucella)
Familia XII: Bactericeas (Celullomonas)
FamiliaXIII: Bacilceas (Clostr. tetani)
Suborden II: Caulobacterineas
Familia I: Nevskiceas
Familia II: Galionelceas
Familia III: Caulobactericeas
Familia IV: Siderocapsceas
Apndice : Pasteuriceas
Suborden III: Rodobacterineas
Familia I: Tiorrodceas
Familia II: Atiorrodceas
Familia III: Clorobactericeas
Orden II: Actinomicetales
Familia I: Microbactericeas (lepra)
Familia II: Actinomicetceas (actinomicosis)
Familia III: Estreptomicetceas (Streptomy.)
Orden III: Clamidobacteriales
Familia I: Clamidobactericeas
Familia II: Crenotricceas
Familia III: Begiatoceas
Apndice : Cariofanales
Familia I: Prontotricceas
Familia II: Artromitceas
Familia III: Oscilopirceas
Familia IV: Carofanceas
Orden IV: Mixobacteriales
Familia I: Citofagceas
Familia II: Arcangiceas
Familia III: Sorangiceas
Familia IV: Poliangiceas
Familia V: Mixococceas
Orden V: Espiroquetales
Familia I: Espiroquetceas (espiroquetas)
Familia II: Treponematceas (sfilis)
Suplemento I: Rickettsiales
Familia I: Rickettisiceas
Familia II: Bartonelceas
Familia III: Clamidozoceas
Suplemento II: Virales
Suborden I: Fgineas
Familia I: Fagceas
Suborden II: Fitofagneas
Familia I: Clorogenceas
Familia II: Marmorceas
Familia III: Anulceas
Familia IV: Rugceas
Familia V: Saboyceas
Familia VI: Letceas
Suborden III: Zoofagneas
Familia I: Borrelinceas
Familia II: Borreliotceas
Familia III: Erronceas
Familia IV: Caronceas
Familia V: Trifurceas
Familia VI: Rabolceas

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Los hongos se reproducen mediante
esporas, cada una de las cuales al germinar
producen un filamento vegetativo ramificado
(hifa). Los filamentos miclicos se agrupan
formando masas compactas denominadas
carpforos, apotecios o peritecios segn los casos,
que es lo que denominamos seta y que en realidad
no son nada ms que los cuerpos fructferos que
contienen las esporas.

Intervienen en los procesos de
descomposicin de la materia orgnica y sus
fermentaciones son utilizadas desde los comienzos
de la civilizacin para la produccin de pan y
bebidas con contenido alcohlico.
Aunque se pueden dividir en hongos
inferiores (sifomicetes) con micelio no tabicado y
hongos superiores (ascomicetes y basidiomicetes)
con micelio tabicado, taxonmicamente podemos
distinguir dentro de los hongos:
Levaduras: Son colonias formadas por clulas
con capacidad de gemacin y ,generalmente,
carentes de micelio como Saccharomyces o
Cndida.
Ascomicetos: Con presencia de ascas y
ascosporas (reproduccin sexual) como
Eurotium y los hongos dermatfilos (tia).
Zigomicetos: sin ascosporas, micelio no
septado (o muy pocas septas) y esporas
formadas endgenamente en esporangios como
Mucor.
Deuteromicetos: No presentan ascosporas,
tienen el micelio septado y los conidios
formados a partir de clulas especializadas
como Aspergillus o Penicillium.
Es necesario destacar los denominados
mohos, que pueden pertenecer a estos distintos
grupos, pues as se denomina cualquier tipo de
micromiceto que se desarrolla sobre materias
orgnicas generalmente en descomposicin.
Dentro de los mohos, tenemos, el moho
azul (Penicillium italicum) que parasita a los
ctricos, el moho blanco (P. candidum) que se
desarrolla en el queso, el moho comn (Mucor
mucedo) que origina la podredumbre de las frutas,
el moho de las frutas que corresponde a diversas
formas conidias del gnero Sclerotinia y que
momifica los frutos de hueso y pepita, el moho gris
(Botrycis cinerea) que ataca el fruto de la vid, el
moho negro (Mucor stolonifer) y el moho verde
(P. digitatum) que forma cspedes sobre los
ctricos y los quesos.

Esta primera clasificacin ha sufridos
revisiones posteriores. As surgi:

Denominacin Especie Coloniza
Moho azul Penicillium italicum Ctricos
Moho blanco P. candidum Queso
Moho verde P. digitatum Alimentos
Moho comn Mucor mucedo Frutas
Moho negro M. stolonifer Alimentos
Moho frutal Slerotinia sp. Frutos
Moho gris Botrycis cinerea Vid
Filamentos miclicos

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No obstante, actualmente se sigue el
criterio de clasificarlos segn 5 divisiones:

Quitridiomicetes (divisin
Chytridiomycota).
Zigomicetes (divisin Zygomycota).
Glomeromicetes (divisin
Glomeromycota).
Basidiomicetes (divisin Basidiomycota).
Ascomycetes (divisin Ascomycota).

Tanto su morfologa como su tamao es
muy diversa, y abarcan desde las levaduras
monocelulares hasta gigantescas setas
pluricelulares (considerado como el mayor de los
organismos vivos).

Los mtodos de deteccin y diagnosis
abarcan desde los mtodos de observacin directa
(microscopa) y recuento en placa, hasta otros no
especficos de la microbiologa, como pueden ser
qumicos -anlisis de quitina-, enzimticos -
bioluminiscencia de adenosin trifosfato (ATP)-,
metablicos (impedancia) e inmunolgicos
(ELISA).
Incontrolados, algunos hongos deterioran
la madera, los productos textiles, las cuerdas, los
aislamientos elctricos, e infinidad de artculos
comerciales e industriales, causando tambin
enfermedades tanto en los hombres como en los
animales y plantas. Especial relevancia adquiere
las toxinas por ellos producidas o micotoxinas, que
estn presentes en los alimentos y de las cuales,
habitualmente, se ignoran los lmites tolerables as
como los niveles de contaminacin. La exposicin
humana en pases desarrollados es pequea,
aunque la salud animal est frecuentemente
afectada.

VIRUS.
Los virus son considerados como las
estructuras vivientes de mayor simplicidad
estructural. Sus caractersticas hacen que no
puedan incluirse en ningn grupo y, por tanto,
formen grupo aparte. Se diferencian de los dems
seres vivos, en que poseen un nico cido nucleico
(ADN o ARN) pero nunca los dos como el resto de
las formas de vida conocidas.

Kingdom Fungi
Eukaryocytes
Ascomycota
Basidiomycota
Zygomycota
Mitosporic Fungi
(Fungi Imperfecti)

Micotoxinas ms frecuentes

Micotoxina Hongo causante Toxicidad

Aflatoxinas Aspergillus flavus Intoxicacin

Esterigmatocistina A. Versicolor Cancer?

Citreoviridina P. Viridicatum Hepatotoxicidad

c. Ciclopiaznico A. Oryzae Necrosis

Patulina P. Patullum Hemorragias

Ergotxicos y LSD Claviceps purpurea Ergotismo

Tricocetenos Fusarium roseum Dermatitis

Zearalenona F. graminearum Estrognico

Fumonisinas F. proliferatum Edema pulmonar
El nombre de virus, procede del latn,
significando veneno o ponzoa. Se dudaba de su
existencia, pues atravesaban los filtros convencionales, y
eran invisibles al microscopio ptico. La prueba de su
existencia se debe a LEFFLER quien en1.898, propag la
fiebre aftosa del cordero a los animales sanos mediante la
inoculacin de pstulas de los enfermos, a pesar, que este
inculo, que haba sido previamente filtrado y
visualizado al microscopio, pareca estril.
En 1.935 STANLEY aisl por primera vez un
virus, el del mosaico del tabaco, y los trabajos posteriores
de ROUS, GASTINEL y LEVATIDI, dieron cuerpo a la
virologa.
Las tcnicas de cultivo clsicas, no pueden ser
utilizadas, puesto que slo se pueden cultivar en ciertos
tejidos vivos. Con las tcnicas ms modernas de
ultracentrifugacin, permeacin en filtros, la
electroforesis, y sobre todo, la microscopa electrnica, se
ha podido estudiar su presencia, que afecta a todos los
seres vivos,. As no existe bacteria conocida, a la que no se
le haya asociado su virus.
Los virus, resisten perfectamente temperaturas
de 20 C, pero son termolbiles. Son ms o menos
sensibles a los antispticos y a las radiaciones, pero
siempre menos que las bacterias.

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Su exiguo tamao, 10-300 nm, hace que
slo sean visibles al microscopio electrnico.
Estn compuestos por una molcula de
ADN o ARN rodeada por una cubierta proteica
denominada cpside (compuesta a su vez por
diferentes unidades, los capsmeros, dispuestos
con simetra cbica, helicoidal o compleja y cuyo
nmero y distribucin espacial, caracteriza a cada
familia de los virus). El ARN est en forma de
cadena simple (la mayora de los virus que infectan
a los animales y la totalidad de los que infectan a
los vegetales) mientras que el ADN puede estar en
forma de cadena simple o de doble cadena.
Algunos virus, de los ms complejos,
poseen asociados a la cubierta proteica una capa
que contiene azcares y lpidos asociados a las
protenas. Todas estas sustancias han sido
sintetizadas por la clula infectada, ya que para
reproducirse necesitan fijar su ADN al de la clula
husped y aprovecharse de sus mecanismos de
replicacin. Es por ello que son parsitos obligados
que ni siquiera metabolizan en estado libre.
La morfologa general es variada, con
simetra esfrica, icosadrica o cilndrica. Los virus
bacterianos (fagos), los ms complejos, tienen una
cabeza de forma icosadrica que contiene el
material gentico y una cola con la que se fija a la
pared bacteriana.

Actualmente est admitido que la
extensin de la infeccin no se realiza mediante
virus sino mediante partculas virales (viriones),
ms simples y compuestas por el cido nucleico y
una pequea capa protenica sintetizados en la
maquinaria gentica del ltimo husped. El
proceso de reproduccin consta de las siguientes
fases:
1. Fijacin del virus a la clula husped.
2. Introduccin del virus, o de su material
gentico, en el interior de la clula infectada.
3. Replicacin del cido nucleico.
4. Sntesis de los dems constituyentes del virus.
5. Ensambladura de los componentes hasta
formar la partcula viral.
6. Lisis y muerte de la clula husped con
liberacin de las partculas virales al medio
extracelular.

Bacteriofago
Esquema de Bacteriofago T4
Virin rbico

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Los virus infectan al resto de los seres
vivos produciendo enfermedades y a veces la
muerte. La reaccin inmunitaria suele ser
inmediata y va dirigida contra las cubiertas que
rodean el material gentico. El hecho de que
inserten su genoma en la clula husped es
equivalente a una mutacin gentica, por lo que se
les considera responsable de la formacin de
oncogenes y posterior desarrollo del cncer en
algunos casos particulares. La infeccin puede
diagnosticarse por la produccin de interfern en
la clula infectada. Se puede hablar de una clara
afinidad, de un virus por una determinada especie
de ser vivo.
Las clasificaciones suelen atender
primariamente al cido nucleico que poseen para
posteriormente adoptar otros criterios, como el
tamao, especie a la que infectan y patologa que
producen.
A veces es utilizada, sobre todo en
Clnica la Clasificacin de Baltimore.

Clasificacin de Baltimore
Grupo I: Virus ADN bicatenario (doble
cadena).
Grupo II: Virus ADN monocatenario (de
caracter positivo).
Grupo III: Virus ARN bicatenario.
Grupo IV: Virus ARN monocatenario
positivo.
Grupo V: Virus ARN monocatenario
negativo.
Grupo VI: Virus ARN monocatenario
retrotranscrito.
Grupo VII: Virus ADN bicatenario
retrotranscrito.

Numerosos virus patgenos para el
hombre, los animales y las plantas, pueden
propagarse utilizando animales vectores, y tras
pasar por un animal intermediario.
Es el caso de la fiebre amarilla, cuyo
vector es un mosquito del gnero Aedes, y que
debe pasar por un mamfero como husped
intermediario antes de infectar al hombre.

OTROS MICROORGANISMOS.

Dentro de este epgrafe se pueden
distinguir:
Protozoos.
Algas.
Rickettsias.
Prticulas subvirales:
Virides.
Priones.
Transposones

CLASIFICACIN DE LOS VIRUS

Nombre del grupo Tamao (nm) Sntomas

VIRUS ARN

1. Enterovirus 17-30
ECHO (24) fiebres y diarreas
Rinovirus resfriados
v. COXSACKIE (A19,B5) miocarditis y pleuritis
poliovirus (3) poliomielitis
v. Hepatitis A hepatitis epidmica

2. Reovirus 60-80
orbivirus diarreas infantiles
rotavirus diarreas infantiles

3. Ortomixovirus 80-120
v. Gripe A, B y C gripe

4. Paramixovirus 80-120
v. Parotiditis paperas
v. Sincitial respiratorio patologas neonatos

5. Togavirus 40-70 encefalitis

6. Rabdovirus 60 hidrofobia

7. Arenavirus 50-300 meningitis linfocitaria

VIRUS ADN

8. Papovirus 45-55 verrugas palmares ...

9. Herpesvirus 100
Herpes simple 1,2 herpes labial y genital
citomegalovirus encefalitis
v. Varicela varicela y H. Zster
v. EPSTEIN-BARR mononucleosis

10. Poxvirus 300 viruela

11. Adenovirus 70-90 conjuntivitis, neumo...

12. Virus Hepatitis B 42 h. B aguda y h. cr...

Virus de la viruela

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FAMILIAS BACTERIANAS DE ESTUDIO
MS FRECUENTE.

De todas las familias bacterianas son tres
las de estudio ms frecuente al tener una mayor
significacin desde el punto de vista de la calidad
microbiolgica y de la salud humana, sin
menospreciar el significado global para la vida, en
general, del resto de las familias.

1. ENTEROBACTERIACEAE.
Los miembros que integran esta familia
son grmenes de forma bacilar, gram-negativos,
aerbicos y anaerbicos facultativos, no
esporulados, mviles o inmviles, que fermentan la
glucosa, reducen los nitratos a nitritos, son
citocromooxidasa-negativos y pueden crecer en
medios que contienen sales biliares.
Muchas crecen en soluciones minerales
simples y son fcilmente cultivables en una gran
variedad de medios a temperaturas entre 25-37 C
y a un pH comprendido entre 6,5-8,0.
En cuanto al tamao, suele variar entre
0,5-2,0 m de ancho y de 1,0-10 m de longitud.
Algunas especies poseen pelos que no deben
confundirse con flagelos.
Aunque muchas especies son,
principalmente, saprfitas y eliminan detritos
orgnicos del medio ambiente, todas se encuentran
en algn momento en el conducto intestinal del
hombre o de otros animales y de ah su nombre.
Incluye 14 gneros con ms de 60
especies. Algunas de ellas son peligrosas y
primariamente patgenas, otras lo son de forma
potencial, es decir, secundariamente patgenas.
Causan enfermedades entricas (fiebre tifoidea,
paratifus, disentera y diarreas infantiles) y las
infecciones del conducto urinario y de otros
rganos.

Para su estudio se suelen subdividir,
primeramente en funcin de propiedades
diferenciales basadas en si producen o no, indol,
acetilmetilcarbinol, sulfuro de hidrgeno o
fenilaminadesaminasa; si eliminan del medio la
urea; si utilizan citrato como nica fuente de
carbono o si son capaces de virar el rojo de metilo
del medio por su actividad metablica.
La segunda subdivisin, en grupos o
gneros se basan en las diferentes propiedades
bioqumicas (si consumen lactosa, sacarosa o
manitol, etc.) e incluso morfolgicas como la
movilidad. Posteriormente para la distincin de
especies, se puede incluso llegar a utilizar la
composicin en bases del ADN (% moles C+G).
No debe olvidarse, que al describir las
caractersticas de cada grupo de bacterias deben
hacerse salvedades, para las variaciones, las
modificaciones y las mutaciones. No es raro
encontrar formas aberrantes de cualquier especie
respecto de cualquier caracterstica fisiolgica.

2. MICROCOCACEAE.
Esta familia est formada por grmenes
de forma esfrica (de ah su nombre), de 0,5-2,5
m de dimetro, que se dividen en ms de un plano
para formar agrupaciones irregulares. Son no
esporulados, generalmente inmviles (excepto uno
FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE

Gnero Fermentan lactosa Observaciones

Escherichia Si Excepto E. Blattae

Shigella No

Salmonella No

Enterobacter Si

Klebsiella Si Excepto Kb.
Pneumoniae
Citrobacter Si 75 % de las cepas

Edwarsiella No

Hafnia No

Proteus No

Providencia No

Serratia Si/No Variable

Yersinia No

Erwinia No Con excepciones

Morganella No

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de sus 4 gneros, Planococcus), aerbicos o
anaerobios facultativos, gram-positivo, catalasa-
positivo y citocromooxidasa-negativos.
Los 4 gneros son:
I. Micrococcus.
II. Stomatococcus.
III. Planococcus.
IV. Staphylococcus.
Dentro de ellos merece resaltarse el
gnero de los Staphylococcus, con 19 especies,
algunas de alta significacin microbiolgica,
especialmente St. aureus.
Los Staphylococcus son inmviles, de
metabolismo fermentativo, aerbicos y anaerobios
facultativos, fermentadores de glucosa sin
produccin de gas (dixido de carbono), que
pueden crecer a elevadas concentraciones salinas, a
temperaturas comprendidas entre 35-40 C y pH
lmites entre 4,2-9,3, segn especies.

3. VIBRIONACEAE.
Aunque cada gnero de la familia tiene
un hbitat y unas propiedades relativamente
diferentes, se describen como bacilos gram-
negativo, anaerobios facultativos y flagelados.
Los 4 gneros son:
I. Vibrio.
II. Photobacterium.
III. Aeromonas.
IV. Plesiomonas.
Por su significacin microbiolgica el
gnero Vibrio con 20 especies diferentes es el ms
estudiado.
Est integrado por bacilos rectos o
incurvados, mviles mediante flagelos monotricos
o multitricos de ah su nombre (debido al
movimiento en vaivn), fermentadores de glucosa
con formacin de cido pero no de gas y
generalmente haloflicos, por lo que se encuentran
normalmente asociado a ambientes marinos.
Como grupo, el gnero Vibrio est ms
ntimamente relacionado con las enterobactericeas
que con las espirilceas, si nos basamos en la
fermentacin de la glucosa. Las clulas de los
vibriones suelen permanecer unidas extremo-
extremo despus de la fisin celular, llegando a
formar largas espirales, aunque la longitud de los
vibriones individualmente no excede de los 10 m
y sus dimetros estn entre 1,0-1,5 m.
Son microorganismos sobre todo
saprfitos, y estn distribuidos universalmente en
las aguas contaminadas.
Como curiosidad, puede comentarse la
biolumniscencia que presenta el gnero
Photobacterium.

Especies de Staphylococcus
1. St. aureus.
2. St. epidermis.
3. St. capitis.
4. St. warneri.
5. St. haemolyticus.
6. St. hominis.
7. St. saccarolyticus.
8. St. auricularis.
9. St. saprophyticus.
10. St. cohnii.
11. St. xylosus.
12. St. simulans.
13. St. carnosus.
14. St. intermedius.
15. St. hycicus.
16. St. caseolyticus.
17. St. sciuri.
18. St. gallinarum.
19. St. caprae.
Especies de Vibrio.

1. V. cholerae.
2. V. metschnikovii.
3. V. harveyi.
4. V. vampbellii.
5. V. parahaemolyticus.
6. V. alginolyticus.
7. V. natriegens.
8. V. vulnificus.
9. V. nereis.
10. V. fluvialis.
11. V. splendidus.
12. V. pelagius.
13. V. nigripulchritudo.
14. V. anguillarum.
15. V. fischeri.
16. V. logei.
17. V. proteolyticus.
18. V. gazogenes.
19. V. marinus.
20. V. costicola.

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ENFERMEDADES USUALES
CAUSADAS POR MICROORGANISMOS
Los microorganismos son agentes real y
potencialmente patgenos para la salud humana.
Aunque los medios de transmisin pueden ser
mltiples, tienen especial relevancia la transmisin
por los alimentos (incluido el agua), por lo que se
exige el control microbiolgico.
El control microbiolgico de los
alimentos, puede considerarse en dos aspectos:
- Calidad higinico-sanitaria.
- Calidad comercial.
Respecto a la calidad comercial, slo
supone un evidente fraude como la prdida de las
caractersticas organolpticas de un alimento. Pero
la falta de calidad higinico-sanitaria supone un
riesgo para la salud del consumidor, aunque no hay
que olvidar que los alimentos no son sustancias
estriles y que su contenido microbiano vara
desde un escaso nmero en las conservas, hasta un
elevado nmero, incluso exigible, en productos
fermentados. Los microorganismos pueden ser
patgenos mediante dos vas:
1. Infeccin: Los efectos patgenos se ocasionan
tras la ingestin directa del microorganismo y
su posterior reproduccin.
2. Intoxicacin: Los efectos patgenos se
ocasionan por la ingestin de los metabolitos
producidos por los microorganismos presentes
en los alimentos, pudiendo ser esta presencia
anterior a su estudio y no presentar el alimento
microorganismos viables.

ENFERMEDAD

ORGANISMO PATOGNIA
Salmonelosis Todos los gneros de
Salmonella
Enteritis y posterior
infeccin en sangre
generalizada
Shigelosis Algunos gneros de
Shygella
Enteritis y posterior
formacin de lceras

Enteriditis por E. coli E. coli (algunas
cepas)
Enteritis.
Colonizacin del
intestino delgado
Intoxicacin
estafiloccica
Enterotoxina de
St. aureus
Irritacin del
estmago e intestino

Gastroentiritis por
B. creus
Toxina de B. cereus Sndrome diarrico y
sndrome emtico

Gastroenteritis por
Cl. perfringens
Enterotoxina A de Cl.
perfringens
Sndrome diarrico y
gangrena en intestino

Botulismo Toxinas de
Cl. botulinum
Alteraciones
digestivas, visuales y
parlisis progresiva
Gastroenteritis por
V. parahaemoliticus
V. parahaemoliticus Sndrome diarrico y
emtico, fiebre

Clera V. cholerae Sndrome diarrico y
emtico, altas fiebres

Yersiniosis Y. enterocoltica Sndrome diarrico y
emtico, poliartritis y
eritema nodoso
Otras enfermedades comunes en el
hombre y causadas por microorganismos pueden, o
no, tener una transmisin en la que se involucren
los alimentos:

ENFERMEDAD

ORGANISMO PATOGENIA
Infeccin diversa Citrobacter (diversas
especies)
Otitis, meningitis,
cistitis, etc.

Infeccin diversa Klebsiella (diversas
especies)
Neumona, enteritis,
cistitis y septicemia

Enteriditis por
Proteus
Proteus (diversas
especies)
Diarreas infantiles

Brucelosis Brucella melitensis Infeccin en ganglios
linfticos y posterior
invasin orgnica.
Tos ferina Bordetella pertussis Infeccin del sistema
respiratorio superior,
bronconeumona
Tularemia
(fiebre del conejo)
Francisella tularensis Ulceracin de piel y
de mucosas en el
hombre
Conjuntivitis
infecciosa
Moraxella lacunata Inflamacin grave de
la crnea

Fiebre de mordedura
de rata
Streptobacillus
moniliformis
Artritis y endocarditis

septicemia
hemorrgica
Pasteurella
multocida
Infeccin
generalizada aunque
es poco comn en
humanos
Meningitis Haemophyllus
influenzae
Meningitis bacteriana
y neumona
Chancro Haemophyllus ducrei Chancro blando
Conjuntivitis
purulenta
Haemophyllus
aegyptius
Infeccin en la crnea

Endocarditis Haemophyllus
parainfluenzae
Endocarditis
bacteriana

Necrosis Actinobacillus
lignieresii
Necrosis membranas
mucosas, linfticas y
de piel
Apendicitis,
peritonitis
Bacteroides fragilis Infeccin intestinal,
abscesos rectales y
lesiones urogenitales
Gingivitis Bacteroides oralis Grietas gingivales,
infecciones en la
cavidad oral
Necrosis Fusobacterium
mortiferum
Necrosis en hgado y
recto

Infeccin diversa Fusobacterium
nucleatum
Infeccin de cavidad
oral, y aparato
respiratorio superior

Anlisis Microbiolgicos Unidad Temtica2. El Laboratorio Microbiolgico

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EL LABORATORIO COMO LUGAR DE
TRABAJO.

Quien trabaja en el laboratorio est
expuesto a riesgos; hay productos qumicos que
son nocivos, txicos, inflamables, explosivos,
corrosivos, teratgenos o carcingenos; a veces,
existe el peligro derivado del uso de mecheros,
altos voltajes, luz ultravioleta y otras radiaciones.
Adems de estos riesgos inherentes a cualquier
laboratorio qumico, en el laboratorio
microbiolgico se est expuesto al riesgo de los
microorganismos con los que se trabaja. En general
los denominados agentes biolgicos.
Independientemente del tipo de
microorganismo, siempre se trabajar como si se
tratara de microorganismos capaces de producir
enfermedades, por lo que es necesario manipular
con el cuidado requerido, tanto los cultivos como
cualquier material que haya estado en contacto con
ellos.
Teniendo en cuenta lo anteriormente
expuesto, y conscientes de que el laboratorio se
debe utilizar exclusivamente para trabajar, la
estancia en el mismo debe comportar una serie de
hbitos que van ms all de lo estrictamente
educacional, y que conlleva el conocimiento de
todo el material y equipos a usar y el cumplimiento
de unas normas estrictas.
Para llevar un control del trabajo del
laboratorio, se deben preparar:
Cuaderno de laboratorio: Todo el trabajo
realizado en el laboratorio debe registrarse
en un cuaderno adecuado, de la forma ms
detallada posible o cuando menos con notas
muy completas. A veces algo que parece
totalmente superfluo a la hora de elaborar un
informe resulta crucial. No existe un
cuaderno en limpio y otro en sucio de
laboratorio, existe un nico cuaderno, que
debe llevarse al da, en el que se ponga la
fecha, y del que no puede arrancarse pgina
alguna, por lo que se recomienda el tipo
encuadernado y numerado. No debe usarse
este cuaderno para tomar notas conceptuales
y bajo ningn concepto se utilizarn hojas
sueltas.
Informes de laboratorio: Deben elaborarse
informes de cada uno de los trabajos
realizados. Estos deben seguir un nico
modelo (que puede ser personal) que debe
incluir al menos los siguientes puntos:

1. Ttulo.
2. Objetivo.
3. Material usado.
4. Reactivos y medios de cultivo.
5. Microorganismos utilizados como
referencia o descubiertos.
6. Mtodos utilizados y su descripcin.
Esquema o resumen del trabajo
realizado.
7. Clculos, si son necesarios.
8. Descripcin de resultados, apoyndolos
con tablas y grficas.
9. Exposicin de conclusiones obtenidas.
10. Bibliografa. Si la publicacin original
no se ha visto, entonces debe darse la
referencia en dnde aparece citada.

IDENTIFICACIN DE MATERIALES Y
EQUIPOS USUALES.

Para el adecuado uso de materiales y
equipos, sin que entraen riesgo ni que se
deterioren, previamente deben poder identificarse,
saber para qu se usan, cual debe ser su
mantenimiento as como las condiciones en que
deben guardarse.
Existen multitud de material y equipos que
usualmente se usan en microbiologa. La
identificacin debe hacerse visualmente por lo que
carece de sentido hacer un extenso listado. En un
principio, los clasificaremos como:
Material fungible: Como pueden ser
dentro de los ms usuales, las placas
PETRI, los tubos de cultivo, los
portaobjetos y cubreobjetos, asas y pinchos
de siembra, campanas de DURHAM,
adems del material clsico de cualquier
laboratorio, pipetas, probetas, matraces,
etc.
Equipos especficos: Como pueden ser,
las estufas de incubacin, los autoclaves,
los microscopios y lupas binoculares,
contadores de colonias, stomacher,
campanas de flujo laminar, adems de los
equipos clsicos de cualquier laboratorio
qumico, como mecheros, granatarios,
campanas extractoras, etc.

2. El Laboratorio Microbiolgico.

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AGENTES BIOLGICOS.
CLASIFICACIN.

Se incluyen dentro de la definicin de
agentes biolgicos a los microorganismos, con
inclusin de los genticamente modificados, a los
cultivos celulares y a los endoparsitos humanos,
susceptibles de originar cualquier tipo de
infeccin, alergia o toxicidad.
El concepto de agente biolgico incluye,
pero no est limitado, a bacterias, hongos, virus,
protozoos, rickettsias, clamidias, endoparsitos
humanos, productos de recombinacin, cultivos
celulares humanos o de animales y los agentes
biolgicos potencialmente infecciosos que estas
clulas puedan contener, priones y otros agentes
infecciosos
La Directiva 90/679/CEE sobre la
proteccin de los trabajadores contra los riesgos
relacionados con la exposicin a agentes
biolgicos, en el artculo 2 y establece la
clasificacin de los agentes biolgicos en cuatro
grupos de riesgo, segn su diferente ndice de
riesgo de infeccin.
Agente biolgico de grupo 1: Agente
biolgico que resulte poco probable que cause
enfermedad en el hombre.
patgeno que pueda causar una enfermedad en
el hombre y pueda suponer un peligro para los
trabajadores; existen generalmente profilaxis o
tratamientos eficaces.
patgeno que pueda causar una enfermedad
grave en el hombre y presente serio peligro
para los trabajadores; existe el riesgo de que se
propague a la colectividad pero existen
generalmente profilaxis o tratamientos
eficaces.
patgeno que puede causar una enfermedad
grave en el hombre y presente serio peligro
para los trabajadores; existen muchas
probabilidades de que se propague a la
colectividad; no existen generalmente
profilaxis o tratamientos eficaces.
Estos niveles de riesgo condicionan las
medidas preventivas tanto individuales como
colectivas, la manipulacin del material biolgico,
la instalacin del laboratorio, las medidas de
proteccin, las tcnicas de laboratorio, etc.

BUENAS PRCTICAS DE
LABORATORIO.

Las Buenas Prcticas recogen los
principales aspectos que deben asegurarse en un
laboratorio para que los resultados de los ensayos
sean adecuados; y siempre se ha insistido que los
requisitos deben cumplirse con sentido comn,
porque no se trata de provocar que la actividades
sean ms engorrosas y complicadas; sino por el
contrario, de lograr el buen desenvolvimiento del
trabajo minimizando los esfuerzo.
Los aspectos a considerar son:
Organizacin
Personal
Instalaciones
Equipos, Instrumentos
Reactivos
Material de laboratorios
Mtodos analticos
Muestras
Seguridad
Sistema de Calidad
Documentos

LABORATORIO BSICO.

Segn recomienda la O.M.S. en el
"Manual de Bioseguridad" y tambin segn la
Directiva del Consejo 90/679/CEE, para la
proteccin de los trabajadores expuestos a agentes
biolgicos, hay que tener en cuenta las siguientes
recomendaciones:
El laboratorio debe tener techos, paredes y
suelos fciles de lavar, impermeables a los
lquidos y resistentes a la accin de las
sustancias qumicas y productos
desinfectantes que se usan ordinariamente
en ellos. Los suelos deben ser
antideslizantes.
Las tuberas y conducciones no
empotradas deben estar separadas de las
paredes y evitar tramos horizontales para,
no acumular el polvo.
Las superficies de trabajo tienen que ser
impermeables y resistentes a los cidos,
lcalis, disolventes orgnicos y al calor
moderado. En las poyatas hay que evitar
las baldosas con juntas de cemento.
Adems hay que calcular una longitud de 2
metros lineales por persona.
Se instalar una iluminacin adecuada y
suficiente y que no produzca reflejos. El
nivel recomendado para el trabajo de

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laboratorio es de 500 lux, segn la Norma
Tcnica DIN 5053.
El mobiliario ser robusto. Los espacios
entre mesas, armarios, campanas y otros
muebles sern suficientemente amplios
para facilitar la limpieza.
En cada unidad del laboratorio debe haber
lavabos de manos, a ser posible con agua
corriente, instalados preferentemente cerca
de la salida.
Las puertas deben estar protegidas contra
incendios y cerrarse automticamente.
Adems, estarn provistas de mirillas con
cristal de seguridad de 40 por 23 cm,
situado a la altura de la mirada. Su misin
es evitar accidentes y poder examinar el
interior del laboratorio sin abrir la puerta.
Fuera de las zonas de trabajo debern estar
los vestuarios, comedores o zonas de
descanso y, caso de que el edificio donde
se halle ubicado el laboratorio lo permita,
espacios reservados para fumadores.
En el mismo laboratorio o local anexo
deber colocarse un autoclave para la
descontaminacin del material de desecho
infeccioso.
Deber reservarse espacio para guardar los
artculos de uso inmediato, evitando su
acumulacin desordenada sobre las mesas
y pasillos. Para el almacenamiento a largo
plazo se recomienda un local fuera de la
zona de trabajo.
Habr que prever espacio e instalaciones
para manejar y almacenar disolventes,
material radioactivo y gases comprimidos
en condiciones adecuadas de seguridad y
siguiendo las normativas especficas para
ello.
Deben existir medios de proteccin contra
incendios, a nivel de prevencin, evitando
que se inicie el incendio y a nivel de
proteccin, evitando que se propague el
incendio. As mismo debe haber un
sistema de deteccin de humos y/o fuego
con alarma acstica y ptica.
Debe disponerse de una instalacin
elctrica segura y de suficiente capacidad.
Se necesita un sistema de iluminacin de
emergencia para facilitar la salida del
laboratorio en condiciones de seguridad.
Conviene que haya un grupo electrgeno
de reserva para alimentar el equipo
esencial (estufas, congeladores, etc.).
Se dispondr de un botiqun suficiente e
informacin sobre primeros auxilios.
No existen normas concretas de
ventilacin, aunque se recomienda trabajar
en depresin y una renovacin de aire de
60 m3 por persona y hora.
No debe haber ninguna conexin entre las
conducciones de agua destinada al
laboratorio y las del agua de bebida. El
abastecimiento de agua potable al
laboratorio estar protegido contra el
reflujo por un dispositivo adecuado.

TCNICAS DE LABORATORIO.

Las tcnicas de laboratorio son los
procedimientos de trabajo recomendados. Hay que
tener en cuenta que un procedimiento ordenado de
trabajo es indispensable para la seguridad.
Nunca se pipetear con la boca,
emplendose los dispositivos de tipo
mecnico.
Deben utilizarse guantes adecuados en
todos los trabajos que entraen algn
contacto con sangre, material infeccioso o
animales infectados.
Hay que utilizar batas o uniformes de
trabajo para evitar la contaminacin de los
vestidos de calle. No se utilizar la ropa de
laboratorio fuera de ste (cafetera,
biblioteca, etc.).
Siempre que haya peligro de salpicaduras
se utilizarn gafas de seguridad, pantallas
faciales u otros dispositivos de proteccin.
A fin de evitar los cortes accidentales, se
preferir el uso de material plstico al de
cristal.
En la zona del laboratorio no se permitir
comer, guardar alimentos, beber, fumar ni
usar cosmticos.
El uso de agujas hipodrmicas y de
jeringas debe evitarse. Cuando ello no sea
posible, las agujas se recogern en
recipientes adecuados que eviten los
pinchazos accidentales.
Las superficies de trabajo se
descontaminarn por lo menos una vez al
da y siempre que haya un derrame. Una
nota debe especificar el modo de empleo
de los desinfectantes, la naturaleza del
desinfectante a utilizar y su concentracin.
Todos los desechos biolgicos, ya sean
lquidos o slidos, tienen que ser
descontaminados antes de su eliminacin y
se seguirn las normas existentes sobre la
gestin de residuos contenidos en las
reglamentaciones referentes a residuos
sanitarios.
Todo el personal se lavar las manos

Pgina 18

despus de haber manipulado material o
animales infecciosos, as como al
abandonar el laboratorio.
El acceso al laboratorio debe ser
controlado.
El material contaminado, que deba ser
descontaminado en un lugar exterior al
laboratorio, se colocar en un contenedor
especial, y se cerrar antes de sacarlo del
laboratorio.
Deber existir un programa de lucha contra
insectos y roedores que se pondr en
prctica.

NIVELES DE SEGURIDAD.

Hasta aqu se han descrito las medidas y
tcnicas recomendadas para el laboratorio bsico,
donde se manipulan agentes biolgicos. Dichas
medidas se aplicarn tambin en los niveles de
seguridad superiores adems de las precauciones
suplementarias a tener en cuenta para cada nivel de
riesgo.
Nivel de contencin biolgica 1
Le corresponde el nivel de riesgo I, que indica
escaso riesgo individual y comunitario. Se
aplicarn las medidas del laboratorio bsico. No
necesita ningn equipo especial de contencin.
Le corresponde el nivel de riesgo II, indicador de
riesgo individual moderado y riesgo comunitario
limitado.
Le corresponde el nivel de riesgo III, indicador de
riesgo individual elevado y riesgo comunitario
escaso.
Le corresponde el nivel de riesgo IV, indicador de
elevado riesgo individual y comunitario. Los
laboratorios de contencin mxima en
funcionamiento deben estar supervisados por las
autoridades sanitarias nacionales o de otro tipo.

NORMAS DE SEGURIDAD EN
MICROBIOLOGA.

Sin menoscabo de que siempre hay que
seguir al pie de la letra, tanto las instrucciones del
profesor, como las de los mtodos y protocolos a
utilizar, debemos como normas generales tener
presente, no para aprenderlas, sino para aplicarlas
de la forma ms rigurosa posible, las siguientes:
1. Siempre debe usarse bata, y esta no debe salir
del laboratorio salvo para su lavado. Ante la
sospecha de trabajar con bacterias muy
infecciosas se debe utilizar guantes
desechables.
2. Est terminantemente prohibido comer, beber
o fumar.
3. Las etiquetas deben ser autoadhesivas, para
evitar la tentacin de usar la lengua para
humedecerlas. En cualquier caso es preferible
la utilizacin de lpices grasos y rotuladores
vitrogrficos.
4. En un cuaderno deben registrarse todos los
accidentes por pequeos que puedan parecer.
Heridas y rozaduras deben cubrirse
perfectamente. Los cultivos derramados, no se
cogen salvo 15 20 minutos despus de haber
sido tratado l y su entorno con una solucin
bactericida.
5. Debe tenerse siempre presente la formacin de
aerosoles, que puede ocurrir simplemente al
abrir un tubo.
6. Los cultivos de hongos deben ser manipulados
sin movimientos bruscos y en campana a ser
posible, pues sus esporas presentan tanto
riesgos de infeccin como de anafilaxis.
7. Las asas y agujas de inoculacin deben
esterilizarse antes y despus de cada uso
evitando cualquier proyeccin de material.
8. Los tubos de cultivo deben estar siempre en
gradillas o en su defecto en vasos al uso.
9. A las placas de recuento de un alimento no se
las puede consideran inocuas slo porque el
alimento pueda ser consumido. Muchos
patgenos como Staphylococcus y Salmonella
pueden desarrollarse en ese medio en muy
poco tiempo.
10. Si se usa algodn en pipetas, ste no evita la
contaminacin del usuario, sino que es una
precaucin para el inculo, por lo que nunca se
debe pipetear con la boca, sino usar peras de
goma o similares.
11. Para evitar aerosoles, el vaciado de pipetas y
lquidos en general, debe efectuarse
lentamente, sin menoscabo de retrasos entre
distintas operaciones.
12. Las pipetas usadas deben retirarse a recipientes
que contengan solucin desinfectante, as
como los portaobjetos y cubreobjetos una vez
separados.
13. El uso de homogeneizadores y agitadores debe
hacerse tomando precauciones contra la
contaminacin propagada por aire.
14. No deben utilizarse con cultivos patgenos las
cmaras de siembra de presin positiva.
15. Una vez acabado el trabajo, la zona de trabajo
debe quedar perfectamente limpia y
desinfectada y todo el material usado recogido
y listo para ser esterilizado.
16. Deben lavarse las manos cuidadosamente antes

Pgina 19

y despus del trabajo de laboratorio, y siempre
que se abandone el mismo.
17. Todos los alumnos deben saber ubicar
correctamente el botiqun, los lavaojos, las
duchas de emergencia, los extintores y
cualquier elemento de seguridad.
18. Ante cualquier duda, siempre, consulta al
profesor.

VAS DE INFECCIN.

Las principales vas de entrada de
infeccin en el organismo son:
1. Va respiratoria: generalmente por
inhalacin: de aerosoles (tambin vapores y
gases). Es la principal va.
2. Va digestiva: ingestin de slido y lquidos, a
travs de la boca, esfago, estmago y los
intestinos.
3. Va parenteral: a travs de cortes y rozaduras
o contacto directo en sangre.
4. Va drmica:
Piel: algunos microorganismos como Brucella
pueden penetrar a travs de la piel intacta.
Ojos: contacto directo. Muchos
microorganismos pueden utilizar como puerta
de entrada los ojos para la infeccin sin
producir lesiones locales, por lo que a veces se
olvida esta va.

HIGIENE EN EL TRABAJO DEL
LABORATORIO MICROBIOLGICO.

Si bien en cualquier trabajo experimental
como los de laboratorio de cualquier tipo, es
esencial la limpieza y el orden, en el caso del
laboratorio de microbiologa estos aspectos suelen
ser crticos, y no slo por motivos de seguridad,
sino de la fiabilidad de los resultados obtenidos.
Cualquier persona que trabaje en un
laboratorio de microbiologa debe tener una actitud
combativa en cuanto a la limpieza y el orden. Se
trata no slo de cumplir de forma rigurosa todas las
normas al efecto, sino de hacerlas cumplir, puesto
que tanto su salud como la calidad de su trabajo se
ve afectada, no slo por lo que uno haga, sino
tambin por lo que hagan los dems.
Cualquier norma, por extraa que pueda
parecer en un principio, persigue la calidad del
trabajo en condiciones de seguridad.
Debe tenerse siempre presente que se
trabaja con algo vivo y potencialmente peligroso,
para nuestra salud y la de los dems.
La infeccin puede ser bidireccional por lo
que entraa riesgos para:
La salud: Aunque la mayora de las muestras
no presentan patogenicidad alguna, siempre
cabe la posibilidad de contraer alguna
enfermedad por no seguir las instrucciones
dadas, o no utilizar todos los medios de
proteccin individuales y colectivos a nuestro
alcance.
La calidad del trabajo: Tanto nosotros, como
el material que usamos, podemos
considerarnos como foco de infeccin para
nuestras muestras, por lo que de nada valdr
nuestro trabajo si a nuestras muestras y medios
de cultivo los contaminamos por no seguir la
tcnica adecuada o trabajar sin la higiene
requerida.
Deben tomarse las normas no como algo
restrictivo a nuestra individualidad, sino como una
herramienta para el aseguramiento de la calidad en
condiciones de seguridad para las personas, los
materiales y los equipos.

LIMPIEZA Y ELIMINACIN DEL
MATERIAL.

Cualquier trabajo que se realiza en un
laboratorio precisa de una limpieza esmerada, y
an ms en el caso de un laboratorio de
microbiologa debido a que el material se puede
contaminar con mayor facilidad.
Por otro lado, el proceso de limpieza es
generalmente ms complejo que el de un
laboratorio qumico o fsico-qumico, puesto que
no solamente es necesario la limpieza sino la
esterilizacin del material.
Tambin es necesario tener en cuenta,
por respeto al medio ambiente y en cumplimiento
de estrictas normas de salubridad, que la
eliminacin del material desechable contaminado
debe realizarse en las debidas condiciones de
seguridad, por lo que, como ya se insistir ms
adelante, todo el material que se deseche debe estar

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en condiciones de esterilidad absoluta sobretodo
los residuos infecciosos.

RESIDUOS INFECCIOSOS.

Se considera residuo infeccioso a "aqul
que es capaz de producir una enfermedad
infecciosa". Como no existe un test lo
suficientemente confiable para valorar la
infectividad de los residuos, conduce a que los
volmenes de residuos infecciosos tengan una gran
variabilidad.
Para el anlisis ms preciso de este
concepto se deben tener en cuenta los siguientes
requisitos bsicos:
Presencia de un agente infeccioso en el
residuo.
Concentracin suficiente del agente infeccioso,
como para tener capacidad infectiva.
Presencia de un husped susceptible.
Presencia de una puerta de entrada para el
acceso del grmen al husped.
Se considera residuo infeccioso a:
Residuos microbiolgicos: Medios de cultivo y
todo material empleado en el laboratorio de
microbiologa para el cultivo y conservacin
de agentes microbianos.
Sangre y productos derivados de la sangre.
Tejidos y rganos humanos.
Todo instrumental o material punzo-cortante
(agujas).
Restos anatmicos parciales o completos de
animales contaminados empleados en
investigacin.

TRATAMIENTO DE RESIDUOS
INFECCIOSOS.

Los mtodos considerados vlidos en la
actualidad son:
Incineracin (hornos pirolticos)
Esterilizacin por autoclave (calor hmedo)
Descontaminacin qumica
Compactacin-trituracin combinado con
descontaminacin qumica.
Inactivacin trmica (microondas)
Esterilizacin por autoclave combinado con
trituracin y compactacin.
En funcin del tipo de residuos:
Residuos microbiolgicos: autoclave,
incineracin, descontaminacin qumica.
Sangre y sus derivados: autoclave,
incineracin, descontaminacin qumica,
sistema cloacal.
Tejidos y rganos: incineracin.
Material punzo-cortante: incineracin.
Restos de animales de investigacin:
incineracin.

TEORA MICROBIANA DE LA
ENFERMEDAD.

Desde tiempo inmemorial se consider la
enfermedad como una fatalidad misteriosa e
incluso sobrenatural, muchas veces se pensaba en
venganzas de los dioses. Mdicos griegos y
romanos ya sospecharon que algn agente
pequesimo invisible causaba enfermedades y
poda transmitirse de alguna manera de un
individuo a otro.
Robert Koch, en 1876, demostr que hay
bacterias patgenas y que un germen, Bacillus
anthracis, era el causante del carbunco,
enfermedad epidmica en los animales y que
tambin puede afectar al hombre. Koch,
experimentando con animales enfermos de
carbunco, logr transmitir la enfermedad a
animales sanos extrayendo sangre de animales
enfermos e inyectndola a los sanos. Aisl el
germen, logr cultivarlo y lo reinyect en animales
sanos para que estos enfermaran, logrando as
reproducir la enfermedad a partir de un cultivo de
microorganismos.
Posteriormente aisl el germen causante de
la tuberculosis, que recibe el nombre de bacilo de
Koch, y demostr que no todos los
microorganismos son infecciosos para los
animales.
Koch elabor unos postulados para
comprobar que un microorganismo era el
productor de una enfermedad:
1. Identifquese al organismo que se sospecha
es el que causa la enfermedad y
demustrese su falta en individuos sanos.
2. Aslese el microorganismo en cultivos
puros.
3. Reprodzcase la misma enfermedad en
animales de experimentacin adecuados.
4. Vulvase a aislar el mismo
microorganismo en los animales infectados
artificialmente.

MICROORGANISMOS PATGENOS.

De todos los microorganismos de estudio
frecuente en un laboratorio microbiolgico,
algunos de ellos tienen una potencial y real
patogenicidad, entre otros:
Escherichia coli: Especie perteneciente a la
familia Enterobacteriaceae y dentro de ella al
grupo de coliformes fecales, cuyo hbitat

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natural es el intestino de los vertebrados.
Existen tres cepas patgenas, E. coli
enterotoxignico capaz de elaborar dos
toxinas, E. coli enteropatgeno y E. coli
enteroinvasivo, todos ellos causantes de
procesos entricos.
Staphylococcus aureus: Especie perteneciente
a la familia Micrococcaceae, microorganismo
ubicuo que se encuentra en el hombre y
muchos animales como parte de la flora
normal. Algunas cepas son capaces de elaborar
enterotoxinas aunque tambin es responsable
de algunas supuraciones y septicemias.
Salmonella: Gnero perteneciente a la familia
Enterobacteriaceae, muy extendida en la
naturaleza contaminando locales, materiales
industriales, lugares de restauracin, etc.,
pudiendo dar lugar a infecciones animales
denominadas salmonelosis, como la fiebre
tifoidea y gastroenteritis. Acorde a sus
propiedades patgenas se hablas de:
- Salmonelas patgenas para el
hombre, como las productoras de
fiebre tifoideas y paratifoideas (S.
typhi y S. paratyphi A, B y C.).
- Salmonelas patgenas para los
animales como S. abortus o S.
gallinarum.
- Salmonelas de husped especfico (la
mayora) como S. typhimorium, S
enteriditis, etc.
Shigella: Gnero perteneciente a la familia
Enterobacteriaceae, cuyo hbitat es el
intestino de primates enfermos, lo que incluye
al hombre. Responsable de la disentera bacilar
(Sh. dysenteriae) y de toxiinfecciones
alimentarias (Sh. sonnei y Sh. flexneri)
originando ulceraciones en mucosas
superficiales ocasionadas por las endotoxinas
liberadas en su lisis.
Bacillus cereus: Especie perteneciente a la
familia Bacilliaceae, germen ubicuo cuyo
mecanismo de patogenicidad es poco
conocido, pero que ha dado lugar a
intoxicaciones alimentarias debida a gran
cantidad de alimentos diferentes y que provoca
sndromes diarricos y emticos.
Clostridium perfringes: Especie perteneciente
a la familia Bacilliaceae, microorganismo
ampliamente distribuido en la naturaleza, y que
provoca intoxicaciones alimentarias a travs de
las toxinas tipo A y C.
Clostridium botulinum: Especie perteneciente
a la familia Bacilliaceae, saprfito fecal que
origina intoxicaciones denominadas
botulismos, enfermedades neuroparalizantes
que afectan a hombres y animales pudiendo ser
letal, debido a las 8 toxinas diferentes que
producen, algunas de ellas, como la A, 15.000
veces ms txica que la aconitina, el alcaloide
ms txico conocido.
Yersinia enterocoltica: Especie perteneciente
a la familia Enterobacteriaceae, presentes en
el agua contaminada y las heces, que puede
crecer a temperatura de refrigeracin y que
provoca enfermedades denominadas
yersiniosis, gastroenteritis agudas con otras
complicaciones.
Campylobacter: Gnero de difcil clasificacin
(algunos autores lo consideran como
perteneciente a una familia nueva
Campilobacteriaceae y dentro de ella como
gnero) que forma parte de la flora intestinal
normal de los animales, que provoca enteritis
agudas alimentarias generalmente por
ingestin de alimentos o aguas contaminadas,
aunque tambin por contaminacin cruzada y
por contaminacin por contacto con personas
que padecen la enfermedad.
Listeria monocytogenes: Especie de la familia
Listeriaceae bastante ubicua, incluso aislada
en personas sanas, que provocan listeriosis,
enfermedades que cursan con septicemias no
muy graves, pero que a embarazadas le puede
provocar el aborto y a poblaciones de riesgo
meningoencefalitis, y que se ha asociado a la
ingestin de alimentos en condiciones
sanitarias inadecuadas.

Anlisis Microbiolgicos Unidad Temtica3. Microscopa

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MICROSCOPIO.

Se denomina microscopio al instrumento
destinado a la observacin de pequeos objetos de
los que se obtiene una imagen muy aumentada
mediante un sistema de lentes (pticas,
electrnicas o acsticas).

TIPOS DE MICROSCOPIOS.

Adems del microscopio ptico tambin
denominado de fotones, que por ser el ms usual
le dedicaremos ms tiempo a su estudio y que
utiliza luz visible, tenemos otros tipos de
microscopios:
En funcin de la radiacin usada:
o De rayos X.
o De infrarrojo.
o De ultravioleta.
o Electrnicos.
o Ultrasnicos.
o De fluorescencia.
o Protnicos.
En funcin de dispositivos adicionales:
o De campo inico.
o Polarizador.
o De campo oscuro.
o De contraste de fases.
o De interferencia.
En funcin de su uso:
o Biolgicos.
o Metalogrficos.
o Metalrgicos.
o Petrogrficos.

FUNCIONAMIENTO

Est formado por dos lentes convergentes:
Lente objetivo, situada muy cerca del objeto.
Lente ocular, al otro extremo del tubo, est
situada ms cerca del ojo y hace la funcin de lupa
sobre la imagen que produce la lente objetivo.
La lente objetivo es muy convergente y el
objeto debe colocarse ms all de su punto focal,
pero cerca de l.
El ocular se coloca de manera que la
imagen formada por la lente objetivo caiga sobre el
punto focal de ella.
Cuando una imagen se forma en el foco, la
luz emerge del ocular en forma de un haz de rayos
paralelos y forma la imagen en el infinito, pero el

ojo, sin esfuerzo de acomodacin, la
concentra en la retina.
El ocular logra que veamos la imagen del
objetivo con un ngulo aparente mayor que si el
objeto estuviera en el punto prximo del ojo.

La lente objetivo produce una imagen
mayor, real e invertida, y la lente ocular, actuando
sobre ella, la hace ms grande pero la deja
invertida y virtual.
La imagen que da el microscopio es
mayor, virtual e invertida.
La imagen final despus de pasar por el ojo
3. Microscopa.
EL MICROSCOPIO
El comienzo de la Microbiologa como
ciencia empieza cuando se pudo observar por
microscopios. Fue ROGER BACON, en el S. XIII el
primero que postul que una enfermedad est
originada por seres vivos invisibles. En 1.658, un
monje llamado KIRCHER se refiri a gusanos
invisibles a simple vista que estaban en la carne, la
leche y en exudados diarricos. Fue el primero que
reconoci el significado de las bacterias y otros
microbios en la enfermedad.
En 1.665 ROBERT HOOKE vio y realiz la
primera descripcin de clulas en un pedazo de
corcho y estableci el hecho de que los cuerpos de
animales y plantas, por complejos que parezcan,
estn a su vez formados por partes elementales
repetidas con cierta frecuencia. Esta teora se
corresponde con la descripcin de Aristteles de la
estructura celular de los seres vivos, que se remonta
al S. IV A.C.
ANTONIO VAN LEEUWENHOEK, holands
que vivi entre 1.632 y 1.723, fue el primero que
comunic sus observaciones con descripciones
detalladas y dibujos precisos. Tall lentes y se
construy microscopios, llegando a hacer ms de
250 durante toda su vida. Alcanz los 200 300
aumentos en los ms poderosos. Sus descripciones
de protozoos fueron tan precisas que muchas de las
formas se reconocen sin dificultad.

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se forma en la retina.
La distancia entre el punto focal imagen
del objetivo y el punto focal objeto del ocular se
llama longitud del tubo, L. En los microscopios
tiene un valor fijo: 16 cm.

CARACTERSTICAS QUE DEFINEN A
UN MICROSCOPIO.

Las caractersticas fundamentales que
definen a un microscopio son:
1. Aumento: En microscopa visual la
caracterstica bsica es la relacin G, que
es la relacin entre el ngulo bajo el cual
se ve el objeto en el instrumento y el
ngulo bajo el cual se vera el objeto real a
una distancia convencional de 25 cm.
En microfotografa se utiliza el aumento
lineal, o relacin entre la dimensin
transversal de la imagen fotogrfica y la
del objeto.
Se demuestra que,

Donde, g
1
es el aumento del objetivo y G
2

el aumento del ocular.
Esta simplificacin merece una un
comentario. En realidad el poder de
amplificacin de un microscopio es el
producto de la amplificacin lateral del
objetivo por la amplificacin angular del
ocular.

La amplificacin lateral del objetivo es:

tg
i
=y / f
1
=- y' / L
Aumento lateral= = y' / y = -L / f
1

El ocular acta como lupa y da una
amplificacin angular expresada por la
frmula:

El ngulo mximo con que el ojo ve el
objeto sin usar lentes es el que logra
cuando el objeto est situado en el punto
prximo del ojo. En esta posicin se forma
imagen ms grande en la retina.
El punto prximo en un ojo normal est a
25 cm por lo que la expresin anterior
queda:

Mo=xp /f 2=0,25 / f 2= Potencia del ocular / 4

Como se defini el poder amplificador del
microscopio por el producto de la
amplificacin lateral del objetivo por la
amplificacin angular del ocular, tenemos:

M=B M = (L / f1) (xp/ f2)

Las casas comerciales facilitan con los
microscopios unas tablas en las que se
indican los aumentos logrados con
diferentes objetivos.
El aumento del objetivo se calcula
dividiendo 16 entre la distancia focal en
cm:

(B=y'/y=-L / f1)

El aumento total es el producto de los
aumentos ocular y objetivo.
La distancia de trabajo es la distancia
existente entre la lente frontal del objetivo
y el objeto enfocado. Es siempre menor
que la distancia focal del objetivo.
Cuanto mayor es el aumento del objetivo
ms cerca est del objeto y menor es la
lente por lo que llega menos luz al ojo. A
mayor aumento menos luminosidad.
2. Profundidad de campo: Definida como la
distancia mxima x, medida en la
direccin del eje ptico, para la que es
aceptable la nitidez de los detalles en el
espacio objeto. En un microscopio ideal

2 1
G g G =
cos 1
1
4n
x

Pgina 25

donde , es la longitud de onda y n el
ndice de refraccin del medio (aire o
lquido de inmersin) y el ngulo
mximo que forman los rayos luminosos
con el eje. Incluso en un objeto
transparente slo se ve con nitidez una
zona muy fina, a menudo del orden de la
micra, con lo que obtenemos un corte
ptico del objeto.
El poder penetrante expresa la cualidad de
un objetivo de poder presentar
perfectamente detalladas los diversos
planos de una preparacin sin variar la
posicin de enfoque. Depende del diseo
del objetivo.
El Poder penetrante (Profundidad de foco)
es inversamente proporcional al cuadrado
de la apertura numrica (A.N.)
Cuanta mayor sea la Profundidad de foco,
tanto menor ser el Poder separador.
3. Poder separador: Para ver con nitidez
objetos cada vez menores, no es suficiente
con incrementar el nmero de aumentos,
ya que la difraccin impone un lmite a la
distancia mnima entre dos puntos cuyas
imgenes pueden distinguirse como
distintas.
Esta distancia viene definida por y,

Al producto
sen n
, se le denomina
apertura numrica (A.N.).
La calidad de un objetivo es tanto
mayor cuanto ms elevada es su
apertura numrica.
El aumento total ms idneo debe estar
comprendido entre 500 (A.N.) y 1000
(A.N.) veces la apertura numrica del
objetivo. Oculares de gran potencia
favorecen el aumento pero disminuyen la
luminosidad, nitidez y las dimensiones del
campo visual. Por eso es aconsejable situar
el aumento total entre 500 y 1000 veces el
valor de A.N.
Esta regla est basada en las relaciones
entre los poderes separadores del ojo y del
microscopio.
La luz visible tiene una longitud de onda
comprendida entre los 400 y los 700
manometros (nm). Esta caracterstica
supone una limitacin al poder separador
(distancia a la que dos puntos se ven
separados).
Cuando se ilumina un objeto, los puntos de

su superficie reflejan las ondas luminosas.
Dos puntos prximos de la superficie se
vern como distintos si la distancia que los
separa es grande comparada con la
longitud de onda que reciben.
Si la distancia que los separa es inferior a
la longitud de onda que los ilumina
aparecern a nuestra vista como dos puntos
unidos. De nada sirve entonces aumentar el
poder amplificador del microscopio. Lo
que lograramos es aumentar de tamao
aparente esa mancha difusa procedente de
la unin de los dos puntos, pero sin
conseguir verlos separados.

Si definimos el poder separador de una
lente o en general de un instrumento ptico
como su capacidad para separar
ntidamente las imgenes de dos puntos
prximos. Si "d" es la distancia mnima a
que pueden estar separados dos puntos
para que sus imgenes se vean como
separadas.

La claridad de la imagen crece con el

En un microscopio convencional:
1000 10 100
2 1
= = = G g G aumentos
cos 1
1
4n
x =
1 1048
25 cos 1
1
5 , 1 4
3 , 589
=

=

nm
nm
x

6 , 0 557
25 5 , 1 2
3 , 589 2 , 1
2
2 , 1
=

= = nm
sen
nm
nsen
y

Bacterias : de 0,1 6

Bacterias grandes: cilindros 5 x 1
Vistas como 5 x 1 mm a 25 cm

Bacterias pequeas: esferas de 0,5
Vistas como 0,5 mm a 25 cm

nsen
y
2
2 , 1
=


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ngulo "". Este ngulo es el de
semiabertura del objetivo:

4. Iluminacin: Segn que el objeto sea
transparente u opaco, se utilizan distintas
formas de iluminacin, solar (con reflexin
especular o difusa), utilizando lmparas
con reflexin (especular o difusa) o por
transmisin y si utilizamos fibra ptica
bajo cualquier ngulo de incidencia.

ABERRACIONES.

Como tal se denomina a cualquier defecto
que altera la calidad de las imgenes
proporcionadas por un sistema ptico, como lo es
el microscopio.
La ausencia de similitud perfecta entre el
objeto y la imagen que de l da un sistema ptico y
la falta de nitidez se deben a tres tipos de
aberraciones:
1. Aberraciones geomtricas: Se dan incluso
con luz perfectamente monocromtica, y slo
depende de la constitucin del sistema ptico.
Se deben a que los rayos surgidos de un mismo
punto luminoso objeto no convergen
exactamente en el mismo punto imagen
despus de atravesar el microscopio. Son
aberraciones de este tipo las denominadas
como aberracin esfrica, coma, astigmatismo,
curvatura de campo y distorsin.

2. Aberraciones cromticas: Se producen de
forma especfica en los sistemas diptricos
(lentes) en los que las imgenes se forman por
refraccin en los medios refringentes. Como el
ndice de refraccin vara con la longitud de
cada onda utilizada, implica una distancia focal
diferente para cada una de ellas. En
consecuencia, un punto emisor policromtico
posee una serie de imgenes monocromticas
pudiendo formar un crculo de difusin
multicolor irisado. Son aberraciones de este
tipo las aberraciones de posicin y tamao.
3. Aberraciones accidentales: Generalmente
debidas a la falta de homogeneidad de las
lentes como irregularidades de tamao,
diferencias de curvatura, etc.
La correccin de las aberraciones se
efecta por optimizacin del sistema ptico
utilizando combinaciones de lentes convergentes y
divergentes de diferente ndice de refraccin. En el
caso de sistemas electrnicos, las aberraciones
esfricas, cromticas y el astigmatismo no se
pueden corregir al no existir lentes divergentes
electromagnticas o electrostticas.

MICROSCOPIO PTICO.

El microscopio ptico, de fotones o de
campo luminoso (as denominado porque el rea
observada est intensamente iluminada y los
objetos en l aparecen ms oscuros), es el ms
utilizado en microbiologa.
Llegan a producir aumentos tiles de hasta
1.000 dimetros, y aunque con modificaciones en
los oculares se consigue duplicar o triplicar este
aumento, a ste se le considera como el lmite til.


Pgina 27

Las partes principales, aunque existen
muchos modelos, son:
A) Soporte mecnico:
Pie: Base pesada que estabiliza el microscopio.
Brazo: Articulado.
Tubo ptico: Donde se localizan en la parte
superior los oculares, y en las inferiores los
objetivos.
Revolver: Pieza giratoria donde se insertan los
distintos objetivos.
Platina: Donde se colocan las preparaciones a
observar. Lleva un carro mvil que permite
desplazamientos transversales y verticales.
B) Parte ptica:
Oculares: Dos o uno (microscopio binocular o
monocular), pudiendo ajustarse en los
primeros la distancia interpupilar para cada
usuario. Se pueden utilizar diferentes aumentos
X8, X10, X12, etc., pudiendo incluirse en
algunos una escala micromtrica a fin de poder
efectuar mediciones.
Objetivos: Situados en el revolver un juego
con diferentes aumentos, generalmente X10,
X20, X40 y X100 aumentos.
Sistema de iluminacin: Puede ser por
reflexin especular de la luz solar o procedente
de una lamparita. Se usa la parte plana para la
luz solar y la cncava cuando utilizamos luz
artificial.
Diafragma: Regula la cantidad de luz que pasa
a travs de la muestra y las lentes. Debe
adaptarse a la muestra y al aumento utilizado,
permitiendo el contraste de la muestra con el
medio que lo rodea.
Condensador: Lente, o serie de lentes, que
dirigen la luz hacia la muestra. En algunos
casos es regulable la distancia.

NORMAS GENERALES DE USO.

Salvo que se especifique lo contrario, las
normas generales de uso y mantenimiento del
microscopio ptico sern las siguientes:
1. Nunca tocar con los dedos las lentes. Estas se

deben limpiar con papel especial o de fumar, pero
nunca con papel de filtro.
2. Para empezar a trabajar se utiliza como
objetivo buscador el de menos aumentos.
3. Para comenzar a trabajar se utiliza la
iluminacin ptima.
4. Nunca se deben hacer movimientos de
aproximacin del tubo ptico a la platina
mirando por el ocular.

5. Para enfocar:
- La iluminacin, si se trata de luz
indirecta, se utiliza colocando la
lmpara a unos 10-15 cm del
microscopio y moviendo el espejo
hasta que el campo visual quede
perfectamente iluminado y sin zonas
de sombra. El condensador debe
estar alto y el diafragma abierto
(salvo que las muestras sean
excepcionalmente poco coloreadas o
muy translcidas).
- Una vez colocada la preparacin en
la platina se sujeta con las pinzas de
presin lateral y se centra mediante
los tornillos de posicionamiento.
Debemos cerciorarnos de que el
portaobjetos quede abajo y el
cubreobjetos arriba pues lo contrario
impide, por el grosor del
portaobjetos, el enfoque con
objetivos de distancia focal muy
corta.
- Se coloca el objetivo girando el
revolver despus de levantar
ligeramente el tubo ptico (los
objetivos de mayores
aumentos,suelen ser ms largos).
- Aproximar, mirando por fuera el tubo
ptico, y la preparacin mediante el
tornillo macromtrico.
- Mirando por el ocular y girando muy
despacio, se aleja el tubo ptico con
el tornillo macromtrico. Los

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aumentos de un objetivo son
inversamente proporcionales a la
distancia focal, por lo que
dependiendo del objetivo, el plano
del enfoque estar ms o menos
prximo a la preparacin.
- Despus de obtener el mximo de
nitidez con el tornillo macromtrico,
se afina el enfoque con el
micromtrico. Son observables
distintos planos de la muestra. Se
elige el ptimo y se adapta la
iluminacin utilizando para ello
diferentes posiciones tanto del
condensador como del diafragma.
Cada muestra y cada aumento usado
requieren la adaptacin de la
iluminacin.
- Tras realizar el enfoque con un
objetivo de poco aumento se centra
la muestra a observar en el campo y
girando suavemente el revolver se
coloca el objetivo de mayor aumento
repitiendo totalmente el proceso de
enfoque.

MANEJO DE OBJETIVOS.

Los objetivos disponibles no tienen la
misma aplicacin:
El objetivo de 4X o10X (20X) se utilizan para
examen de preparaciones en las que se
pretenden observar elementos de mayor
tamao que bacterias, como protozoos, etc.
Estos objetivos no se utilizan con aceite de
inmersin. Se utilizan con el condensador en la
posicin de baja y con cierre moderado del
diafragma.
El objetivo utilizado para el examen de
preparaciones no teidas y sin fijar (exmenes
en fresco) es de 40X, que se utiliza sin
necesidad del aceite de inmersin.
El objetivo de 100X se utiliza siempre en
inmersin para visualizaciones de
preparaciones fijadas y teidas.
Los objetivos 100X y 40X se utilizan estando
el condensador en posicin de alta y el
diafragma en posicin de abierto.
El aceite de inmersin es necesario cuando se
utilizan grandes aumentos. Debe quedar
sumergido en la gota el objetivo. El fin es que
no exista tanta diferencia en el ndice de
refraccin entre el vidrio de la lente del
objetivo y el aire si no se utilizara, lo que sera
causa de grandes aberraciones.

NORMAS DE USO UTILIZANDO EL
OBJETIVO DE INMERSIN.

1. Asegura que objetivos, oculares, condensador
y espejo se encuentren limpios.
2. Coloca la fuente de luz a unos 15 cm del
espejo.
3. Ajusta el tubo ptico a la distancia adecuada.
4. Con el objetivo de 10X en posicin y despus
de quitar el ocular se ajusta el lado adecuado
del espejo de modo que la luz pase por la parte
central del tubo.
5. Coloca el ocular y la muestra y enfoca con el
objetivo 10X utilizando el tornillo
macromtrico.
6. Se dirige la fuente de luz sobre el objeto
colocando un lpiz junto a la fuente de luz y
moviendo el condensador en vertical hasta
obtener una imagen clara del mismo en el
mismo campo que el objeto enfocado. Es la
denominada iluminacin crtica en la que la
imagen de la fuente de luz est en el mismo
plano que el objeto enfocado.
7. Utilizando los objetivos 10X y/o 40X,
selecciona el campo adecuado.
8. Se levanta el objetivo y se gira el de inmersin
hasta su posicin.
9. Se coloca una gota de aceite de inmersin
sobre la preparacin.
10. Con el tornillo macromtrico y suavemente se
baja el objetivo hasta que el nivel de aceite se
aplaste sin que la lente toque la preparacin.
11. Levanta lentamente el objetivo con el tornillo
macromtrico mientras se observa a travs del
ocular, NUNCA BAJAR!, hasta ver el objeto
enfocado.
12. Enfoca perfectamente con el tornillo
micromtrico.
13. Quitar el ocular y ajustar nuevamente el espejo
para comprobar que la lente posterior del
objetivo est simtricamente llena de luz. Para
evitar el deslumbramiento se puede cerrar el
diafragma hasta que la lente posterior est
iluminada en unas partes.
14. Colocar de nuevo el ocular y volver a enfocar

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con el tornillo micromtrico si fuera necesario.
15. Limpia PERFECTAMENTE! el aceite de
inmersin as como, si no se va a usar ms,
todos los elementos pticos con los medios
adecuados.

MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES
DE USO.

1. Si no se est utilizando el microscopio debe
estar guardado, o por lo menos cubierto por
una funda de plstico, con el fin de evitar que
se daen o ensucien las lentes.
2. Nunca se deben tocar las lentes con las manos.
Cuando es necesario limpiarlas debe utilizarse
el material adecuado para ello.
3. Cuando no est utilizando el microscopio no
debe permanecer la preparacin sobre la
platina.
4. Despus de usar el objetivo de inmersin se
debe limpiar el aceite inmediatamente. En caso
de secarse se debe limpiar con alcohol-acetona
(7:3) o con xilol. El exceso de esta limpieza
puede daar tanto las lentes como el adhesivo
de su sujecin.
5. Nunca se deben forzar los dispositivos
giratorios del microscopio.
6. No se debe cambiar de objetivo mientras se
est observando por el ocular.
7. Cuando se finaliza el trabajo se pone el
objetivo de menor aumento en posicin de
observacin.
8. Es conveniente limpiar y revisar los
microscopios al finalizar cada sesin de trabajo
de observacin.

MICROSCOPIOS ELECTRNICOS.

Permiten obtener imgenes muy
aumentadas de un objeto mediante su interaccin
con electrones. Los microscopios electrnicos son
de diferentes tipos:
Microscopio electrnico de transmisin: Es
el ms convencional y tambin se denomina de
haz fijo. Un haz de electrones concentrado en
la zona observable incide y es desviado al
interactuar con los tomos mediante el proceso
de difraccin. Pasa despus a travs de
diferentes lentes intermedias a una pantalla de
observacin fluorescente, a una placa
fotogrfica o pelcula, a una pantalla de
televisin o incluso a una digitalizadora para
poder trabajarla con ayuda de un ordenador. Se
han conseguido con l resoluciones de 3 .
Microscopio electrnico de emisin: Un
estrecho haz de electrones se focaliza en la
muestra creando una corriente de electrones
secundarios que se recogen mediante un
dispositivo de centelleo, fotodiodo o tubo
fotomultiplicador. Se alcanzan resoluciones de
hasta 40 .
Microscopio electrnico de alta tensin:
Utilizado para muestras de mayor grosor, da
una mayor profundidad en la observacin al
utilizar electrones incidentes de una mayor
energa.
Microscopio electrnico de reflexin:
Permite el estudio de superficies por medio de
la utilizacin de los electrones rpidos
reflejados por el objeto en incidencia rasante.
Microscopio electrnico de espejo: Como
uno de los tipos de microscopios electrnicos
de emisin, utiliza un objetivo de inmersin.
Los electrones incidentes son reflejados por un
potencial adecuado antes de alcanzar el objeto.


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OTROS TIPOS DE MICROSCOPIO.

Adems de los microscopios pticos y
electrnicos, ms usuales, tambin se utilizan otros
tipos de microscopios.
Microscopio de campo oscuro: Esta tcnica
consiste en la creacin de un fondo oscuro
sobre el que los objetos se ven intensamente
iluminados, lo que se consigue mediante un
condensador especial que dirige la luz de tal
forma que no entra por el objetivo, salvo que
se produzca por reflexin o difraccin al
incidir en medios no totalmente transparentes,
es decir, en la muestra. Este tipo de
microscopa se usa mucho en el examen de
microorganismos sin tincin, tanto en las
preparaciones hmedas como en las de gota
pendiente.
Microscopio de contraste de fases: La
muestra se ilumina de forma controlada por
medio de objetivos especiales, lo que hace
posible distinguir estructuras que slo difieren
ligeramente en cuanto a sus ndices de
refraccin, lo que es til para el estudio de
clulas vivas, pues pone de manifiesto detalles
estructurales no discernibles por otros
mtodos.
Microscopio de campo inico: Consiste en
una punta extremadamente fina sumergida en
una atmsfera enrarecida de un gas fcilmente
ionizable y poco reactivo (gas noble). Se crea
un campo elctrico entre la punta y una
pantalla fluorescente que ioniza molculas de
gas que se proyectan en la pantalla obteniendo
as la localizacin atmica de la superficie por
la que pasa.
Microscopio de rayos X: Una sonda de
electrones, lo ms fina posible, se concentra en
una antictodo metlico delgado de un
conductor (oro o cobre), acoplado a un sistema
de registro fotogrfico o de otro tipo,
obtenindose siluetas perfectas con una
resolucin de unos 1.000 .

Anlisis Microbiolgicos Unidad Temtica 4. Preparaciones Microscpicas

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CONFECCIN DE PREPARACIONES.

Normas generales:
1. Portaobjetos y cubreobjetos deben estar
perfectamente limpios, secos y exentos de
grasa.
2. Observa las ms rigurosas normas de asepsia.
3. Esteriliza el asa ponindola al rojo en toda su
longitud antes y despus de utilizarla. Antes de
utilizarla, dejarla enfriar.
4. Flamea la boca del tubo despus de destaparlo
y antes de volver a taparlo. Nunca toques la
parte del tapn que queda dentro del tubo ni lo
dejes sobre la mesa de trabajo.
Para examen en fresco:
1. Deposita una gotita de lquido, con asa o
pipeta, en el centro de un portaobjetos.
- Lquidos turbios o purulentos:
directamente.
- Lquidos limpios: centrifuga durante unos
diez minutos a unas 2.000 r.p.m., elimina
el lquido sobrenadante, emulsiona el
sedimento en el lquido adherido a las
paredes hasta obtener una suspensin
homognea.
- Productos semislidos emulsionables: se
deposita una gota de suero fisiolgico o
agua destilada en el centro y emulsionar en
ella un asa del producto.
- Productos semislidos no emulsionables:
en una placa de PETRI estril depositamos
unos 5 mL de suero fisiolgico estril y
con la ayuda de una jeringa con una aguja
gruesa, por medio de aspiraciones y
expulsiones, obtenemos una suspensin
homognea de la que se deposita una
gotita.
- Productos slidos: se deposita la pieza o
un fragmento de la misma en un mortero
con arena estril, se le aade un volumen
similar de suero machacando hasta obtener
una suspensin homognea de la que
tomamos la gota.
- Hisopos: se realiza la emulsin con 2 mL
de suero exprimiendo el hisopo
enrgicamente contra las paredes del tubo
del cual tomaremos la gotita.
- Cultivos en medios lquidos: Se procede
como si se tratara de un lquido turbio.
- Cultivos en medio slido: toma con el asa
una pequea cantidad de una colonia

aislada y se procede como en el caso de los
productos fcilmente emulsionables.
2. Formando un ngulo de 45 deslizar un
cubreobjetos sobre el portaobjetos hasta que
toque la gota dejndolo caer sobre la misma.
3. La lmina de lquido que queda entre el cubre
y el porta debe ser lo ms fina posible sin
llegar a rebosar los bordes del cubre.

Para tincin:
1. Prepara como un examen en fresco.
2. Deposita una gota en el centro del porta
extendiendo cuidadosamente con movimientos
circulares dejando la preparacin lo
suficientemente fina como para permitir ver a
su travs las letras impresas.
3. Sujetando el porta con los dedos pulgar e
ndice y manteniendo el cultivo en la parte
superior se pasa rpidamente sobre la llama de
un mechero, calentando muy suavemente sin
que el porta llegue a quemar nunca. A este
procedimiento se le denomina fijacin.
4. Una vez seca la extensin se deja enfriar y se
tie.
5. Una vez efectuada la tincin se lava
abundantemente con agua destilada y se deja
secar a temperatura ambiente. Slo en caso de
urgencia se recurre a colocarlo entre papel de
filtro y presionarlo suavemente, para secarlo
sobre el mechero en una o dos pasadas. Nunca
se debe volver a utilizar el mismo papel.

4. Preparaciones Microscpicas.

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PREPARACIN EN GOTA PENDIENTE.

Muchos microorganismos, especialmente
las bacterias, en su estado natural son mejor
observados cuando se mantienen suspendidos en
cualquier lquido claro y transparente
(generalmente agua o caldo).
Como las clulas son transparentes,
incoloras y tan pequeas (sobre todo los cocos), es
difcil observarlas en la gota del lquido. Este
mtodo recurre a suspender una gota en el centro
de un cubre con un asa, poniendo una gota de
aceite mineral en sus cuatro vrtices.
Posteriormente se coloca un porta excavado con la
depresin en el lado de abajo y sobre la gota para
invertir rpidamente el conjunto sin que resbale la
gota.
A continuacin, y si es preciso, se puede
rodear el borde del cubre con otra gota de aceite
mineral. Este aceite se extiende entre el porta y el
cubre, evitando que se seque la gota.
Con este mtodo puede observarse la
forma y disposicin de las bacterias as como sus
posibles movimientos, que nunca deben
confundirse con el movimiento browniano o con el
arrastre por las corrientes del lquido. La
informacin que puede proporcionar es muy
limitada, pero valiosa.

PREPARACIONES HMEDAS.

El examen en fresco de una suspensin
microbiana es esencial siempre que se desee
observar microorganismos vivos y conocer sus
caractersticas (morfologa, tamao real, color,
movimientos) evitando los artefactos que puedan
ocasionar los procedimientos de fijacin y teido.
Se preparan de la forma siguiente:
1. Toma una gota con un asa y depositarla en el
porta.
2. Coloca un cubre evitando la aparicin de
burbujas.
3. Observa lo ms rpidamente (como en el caso
de la preparacin en gota pendiente) por el
microscopio. El calor desprendido por el
sistema de iluminacin ir secando la
preparacin, con lo que los microorganismos
se irn paralizando y aparecern corrientes de
lquido que dificultarn la observacin.

TINCIN SIMPLE.

Tanto en la tincin simple como en la
tincin diferencial se utilizan colorantes como
mtodo de visualizar los microorganismos, o sus
estructuras. Estrictamente un colorante es una
sustancia generalmente coloreada que combinada
con otra confiere a esta un determinado color. Son
compuestos orgnicos que contienen grupos azo,
nitroso, azoxi, tiocarbonilo o trifenilmetano.
La forma de preparacin es simple, la
extensin una vez fijada al calor se coloca en una
rejilla o soporte de portaobjetos sobre una cubeta,
siempre preferible a la pila, cubriendo la misma
durante el tiempo estipulado para cada colorante,
para posteriormente enjuagar suavemente con agua
y secar con papel de filtro limpio con ligera
presin.
El tiempo de contacto del colorante con la
muestra a teir depende del colorante. As:
- Violeta cristal: 1 minuto.
- Azul de metileno de LOEFFLER: Al menos
durante 5 minutos.
- Fucsina fenicada diluida: 30 segundos.

TINCIN DE GRAM.

Es un mtodo diferencial de doble tincin,
base del anlisis e identificacin preliminar de las
bacterias y de su primera clasificacin. Se tien
primeramente con violeta cristal y posteriormente
con solucin de yodo. A continuacin se lavan con
etanol o acetona, lo que elimina el violeta cristal de
las bacterias gram-negativas, pero no de las gram-
positivas. Como colorante de contraste se puede
utilizar fucsina fenicada diluida o safranina con el
fin de teir las bacterias gramnegativas.


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Con este mtodo, podemos dividir las
bacterias en dos clases:
Gram-positivas: no decolorables en
etanol y apareciendo de color prpura,
como los Staphylococcus y Bacillus.
Gram-negativas: aparecen de color
rojo, como Pseudomonas y
Escherichia.
En cuanto al mtodo:
1. Se prepara una extensin fijada al calor a partir
de un cultivo de 18-24 h. Los cultivos de
ciertas bacterias, al envejecer, cambian no slo
de morfologa sino su reaccin con los
colorantes.
2. Se tie con solucin de violeta cristal durante
1-2 minutos.
3. Se lava inmediatamente con agua.
4. Se aade solucin de lugol y se deja reposar un
minuto.
5. Se decanta el lugol, se seca con papel secante y
se lava el porta con etanol al 95 % (o con
alcoholes metilados industriales) hasta el
momento que ya no se desprenda color violeta
de la extensin (bastarn de 5 a 15 segundos).
6. Se lava con agua.
7. Se tie con solucin de fucsina fenicada
durante 20-30 segundos. De forma alternativa
se puede utilizar safranina como contraste.
8. Se lava bien el portaobjetos y se seca con papel
secante.
9. Se coloca un cubre.
10. Observar en inmersin.

Solucin Reaccin y aspecto bacteriano
Gram-positivas Gram-negativas
Violeta-
Cristal (VC)
Las clulas se tien de
violeta
Las clulas se tien de
violeta
Solucin de
yodo (I)
Se forma un complejo
VC-I violeta
Se forma un complejo
VC-I violeta
Alcohol La pared celular se
deshidrata. Disminuye
el tamao de los poros
impidiendo la salida
del complejo VC-I,
permaneciendo violeta
Se extraen lpidos de
la pared celular. Los
poros se agrandan y el
complejo VC-I es
eliminado decolorando
la clula
Fucsina
fenicada
Las clulas no se
afectan permaneciendo
el color violeta
Las clulas toman este
colorante ponindose
de color rojo

La agrupacin preliminar de las
bacterias se basa normalmente en su
morfologa y en la forma en que reaccionan
ante los procedimientos de tincin.
Cuando se efecta la tincin de GRAM
la mayora de las bacterias quedan agrupadas
como gram-positivas (que incluye agentes
causantes de enfermedades como el ntrax, la
difteria, la fiebre reumtica y algunas formas
de pulmona) o como gram-negativas (que
comprende organismos que causan disentera,
clera y varios tipos de intoxicaciones
alimentarias). Menos usuales suele ser el grupo
gram-variable como el gnero Neisseria o
gram-no reactivo como son el gnero
Mycobacterium y varias espiroquetas.
Bacterias gram-positivas
Bacterias gram-negativas

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TINCIN DE ZIEHL-NEELSEN.

Se utiliza para teir bacterias cido-
resistentes, como puede ser la diferenciacin de los
gneros Mycobacterium (M. Tuberculosis y M.
Leprae) y Norcardia.
En primer lugar, se tien las bacterias
con un colorante caliente y concentrado, para
posteriormente decolorar con un cido fuerte. Se
vuelven a teir con azul de metileno, con lo que las
bacterias resistentes al cido quedan en rojo, y las
decoloradas y el medio en azul. La concentracin
del cido resulta crtica en funcin del
microorganismo a visualizar.
En cuanto al mtodo:
1. Se cubre el porta con fucsina fenicada
concentrada de ZIEHL-NEELSEN y se calienta
la parte inferior del mismo muy suavemente
(basta una torunda empapada de alcohol).
Cuando el colorante comienza a desprender
vapor se retira de la llama mantenindolo en
caliente y aadiendo, si es preciso, ms
colorante y evitando que la extensin se
seque. Se calienta durante 5 minutos sin que el
colorante llegue a hervir.
2. Se lava bien.
3. Se decolora con alcohol cido o con cido
sulfrico al 20, 5 o 1 %. El exceso de
colorante se libera en forma de solucin parda
quedando la extensin color marrn. Se lava
con agua con lo que quedar rosa. Se repite el
proceso tantas veces como sea necesario hasta
que el color quede rosa plido.
4. Se realiza la tincin de contraste con azul de
metileno de LOEFFLER durante 5 minutos.
5. Se lava bien y se elimina con la ayuda de un
papel de filtro, los restos de colorante que
queden en la parte posterior del porta secando
todo con papel de filtro.

TINCIN DE FLAGELOS.

Los flagelos no son normalmente visibles
puesto que su dimetro es inferior al lmite de
resolucin de un microscopio ptico. Con ciertas
tcnicas especiales de tincin se consigue depositar
una capa sobre los mismos aumentando su
dimetro aparente. Se suele utilizar para distinguir
los miembros de la familia Pseudomonadaceae
(flagelos polares) de los miembros de la familia
Enterobacteriaceae (flagelos pertricos, cuando
son mviles).
De cualquier forma, su gran fragilidad los
hace desprenderse y la mayora de los mtodos de
tincin dejan depsitos de fondo que dificultan la
observacin. As, la observacin pertrica es
confirmativa, pero la polar no elimina la
posibilidad de que sea pertrica. Suelen emplearse
sales de plata o fucsina bsica. Como deben
utilizarse exclusivamente portaobjetos
completamente limpios se deben preparar para ello
y mantenerlos sumergidos en alcohol del 95 %
hasta su uso.
En cuanto al mtodo (existen otros ):
1. Se saca un porta del alcohol y se flamea al
mechero durante 10 segundos. Se deja
enfriar sobre una rejilla de tincin y se
divide en dos partes con un lpiz graso
(uno de los extremos se puede utilizar para
sujetarlo mediante pinzas). Con la ayuda
de una pipeta graduada o PASTEUR se
depositan 2 mL de agua destilada estril en
el cultivo - que se debe haber efectuado en
agar inclinado e incubado a una
temperatura en 3-5 C inferior a la ptima
despus de haber humedecido su
superficie, y que debe ser reciente y de
crecimiento activo (18 h)- para suspender
suavemente las bacterias mediante giro
cuidadoso del tubo.
2. Se pasa la suspensin a un tubo de ensayo
limpio y se comprueba su movilidad por el
mtodo de la gota pendiente.
3. Se diluye la suspensin hasta que quede
ligeramente turbia.
4. Se coloca en la estufa a una temperatura de
20-30 C durante 30 minutos.
5. Se saca un asa abundante de la suspensin
depositndola en un extremo del
portaobjetos ya fro e inclinando este hasta
que llegue a la lnea trazada.
6. Se seca al aire, nunca se fija con calor.
7. Se cubre con mordiente Fontana 5
minutos.
8. Se enjuaga suave pero profusamente.
9. Se cubre con solucin Fontana caliente
(bao Mara hirviente) durante 5 minutos,

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renovando el colorante cada minuto.
10. Se lava con agua y se deja secar.

TINCIN DE CPSULAS.

Con el fin de poder distinguir las
cpsulas de las bacterias que se estn estudiando en
un cultivo puro se emplean tcnicas especiales
como la de LEIFSON para flagelos o mtodos ms
simples como el utilizar pelcula de tinta china en
fresco:
1. Se deposita un asa de tinta china sobre un
portaobjetos perfectamente limpio.
2. Se le mezcla una pequea porcin del cultivo o
suspensin bacteriana.
3. Sobre la mezcla se coloca un cubre, evitando la
formacin de burbujas, oprimiendo
fuertemente con papel secante hasta que la
capa de lquido sea muy fina.
4. Las cpsulas se observan como la zona clara
alrededor de la bacteria.
5. Utiliza un control con tinta exclusivamente
pues pudiera estar contaminada por bacterias
capsuladas.

TINCIN DE ESPORAS.

Las bacterias de los gneros Bacillus y
Clostridium forman endoesporas que son muy
resistentes a las altas temperaturas, a la falta de
humedad y a los productos qumicos txicos.
Tambin son resistentes a los colorantes
bacteriolgicos y en una extensin teida mediante
el mtodo de GRAM, se pueden distinguir como
zonas incoloras en las formas vegetativas de las
bacterias gram-positivas. Sin embargo, una vez
teidas su decoloracin suele ser difcil. Un
mtodo clsico es del BARTHOLOMEW y
MITTWER:
1. Se prepara una extensin en la forma habitual
y se fija intensamente a la llama para lo cual se
pasa unas 20 veces por la misma.
2. Se tie durante 10 minutos con solucin
saturada de verde malaquita.
3. Se lava suavemente con agua fra durante 10
segundos.
4. Se tie con solucin de safranina al 0,25 %
durante 15 segundos.
5. Se lava con agua y se seca con papel secante.

TINCIN NEGATIVA.

Es un mtodo muy sencillo y til que
permite apreciar la forma externa de las bacterias
dentro de una extensin. Las bacterias, as teidas,
se rodean de una fina pelcula de tinte negro y
aparecen como elementos blancos sobre fondo
gris.
En cuanto al mtodo:
1. Se prepara, de la forma habitual una extensin
muy fina utilizando un portaobjetos limpio.
2. En uno de sus extremos se deposita una gota
de solucin de nigrosina al 2 %.
3. Se toma otro portaobjetos y se apoya uno de
sus extremos sobre la porta anterior, de manera
que toque la gota de nigrosina formando un
ngulo de 30, movindolo para extender la
nigrosina sobre la superficie del primer porta,
obteniendo as una extensin uniforme y muy
delgada del colorante.
4. Se deja secar al aire.
Junto con este mtodo, se puede aplicar
un mtodo de tincin simple con el fin de poner de
manifiesto la presencia de cpsulas. En este caso,
se debe teir las extensiones con fucsina fenicada
diluida, lavarlas y secarlas, antes de comenzar el
tratamiento con nigrosina.

COLOCAR LA MUESTRA TINTA CHINA EXTENDER
COLOCAR EL PORTA
ELIMINAR EXCESO
TI NCI N DE ESPORAS

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OTRAS TINCIONES.

Entre otras, podemos destacar:
Tincin de Papanicolau.
Tincin con plata.
Tinciones con agentes fluorescentes:
o Naranja de acridina.
o Calcoflor.
o Falloidina.
o Bromuro de etidio.
Anticuerpos fluorescentes.

GALERA DE IMGENES.

S. aureus (Gram+)
Escherichia sp. (Gram-)
E. coli
Tincin con nigrosina
Hongo
Tincin con calcoflor
Helicobacter plory
Con Naranja de acridina
Mycobacterium sp.
Tincin cido resistente
E. coli
Tincin de flagelos
Coco
Tincin de cpsulas
Bacilo
Tincin de esporas
Anlisis Microbiolgicos Unidad Temtica 5. Limpieza y Esterilizacin

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INTRODUCCIN.

Todo trabajo que se realiza en el
laboratorio precisa de una limpieza esmerada, y
an ms exhaustiva en el anlisis microbiolgico
debido a que el material se puede contaminar con
mayor facilidad.
Por otro lado, la destruccin (eliminacin)
o inhibicin (evitar el crecimiento) de los
grmenes es muy importante en microbiologa
para:
1. Prevenir la infeccin de hombres e incluso
animales o plantas.
2. Evitar la descomposicin de alimentos y otros
productos.
3. Eliminar las interferencias de microorganismos
contaminantes en procesos que necesitan de
cultivos puros.
4. Prevenir la contaminacin de materiales y
equipos usados en el anlisis.

TRMINOS DE USO MS FRECUENTE.

A veces resulta necesario definir aquellos
trminos que con posterioridad se usarn con el fin
de utilizar el ms adecuado:
1. Esterilizacin: Esterilizar una sustancia u
objeto supone mantenerlos libres de toda clase
de vida. Es la destruccin de todo agente
microbiolgico contenido en un producto,
tanto en forma vegetativa como en forma de
resistencia. La esterilidad es algo absoluto.
2. Desinfeccin: Significa la muerte o
eliminacin de los grmenes capaces de causar
infecciones. Es la eliminacin de determinados
microorganismos patgenos en ciertas
situaciones. Lo que se pretende crear es la
imposibilidad de una infeccin posterior por
un germen determinado. Se suele aplicar a
seres inanimados, o a seres vivos en zonas
superficiales.
3. Antisepsia: Accin ejercida por unos agentes
qumicos que se oponen a la sepsis
(putrefaccin). Con ello se previene o detiene
el desarrollo de microorganismos, ya
destruyndolos o inhibindolos en su
crecimiento. Se suele aplicar sobre tejidos
vivos, debido a que el desinfectante es ms
enrgico que el antisptico.
4. Antisptico: A veces se emplea como
sinnimo de desinfectante y es toda sustancia
capaz de destruir o inhibir los m.o.

5. Microbicida: Cualquier sustancia o agente
capaz de matar a los microorganismo. Tambin
se habla de germicida en general o segn su
funcin: bactericida, fungicida o viricida.
6. Microbiosttico: actan no destruyendo, sino
inhibiendo a las bacterias (bacteriostticos),
hongos (fungistticos) o virus (virostticos) de
forma reversible, de tal modo que al cesar el
producto cesa la accin.
7. Microbiostsis: Estado producido por
sustancias o por condiciones externas que no
destruyen a los microorganismos, pero inhiben
su metabolismo impidiendo el crecimiento.
8. Sepsis: Estado txico o de enfermedad
causado por el crecimiento de
microorganismos perjudiciales.
9. Asepsia: En sentido estricto sera la ausencia
de grmenes infecciosos, pero el trmino se
aplica generalmente para designar cualquier
tcnica que impide el acceso de los
microorganismos no deseados a nuestro campo
de trabajo u observacin. Conjunto de tcnicas
que tienen por objeto evitar la llegada o acceso
de los microorganismos a los productos o
medio ambiente, impidiendo con ello la
contaminacin (quirfanos, laboratorios...).

LIMPIEZA DEL MATERIAL DE VIDRIO.

1. MATERIAL NUEVO.

El tratamiento del material nuevo de
vidrio se realiza en funcin de su composicin. Si
el cristal es de borosilicato (Pirex) basta con
lavarlo normalmente, pero si es sdico, debe
sumergirse en cido clorhdrico 1N durante al
menos 12 horas para neutralizar parcialmente el
lcali contenido en el vidrio antes de su lavado.

2. MATERIAL USADO.

Cualquier material que haya contenido
cultivos microbianos o haya podido ser objeto de
contaminacin bacteriana debe esterilizarse
previamente antes de su limpieza. Para ello son
suficientes 20 minutos en autoclave a 121 C. Esta
operacin adems, funde cualquier resto slido lo
que facilitar su limpieza.
El material se enjuaga posteriormente con
agua del grifo, se sumerge en agua jabonosa y se
lava cuidadosamente y preferiblemente con la
ayuda de un cepillo. Se enjuaga al chorro de agua
5. Limpieza y Esterilizacin.

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(primero de grifo y posteriormente destilada) y se
deja secar a temperatura ambiente en escurridores,
o en desecadores de aire forzado y caliente.
El detergente a utilizar debe reunir una
serie de requisitos:
1. Debe eliminar completamente los
residuos ms tenaces, como las
protenas y las grasas.
2. Debe ser fcilmente eliminable al
enjuagarse.
3. No debe producir deterioros en el
material ni en la piel del limpiador.
Si algn material ha sido utilizado con
vaselina o con parafina debe limpiarse por
separado, con el fin de evitar que se extienda la
pelcula de grasa.
Este es el mtodo general, pero existen
algunas excepciones:
Pipetas: Tanto PASTEUR como graduadas,
despus de la esterilizacin, se recogen en
recipientes provistos de solucin de formol
al 1 por mil en las que permanecern
durante 24 horas. Despus se saca,
mediante un alambre, el trozo de algodn
que actu como filtro, para posteriormente
ser lavadas.
Portas, tubos de ensayo y placas de
PETRI: Despus de la esterilizacin se
sumergen durante 24 horas en mezcla
sulfocrmica, para lavar posteriormente
con agua jabonosa, enjuagar y secar al
aire, excepto los porta que se deben secar
con un pao limpio que no deje hilazas en
su superficie.
Cualquier material en contacto con
colorantes: Antes de su lavado debe
sumergirse en mezcla sulfocrmica.

ALGUNOS AGENTES MICROBICIDAS Y
MICROBIOSTTICOS.

Sin ser exhaustivos podemos clasificarlos
en funcin de su accin:
1. Destruccin.
Calor (horno, llama).
Agentes qumicos.
Radiaciones.
Agentes mecnicos como los
ultrasonidos.
2. Separacin.
Filtracin.
Ultracentrifugacin.
3. Inhibicin.
Bajas temperaturas.
Desecacin.
Liofilizacin.
Presin osmtica elevada.
Productos qumicos.

FACTORES QUE AFECTAN A LA
ESTERILIZACIN Y DESINFECCIN.

1. Hidratacin: La temperatura de coagulacin
de protenas est claramente influida por su
estado de hidratacin. Esta afirmacin es
vlida para la coagulacin por calor y para
algunos agentes qumicos. Es posible que la
resistencia de las endosporas al calor se deba a
su estado prcticamente deshidratado.
2. Tiempo: Ningn agente es instantneo, debe
contactar fsicamente con el microorganismo
un tiempo suficiente para provocar alteraciones
fsicas o reacciones qumicas, segn su
mecanismo de accin.
3. Tasa de accin: En las mimas condiciones no
todas los microorganismos, ni incluso
diferentes generaciones de un mismo
microorganismo, presentan frente a un agente
la misma vulnerabilidad ni la misma tasa de
mortandad.
4. Temperatura: Con respecto a la accin
microbiana del calor, la temperatura necesaria
suele estar en funcin inversa del tiempo de
accin, una vez superada una temperatura
mnima. Con respecto a los agentes qumicos,
suelen ser ms activos en caliente, como es
normal en cualquier reaccin qumica.
5. Concentracin: Dentro de unos lmites, al
aumentar la concentracin aumenta la
efectividad, no linealmente sino
exponencialmente, para a partir de un punto
conseguir incrementos insignificantes.
6. Efecto pH: Como regla general, cualquier
alejamiento del pH fisiolgico tiende a
aumentar el efecto letal de cualquier agente
fsico, u otro agente qumico distinto a los
cidos y los lcalis.
7. Presin osmtica: Los lquidos con elevada
presin osmtica como almbares y salmueras
deshidratan los contenidos celulares de los
microorganismos aumentando la resistencia si
son capaces de vivir en un medio con tan baja
actividad de agua.
8. Tensin superficial: Los tensoactivos pueden
incrementar la efectividad de los desinfectantes
al aumentar la humedad en las superficies
celulares. En otros casos, la disminucin de la
tensin superficial puede aumentar la
concentracin superficial del agente qumico.


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ESTERILIZACIN POR MEDIO DE
CALOR SECO.

Si bien en presencia de humedad el calor
resulta ms efectivo, sin embargo, a veces puede
ser til el empleo de calor seco, mediante:
1. Flameado al rojo: Generalmente con
mechero tipo BUNSEN o MECKER. Se emplea
para esterilizar alambres, asas e instrumentos
metlicos resistentes al fuego y utilizados para
sembrar. Si han estado en contacto con
cultivos de patgenos pueden utilizarse
quemadores especialmente diseados para
evitar las salpicaduras.
2. Flameado sin rojo: Se utiliza para materiales
que no pueden llevarse al rojo vivo, a los que
previamente se les ha sumergido en etanol,
como el caso de escalpelos y esptulas. El
mtodo no garantiza una esterilizacin
completa.
3. Horno de aire caliente: Tambin denominado
horno PASTEUR, que puede ser elctrico o de
gas y est controlado termostticamente. Se
emplea generalmente para material de vidrio
previamente seco, como tubos de ensayo,
placas Petri, matraces, pipetas, etc. Tambin se
suele utilizar para esterilizar materiales secos
que se encuentran en envases cerrado
hermticamente. Generalmente se utiliza a 160
C durante al menos dos horas.
4. Esterilizador de sal o perlas de vidrio: Los
instrumentos se introducen en un recipiente
que contiene perlas de vidrio o sal a una
temperatura de 218 C. Mantenidos as durante
10 segundos resulta un medio til para
esterilizar materiales de forma rpida cuando
se van a usar continuamente.

ESTERILIZACIN POR MEDIO DE
CALOR HMEDO.

1. Bao de agua hirviendo: Para eliminar las
bacterias no formadoras de esporas es
suficiente la ebullicin en un bao de agua
durante 5-10 minutos, pero teniendo en cuenta
que las esporas pueden sobrevivir a este
tratamiento. No obstante este mtodo resulta
prctico cuando no existe otro o no se requiere
una esterilizacin completa. Se debe utilizar
agua destilada, especialmente en zonas de
aguas duras, para evitar la formacin de cal
sobre los aparatos.
2. Esterilizador KOCH de vapor: Es un
generador de vapor a presin atmosfrica, y,
por tanto, de temperatura prxima a los 100
C, que se utiliza para aquellos medios que no
resisten temperaturas ms altas, como
azcares, gelatinas y leche. El vapor fluente se
puede utilizar o bien mediante una sola
exposicin durante 90 minutos, o bien por
tindalizacin o calentamiento intermitente
durante tres das consecutivos durante 30
minutos. Con este segundo mtodo, la primera
exposicin destruye la vida vegetativa, y entre
ambos tratamientos, germinan las esporas que
son destruidas posteriormente.
3. El autoclave: Es el mtodo ms eficaz para
esterilizar medios de cultivo y materiales
resistentes a elevadas temperaturas. Tambin
se utiliza para esterilizar el material de vidrio e
instrumentos, para la esterilizacin de cultivos
y material contaminado antes de su lavado y
para la esterilizacin del material desechable
antes de llevarlo al vertedero. La temperatura
del interior del autoclave, depende de la
presin de vapor.
La esterilizacin en autoclave se
consigue manteniendo el material a una
temperatura de 121 C durante 15-30 minutos
en vapor puro saturado a 1,054 kg/cm
2
sobre la
presin atmosfrica (103,4 kN/m
2
).
El periodo de tiempo necesario, a la
temperatura deseada, depende de una serie de
factores, entre los que se encuentran:
Carga microbiana del material a esterilizar.
Naturaleza de los contaminantes.
Tamao de los envases y espesores de
pared.
Naturaleza del contenido de los envases.
Es importante comprobar que el
autoclave quede sin aire, ya que este no permite
alcanzar la temperatura deseada ni la
homogeneizacin de la misma.

4. El coagulador: Sistema utilizado para la
preparacin de medios tales como el suero de
LOEFFLER. El medio se distribuye en tubos
colocados en posicin inclinada en sus
soportes y la temperatura se va aumentando
hasta alcanzar los 85 C mantenindose as

PRESIN MANOMTRICA TEMPERATURA

kg/cm
2
kN/m
2
C

0 0 100

0,351 34,5 109

0,703 68,9 115

1,054 103,4 121

1,406 137,9 126

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durante dos horas, lo que hace que el medio se
solidifique totalmente. Cuando no es necesaria
la coagulacin del material se pueden utilizar
temperaturas ms bajas (de unos 56 C) pero
repitiendo el proceso durante al menos tres
das sucesivos.

ESTERILIZACIN POR FILTRACIN.

Este mtodo se emplea para esterilizar
aquellos lquidos y soluciones que resultaran
alterados por el calor. Estos componentes pueden
posteriormente ser aadidos por procedimientos
aspticos a otros materiales que hayan sido
esterilizados por calor. Tambin se emplea este
mtodo cuando se necesita una fuente de aire
estril como en los fermentadores, aunque resulte
difcil la entrada de bacterias.
1. Bujas de loza: Se encuentran entre los
primeros filtros utilizados pero ya en desuso.
2. Filtros de asbesto: Consisten en una matriz de
material ordenado al azar y con una amplia
gama de tamaos de poro por lo que no
garantiza totalmente la eliminacin de todas
las bacterias. Cuanta mayor presin se utilice
en el proceso de filtracin, mayor avance de
las bacterias en el filtro, pudiendo llegar a
pasar a travs del mismo.
3. Filtros de membrana: Se fabrican
generalmente con acetato de celulosa de
elevada porosidad y se pueden adquirir con
una gran variedad de dimetro de poro. La
retencin del material es por tamao lo que
asegura la esterilizacin. La filtracin se puede
llevar a cabo bien por presin positiva, como
por presin negativa (succin).
Las soluciones de carbohidratos,
alcoholes, etc., se filtran con bastante rapidez a
travs de un filtro de grado esterilizador colocando
preferiblemente un prefiltro de fibra de vidrio. Para
filtrar rpidamente aquellos medios que contengan
protenas resulta conveniente utilizar 2 filtros de
membrana despus del prefiltro, siendo el primero
de grado menos fino. Resulta conveniente si se va
a utilizar ms de un filtro de membrana el
separarlos mediante una red de Terylene.

ESTERILIZACIN POR RADIACIONES.

Cuando el material a esterilizar es
sensible al calor, o cuando es necesario esterilizar
una gran cantidad de material a la vez, se utilizan
las denominadas tcnicas de esterilizacin en fro,
cuyo prototipo es la esterilizacin mediante
radiacin ultravioleta o utilizacin de radiaciones
ionizantes (radioesterilizacin).
1. Radiaccin U.V.: La mayor accin
bactericida se obtiene con longitudes de
onda de 2500 a 2800 AMSTRONGS. Este
tipo de desinfeccin debe limitarse a las
superficies y aire.
2. Radioesterilizacin: Se trata en general,
de grandes instalaciones en las que una
fuente de cobalto 60 emite radiaciones de
hasta 500.000 curios con un gran poder de
penetracin que esteriliza todo el material.
Este va individualmente o en pequeos
lotes introducidos en envases de plstico,
donde mantiene su esterilidad durante
meses o hasta su apertura.

DESINFECTANTES QUMICOS.

Estos productos se utilizan generalmente
para la desinfeccin de la piel, los suelos, los
edificios y para aquellos objetos no resistentes al
calor. En el laboratorio las pipetas y portaobjetos
que contengan bacterias vivas, una vez usados,
deben sumergirse en recipientes con el
desinfectante qumico adecuado. Cualquier cultivo
derramado, deber cubrirse de desinfectante antes
de ser recogido. Para estos fines resulta til el uso
de yodforos y soluciones de hipoclorito (lejas).
Para ciertos fines, se pueden utilizar
antispticos voltiles como el cloroformo y el
tolueno para evitar el crecimiento bacteriano en
soluciones nutritivas de las que son fcilmente

Si se somete un cultivo microbiano a
tratamientos de calor cada vez ms largos, se producir
una reduccin gradual de la poblacin viable. El tiempo
necesario para destruir la totalidad de la poblacin a
una temperatura dada ser ms largo todo lo mayor
que sea el nmero de bacterias que se encuentren
presentes al principio.
Al representar grficamente el logaritmo de
las cifras de supervivientes en relacin con el tiempo, se
obtiene una curva que tiende hacia la lnea recta. El
recproco de la pendiente de esa lnea recta es el valor
D, que se define como el tiempo que se emplea a una
temperatura dada para que se produzca una reduccin
del 90 % en la poblacin microbiana.
El valor D ser ms bajo cuanto ms alta sea
la temperatura. Si representamos grficamente frente
a la temperatura los logaritmos de los valores de D
obtenidos a diferentes temperaturas y se traza la lnea
recta ms probable entre los puntos, el recproco de la
pendiente de esta lnea recta es el valor z, que se define
como el nmero de grados que debe aumentarse ( o
disminuirse) la temperatura para que se produzca una
reduccin del 90 % (o aumento del 10 %) del valor D.

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eliminables con calor moderado.
Por su gran uso merece la pena destacar:
1. xido de etileno: Se emplea en cmaras de
acero inoxidable y mezclado con fren o
dixido de carbono (CARBOXIDE), pues con
el aire su mezcla es explosiva. Esteriliza el
material que se somete a una concentracin de
1,2 g/L durante 3-8 horas a una temperatura de
20-24 C y una presin de 1-2 atm. No debe
permitirse residuo alguno en los alimentos
tratados con ste producto.
2. Glutaraldehido: se utiliza en soluciones al 2
% amortiguada con sales sdicas del cido
fnico y a un pH de 7,4. El material a
esterilizar, generalmente caucho o plstico, se
sumerge en la solucin durante un tiempo que
vara entre los 15 minutos y las 3 horas, si bien
son necesarias 10 horas para destruir las
esporas.
3. Formol: Utilizado en forma de vapor 10
mL/m
3
y en cmaras especiales provoca una
esterilizacin completa. El formaldehdo en
disolucin al 8% slo o mejor an con un 65-
70 % de alcohol isoproplico mata rpidamente
a las bacterias, si bien son necesarias 24 horas
de exposicin para la destruccin de las
esporas bacterianas o fngicas.
4. Ozono: El ozono (0
3
) se ha utilizado en el
control de microorganismos en los alimentos y
la desinfeccin del agua. Es muy txico para el
ser humano y su efectividad se reduce a
temperatura y humedad relativamente altas. Su
uso se limita a la esterilizacin superficial ya
que no tiene accin permanente.
5. Fenol y derivados: Utilizado para la
desinfeccin de sanitarios y cuartos de vestir.
El difenilfenol se usa para impregnar las
envolturas de frutas ctricas y evitar el
crecimiento de hongos. El pentaclorofenol se
usa extensamente en la preservacin de la
madera como agente fungicida en pinturas. La
hidroxiquinolina cprica se utiliza en pinturas
como agente funguicida, pues aunque es
soluble en agua y tiene alta toxicidad para el
ser humano es muy econmica.
6. Cloro e hipocloritos: Estos compuestos, si se
utilizan debidamente, pueden considerarse
entre los mejores para los establecimientos
pudiendo obtenerse soluciones concentradas de
hipoclorito de sodio lquido que contiene de
100 a 130 gramos de cloro por litro , o
mezclarse con detergentes en forma de
cristales clorados. Estos desinfectantes tienen
un efecto rpido sobre una gran variedad de
microorganismos y son relativamente baratos.
Son los ms apropiados para la desinfeccin
general de las plantas de productos
alimenticios. Deben usarse en concentraciones
de 100 a 250 miligramos de cloro disponible
por litro. Como est grupo de desinfectantes
corroe los metales y produce, adems, efectos
decolorantes, es necesario enjuagar lo antes
posible las superficies desinfectadas con
dichos productos, despus de un tiempo
suficiente de contacto. Los desinfectantes
clorados con excepcin del bixido de cloro
pierden su eficacia ante la presencia de
residuos orgnicos.
7. Yodforos: Estos compuestos siempre se
mezclan con un detergente en un medio cido,
por lo que son muy convenientes en los casos
en que se necesite un limpiador cido. Su
efecto es rpido y tienen una amplia gama de
actividad antimicrobiana. Para superficies
limpias, normalmente, se necesita una solucin
de unos 25 a 50 miligramos por litro de yodo
disponible a pH 4. Pierden su eficacia con
material orgnico. Es posible observar
visualmente la eficacia de los yodforos ya
que pierden el color cuando el yodo residual ha
bajado a niveles ineficaces. Los yodforos no
son txicos cuando se emplean en
concentraciones normales pero pueden
incrementar el contenido total de yodo de la
dieta. Apenas tienen sabor u olor pero
mezclndose con determinadas sustancias en
los alimentos pueden causar envenenamiento.
Los yodforos pueden tener una accin
corrosiva en los metales dependiendo de la
frmula del compuesto y la naturaleza de la
superficie a la que se apliquen. Por estas
razones debe tenerse especial cuidado en
eliminarlos enjuagando las superficies despus
de utilizarlos.
8. Compuestos de amonio cuaternario: Estos
compuestos presentan tambin buenas
caractersticas detergentes. Son incoloros,
relativamente no corrosivos de los metales y
no son txicos, pero pueden tener un sabor
amargo. No son tan eficaces contra las
bacterias gram-negativas como el cloro y los
desinfectantes a base de cloro y yodo. Las
soluciones tienden a adherirse a las superficies,
por lo que es necesario enjuagarlas a fondo.
Debe utilizarse en concentraciones de entre
200-1200 miligramos por litro (mg/L). Se
requieren concentraciones ms altas cuando se
emplean con aguas duras. No son compatibles
con jabones o detergentes aninicos.
9. Anfteros tensioactivos: Este tipo de
desinfectantes consta de un agente activo con
propiedades detergentes y bactericidas. Son
productos de baja toxicidad, relativamente no
corrosivos, inspidos e inodoros y son

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eficientes cuando se usan acordes con las
recomendaciones del fabricante. Pierden su
eficacia con material orgnico.
10. cidos y lcalis fuertes: Adems de sus
propiedades detergentes, los cidos y lcalis
fuertes tienen considerable actividad
antimicrobiana. Debe tenerse especial cuidado
de que no contaminen los alimentos. Despus
de un tiempo de contacto adecuado, todas las
superficies que han sido desinfectadas debern
someterse a un enjuague final con agua.
11. Metales pesados: Actan sobre los grupos SH,
originando un puente y envenenando al
enzima. Los ms empleados son:
El cobre en forma de sulfato cprico acta
como fungicida y algicida. Se emplea para
depurar agua de piscina y enfermedades
fungicidas en las plantas.
El mercurio es un buen bactericida pero
txico, por ello se usa en concentraciones
bajas (1%). Se usa como antisptico
cutneo como el mercurocromo y el
mertiolato.
La plata en forma de nitrato de plata fue
utilizado antiguamente como antisptico
de la conjuntiva ocular para prevenir la
oftalmia en el recin nacido.

PRUEBAS DE ESTERILIDAD DE LOS
EQUIPOS DEL LABORATORIO.

Cuando surge contaminacin de fuente
desconocida es necesario controlar los procesos de
esterilizacin que deben ser lgicamente aspticos
para evitar resultados positivos falsos.
1. Medios: Una vez esterilizados se incuban a la
temperatura de uso durante 48 horas
dejndolos despus a temperatura ambiente
durante otras 48 horas antes de su utilizacin.
Si no se observa crecimiento bacteriano, se
deduce una buena esterilizacin.
2. Pipetas: Se enjuagan dos pipetas en un tubo
que contenga caldo nutritivo estril aspirando
y soplando el caldo unas 10 veces. Se desechan
las pipetas y el caldo se cultiva a 30 C durante
48 horas. Las pipetas estn estriles si no hay
crecimiento en el caldo.
3. Placas de Petri: Se llenan con 10 mL de agar
estril y fundido a 45 C, para incubarlas a 30
C durante 48 horas. Si no se observa
crecimiento se infiere que estaban bien
esterilizadas.
4. Lquidos de lavado: Como soluciones RINGER
a un cuarto y otras. Se ponen 2 mL de lquido
de lavado en una placa aadiendo 10 mL de
agar fundido a 45 C mezclando y dejando
solidificar. Se incuba posteriormente a 30 C
durante 48 horas. Si no se observa crecimiento
bacteriano los lquidos estaban debidamente
esterilizados.

DESINFECCION CON SUSTANCIAS QUIMICAS

Los factores que se indican a continuacin
afectan la eficacia de los desinfectantes:

INACTIVACION DEBIDA A LA SUCIEDAD. La
presencia de suciedad y otros materiales sedimentados
reducen la eficacia de todos los desinfectantes qumicos.
Cuando hay mucha suciedad, los desinfectantes no
surten ningn efecto. Por lo tanto, la desinfeccin con
sustancias qumicas deber efectuarse despus de un
proceso de limpieza o en combinacin con el mismo.

TEMPERATURA DE LA SOLUCION. En general,
cuanto ms alta sea la temperatura ms eficaz ser la
desinfeccin. Es preferible usar, por lo tanto, una
solucin desinfectante tibia o caliente, que una fra. Por
lo que habr que seguir las instrucciones del fabricante,
ya que por ejemplo a temperaturas superiores de 43 C
los yodforos liberan yodo que puede manchar los
materiales, y la accin corrosiva del cloro aumenta
cuando se usan soluciones calientes de hipoclorito.

TIEMPO. Todos los desinfectantes qumicos necesitan
un tiempo mnimo de contacto para que sean eficaces.
Este tipo de contacto mnimo puede variar de acuerdo
con la actividad del desinfectante.

CONCENTRACION. La concentracin de la solucin
de desinfectante necesaria, variar de acuerdo con las
condiciones de uso, y, adems deber ser adecuada para
la finalidad a la que se destina y el medio ambiente en
que haya de emplearse. Las soluciones debern
prepararse, por lo tanto, siguiendo estrictamente las
instrucciones del fabricante.

ESTABILIDAD. Todas las soluciones desinfectantes
debern ser de preparacin reciente, en las que se
hayan utilizado utensilios limpios. El mantenimiento
prolongado de soluciones diluidas listas para ser usadas
puede reducir su eficacia o convertiste, tal vez, en un
depsito de organismos resistentes. Los desinfectantes
pueden desactivarse si se mezclan con detergentes y
otros desinfectantes no adecuados. Es necesario
verificar peridicamente la eficacia de los
desinfectantes, especialmente cuando se han disuelto
para usarlos. Existen para tal fin equipos de ensayo
baratos y de fcil uso.

PRECAUCIONES. Los desinfectantes qumicos que
pueden envenenar los alimentos, as los fenlicos, no
deben usarse en las fbricas de elaboracin de
alimentos ni en vehculos para su transporte. Deber
tenerse cuidado de que los desinfectantes qumicos no
daen al personal, y de que cuando se usan en lugares
donde se guardan o transportan animales, tales como
establos y vehculos, no les produzcan daos ni
molestias.

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5. Frascos de muestras, tubos de ensayo y
otros recipientes: Se llenan con 10 25 mL
de lquido de lavado y se agita unas 10 veces.
Con 2 mL del lquido usado se sigue el
procedimiento del punto anterior.
Es obvio que los procedimientos
descritos, slo son vlidos para determinar la
ausencia de los microorganismos capaces de
desarrollarse en las condiciones utilizadas.
De cualquier forma toda esterilizacin,
requiere como medida de seguridad uno o ms
controles. Los mtodos utilizables son:
Fsicos: Como el registro grfico de la
temperatura, presin, humedad, concentracin
o radiacin recibida.
Qumicos: Como el uso de indicadores
colorimtricos que pueden virar el color a
determinadas temperaturas.
Biolgicos: Tambin denominados
bioindicadores, que utilizan esporas
bacterianas de Bacillus subtilis (para calor seco
y xido de etileno) y Bacillus
stearothermophilus (para autoclave).
Los sistemas de esterilizacin deben
comprobarse al menos dos veces al ao por
coesterilizacin, de al menos tres paquetes, de
esporas repartidas de forma homognea en el
aparato lleno de material a esterilizar.

EVALUACIN DE DESINFECTANTES.

El desinfectante ideal debera cumplir los
siguientes requisitos:
1. Muy efectivo contra una amplia variedad de
microorganismos.
2. Efectivo en concentraciones tan bajas que
permita su uso de forma econmica.
3. No txico para plantas o animales.
4. Que no manche y no sea ofensivo al olfato y al
gusto.
5. Buen reductor de la tensin superficial.
6. Almacenable de forma estable.
7. Fcilmente disponible y barato.
8. De fcil aplicacin.
9. Rpido.
10. Que no de un estado de microbiostsis que
proporcione un falso sentido de seguridad.
Ningn desinfectante posee todas las
propiedades, por lo que generalmente se mide su
actividad mediante diversas pruebas:
a) Prueba de RIDEAL-WALKER: Se compara la
actividad del desinfectante con el fenol que se
toma como patrn. El resultado obtenido se
conoce como coeficiente fenlico. No obstante
slo es vlido para compuestos qumicos
similares al fenol y no para otros
desinfectantes como los hipocloritos y las sales
de amonio cuaternarias.
b) Prueba de la suspensin: Tambin conocido
como mtodo de la curva de supervivencia y
consiste en aadir un nmero dado de bacterias
en suspensin a una solucin desinfectante, de
concentracin adecuada, para determinar el
nmero de bacterias supervivientes despus de
ciertos intervalos de tiempo. Una ventaja es
que las concentraciones y los tiempos a usar
pueden ser similares a los que se utilicen de
forma prctica.
c) Prueba de la capacidad: Permite obtener
datos en relacin a la capacidad que tiene una
dilucin de uso de un desinfectante para
permanecer en contacto con bacterias y
materias orgnicas sin que su actividad
desinfectante se vea disminuida. Este mtodo
es til para realizar ensayos con diferentes
desinfectantes, o mezclas de desinfectantes y
detergentes, a utilizar en los depsitos de
material usado, o para determinar el tiempo de
su renovacin.

ANTIMICROBIANOS.

Los agentes antimicrobianos son
sustancias qumicas sintetizadas parcial o
totalmente en laboratorio que son capaces de
inhibir el crecimiento y/o destruir
microorganismos. Los antibiticos son
sustancias qumicas sintetizadas por
microorganismos que poseen accin
antimicrobiana.
Desde el punto de vista prctico existen
distintos tipos de antimicrobianos:
Desinfectantes: slo se aplican a sistemas
inanimados y eliminan la carga microbiana
total.
Sanitizantes: slo se aplican a sistemas
inanimados y disminuyen la carga microbiana
total.
Antispticos: reducen y controlan la presencia
de microorganismos potencialmente
patgenos, slo se pueden aplicar
externamente en seres vivos (piel y/o
mucosas).
Antimicrobianos de uso sistmico: reducen y
controlan la presencia de microorganismos que
han invadido los tejidos. Actan en el
organismo, pudiendo ser ingeridos (va oral),
absorbidos por piel (apsitos) y/o inyectados.
Los agentes antimicrobianos de uso
sistmico se pueden clasificar segn su origen,
efecto antimicrobiano, espectro de actividad y
mecanismo de accin.

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Origen:
1. Naturales: se obtienen a partir de
microorganismos (hongos, Bacterias, etc.).
2. Sintticos: se obtienen totalmente por sntesis
qumica.
3. Semisintticos: se obtienen por modificaciones
qumicas de antimicrobianos naturales, con el
fin de mejorarlos.
Efecto:
1. Bacteriosttico: la mxima concentracin no
txica que se alcanza en suero y tejidos impide
el desarrollo y multiplicacin de los
microorganismos, sin destruirlos, pudiendo
stos multiplicarse nuevamente al desaparecer
el agente antimicrobiano. Sirven para
complementar los mecanismos defensivos del
husped.
2. Bactericida: su accin es letal sobre los
microorganismos, por lo que stos pierden
irreversiblemente su viabilidad o son lisados.
Espectro de actividad:
1. Amplio: actan sobre un gran nmero de
especies microbianas (ej. TETRACICLINA).
2. Intermedio: actan sobre un nmero limitado
de microorganismos (ej. MACROLIDOS).
3. Reducido: actan sobre un pequeo nmero de
especies microbianas (ej. POLIMIXINA).
Mecanismo de accin:
1. Inhibicin de la sntesis de la pared celular.
2. Alteracin de la permeabilidad celular.
3. Inhibicin de la sntesis proteica.
4. Inhibicin de la sntesis de DNA y RNA.
Los antimicrobianos de uso sistmico
deben reunir las siguientes caractersticas:
Deben ser ms bactericidas que
bacterioestticos.
Deben mantenerse activos en presencia de
plasma y lquidos corporales.
Es deseable que sean efectivos frente a un
amplio espectro de microorganismos.
Los microorganismos susceptibles no se deben
volver resistentes gentica o fenotpicamente.
No deben ser txicos y los efectos colaterales
adversos tienen que ser mnimos para el
husped.
La concentracin activa frente a los
microorganismos se debe alcanzar con rapidez
y debe mantenerse durante un tiempo
prolongado.
Deben ser hidro y liposolubles.

ANTIBIOTICOS.

En el uso comn, un antibitico (del
griego - anti, "en contra" + - biotikos,
"dado a la vida") es un medicamento que mata o
impide el crecimiento de ciertas clases de bacterias
a bajas concentraciones, y que por su efecto, se
indica en medicina humana y animal para tratar
una infeccin por estos microorganismos.
Normalmente un antibitico es un agente
inofensivo para el husped, aunque ocasionalmente
puede producirse una reaccin adversa al
medicamento o puede afectar a la flora bacteriana
normal del organismo.
En trminos estrictos, un antibitico es
una sustancia secretada por un microorganismo,
que tiene la capacidad de afectar a otros
microorganismos. La mayora de los antibiticos y
antimicrobianos no son efectivos en las
enfermedades vricas.
Existen diversas clases de antibiticos y
antibacterianos sintticos de uso comn hoy en da.
Son:
Aminoglucsidos
Beta-lactmicos
o Carbapenems
o Cefalosporinas y cefamicinas
o Beta-lactmicos monocclicos o
monobactmicos
o Penicilinas
Estreptograminas
Fenicoles
Glicopptidos o glucopptidos
o Vancomicina
o Teicoplanina
Lincosamidas
Macrlidos
Oxazolidinonas
Polimixinas
Quinolonas
Sulfamidas
Tetraciclinas
Antibiticos que no pertenecen a las clases
mencionadas anteriormente:
o cido fusdico
o Bacitracina
o Espectinomicina
o Fosfomicina
o Mupirocina
o Trimetoprima
Actualmente se tiende a abusar de los
antibioticos. Las formas usuales de abuso de los
antibiticos incluyen la toma de antibiticos para
una enfermedad no infecciosa o infeccin no
bacteriana(fiebre), en particular el uso de
antibiticos para las infecciones vricas, como un
catarro o una gripe; y la administracin incompleta
del antibitico, generalmente debido a que el
paciente se siente mejor una vez que la infeccin
comienza a ceder.
En algunas ocasiones, los antibiticos

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son recetados innecesariamente por los propios
mdicos, a veces por presin del paciente y otras
veces, incluso, sin que el paciente lo solicite.
Existe un debate sobre la conveniencia de
incluir los antibiticos en la dieta de los animales
de granja sanos. Los opositores de esta prctica
indican que conduce a la resistencia a los
antibiticos, incluyendo a las bacterias que
infectan a los humanos. La prctica contina en
muchos lugares, no obstante, debido a que los
antibiticos en la alimentacin del ganado
proporcionan un aumento de peso y porque tiene
sentido econmico. El abuso de este medicamento
puede daar al paciente.

RESISTENCIA BACTERIANA.

La resistencia antibitica es la capacidad
de un microorganismo para resistir los efectos de
un antibitico. La resistencia se produce
naturalmente por seleccin natural a travs de
mutaciones producidas por azar, pero tambin
puede inducirse artificialmente mediante la
aplicacin de una presin selectiva a una
poblacin. Una vez que se genera la informacin
gntica, las bacterias pueden trasmitirse los nuevos
genes a travs de trasferencia horizontal (entre
individuos) por intercambio de plsmidos.
Si una bacteria porta varios genes de
resistencia, se le denomina multirresistente o,
informalmente, superbacteria.
La resistencia antibitica es una
consecuencia de la evolucin va la seleccin
natural. La accin antibitica es una presin
ambiental: aquellas bacterias que tengan una
mutacin que les permita sobrevivir se
reproducirn. Ellas pasarn este rasgo a su
descendencia, que ser una generacin totalmente
resistente.
Varios estudios han demostrado que
ciertos patrones de uso de los antibiticos afectan
en gran medida al nmero de organismos
resistentes que se desarrollan. El uso excesivo de
antibiticos de amplio espectro, tales como las
cefalosporinas de segunda y tercera generacin,
acelera en gran medida el desarrollo de resistencia
a la meticilina. Otros factores que contribuyen a la
resistencia incluyen los diagnsticos incorrectos,
prescripciones innecesarias, uso incorrecto de
antibiticos por parte de los pacientes y el uso de
los antibiticos como aditivos en la alimentacin
del ganado para aumentar el engorde.
Los cuatro principales mecanismos por
los cuales los microorganismos adquieren
resistencia a los antibiticos son:
1. Inactivacin o modificacin de los
medicamentos. Por ejemplo, la desactivacin
enzimtica de la penicilina G en algunas
bacterias resistentes a la penicilina mediante la
produccin de beta-lactamasas.
2. Alteracin del punto de accin. Por ejemplo,
la alteracin de la protena del punto de enlace
de la penicilina en las bacterias MRSA y otras
resistentes a la penicilina.
3. Alteracin de la ruta metablica. Por
ejemplo, algunas bacterias resistentes a la
sulfonamida no precisan cido para-
aminobenzoico (PABA), un precursor
importante para la sntesis de cido flico y de
cidos nucleicos en las bacterias inhibidas por
sulfonamidas. En lugar de ello, como las
clulas de los mamferos, utilizan cido flico
pre-elaborado.
4. Reduccin de la acumulacin del
medicamento. Decrementando la
permeabilidad al medicamento de la membrana
y/o incrementando el bombeo al exterior del
medicamento a travs de la superficie de la
clula.

PATGENOS RESISTENTES.

Staphylococcus aureus es uno de los
principales patgenos resistentes a los antibiticos.
Se encuentra en las mucosas y en la piel de
aproximadamente la mitad de la poblacin y es
extremadamente adaptable a la presin antibitica.
Fue la primera bacteria en la que se descubri la
resistencia a la penicilina en 1947, solo cuatro aos
despus de que comenzase su produccin en masa.
La meticilina era entonces el antibitico
alternativo, pero desde entonces ha sido
reemplazado por la oxacilina debido a su
importante toxicidad renal. El primer MRSA
(Staphylococcus aureus resistente a la meticilina)
fue inicialmente detectado en Inglaterra en 1961 y
es ahora bastante comn en los hospitales. MRSA
fue responsable del 37% de los casos locales de
sepsis en Inglaterra en 1999, y en EE.UU. son
resistentes a penicilina, meticilina, tetraciclina y
eritromicina.
Enterococcus faecium es otra bacteria
resistente a los antibiticos presente en los
hospitales. Cepas resistentes a la penicilina fueron
identificadas en 1983, resistentes a la vancomicina
(VRE) en 1987 y resistentes a la linezolida (LRE)
a finales de la dcada de 1990.
Streptococcus pyogenes (Streptococcus
del Grupo A: GAS) causa infecciones que pueden
tratarse usualmente con una gran variedad de
antibiticos. Pero incluso la mejor atencin mdica
no impide la enfermedad invasiva y la muerte en
todos los casos. Para aquellos enfermos muy
graves, puede ser necesario el apoyo de una unidad

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de cuidados intensivos. Para personas con fascitis
necrotizante se precisa a menudo ciruja para
eliminar los tejidos daados.4 Se han descubierto
cepas de S. pyogenes resistentes a los antibiticos
macrlidos; sin embargo, todas las cepas continan
siendo uniformemente sensibles a la penicilina.
La resistencia de Streptococcus
pneumoniae a la penicilina y a otros beta-lactamos
se est incrementando en todo el mundo. El
principal mecanismo de resistencia envuelve la
introduccin de mutaciones en los genes que
codifican las protenas de enlace de la penicilina.
La presin selectiva juega un papel importante y el
uso de antibiticos beta-lactamos se cita como un
factor de riego para la infeccin y colonizacin.
Streptococcus pneumoniae es responsable de
neumonia, bacteremia, otitis media, meningitis,
sinusitis, peritonitis y artritis.
Proteus puede producir infecciones del
tracto urinario e infecciones adquiridas en
hospitales. Proteus es nica, sin embargo, porque
es altamente mvil y no forma colonias regulares.
En su lugar, Proteus forma lo que se conoce como
"colonias enjambres" cuando se colocan en medios
no inhibidores. El miembro ms importente de este
gnero es Proteus mirabilis, causante de
infecciones urinarias y de las heridas.
Afortunadamente, la mayora de las cepas de
Proteus mirabilis son sensibles a la ampicilina y a
las cefalosporinas. Al contrario, su pariente Proteus
vulgaris, no es sensible a esos antibiticos. Sin
embargo, este organismo es aislado menos
frecuentemente en el laboratorio y usualmente solo
ataca a pacientes inmunodeprimidos.
En 1993, Escherichia coli era resistente
a cinco variantes de las fluoroquinolonas.
Mycobacterium tuberculosis es
comnmente resistente a la isoniazida y
rifampicina y algunas veces universalmente
resistente a todos los tratamientos comunes. Otros
patgenos que presentan alguna resistencia
incluyen a Salmonella, Campylobacter y
Streptococcus.
Pseudomonas aeruginosa es un
relevante patgeno oportunista causante de
infecciones crnicas. Una de las caractersticas
ms preocupantes de P. aeruginosa es que presenta
una baja susceptibilidad antibitica. Esta baja
susceptibilidad es debida a la accin concertada de
un bombeo multidroga al exterior, genes en los
cromosomas que codifican la resistencia antibtica
y la baja permeabilidad de la envoltura celular
bacteriana. Adems de esta resistencia intrnseca,
P. aeruginosa desarrolla fcilmente una resistencia
adquirida por mutaciones en los genes
cromosmicos o por transferencia horizontal de
genes. El agrupamiento de varios genes de
resistencia a los antibiticos en integrones favorece
la adquisicin concertada de los factores
determinates a la resistencia antibitica. Algunos
estudios recientes muestran que los fenotipos de
resistencia asociados a la formacin de
biopelculas o a la aparicin de pequeas variantes
en las colinias puede ser importante para la
respuesta de las poblaciones de P. aeruginosa al
tratamiento antibitico.

VACUNAS.

La vacuna (del latn vaccinus-a-um,
'vacuno'; de vacca-ae, 'vaca') es un preparado de
antgenos que una vez dentro del organismo
provoca una respuesta de ataque, denominada
anticuerpo. Esta respuesta genera memoria
inmunolgica produciendo, en la mayora de los
casos, inmunidad permanente frente a la
enfermedad. La primera vacuna descubierta fue la
usada para combatir la viruela por Edward Jenner
en 1796.
Las vacunas se administran por medio de
una inyeccin, o por va oral (tanto con lquidos
como con pastillas).
Existen varios mtodos de obtencin:
1. Vacunas avirulentas preparadas a partir de
formas no peligrosas del microorganismo
patgeno.
2. Vacunas posificadas a partir de organismos
muertos o inactivos.
3. Antgenos purificados.
4. Vacunas genticas.
Las vacunas se clasifican en dos grandes
grupos:
Vacunas vivas o atenuadas
Vacunas muertas o inactivadas
Hay cuatro tipos tradicionales de
vacunas:
Inactivadas: microorganismos dainos que
han sido tratados con productos qumicos o
calor y han perdido su peligro. Ejemplos de
este tipo son: la gripe, clera, peste bubnica y
la hepatitis A. La mayora de estas vacunas
suelen ser incompletas o de duracin limitada,
por lo que es necesario ms de una toma.
Vivas atenuadas: microorganismos que han
sido cultivados expresamente bajo condiciones
en las cuales pierden sus propiedades nocivas.
Suelen provocar una respuesta inmunolgica
ms duradera, y son las ms usuales en los
adultos. Por ejemplo: la fiebre amarilla,
sarampin o rubeola (tambin llamada
sarampin alemn) y paperas.
Toxoides: son componentes txicos
inactivados procedentes de microorganismos,

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en casos donde esos componentes son los que
de verdad provocan la enfermedad, en lugar
del propio microorganismo. En este grupo se
pueden encontrar el ttanos y la difteria.
Subunitarias: ms que introducir un
microorganismo atenuado o inactivo entero
dentro de un sistema inmune, un fragmento de
este puede crear una respuesta inmunitaria. Un
ejemplo caracterstico es la vacuna subunitaria
contra la hepatitis B, que est compuesta
solamente por la superficie del virus
(superficie formada por protenas).
Hoy da se estn desarrollando y
probando nuevos tipos de vacunas:
Conjugadas: ciertas bacterias tienen capas
externas de polisacridos que son
mnimamente inmunolgicos. Poniendo en
contacto estas capas externas con protenas, el
sistema inmunitario puede ser capaz de
reconocer el polisacrido como si fuera un
antgeno (un antgeno puede ser una protena o
un polisacrido). Este proceso es usado en la
vacuna Haemophilus influenzae del tipo B
(tambin conocido como bacilo de Pfeiffer).
Vector recombinante: combinando la
fisiologa (cuerpo) de un microorganismo dado
y el ADN (contenido) de otro distinto, la
inmunidad puede ser creada contra
enfermedades que tengan complicados
procesos de infeccin.
Vacuna de ADN: vacuna de desarrollo
reciente, es creada a partir del ADN de un
agente infeccioso. Funciona al insertar ADN
de bacterias o virus dentro de clulas humanas
o animales. Algunas clulas del sistema
inmunitario reconocen la protena surgida del
ADN extrao y atacan tanto a la propia
protena como a las clulas afectadas. Dado
que estas clulas viven largo tiempo, si el
agente patgeno (el que crea la infeccin) que
normalmente produce esas protenas es
encontrado tras un periodo largo, sern
atacadas instantneamente por el sistema
inmunitario. Una ventaja de las vacunas ADN
es que son muy fciles de producir y
almacenar. Aunque en 2006 este tipo de
vacuna era an experimental, presenta
resultados esperanzadores.

FUNCIONAMIENTO DEL AUTOCLAVE.

1. Puesta en marcha:
Comprueba que los grifos de desage y de
vapor estn cerrados.
Conecta a la red elctrica.
Abre la tapa del autoclave girando el volante
de cierre hasta levantarla totalmente y,
realizado esto, girar el brazo hacia fuera.
Llena el autoclave con agua destilada hasta el
nivel de la base de la gradilla inferior.
Introduce el material en el interior, bien en
bolsas directamente o en cestos, procurando
que entre el material queden espacios para la
circulacin del vapor.
No tapones los orificios de la parte alta del
interior del depsito.
Ten la precaucin de que al colocar los tubos
en los cestos no sobresalgan para que el cesto
siguiente quede perfectamente colocado sobre
el de abajo.
Cierra la tapa girando el brazo hasta el tope y
aprieta el volante de cierre hacia abajo
cerrando completamente.
Acciona el interruptor.
Asegrate que el terminal posterior de
desage, por el que saldrn las gotas de agua
de condensacin del aire, est colocado en la
rejilla de salida y sta no est obstruida.
Comprueba que la temperatura y el tiempo
estn seleccionados y son los correctos.
La esterilizacin empieza y acaba cuando
suena un zumbador bitonal.
2. Durante la esterilizacin:
Al accionar el interruptor mira que se enciende
el piloto de red, el de calefaccin y el
regulador de temperatura real del autoclave.
Observar el aumento de la temperatura y la
purga automtica del aire hasta encenderse el
piloto de purga total.
La temperatura aumenta hasta llegar a la
seleccionada, generalmente 121 C,
apagndose entonces el piloto de calefaccin e
iluminndose el piloto del temporizador hasta
el tiempo seleccionado, generalmente de 20
minutos.
El temporizador va graduado en horas de 0 a 1
y con divisiones decimales. Para pasar a
minutos debemos tener en cuenta el multiplicar
los decimales por 60.
El temporizador no inicia la cuenta del mismo
hasta que no se alcanza la temperatura
seleccionada.
3. Parada:
Cuando suena el zumbador cierra el
interruptor.
Dejar enfriar el autoclave hasta que la presin
sea 0 y la temperatura sea inferior a 100 C.
NUNCA ABRIR ANTES!.
Abre el autoclave.
Saca los cestos y las bolsas con el material.
Comprueba el nivel de agua del interior.


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GALERA DE IMGENES.

MECHERO
HORNO PASTEUR
ESTERILIZADOR
DE SAL
BAO DE
AGUA
AUTOCLAVES
ESTERILIZADOR
DE RAYOS UV
Anlisis Microbiolgicos Unidad Temtica 6. Muestreo y Preparacin de la Muestra

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MUESTREO.

Como en cualquier anlisis no se analiza
todo el material susceptible de anlisis, sino una
pequea porcin a la que denominamos muestra.
La toma de esta pequea porcin, que debe reunir
una serie de caractersticas peculiares, es lo que
denominamos muestreo.
Es necesario que las muestras
microbiolgicas sean numerosas y representativas
de todo el material a analizar. Tanto el muestreo
como la preparacin de la muestra, es diferente
para cada tipo de anlisis y cada tipo de material a
analizar, es objeto de protocolo y legislacin. Por
tanto, aqu hablaremos slo de generalidades.
En el caso de productos empaquetados,
slo se abrir el paquete en el laboratorio y las
muestras se tomarn aspticamente. Para ello todos
los aparatos usados para el muestreo se habrn
envuelto y esterilizado previamente.
De los lotes que estn en paquetes, latas,
sacos, etc., se examinarn un nmero de unidades
elegidas al azar mediante anlisis por separado.
As, a ttulo de ejemplo, la ICMSF (1974)
discute en detalle los criterios para determinar la
rigurosidad del muestreo necesario para una
combinacin dada de alimento a analizar, tipo de
proceso, mtodo de almacenamiento y clase de
microorganismo que se sospecha.
En general, el mtodo de muestreo va a
depender principalmente del estado de agregacin
del material a analizar.

REQUISITOS DE LAS MUESTRAS.

Las muestras deben reunir una serie de
requisitos:
1. Debern reflejar las condiciones
microbiolgicas del lote.
2. Se recogern aspticamente y se protegern de
la contaminacin exgena.
3. Se mantendrn, o no, en funcin del tipo de
muestra (congeladas, no congeladas,
perecederas).
4. Se debe realizar el anlisis en tiempo no
superior a 12-24 horas desde la toma de
muestra.
5. Debe existir un compromiso entre el nmero
de muestras para preparar y analizar y la
economa del anlisis.

MUESTRAS LQUIDAS.

Lo normal es que sea relativamente fcil
conseguir muestras representativas de lquidos. El
lquido se coloca en un tanque y se somete a un
batido continuo o peridico. O bien, el lquido se
agita concienzudamente arriba y abajo en un
recipiente estril, o incluso en el mismo recipiente
comercial antes de tomar la muestra.
Se pasa una muestra suficiente, por
ejemplo entre 100-500 mL, a un recipiente estril
para ser transportada al laboratorio.
En el laboratorio el lquido se agita
intensamente otra vez antes de pipetear las
cantidades requeridas para el anlisis.

MUESTRAS SLIDAS.

El muestreo de slidos se lleva a cabo,
segn la naturaleza del material con escalpelos
estriles, cucharas o sacabocados, etc.
De una sustancia pulverulenta, como
harina o leche en polvo, puede ser suficiente una
nica muestra pequea, por ejemplo de unos 100 g,
despus de haberla mezclado bien (tcnica de
cuarteo o similar). Sin embargo, si el producto
tiene un volumen muy grande hay que tomar la
muestra de ms de un sitio.
Las muestras grandes se toman de una
forma separada, siendo entonces en el laboratorio
donde se mezclan cuidadosamente cada una de
ellas, antes de tomar de ellas otra muestra menor
para analizarla.
Para las sustancias compactas el muestreo
debe reunir tanto la parte interna como la parte ms
superficial. Las muestras del interior se deben
tomar con cuidado para disminuir la contaminacin
6. Muestreo y Preparacin de la Muestra.
MUESTREO

Poblacin
Lote Muestra
Partida

Aceptar o Rechazar

Conocimiento de
Determinadas caractersticas

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de las partes ms superficiales, generalmente, ms
afectadas por la contaminacin.

MUESTRAS GASEOSAS.

El control peridico y repetitivo de las
condiciones de higiene del aire ambiental desde el
punto de vista microbiolgico es una necesidad
tanto de la industria (generalmente farmacutica y
alimentaria), como de los lugares pblicos
(principalmente socio-sanitarios).
Aunque clsicamente se ha venido
utilizando la exposicin controlada de placas de
PETRI para su posterior incubacin y recuento, este
mtodo adolece de ser meramente cualitativo o,
como mucho, semicuantitativo.
Actualmente existen dispositivos
comerciales, en los cuales el aire a examinar es
aspirado a travs de una superficie perforada con
un caudal preestablecido y un tiempo
predeterminado para ser guiado sobre una placa de
PETRI que contiene el medio especfico para los
microorganismos que nos propongamos investigar,
es decir, para su posterior incubacin y recuento.
Con los datos del flujo y del tiempo,
podemos as determinar el nmero de
microorganismos por volumen unitario, que
llevados a unos ndices de aceptabilidad
predeterminados, nos permitir enjuiciar las
condiciones de higiene microbiolgica del
ambiente controlado.

Donde es flujo, V el volumen y t el
tiempo

MUESTRAS SUPERFICIALES.

Las muestras de las superficies reviste un
inters especial puesto que generalmente son las
partes ms contaminadas de cualquier material.
Aunque existen diferentes mtodos, no son
equivalentes desde el punto de vista cuantitativo y,
a veces, son incapaces de catalogar las muestras en
el mismo orden de acuerdo con su aparente carga
bacteriana.
En cualquier caso, el inculo debe
sembrarse en el medio idneo lo antes posible ya
que es difcil, si no imposible, asegurar que los
microorganismos no van a morir, o no van a
multiplicarse durante el transporte, en medios tan
poco adecuados.
1. Lonchas superficiales: Se hacen lonchas muy
delgadas de la capa superficial a analizar, en el
caso de que sea posible, con la ayuda de un
escalpelo y unas pinzas estriles. Las lonchas
se homogeneizan en un diluyente apropiado a
la dilucin inicial en microbiologa, es decir,
1:10.
2. Aclarados y lavados: Se lava o aclara la
superficie (1 parte en peso) con diluyente
estril (10 partes en peso), considerando
entonces que esta agua de lavado presenta una
dilucin inicial de 10
-1
. Hay que tener presente
que. a veces, los microorganismos
superficiales no son arrastrados por el mero
lavado por lo que, si es posible, se tomarn
muestras, para su trituracin en un stomacher o
aparato similar.
3. Escobillones: Que cuando se requieran
resultados cuantitativos el rea se sealar
mediante una plantilla estril. Se usan
escobillones de algodn en rama o de alginato.
Con los escobillones levemente humedecidos
con solucin RINGER estril diluida al cuarto
(u otro diluyente usual) se frota girando el
escobilln mediante trazos paralelos y
posteriormente perpendiculares a los
anteriores. Para preparar recuentos se le
aaden 10 mL de solucin de RINGER diluida
al cuarto agitando para liberar las bacterias del
escobilln.
4. Cinta adhesiva: Se utilizan cintas
autoadhesivas que cumplan dos requisitos, por
un lado su esterilidad, y por otro la ausencia de
actividad bactericida residual. La etiqueta se
despega separando uno de sus ngulos y
tirando de l, se hace presin sobre la
superficie a analizar y se vuelve a colocar
sobre el papel soporte. De este y ya en el
laboratorio, se vuelve a presionar con ella
sobre el medio de cultivo apropiado, para
finalmente desecharla.
t V =
t V =

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5. Cilindro de agar: Consiste en un medio estril
con agar que se ha solidificado dentro de un
tubo de plstico estril. Para usarlo, se corta
aspticamente uno de sus extremos y la
superficie de agar resultante se presiona sobre
la superficie a investigar. Se corta entonces
una loncha usando un escalpelo estril y se
coloca aspticamente en una placa de Petri con
la superficie sembrada hacia arriba y se incuba.
6. Placas de impresin: Son placas especiales
cuyo depsito interior se llena lo suficiente
como para producir un menisco convexo.
Cuando se solidifican, se puede presionar la
superficie del agar contra la superficie que se
quiere estudiar.
7. Portaobjetos de contacto: Se presiona un
portaobjetos estril contra la muestra de la
superficie a examinar, para posteriormente,
fijarla, teirla y examinarla al microscopio.
Otra posibilidad es utilizar los portas
impresionados para aplicarlos a la superficie
de agar de una placa, transfiriendo as la carga
microbiana para despus de retirar el porta con
pinzas estriles incubar la placa. Aunque
carece de valor cuantitativo es un mtodo
rpido de visualizar la microflora dominante.

MUESTREO DE ANAEROBIOS.

Si se precisa realizar un examen de
bacterias anaerobias es importante que las
muestras, que han de tener de por s poco oxgeno
libre, no sean expuestas a la concentracin normal
de oxgeno como ocurre cuando se toman muestras
pequeas, por lo que la muestra debe ser grande y
tomarse de lugares no accesibles al aire.
Cuando la muestra necesariamente es
pequea, como en el caso de ser tomada por
escobillones, debe de emplearse un medio de
transporte adecuado capaz de mantener las
condiciones reductoras como el medio de
transporte de STUART. Por tanto, el escobilln no
debe ser devuelto a su tubo original sino a un
frasco que contenga dicho medio de transporte.
Los escobillones tambin pueden ser humedecidos,
antes de usarlos, con un medio para clostridios
reforzado.

PROGRAMAS DE LOS PLANES DE
TOMA DE MUESTRAS.

Aunque cada mtodo de anlisis oficial
cuenta con su protocolo de toma de muestras
especfico, de forma general podemos tener 2 casos
usuales:
1. Muestreo para detectar y contar bajas
concentraciones de bacterias.
Cuando se desea saber la concentracin
de bacterias viables en un material y stas se
encuentran por debajo del lmite de sensibilidad de
las tcnicas de recuento de colonias, es posible
echar mano de la tcnica de dilucin en tubos,
empleando diluciones sucesivas y usando, si fuera
necesario, una gran cantidad de inculo (100, 10
1 g).
Otra posibilidad, conocida como un
esquema de muestreo programado, es tomar un
nmero de muestras del mismo volumen y
determinar si alguna contiene la bacteria a estudiar.
Si no se detecta, es posible calcular entonces la
mxima proporcin de unidades de este volumen
que contendr, con una probabilidad dada, al
menos una de las bacterias en cuestin.
Este esquema es de fcil aplicacin,
cuando la sustancia objeto de estudio se distribuye
en unidades discretas, y se presupone que los
microorganismos se distribuyen al azar dentro de
un lote compuesto por unidades de un tamao
dado.
La probabilidad p de al menos 1 unidad
defectuosa tomada entre n unidades, donde d es el
porcentaje defectuoso del lote completo para
valores de n pequeos viene dada por:

y, por tanto

n
d
p
=
100
1 1
) 1 1 ( 100
n
p d =

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2. Uso de planes de toma de muestras
programadas conjuntamente con recuento de
colonias o NMP.
Se recomienda la aplicacin de planes de
tres clases programados, y en lugar de la decisin
si/no, se recurre a la categorizacin de aceptable,
medianamente aceptable y completamente
inaceptable o rechazable, aunque para ciertos
microorganismos se sigue aplicando los planes de
dos clases con la categorizacin de aceptable y
rechazable. Tambin se suelen emplear, sobre
todo para el anlisis de alimentos, los muestreos
basados en las tablas MIL-STD-105E, originarias
del ejrcito U.S., donde el promedio de calidad
viene determinado por el mximo porcentaje de
unidades defectuosas tolerables.

MUESTREO DE ALIMENTOS.

Es el caso ms usual dentro de los
anlisis microbiolgicos.
El anlisis de una poblacin, lote o
partida (conjunto homogneo de unidades de
muestra sometidas a inspeccin), se puede
investigar de dos formas:
1. Exhaustivamente: como se hace en la
investigacin censal de mataderos que
presenta como ventaja la exactitud pero
presenta el inconveniente de que las
pruebas son destructivas y al ser las
partidas numerosas producen unos costos
elevados.
2. Investigacin muestral: tambin
denominado muestreo, donde de una
poblacin se saca un subconjunto, o
muestra, cuyas unidades se valoran y a
partir de esos resultados y mediante una
aproximacin o estimacin estadstica de
la exactitud podemos dar la calidad de la
poblacin. Para que el muestreo sea
vlido, debe cumplir dos requisitos:
Representatividad: lo que implica que
todas las unidades que componen la
poblacin deben ser homogneas, y
las que van a componer la muestra
deben ser tomadas de la misma
forma.
Aleatoriedad: Es decir, que todas las
unidades de la poblacin tienen las
mismas probabilidades de ser elegidas
para componer la muestra. Esto se
verifica mediante la tcnica adecuada:
- Bombo.
- Quinteo
- Tabla de nmeros al azar.
A) DEFINICIONES:
Criterio microbiolgico: Valor o gama de
valores microbiolgicos, establecidos
mediante el empleo de procedimientos
definidos, para determinar la aceptacin o
rechazo del alimento muestreado.
Parmetro microbiolgico: Anlisis
microbiolgicos practicados a cada alimento,
tales como, microorganismos indicadores,
patgenos, toxinas, etc.
Indicador microbiolgico: As se denomina
a los microorganismos no patgenos pero
frecuentemente asociados a stos y utilizados
para reflejar el riesgo de la presencia de
agentes productores de enfermedades.
Severidad del muestreo: El rigor que se
aplica al muestreo. Depende del grado de
riesgo para la salud y condiciones de uso
posterior del alimento. Determina los planes
de muestreo con respecto, al nmero de
unidades de muestra para ser examinadas n, a
la cantidad mxima de unidades defectuosas
que puede contener la muestra c, y al tipo de
plan de dos tres clases.

Por ejemplo, si tomamos 6 unidades de 25 g
cada una y las examinamos, el porcentaje de unidades
positivas del lote total que se detectar con un 95 % de
probabilidad para, al menos, una de las 6 unidades,
viene dado por:
% 3 , 39 )
6
95 , 0 1 1 ( 100 = = d

Es decir, que si todas las unidades fueran
negativas, con p = 0,95, el nmero de bacterias en el lote
sera tal que habra menos de 39,3 % de las unidades de
25 g positivas, es decir, habra menos de 40 bacterias
por cada 2,5 kg de materia.
De forma anloga podemos calcular el
nmero de unidades a examinar para cada
especificacin dada.
As podemos calcular que nmero de bolsas
de 1 g, y que todas resulten negativas, debemos analizar
para asegurar con una probabilidad del 95 % la
ausencia de Salmonella en 25 g.

Por tanto, p=0,95 y d= 1/25= 4%

=
100
1 log 1 log log
d
n p

96 , 0 log 1 log 95 , 0 log n =

n = 18 unidades.

Resumiendo, debemos analizar 18 unidades
de 1 g de material y que todas resulten negativas para
poder afirmar con un 95 % de fiabilidad la ausencia de
Salmonella en 25 g de material.


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Plan de muestreo: Es el procedimiento en
que se estipula el tamao de la muestra n, y el
criterio de aceptacin o rechazo c, de forma
que pueda tomarse una decisin respecto a si
se debe aceptar o rechazar el alimento
inspeccionado basndose en los resultados del
anlisis.
Categora de riesgo: Es la relacin entre el
grado de peligrosidad que representa el
alimento para la salud en relacin con las
condiciones posteriores de manipulacin.

Condiciones normales en las que ser
manipulado y consumido el alimento tras el
muestreo.
Clase
De
peligro
Grado de
peligrosidad
reducido
Sin cambio de
peligrosidad
Aumenta la
peligrosidad
Sin peligro directo
para la salud
(contaminacin
general, vida til y
alteracin)
Categora 1
3 clases
n = 5
c = 3
Categora 2
3 clases
n = 5
c = 2
Categora 3
3 clases
n = 5
c = 1
Peligro para la
salud bajo,
indirecto.
Categora 4
3 clases
n = 5
c = 3
Categora 5
3 clases
n = 5
c = 2
Categora 6
3 clases
n = 5
c = 1
Moderado,
directo, difusin
limitada.
Categora 7
3 clases
n = 5
c = 2
Categora 8
3 clases
n = 5
c = 1
Categora 9
3 clases
n = 5
c = 1
Moderado,
directo, difusin
potencialmente
extensa.
Categora 10
2 clases
n = 5
c = 0
Categora 11
2 clases
n = 10
c = 0
Categora 12
2 clases
n = 20
c = 0
Grave, directo. Categora 13
2 clases
n = 15
c = 0
Categora 14
2 clases
n = 30
c = 0
Categora 15
2 clases
n = 60
c = 0

Se configuran 15 categoras de riesgo; las
tres primeras hacen referencia a recuentos totales
de la flora en los alimentos, recuento de aerobios
mesfilos, recuento de mohos y levaduras, etc.; los
siguientes tres hacen referencia a indicadores,
coliformes totales, enterobacterias, etc.; los tres
siguientes hacen referencia a patgenos aceptables
como St. aureus, B. cereus, etc.; los seis ltimos
hacen referencia a patgenos no aceptables como
Salmonella o Cl. botulinum.
Adems, se clasifican los alimentos
segn su origen y tecnologa aplicada para a su vez
subdividirlos segn:
Factores de riesgo.
Grupo consumidor.
Preparacin y consumo.
Mantenimiento y conservacin.

B) PLAN DE DOS CLASES:
Es un plan de muestreo por atributos
(cualitativo), donde la calidad de un producto de
acuerdo con los criterios microbiolgicos puede
dividirse en dos grados de calidad, aceptable y
rechazable. Est basado en comprobar la presencia
o ausencia de microorganismos, o si la tasa
microbiolgica es superior o inferior a un nivel
crtico establecido c. Un plan de dos clases, queda
definido por el mencionado c y n o nmero de
muestras a analizar.

C) PLAN DE TRES CLASES:
Es un plan de muestreo por atributos,
donde la calidad de un producto de acuerdo con los
criterios microbiolgicos puede dividirse en tres
grados de calidad, aceptable, medianamente
aceptable y rechazable. La clase aceptable tiene
como lmites 0 y m; la clase medianamente
aceptable tiene como lmites m y M; la rechazable
aquellos valores superiores a M. Un plan de tres
clases viene definido por n, o nmero de muestras
para ser examinadas; m o valor del parmetro
microbiolgico para el cual o por debajo del cual el
alimento no representa riesgo para la saludo; c o
nmero mximo de unidades de muestra que
pueden contener un nmero de microorganismos
comprendidos entre m y M para que el alimento
sea medianamente aceptable, y M el valor del
parmetro microbiolgico por encima del cual el
alimento presenta un riesgo para la salud.

D) USO DE NORMAS MIL STD 105 E:
Se basan en el concepto de nivel de
calidad (AQL) o mximo porcentaje defectuoso
tolerable como promedio de calidad. Los
procedimientos de muestreo pueden ser:
1. Por atributos: Es cualitativo y se basan en
la categorizacin de aceptable/rechazable.
Adems, es necesario definir el grado de
inspeccin que puede ser: reducido,
normal o riguroso. En general se aplica el
grado normal, salvo que la empresa
suministradora cumpla normalmente
(utilizacin del grado reducido), o que la
visualizacin de las instalaciones
precarias, la inexperiencia o dificultades
anteriores lo aconsejen (grado riguroso).
Tenemos los siguientes casos:
- Atributo simple.
- Atributo secuencial doble.
- Atributo secuencial mltiple.
- Sublotes.
2. Por variables: Es un plan de muestreo
cuantitativo y se compara con una escala.

ELECCIN DE MUESTRAS NO
TOMADAS AL AZAR.

Normalmente se hacen intentos de tomar
las muestras al azar dado que la calidad del
muestreo va a depender de la aleatoriedad de la
toma de muestras, es decir, de que todas las

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unidades del lote tengan la misma probabilidad de
ser parte de la muestra a analizar (para lo que
podemos utilizar, el bombo, el quinteo o una tabla
de nmeros al azar).

Sin embargo, en una lnea de transporte
alimentario es normal que aumente la carga
microbiana con el tiempo, o que al comenzar un
ciclo de produccin, las primeras unidades sean las
ms contaminadas, o que en una almacn de
refrigeracin, se den gradientes de temperatura y,
por tanto, cargas microbianas diferenciadas. En
tales casos, se obtiene una mayor informacin,
mediante la eleccin de muestras que mediante el
muestreo al azar, sobre todo si se trata de alimentos
y de microorganismos patgenos, en los cuales
deberemos considerar siempre el caso ms
desfavorable.

TRANSPORTE Y ALMACENAMIENTO.

Siempre que sea posible, la muestra debe
mantenerse en su estado original hasta la
realizacin de las pruebas de laboratorio. En el
caso ms usual, los alimentos, la conservacin
durante el transporte y el almacenamiento, pueden
conseguirse utilizando nieve carbnica (con
precauciones, para proteger las muestras del
alimento a la exposicin del dixido de carbono
gaseoso) y recipientes aislantes para su transporte
al laboratorio, y conservarse en congelador hasta el
momento de su examen.
Las muestras que se pueden refrigerar,
pero que no se pueden congelar, deben estar
enfriadas en refrigerador y mantenidas en l a unos
4 C hasta el momento del anlisis.
Debemos, no obstante, tener presente que
la refrigeracin de las muestras durante periodos
de tiempo de tres o ms das puede dar como
resultado la multiplicacin de los microorganismos
psicrfilos presentes en la muestra y en cambio
puede originar la muerte de algunos termfilos y
mesfilos.
En cualquier caso, para todas las
sustancias se deben anotar todos los datos
referentes, no slo al muestreo, sino tambin a su
transporte y almacenamiento.

PREPARACIN DE DISOLUCIONES.

Casi en todos los mtodos de muestreo,
sobre todo para los alimentos, sugieren que se
efecten las diluciones de 1:10, es decir, que se
preparen con 10 g de material suspendido y
homogeneizado en 90 mL de diluyente, ya que este
volumen es frecuentemente el mayor que puede ser
manipulado con comodidad en la mayora de los
laboratorios.
Sin embargo, y si es posible, es preferible
preparar la dilucin 1:10 a partir de 50 g de
material en 450 mL de diluyente, ya que esto
proporciona resultados ms seguros y
representativos sin incordio de grandes volmenes.
La eleccin del diluyente es crtica en
funcin de los microorganismos que queramos
analizar:
1. Diluyentes de uso general: Para muchos fines
son diluyentes satisfactorios:
Agua de peptona al 0,1 % y pH 6,8-7,0.
Buffer fosfato.
Solucin RINGER al cuarto.
En cualquier caso la siembra de medios
se har dentro de los 15-30 minutos siguientes a la
preparacin de las disoluciones.
En caso de duda sobre una serie de

As imaginemos que queremos comprar un lote
de 50.000 huevos y aceptamos como Nivel de Calidad
Aceptable (NCA) el 1% con la cscara rota, a una empresa
buena pero de contrato nuevo por lo que aplicaremos un
grado de inspeccin normal. Utilizando la inspeccin
normal por atributo simple y al estar comprendido el lote
entre 35.001 y 150.000 unidades, le corresponde una letra
cdigo N.
Llevado a la Tabla de muestreo simple para
inspeccin normal y teniendo en cuenta el N.C.A. de 1, le
corresponde un tamao muestral de 500 unidades, con un
nmero de aceptacin de 10 y un nmero de rechazo de 11.
Resumiendo deberamos inspeccionar 500
huevos, si los rotos son 10 menos aceptaramos el lote, si
fueran ms los huevos rotos, el lote sera rechazado. Si la
empresa fuera de confianza (nivel de inspeccin reducido)
habramos obtenido una letra cdigo L y en la tabla de
muestreo simple y valor de N.C.A =1, tenemos un tamao
de muestreo de 200 y unos valores de aceptacin y de
rechazo de 5 y 6 respectivamente.
Un ejemplo de utilizacin de inspeccin normal
por variables nos lo dara la compra de 50.000 litros de
leche que debe poseer un mnimo de 3,2 % de materia
grasa. Al estar comprendido el nmero de unidades entre
22.001 y 110.000 le corresponde una letra cdigo M.
Aqu se presentan 2 casos; en el caso de
conocerse la desviacin tpica de los anlisis, le corresponde
un tamao muestral de 36 unidades y un valor K = 1,653;
en el caso de no conocerse la desviacin tpica el tamao
muestral debe ser 100 y el valor K = 1,674.

Para la serie de medidas, Xi - Xn se estable:

x
n i
i
xi x /
1
=
=
=

) ( + = k X NCA
As si el NCA calculado puede ser mayor o igual
a 3,2 en cuyo caso se acepta y si es menor o igual a este
valor el lote se rechaza.

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diluyentes, se escoger como ms conveniente,
aquel que d mayor proporcin de aislamientos.
2. Diluyentes para anaerobios: Se utiliza el
medio de clostridios reforzado, o una frmula
semejante, con el fin de mantener un ambiente
reductor. La dispersin de la muestra en el
diluyente se realizar mediante mtodos que
eviten la introduccin de oxgeno en la mezcla.
3. Diluyentes para osmfilos: Un diluyente
adecuado es la solucin de sacarosa al 20 %,
como siempre, estril.
4. Diluyentes para halfilos: Se puede usar una
solucin de cloruro de sodio al 15 % estril.

DILUCIN DE LQUIDOS.

Las diluciones de los lquidos se preparan
tomando con una pipeta estril y de forma asptica,
10 mL de la muestra del lquido previamente
homogeneizado, mezclndolo cuidadosamente en
un frasco estril, con tapn de vidrio
preferentemente, con 90 mL del diluyente elegido
a fin de obtener una dilucin 1:10 v/v. Si se
necesitan las diluciones decimales, se preparan de
una forma anloga.
Aunque no es muy comn, tambin se
puede hacer, pesando en el frasco y con las
precauciones de asepsia necesarias, 10 g de la
muestra bien mezclada y aadiendo 90 mL del
diluyente adecuado, para obtener una dilucin 1:10
p/v, que a fines prcticos es equivalente a las
diluciones 1:10 p/p o v/v.
En cualquier caso y siendo reiterativo, la
siembra de los medios debe realizarse en los 15-30
minutos posteriores a la preparacin de las
diluciones.

DILUCIN DE LOS SLIDOS
PULVERULENTOS.

La preparacin de la dilucin inicial se
consigue fcilmente mediante la pesada asptica de
10 g de material en un frasco estril al que se le ha
marcado una lnea, que corresponde a un volumen
de 100 mL, para agregar posteriormente el
diluyente adecuado hasta dicho nivel, obteniendo
una dilucin 1:10 p/v, para a continuacin agitar la
suspensin 25 veces y haciendo un recorrido de
unos 30 cm.
Si son necesarias mayores diluciones, se
preparan de la forma habitual.
Deben tomarse todas las precauciones,
sobre todo en las muestras muy solubles, para que
el recuento obtenido por distribucin de volmenes
medidos pueda relacionarse directamente con la
muestra original, lo que obliga a la medida exacta
de los volmenes.
La siembra ha de realizarse dentro de los
30 minutos de haber preparado las diluciones.

DILUCIN DE OTRAS MUESTRAS
SLIDAS.

Exceptuando el anlisis de superficies, ya
comentado, el anlisis del resto de las muestras
slidas no pulverulentas requiere la trituracin del
material que puede contener microorganismos por
debajo de su superficie. La preparacin de la
muestra puede realizarse homogeneizando 10 g de
la muestra triturada en la apropiada cantidad de
diluyente estril, utilizando un aparato idneo de
los existentes en el comercio.
1. Homogeneizador de alimentos con
agitacin inferior: Como el Alto-Mix, que
consta de un cilindro de acero inoxidable
autoclavable, con las cuchillas del molinillo
unidas a un eje a prueba de filtraciones que
atraviesa la base del recipiente; la tapa del
recipiente cierra tambin hermticamente. La
muestra se homogeneiza en el diluyente estril
(10 g en 90 mL en un recipiente de 200 mL, o
50 g en 450 mL en un recipiente de un litro)
durante 30 segundos a baja velocidad, para
seguir durante 2 minutos a alta velocidad y
volver durante 15 segundos a baja velocidad.
La desventaja es que puede alcanzar elevadas
temperaturas que puede afectar a algunos
tipos de muestra. El uso de diluyente fro para
evitar este calentamiento puede afectar al
recuento a causa del choque fro.


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2. Homogeneizador de alimentos con
agitacin superior: Como el Ultra-Turrax,
donde el eje del homogeneizador gira a alta
velocidad creando un torbellino considerable
que facilita la preparacin de la muestra, pero
que presenta el problema del lavado y
esterilizado entre muestras al no ser
autoclavable. Adems, slo es vlido en el
caso de que las muestras sean pequeas, es
decir, si previamente estn troceadas en
pequeos fragmentos (del orden de 5 mm de
dimetro aproximadamente).

3. Stomacher: La muestra y el diluyente se
colocan dentro de una bolsa de politeno
estril, delgada, flexible y desechable, que se
coloca en una cmara de agitacin, donde al
sobresalir por la parte superior, al cerrar la
puerta, queda firmemente cerrada. Al poner en
marcha el aparato, dos grandes palas planas de
acero inoxidable comprimen alternativamente
la bolsa con su contenido contra la cara
interior de la puerta. Esta operacin se lleva a
cabo durante 30 segundos, y basta para
homogeneizar la mayor parte de las muestras,
si bien se precisan hasta 90 segundos, en el
caso de altos contenidos de grasa. La gran
ventaja del aparato, es que las muestras no
entran en contacto directo, ni con el aparato,
ni con las palas, ni con las bolsas desechables
(que no son excesivamente caras), y, adems,
no existe a efectos prcticos aumento de la
temperatura para obtener una buena
dispersin, incluso, con muestras congeladas.
Adems, si se sospechan recuentos bajos
pueden prepararse diluciones bajas, y es
menos ruidoso que sus competidores.


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USO DEL STOMACHER.

El Stomacher (en nuestro caso modelo 400
Circulator) es un instrumento homogeneizador de
muestras provisto de una bolsa especial lo que hace
que la muestra a tratar nunca entre en contacto con
el aparato y cuya accin es similar al proceso de
digestin del estmago, de ah su nombre.
La capacidad de tratamiento va desde los
80 mL hasta los 400 mL, trabaja a temperatura
ambiente, tiene una velocidad de uso de 200, 230 y
260 r.p.m. y un temporizador con uso de 0 a 99 m.
Y 55 s con un incremento de 1 s.
Puede operar tanto en forma manual como
en forma automtica y permite el almacenamiento
de las variables del proceso hasta en tres memorias
o programas de trabajo (que a su vez se pueden
usar en modo manual o en modo automtico).
1. Operacin manual:
Comprueba que la llave de encendido
est en posicin de on, la lmpara verde del
interruptor se enciende y se oye un tono corto.
Ahora la pantalla indica el estado del aparato.
Comprueba que el icono AUTO no
aparece en pantalla, si aparece aprieta la tecla
AUTO para volver al estado manual; de igual
forma si est seleccionado algn programa,
P1, P2 o P3, presiona la tecla PROG
repetidamente hasta que no est seleccionado
ningn programa.
Abre la puerta que da acceso al
compartimento de las paletas. El icono DOOR
OPEN aparece ahora en pantalla.
Sita la bolsa en su compartimento
dejando por encima de 5 a 6 cm para poder
cerrarla hermticamente cuando cierres la
puerta. Ahora desaparece el icono DOOR
OPEN de la pantalla.
El icono del tiempo seleccionado aparece
por defecto en el valor 30 s. Ajusta el
parmetro al valor deseado con las teclas de
incremento o decremento.
El icono de velocidad seleccionado
aparece por defecto al valor de 230 r.p.m.
Ajusta el parmetro al valor deseado con las
teclas de incremento o decremento.
Presiona la tecla START para comenzar
el proceso. El instrumento funcionar hasta
que, el ciclo de tiempo haya acabado, se
presione la tecla STOP, se abra la puerta o se
presione el interruptor al estado de off.
Una vez acabado el proceso, abre la
puerta, extrae la bolsa de la muestra procesada
y el instrumento queda lista para una prxima
muestra.
2. Operacin automtica:
Cuando una gran cantidad de muestras deben
ser procesadas en la mismas condiciones es
preferible trabaja en modo automtico:
Selecciona los valores de velocidad y
tiempo como en la operacin manual.
Presiona la tecla AUTO, aparece su
icono en pantalla.
Coloca la bolsa con la muestra.
Al cerrar la puerta se inicia el proceso.
Una vez acabado, abre la puerta y
sustituye la bolsa con la muestra. Al cerrar la
puerta el proceso comenzar
automticamente.
3. Almacenamiento de programas:
Es posible almacenar tres combinaciones
velocidad / tiempo en la memoria del aparato
(generalmente se almacenan la combinacin de
parmetros que se usan con ms frecuencia). Para
almacenar o cambiar los valores de un programa:
Presiona reiteradamente la tecla PROG
se llega al programa deseado, P1, P2 P3 y
vuelve al programa manual (sin icono PROG).
Presiona la tecla hasta alcanzar el programa
deseado (en pantalla aparecen los valores
almacenados por defecto).
Ajusta los valores de velocidad y tiempo.
Mantn presionadas durante 2 s las teclas
AUTO y PROG. Se oye un tono ms largo y
se almacena en memoria los valores
seleccionados.
4. Uso de programas manual:
Con la tecla PROG selecciona el
programa deseado.
Carga la bolsa.
Presiona la tecla START.
Despus del procesado y retirada de la
muestra el aparato est listo para una nueva
muestra.
5. Uso de programas automtico:
Con la tecla PROG selecciona el
programa deseado.
Presiona la tecla AUTO.
Carga la bolsa.
Al cerrar la puerta comenzar el proceso.
Al acabar y sustituir la bolsa y volver a cerrar
la puerta, se vuelve a iniciar el mismo.
6. Limpieza y mantenimiento:
Externamente debe limpiarse y preservarse
del polvo cuando no est usndose en seco. De
forma peridica puede utilizarse un pao
sumergido en agua con detergente y previamente
escurrido, en cuyo caso debe desenchufarse de la
corriente. Nunca debe ser utilizado limpiadores
que contengan disolventes. Para facilitar la
limpieza de la cmara de procesado se puede abrir
totalmente la puerta del mismo.

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Anlisis Microbiolgicos Unidad Temtica 7. Medios de Cultivo

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MEDIOS DE CULTIVO.

Un medio de cultivo es un conjunto de
nutrientes, factores de crecimiento y otros
componentes que crean las condiciones necesarias
para el desarrollo de los microorganismos.
Este medio puede ser similar al sustrato
natural en el cual crecen normalmente las
bacterias, como por ejemplo suero sanguneo en el
caso de patgenos animales, leche en bacterias
lcteas y extracto de suelo en el caso de las
bacterias edficas, o ser preparado en el
laboratorio.

NECESIDADES NUTRITIVAS DE LOS
MICROORGANISMOS.

La diversidad metablica de los
microorganismos es enorme, por ello, la variedad
de los medios de cultivo tambin lo es, no
existiendo un medio de cultivo universal adecuado
para todos ellos, pero en cualquier caso debe
contener todos los componentes necesarios para el
crecimiento; estos an variando segn el tipo de
bacterias cuyo crecimiento se desea conseguir,
deben incluir:
1. Agua.
2. Compuestos que contengan nitrgeno,
como protenas, aminocidos o sales
inorgnicas que contenga nitrgeno.
3. Fuentes energticas, como carbohidratos o
protenas.
4. Otros factores de crecimiento.
Las necesidades nutritivas de las bacterias
varan desde los sencillos compuestos inorgnicos
de los auttrofos, a las diferentes vitaminas y
factores de crecimiento que necesitan algunas de
las bacterias ms exigentes, como los patgenos y
las bacterias lcticas. Por tanto, resulta imposible,
formular un medio que favorezca el crecimiento de
todas las bacterias en general. No obstante, los
medios empricos utilizados corrientemente y
compuestos por un caldo nutritivo y un agar
nutritivo, son capaces de favorecer el crecimiento
de muchos tipos de bacterias. Estos medios se
pueden utilizar como medios base, a lo que se les
aade las sustancias necesarias para las exigencias
de cada tipo de bacteria, consiguiendo as, que un
medio de cultivo, pueda llegar a ser selectivo o
incluso de valor diagnstico.

REQUERIMIENTOS ENERGTICOS.

Son los nutrientes del medio de cultivo que
va a ser utilizado por la bacteria para su
crecimiento. Van a ser fuentes de energa en un
medio de cultivo, al menos, una fuente de carbono
y una fuente de nitrgeno.
Fuentes de carbono: existen muchos tipos de
fuentes de carbono, ya que esto est ligado al
metabolismo energtico de la especie
microbiana; generalmente se trata de
sustancias orgnicas y en la mayor parte de los
casos son azcares en forma de mono o
disacridos (glucosa, lactosa, maltosa, etc.) e
incluso hay microorganismos que utilizan
polisacridos ms complejos como el almidn.
Existen bacterias capaces de utilizar dixido de
carbono (bacterias fotosintetizadoras), metano,
benceno y otros hidrocarburos.
Fuentes de nitgeno: es una fuente menos
energtica que la de carbono, pero necesaria
para el metabolismo microbiano, produciendo
tambin energa. La van a formar las protenas,
pptidos o aminocidos: se presentan en forma
de peptonas (productos intermedios en la
hidrlisis de protenas), extractos de carne
(suministran productos nitrogenados, no
nitrogenados y alguna vitamina), extractos de
levadura (igual que los extractos de carne, pero
ms baratos y completos), gelatina, casena,
etc. Otra fuente de nitrgeno son los nitratos,
nitrgeno orgnico, amoniaco, sales de
amonio, aminocidos, etc. El hecho de conocer
la fuente de nitrgeno que utiliza una especie
microbiana problema es muy til para
establecer su clasificacin taxonmica.

REQUERIMIENTOS NO ENERGTICOS.

Fuentes de azufre: todos los microorganismos
que utilizan en su metabolismo azufre lo hacen
mayoritariamente en forma de sulfatos, a veces
en forma de tiosulfatos y en otras ocasiones lo
pueden obtener a partir de algn aminocido
(cistena, tiamina, metionina, ...).
Fuentes de fsforo: en general lo utilizan en
forma de fosfatos.
Fuentes de agua: necesaria para la existencia
de toda clula viva.
Iones metlicos: son utilizados a
concentraciones muy bajas. Son, por ejemplo,
el sodio, potasio, hierro, magnesio, calcio, etc.
7. Medios de Cultivo.

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Son esenciales para el crecimiento microbiano
y dependiendo de su concentracin pueden
inhibir el crecimiento de otros.
Factores de crecimiento: no todas las
bacterias son capaces de crecer en medios
donde se encuentran cubiertas las necesidades
elementales. Existen bacterias que no crecen
en estos medios o lo hacen muy lentamente. A
este tipo de bacterias les hace falta una serie de
componentes que no pueden fabricar por s
solas para su crecimiento y corresponden a
algn tipo de aminocido, son los factores de
crecimiento.
Factores de arranque: sustancias que
permiten a la bacteria en estudio salir de su
fase de latencia y comenzar su fase de
crecimiento exponencial. Son
fundamentalmente fuentes de energa (glucosa)
o factores no energticos, como algn in, que
estimule el crecimiento.
Factores inhibidores: componentes que van a
impedir el crecimiento de algn tipo de
microorganismo por bloqueo de sus procesos
metablicos; por ejemplo, la azida sdica
inhibe el crecimiento de bacterias Gram-, los
antibiticos son inhibidores o destructores de
la bacteria, algunos colorantes (eosina azul de
metileno) impiden el crecimiento de bacteria
Gram+. Etc. Las sustancias inhibidoras son
muy tiles para la identificacin y tipificacin
bioqumica de bacterias.
Factores solidificantes: como el agar o la
gelatina.

CONSTITUYENTES HABITUALES DE
LOS MEDIOS DE CULTIVO.

1. Agar: Se utiliza como gelificante para dar
solidez a los medios de cultivo. Su
componente dominante es un polisacrido no
puro y extrado de algas marinas. Un gel de
agar al 1-2 % en agua se lica hacia los 100 C
y se gelifica alrededor de los 40 C
dependiendo de su grado de pureza. Con la
excepcin de algunos microorganismos
marinos, el agar no es empleado como
nutriente.
2. Extractos: Para su preparacin ciertos rganos
y tejidos animales o vegetales (carne, hgado,
cerebro, semillas, etc.) son extrados con agua
y calor, para posteriormente ser concentrados
hasta la forma de pasta o polvo.
3. Peptonas: Son mezclas complejas de
componentes orgnicos nitrogenados y sales
minerales que se obtienen por digestin
enzimtica o qumica de protenas animales o
vegetales (soja, carne, gelatina, casena, etc.).
Aunque ricas en pptidos y aminocidos
pueden ser deficitarias en algunas vitaminas y
sales minerales.
4. Fluidos corporales: Los fluidos corporales no
solo contribuyen con factores de crecimiento,
sino tambin con sustancias que neutralizan
inhibidores del crecimiento de algunas
bacterias. Se emplean sangre desfibrinada,
plasma o suero sanguneo. La sangre, al no
poder ser esterilizada, debe obtenerse
directamente del animal sano en condiciones
aspticas.
5. Sistemas amortiguadores: Algunos
componentes son incorporados al medio de
cultivo para mantener el pH dentro del rango
ptimo del crecimiento bacteriano. Los
microorganismos ms comunes son neutrfilos
y las sales como los hidrogenofosfatos sdicos
o potsicos, o sustancias orgnicas como las
peptonas, previenen una desviacin del pH.
6. Indicadores de pH: Se aaden, a veces,
indicadores cido-base con objeto de detectar
las variaciones del mismo.
7. Agentes reductores: Como la cistena y el
tioglicolato que se aaden para el desarrollo de
grmenes microaerfilos o anaerobios.
8. Agentes selectivos: Muy diversos, sales
biliares, violeta cristal, telurito potsico,
antibiticos, etc., que transforman un medio de
cultivo general en selectivo.

CONDICIONES.

Para que un microorganismo crezca en un
medio de cultivo es necesario:
1. Una composicin de nutrientes adecuada a las
necesidades de ese microorganismo.
2. Unas condiciones fsico-qumicas apropiadas:
Temperatura ptima: apropiada a
cada especie bacteriana. Las bacterias
son psicrfilas cuando crecen a
temperaturas inferiores a 20 C,
mesfilas cuando crecen a
temperaturas comprendidas entre 20 y
45 C y termfilas cuando crecen por
encima de 45 C. Para cada especie de
bacterias existe una temperatura
ptima donde su proliferacin es ideal;
fuera de esta temperatura no crecen o
lo hacen muy despacio.
Grado de humedad: corresponde a la
cantidad de agua que va a necesitar la
bacteria para su crecimiento. Cualquier
medio slido o lquido requiere una
cierta proporcin de agua. En medios

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sin agua es muy difcil el crecimiento
bacteriano; de ah que por ejemplo la
liofilizacin, y en general cualquier
tratamiento de deshidratacin, sea un
buen medio de conservacin.
pH: Hay sustancias que va a
estabilizar el pH del medio, reciben el
nombre de buffers o tampones;
proporcionan al medio un pH estable
que facilite el crecimiento microbiano.
En general el pH ptimo es prximo a
la neutralidad.
Presin osmtica: en general los
medios son isotnicos respecto a las
bacterias.
Oxgeno: Presencia o ausencia.

CLASIFICACIN SEGN ORIGEN.

Empricos o naturales: no se interviene
directamente en su composicin, de origen
natural y se desconoce su composicin
especfica (leche, medios de papa, zumos,
sueros, extracto de carne, etc.).
Sintticos: de composicin qumica
conocida, aparecen sustancias qumicas
definidas. Son los ms utilizados y siempre
deben contener en su composicin una
fuente de carbono (azcar), una fuente de
nitrgeno en forma orgnica o inorgnica,
compuestos minerales y factores de
crecimiento.
Semisintticos: parte de su composicin
corresponde a extractos naturales y no
tiene una composicin definida; a estos se
aaden constituyentes sintticos o
qumicamente definidos para el
crecimiento microbiano.
Complejos: fueron los primeros utilizados
en bacteriologa; en la actualidad su uso
est ms restringido. Sin embargo se
utilizan mucho en parasitologa y
virologa. Se preparan de forma compleja a
partir de tejidos animales y ms raramente
vegetales; su composicin no est tan
definida como en los sintticos, no es
rigurosamente constante. Sus materias
primas suelen ser carne de msculo, de
hgado, de corazn, yema de huevo, etc.

CLASIFICACIN SEGN ESTADO
FSICO.

O segn proporcin de agua:
Liquidos: tambin se denominan caldos; su
componente principal es el agua y no
contienen agar. En ellos los microorganismos
crecen en todas direcciones enturbiando el
medio; son de gran utilidad para la realizacin
de pruebas bioqumicas, identificacin a travs
de medios especficos y realizacin de
recuentos por turbidimetra.
Slidos: Resultan de aadirles a los lquidos
sustancias solidificantes como el agar o la
gelatina; en la actualidad el ms utilizado es el
agar, ya que la gelatina funde a 24 C y adems
existen numerosas bacterias gelatinasa+. La
proporcin de agar est siempre por encima del
15%. Permiten el aislamiento, purificacin,
visualizacin de colonias, elaboracin de
antibiogramas, ect.
Semislidos: intermedios entre los slidos y
los lquidos, contienen menos de un 5% de
agar. Se suelen utilizar para ver la movilidad
de los grmenes y para la realizacin de
mltiples pruebas bioqumicas.

CLASIFICACIN SEGN USO.

1. Medios generales: Tambin denominados
medios no selectivos o comunes y que
permiten el desarrollo de una gran variedad de
microorganismos. son medios de uso general.
Con ellos se favorece el crecimiento de la
mayor parte de las bacterias, sin exigencias
nutritivas especiales; ejemplo, agar comn,
caldo nutritivo, ...
2. Medios de enriquecimiento: Favorecen el
crecimiento de un determinado tipo de
microorganismo sin llegar a inhibir totalmente
el crecimiento del resto. En un medio general
se obtienen cultivos mixtos, por lo que es
posible, si estn superficiales, el aislamiento de
las bacterias requeridas para su resiembra en
este tipo de medios donde se desarrollan
preferentemente gracias al aprovechamiento de
cualquier caracterstica fisiolgica de las
mismas. Siempre es necesario tener en cuenta
que los medios de enriquecimiento, al ser
lquidos, no permiten obtener cultivos puros, y
para obtenerlos debe ser llevado sobre medios
slidos.
3. Medios electivos: Son medios que satisfacen
las necesidades nutritivas elementales de
microorganismos de caractersticas nutritivas
poco comunes. Por ejemplo, para aislar
levaduras salvajes se emplea agar lisina, sobre
el cual no pueden crecer las bacterias, salvo
que stas puedan utilizar la lisina como nica
fuente de nitrgeno.
4. Medios selectivos: Permiten el crecimiento de
un tipo de microorganismos determinados,

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inhibiendo el desarrollo de los dems. Suele
ser un medio bsico que ha sido alterado,
incluyendo uno o ms agentes inhibidores
limitando as el desarrollo de bacterias no
interesantes. Como agentes inhibidores se
pueden emplear cidos, lcalis, antibiticos,
sales biliares, colorantes y otras sustancias.
As, el violeta cristal, o la penicilina evitan el
crecimiento de bacterias gram-positivas
favoreciendo el crecimiento de las gram-
negativas; el agar MCCONKEY con sales
biliares, inhibidor de casi todas las bacterias
aunque en menor grado en las coliformes, por
lo que resulta selectivo para estas; o el uso de
inhibidores tales como el telurito potsico, el
acetato de talio o la azida sdica que son
selectivos para las bacterias gram-positivas.
5. Medios diferenciales: Son aquellos en los que
se ponen de relieve propiedades de un
determinado tipo de microorganismos,
generalmente formando colonias fcilmente
reconocibles. As, es fcil distinguir las
especies hemolticas de las no hemolticas en
agar sangre, que no es un medio selectivo. No
obstante un medio puede ser selectivo y
diferencial, As, en el agar MCCONKEY los
coliformes forman colonias rojas, mientras
otras bacterias intestinales como la Salmonella
forman colonias incoloras.
6. Medios de transporte o mantenimiento: se
utilizan en la recogida, transporte y
conservacin de muestras microbiolgicas.
Esencialmente son medios slidos no
nutritivos que inhiben las reacciones
enzimticas autodestructivas; son medios que
no deben potenciar el crecimiento lujurioso.
7. Medios para filtros de membrana.

MUGPLUS: Agar cromognico para E. coli

CLASIFICACIN SEGN
PRESENTACIN.

1. Deshidratados o liofilizados: se presentan tal
cual y en el laboratorio se preparan aadiendo
la cantidad de agua correspondiente en
condiciones totalmente aspticas o una vez
preparados sin estas condiciones los
esterilizaramos en el autoclave.
2. Preparados: elaborados por las casas
comerciales presentando un control de calidad
y caractersticas especficas a cada tipo de
cultivo. Pueden presentarse en forma de
placas, en tubo, en frascos, como medios
semislidos o lquidos, etc.
3. Medios slidos en placa de Petri: son medios
slidos que ocupan una superficie lo
suficientemente grande como para poder
visualizar perfectamente las colonias
microbianas (mucho mejor que en un tubo). Es
de los medios que mejor permiten el
aislamiento de los microorganismos que
pueden crecer en l.
4. Medios slidos en tubo: corresponden a tubos
con agar inclinado y solidificado para
aumentar la superficie donde se va a producir
el crecimiento bacteriano una vez sembrado.
Son tiles para la conservacin de cepas por
ser la desecacin menor que en los cultivos en
placa.
5. Medios lquidos en tubo: no permiten
visualizar colonias pero tienen muchas
aplicaciones como, por ejemplo, pruebas
bioqumicas; pueden servir para aumentar la
concentracin del microorganismo inoculado,
es decir, realizar un inculo, y otras
aplicaciones. No contienen nunca agar.
6. Medios semislidos en tubo: se siembran por
picadura y corresponden a un trmino medio
entre los lquidos y los slidos. Se utilizan en
ciertas pruebas bioqumicas como la de
movilidad, la de oxidacin-fermentacin, etc.
7. Medios de doble fase en frasco: son frascos
constituidos por una fase slida y otra lquida,
por ejemplo, para la determinacin rpida de
microorganismos en sangre.

Existe actualmente la tendencia a utilizar
medios que al mismo tiempo sirvan para la
identificacin, diferenciacin y confirmacin de las
bacterias en un mismo medio. As la firma Fluka
posee los denominados medios cromognicos, medios
tradicionales modificados por la adicin de agentes
cromognicos que detectan enzimas altamente
especficas.
As el agar HiCrome
TM
UTI (Urinary Tract
Infection) es un medio cromognico diferencial para
la identificacin, diferenciacin y confirmacin de
bacterias entricas en muestras de orina, agua y
alimentos, donde E. coli aparece de color rojo,
Pseudomonas aeruginosa aparece de colora amarillo
claro, Proteus mirabilis de color amarillo intenso,
Klebsiella pneumoniae de color azul marino y
Enterococcus faecalis de color azul celeste.

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MEDIOS DESHIDRATADOS.

Antiguamente, en los laboratorios de
microbiologa, se tenan que preparar no slo los
medios de cultivo, sino tambin sus componentes.
En la actualidad se pueden conseguir casi
todos los productos por va comercial y que
generalmente vienen en forma deshidratada, salvo
en los casos que no es posible fabricarlo; el medio
as adquirido se disuelve en la cantidad de agua
adecuada para posteriormente ser esterilizado.
Se deben tener en cuenta las instrucciones
especficas de cada fabricante a la hora de
prepararlos, sobre todo aquellos medios
deshidratados que contengan agar, que deben de
mantenerse en remojo y agitacin de 15-30
minutos antes de aplicarles calor alguno.
En cualquier caso, la composicin y el pH
del medio deber ser el adecuado para un correcto
cultivo.

DETERMINACIN Y AJUSTE DEL pH.

Para la determinacin del pH, y en funcin
de la exactitud requerida, se suelen emplear dos
tcnicas, que son de menor a mayor exactitud:
1. Tiras indicadoras de papel pH: Como en
cualquier anlisis, se pone una gota del medio
sobre el papel indicador y se compara el color
resultante con la tabla de colores
proporcionada por el fabricante. Debe tenerse
siempre presente que este mtodo slo
proporciona una idea aproximada del valor del
pH.
2. pH-mtro: Una vez ajustado, con los dos
tampones, y lavado el electrodo con agua
destilada, se sumerge el mismo en un vaso que
contenga el medio de cultivo, tomando como
valor del pH el marcado por el aparato tras
agitacin.
El ajuste del valor del pH se realiza por
adicin de disolucin de cido clorhdrico o
hidrxido sdico 0,1 N hasta la consecucin del
valor a obtener.
Generalmente, se realiza una prueba con
un volumen mnimo conocido, midiendo el
volumen de reactivo necesario para su ajuste para
posteriormente extrapolar los resultados a todo el
medio de cultivo. Se recomienda utilizar para su
medicin un pH-mtro que est dotado de un
electrodo de vidrio (combinado con el electrodo
indicador) y una sonda termomtrica.

La correccin del valor del pH de un medio
de cultivo debe realizarse una vez esterilizado. En
general, la medida se realiza sobre una alcuota de
volumen conocido, a temperatura ambiente si es un
caldo o entre 45-50 C si se trata de agares (para ello
se debe tener en cuenta la correccin necesaria en el
pH-metro segn la temperatura que marque la sonda
termomtrica), aadiendo HCl o NaOH 0,1N (segn
sea necesario) mediante una bureta dosificadora.
Con la medida obtenida se calcula el
volumen necesario aadir para ajustar el pH del
volumen total del medio, para posteriormente
aadirlo. El reactivo utilizado debe estar previamente
esterilizado (por filtracin sobre filtro de vidrio, o,
mejor, de membrana.

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PREPARACIN DE LOS MEDIOS DE
CULTIVO.

En la actualidad, la mayora de los medios
de cultivo se encuentran comercializados,
normalmente, bajo la forma de liofilizados que es
preciso rehidratar. En general, la preparacin de un
medio de cultivo se reduce simplemente a pesar la
cantidad deseada del mismo y redisolverla en agua
destilada (libre de inhibidores del crecimiento)
siguiendo las instrucciones del fabricante. Las
sustancias termolbiles se esterilizan por filtracin
y se aaden al resto de los componentes
previamente esterilizados en autoclave.
Antes de su esterilizacin, los medios
lquidos en caldo se distribuyen en los recipientes
adecuados (tubos o matraces) y en ningn caso la
altura del lquido en el recipiente debe exceder de
un tercio del volumen total de ste.
Si es un medio slido, habitualmente se
procede a fundir el agar en un bao Mara antes de
esterilizarlo. Los recipientes utilizados nunca
deben estar cerrados de forma hermtica.Una vez
fundido, se distribuye en caliente en tubos o
matraces (no en placas de Petri), se tapa y se
esteriliza.
En general la esterilizacin es suficiente
utilizando en el autoclave 121 C durante unos 15
minutos (debe evitarse la sobrecarga trmica).
Finalizada la esterilizacin en el autoclave:
1. Los medios lquidos se dejarn enfriar a
temperatura ambiente.
2. Los medios slidos contenidos en tubo deben
inclinarse para que al solidificarse adopten la
forma de agar inclinado (a veces denominado
slant) si tal es su finalidad. Si no se dice otra
cosa, se suelen solidificar de tal forma que el
fondo y la lengeta tengan el mismo tamao de
unos 3 cm.
3. Las placas de PETRI pueden tambin ser
preparadas ahora, vertiendo el medio an
fundido y estril dentro de ellas en un
ambiente asptico (como la proximidad de un
mechero de laboratorio), y previamente
enfriado a la temperatura de vertido (45-55 C
para evitar el exceso de condensacin). Una
vez aadido unos 15-20 mL, las placas se
remueven circularmente, se eliminan las
posibles burbujas abanicando la placa con el
mechero a la llama no luminosa y se dejan
solidificar por enfriamiento. Posteriormente se
proceden a su secado, que puede efectuarse de
forma rpida con las placas abiertas e
invertidas a unos 30-40 C durante 2-3 horas, o
en estufa a baja temperatura con las placas
cerradas e invertidas durante 2-3 das. Este
ltimo procedimiento es preferible puesto que
as, adems de secar las placas se detecta si
estn contaminadas. Es posible asimismo,
conservar el medio destinado para preparar
placas solidificado y estril en tubos o frascos,
que se fundirn al bao Mara en el momento
de prepararlas, e incluso, mantenerlos durante
periodos cortos en una estufa de
mantenimiento entre 50-60 C.
Caldos y medios slidos de cultivo pueden
conservarse, una vez esterilizados, a temperatura
ambiente. Sin embargo, para reducir su
deshidratacin y el consiguiente cambio de las
concentraciones de los componentes, es preferible
conservarlos a 4 C en refrigerador pero nunca se
deben congelar.
Cuando el medio de cultivo posee un pH
inferior a 5, debemos trabajar con sumo cuidado
puesto que el agar se hidroliza, por lo que se
recomienda no refundir, y en caso de absoluta
necesidad aadir ms agar-agar base.

CONTROL DE MEDIOS PREPARADOS.

El cuatro por cien de unidades de los lotes
que se preparen, se controlan en una estufa durante
5-7 das a una temperatura de 37 C. Durante este
tiempo, debe verificarse el color del medio, as
como la gelificacin, los precipitados atpicos, etc.,

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para desechar los lotes en los que se observen
variaciones atpicas.
Tambin habr de verificarse la capacidad
del medio recin fabricado para respaldar el
desarrollo de los microorganismos con un inculo
en suspensin diluida: el inculo a utilizar debe ser
el de la especie ms exigente que se puede esperar
contenga la muestra a controlar.
a) Caducidad del medio preparado: en funcin
de su presentacin, los medios de cultivo
preparados, almacenados adecuadamente, tienen
por regla general las siguientes caducidades:
Placa de petri: dos meses y medio.
Placa rodac: dos meses y medio.
Tubo: seis meses.
Vial: seis meses.
Frasco: ocho meses.
Laminocultivos: seis meses.
b)Almacenamiento: el almacenamiento de los
medios ya preparados debe hacerse en sus distintas
presentaciones en cmaras fras a una temperatura
de 4-8 C. Las placas de petri deben almacenarse
en bolsas de plstico e invertidas para evitar la
evaporacin excesiva de la humedad del medio;
debe ser una bolsa microporosa (celofn) para
evitar una excesiva condensacin de agua en la
misma.

FORMULACIN DE ALGUNOS MEDIOS
DE CULTIVO USUALES.

1. MEDIOS NO SELECTIVOS.

1. Caldo nutritivo: Es un medio emprico de uso
general para el cultivo de la mayora de las
bacterias (con la excepcin de las bacterias del
cido lctico y de algunos patgenos ms
exigentes). Como ingredientes, tiene:
Peptona 10 g
Extracto de carne 10 g
Cloruro sdico 5 g
Agua destilada 1000 mL
2. Agar nutritivo: Este es un medio cuyo
elemento bsico es un caldo nutritivo
solidificado con agar, y de uso general como se
ha expuesto anteriormente.
Caldo nutritivo a pH=7,2 1000 mL
Agar 15 g
3. Leche tornasolada: Es un medio natural,
actualmente poco utilizado salvo para indicar
el efecto de los cultivos puros de bacterias
sobre los componentes de la leche y para
detectar las bacterias de la descomposicin de
la leche en el agua de aclarar los utensilios, etc.
Leche descremada 1000 mL (a
partir de leche descremada en polvo o
leche desnatada de buena calidad).
Solucin de tornasol c.s.p. un
color malva plido.

2. MEDIOS SELECTIVOS.

1. Caldo MCCONKEY: Medio selectivo y
diferencial que se utiliza para el
enriquecimiento y deteccin de coliformes
(enterobacterias que fermentan la lactosa), en
productos como la leche y el agua.
Ingredientes:
Peptona 20 g
Sales biliares 5 g
Cloruro sdico 5 g
Lactosa 10 g
Prpura de bromocresol 1 mL de
solucin etanlica al 1 %.

2. Agar MCCONKEY: Este es un medio de uso
general para la deteccin y el aislamiento de
bacterias de la familia de las
enterobacteriaceas.
Peptona 20 g
Sales biliares 5 g
Cloruro sdico 5 g
Lactosa 10 g
Solucin rojo neutro 1 mL de
solucin acuosa al 1 %.
Agar 20 g
3. Modificacin agar MCCONKEY: El agar
MCCONKEY es un medio bsico y como tal
puede ser modificado. A fin de conseguir una
mayor selectividad y definicin en relacin
con las colonias de coniformes, se modifica
mediante:
Se aade violeta cristal a 1ppm.
Se incluye una sal biliar ms activa a una
concentracin ms baja.
4. Agar bilis rojo violeta: Es otra modificacin
del agar MCCONKEY, que se realiza:
Se reduce la concentracin de peptona y
sal biliar.
Se aade violeta cristal hasta 2 ppm.
Se aade extracto de levadura.

OTRAS FORMAS DE EXPEDICIN
USUALES.


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Placas Petri irradiadas

Placas contacto irradiadas

Unidades de Filtracin

Placas filtracin irradiadas

Frascos de vertido

Tubos preparados
Anlisis Microbiolgicos Unidad Temtica 8. Tipos de Cultivo y Tcnicas de Siembra

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CULTIVO DE BACTERIAS.

Los medios de cultivo pueden distribuirse
de diversas formas, en tubos de ensayo, matraces o
frascos de tapn de rosca, segn el tipo de siembra
que se vaya a realizar.
Los tubos de ensayo y los matraces deben
taponarse con cierres bien ajustados de algodn no
absorbente (algodn hidrfobo), con tapones de
metal roscado, con tapones de plstico (roscados o
no) o con tapones especiales de goma.
Los frascos, y cualquier sistema, de
tapones roscados, presentan la ventaja de que con
ellos se evita la evaporacin, y el medio no se seca
durante el periodo de almacenamiento.
Las tcnicas de siembra de cultivos estn
supeditadas al tipo de cultivo utilizado, y ste a su
vez est en funcin de lo que queramos observar o
cuantificar.

TIPOS DE CULTIVO Y SUS SIEMBRAS.

1. Cultivo en caldo: Es un cultivo en medio
lquido al que no se le aade ningn
componente nutritivo durante el crecimiento.
La siembra se realiza por homogeneizacin del
inculo en el caldo mediante agitacin vertical,
con las manos o con ayuda de agitadores
elctricos.
2. Cultivo en agar inclinado: Para ello se
emplean tubos de ensayo o frascos pequeos
que conteniendo unos 5 mL de un medio de
agar o gelatina. Se dejan enfriar en posicin
inclinada.
La siembra se realiza en toda la superficie del
medio, o bien a lo largo de una estra delgada
con la ayuda de un asa de siembra. A veces
tambin se incluye la siembra en el fondo para
lo que se utiliza un pincho de siembra.
3. Cultivo en picadura: Los tubos de ensayos o
frascos pequeos, similares a los anteriores, se
dejan solidificar en posicin vertical.
La siembra se deposita mediante una aguja
verticalmente y en el centro del tubo.
4. Cultivo en medio semislido: As se
denomina, al cultivo que se deja crecer en un
medio que contiene la suficiente cantidad de
agar como para aumentar la viscosidad del
medio (de un 0,02-0,3 %), pero insuficiente
para producir la total solidificacin.
La siembra se realiza por homogeneizacin del
inculo mediante agitacin vertical.

5. Cultivo en masa en medio slido: Se utilizan
tubos de ensayo que contienen un medio
slido.
El medio se funde, se enfra a unos 45 C, se
siembra el inculo, se agita mediante giro del
tubo y se deja enfriar en posicin vertical.
6. Cultivo en placa: Se utilizan placas de PETRI,
en las que se deposita un medio slido fundido
estril de unos 10-15 mL, para dejarlo
solidificar a temperatura ambiente.
Siembra en estra en la superficie del medio
solidificado con la tcnica adecuada.
Siembra en masa, se deposita el inculo sobre
la placa para posteriormente llenarlas como en
el punto 5.
7. Cultivo en masa en medio lquido: Los
medios lquidos y en grandes volmenes se
utilizan generalmente para el cultivo en masa
como forma de obtener un metabolito o
componente bacteriano, para su anlisis o su
utilizacin. Los problemas se multiplican con
el volumen, para la esterilizacin, el control
del medio y el control de la temperatura.
8. Cultivo continuo: As se denomina a aquel
cultivo al que constantemente, o a ciertos
intervalos, se le suministran nutrientes y
simultneamente se extrae un volumen
proporcional de cultivo. Como en el caso
anterior se utiliza en procesos industriales.

MANEJO DE LAS MUESTRAS Y TOMA
DEL INCULO.

La toma del inculo (de una muestra que
hay que examinar, de un medio slido o de un tubo
de ensayo con un medio lquido), es simple, pero
requiere prestar toda la atencin posible para que la
tcnica resulte adecuada.
1. Colcate frente al mechero, disponiendo
delante la preparacin o muestra que contenga
los microorganismos, as como el resto del
material necesario (portaobjetos, tubos, placas,
etc.), para ser alcanzado con facilidad y sin
tropiezos.
2. Toma el asa de siembra o aguja y flamee el
filamento en toda su extensin hasta el rojo
incandescente, dejndolo enfriar (durante unos
10 segundos) en la proximidad de la llama.
3. Toma con la otra mano el recipiente (tubo,
placa, etc.), que contiene la muestra o los
8. Tipos de Cultivos y Tcnicas de Siembra.

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microorganismos. Si la muestra est en un
tubo, quita el tapn con los dedos anular y
meique y flamee la boca del tubo. Si la
muestra est en una placa, se coloca invertida
sobre la mesa y se levanta la parte de la placa
que contiene el medio de cultivo, llevndola a
la proximidad de la llama del mechero.
4. Trabajando en la proximidad de la llama, se
introduce el asa de siembra y se toma una
pequea cantidad de cultivo. Si el medio es
lquido, agite ligeramente el tubo y tome la
muestra que quedar adherida, por tensin
superficial, en el extremo del asa de siembra.
Si el medio es slido, se toma una pequea
porcin de colonia mediante un ligero roce con
el asa de siembra. Si la muestra se encuentra a
profundidad, se hunde una aguja (mejor que el
asa) dentro del medio hasta tomar una pequea
porcin de la misma.
5. Transfiere el inculo con el asa de siembra (o
pincho) a otro medio estril tomando las
mismas precauciones de antes en cuanto a las
condiciones aspticas.
Si la transferencia se va a realizar a un caldo,
se descarga el inculo mediante agitacin del
asa de siembra en aquel.
Si la transferencia se va a realizar en slant se
introduce el asa con el inculo y se siembra en
su superficie en zigzag (a veces
longitudinalmente).
Si la transferencia se va a realizar en placa, se
deposita el inculo en un rea pequea de la
superficie y cerca del borde para seguir con la
tcnica adecuada (estra nica, agotamiento en
estras paralelas u oblicuas, etc).
6. Una vez realizada la transferencia:
En el caso de los tubos, flamea la boca de los
mismos antes de colocar el tapn. Marca los
tubos con la identificacin del cultivo, la fecha
y el nombre, para pasarlo a incubacin.
En el caso de placas de PETRI, tape la placa
para incubarla, marcando en la base de la placa
la identificacin del cultivo, la fecha y el
nombre.
7. Antes de dejar el asa de siembra sobre la mesa,
flamea nuevamente con el objeto de
esterilizarla.

CULTIVOS EN PLACA.

Son los ms usuales junto con los tubos de
medio lquido. Se utiliza cuando se necesita una
gran superficie de medio (elevada relacin
superficie/volumen), generalmente para separar
una mezcla de bacterias, es decir, para el
aislamiento y resiembra hasta llegar a cultivos
puros, que son aquellos que contienen un nico
tipo de microorganismos.
1. Preparacin de las placas: En condiciones
aspticas, se depositan 10-15 mL de medio
fundido estril en una placa de PETRI tambin
estril, de manera que forme una delgada capa
que se deja solidificar. La parte exterior del
tubo de ensayo o del frasco debe secarse antes
de proceder al llenado de las placas, con el fin
de evitar que caigan en su interior gotas de
agua.
2. Secado de las placas: Una vez llenas las
placas y solidificado el medio, stas deben
secarse ya que la humedad que se forma sobre
la superficie del medio podra impedir la
formacin de colonias aisladas.
Secado rpido: Las placas se secan a 37 C en
estufa durante 20-60 minutos. En primer lugar
se coloca la tapa de la placa y despus se
invierte la parte de la misma que contiene el
medio, colocndose de tal forma que una parte
de la misma se apoye sobre la tapa. Con este
mtodo de secado se evita la contaminacin
producida por el polvo.
Secado convencional: Tambin pueden
secarse las placas cerradas en estufa durante
uno o ms das hasta la total evaporacin del
agua condensada en las tapas, sin quitar stas
y colocando como siempre las placas en
posicin invertida. Por este procedimiento,
tambin se detecta al mismo tiempo si una
placa ha resultado contaminada.
3. Siembra de las placas: Generalmente se
utiliza la inoculacin en superficie, trazando
una o varias estras con ayuda de un asa de
siembra. Se puede realizar por ms de una
tcnica:
Extensin en superficie: se distribuye,
empleando una esptula o un asa de
DRIGLASKI, el inculo por la superficie del
medio de cultivo contenido en la placa. Luego,
sin volver a cargar la esptula o asa, se repite
el proceso tantas veces como sea necesario
diluir la concentracin del inculo hasta
asegurar el aislamiento de las colonias,
preferiblemente una.
Aislamiento por agotamiento en estras: con un
asa de platino cargada de material se deposita

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en una zona sobre la superficie del medio y
cerca del borde de la placa. Se esteriliza el asa,
y sin cargar nuevamente se trazan estras en un
sentido, para repetir el proceso tantas veces
como sea necesario hasta poder lograr aislar
colonias aisladas, preferiblemente una nica.
Las estras pueden hacerse bien en
perpendicular, bien de forma oblicua.
Mtodo de dilucin: utiliza todo el medio de
cultivo, y no como en los dos epgrafes
anteriores que utilizaban exclusivamente la
superficie. Podemos depositar en una placa
vaca una gota de material objeto de nuestro
estudio, y verter sobre ella el medio de cultivo,
teniendo la precaucin de que est fundido
pero a temperatura adecuada (45 C) para
homogeneizar (con movimientos de vaivn en
dos direcciones perpendiculares), o bien,
preparar el medio de cultivo fundido y
atemperado en un tubo de ensayo, sembrar el
material objeto de estudio, homogeneizar por
rotacin vertical y verter el contenido en una
placa de PETRI. A esta tcnica tambin se la
denomina siembra en masa y le es aplicable
una doble capa con otros 5 mL de medio y una
vez solidificado el primero.

CULTIVOS MEDIANTE DILUCIONES
SERIADAS.

Consiste en realizar diluciones sucesivas de
la muestra en condiciones de esterilidad con objeto
de sembrar cantidades conocidas de las mismas en
placas de PETRI (o en tubos de cultivo segn
algunas tcnicas de recuento). Es obvio que
utilizando varias diluciones alguna de las mismas
ser tal que originar en una placa colonias
separadas y por tanto puras (o susceptibles de ser
contadas para las tcnicas de recuento).
De igual manera, conocidos el nmero de
colonias, la cantidad sembrada y la dilucin
correspondiente, esta tcnica permite evaluar el
nmero de grmenes viables de la muestra original.
Existen varios mtodos y se realizan con pipeta.
1. Obtencin de las diluciones seriadas:
Flamea ligeramente la punta de una pipeta de
10 mL, abre ligeramente el recipiente que
contiene la solucin estril, flamea la boca del
recipiente, toma 9,9 mL de contenido, flamea
nuevamente la boca del recipiente y tpalo.
Transfiere el volumen a un tubo estril,
flameando su boca despus de retirar su tapn
y antes de volverlo a poner (los tapones nunca
se dejan en la mesa, ni la pipeta debe tocar con
su extremo ningn objeto, ni abandonar la
zona de proximidad de la llama).
Con la misma pipeta, llena con 9,9 mL de la
solucin estril un nuevo tubo.
Con la misma pipeta, llena con 9 mL de la
solucin estril tantos tubos como sean
necesarios.
Con una pipeta estril de 1 mL y flameada se
toma 0,1 mL de la muestra original, se
transfiere al primer tubo con 9,9 mL, se agita y
se marca como 1/100 0 10
-2
.
Del tubo de 10
-2
, se toman 0,1 mL y se repite
el proceso con el segundo tubo de 9,9 mL de
contenido, para agitar y marcar como 10
-4
.
Con una pipeta estril de 1 mL y a partir de las
diluciones ya preparadas, toman 1 mL y
utilizando los tubos que contiene 9 mL de
solucin estril, preparar las diluciones
necesarias (usualmente las diluciones 3 y 5).
Tambin se puede preparar la serie de
diluciones decimales a partir de la disolucin
madre general de la muestra (-1, obtenida a partir
de 10 g o mL de la muestra en 90 mL de diluyente,
o mejor an, con 50 g o mL de muestra en 450 mL
de diluyente), tomando 1 mL de la misma para
llevarlo sobre un tubo con 9 mL de diluyente,
agitando y etiquetando, para repetir el proceso
(siempre con una pipeta estril nueva) tantas veces
como diluciones sean necesarias.
A cada denominador de la fraccin
considerada se le denomina factor de dilucin y es
imprescindible para realizar los recuentos.
2. Transferencia a las placas: Generalmente se
transfiere 0,1 1 mL de cada tubo seriado a la
placa (en funcin de que realicemos una
siembra en superficie o en masa) o a los tubos
de cultivo si as lo requiere la tcnica de
recuento. Si se desea utilizar una sola pipeta,
se debe comenzar por la de factor de dilucin
ms alto (la ms diluida), y seguir por este
orden. En caso contrario, habr de emplearse
una pipeta para cada dilucin. Todas las
pipetas debern depositarse en recipientes con

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solucin esterilizante despus de su uso.

MTODOS DE CULTIVO ANAEROBIO.

Para el cultivo de microorganismos
anaerobios se debe mantener un ambiente que
carezca de oxgeno, lo que se consigue mediante la
utilizacin de un medio que contenga sustancias
reductoras, o modificando algunos otros por
adicin de sustancias reductoras como la glucosa,
el tioglicolato sdico, el cido ascrbico o la
cistena.
Los medios ya preparados no pueden
conservarse durante mucho tiempo. El oxgeno
disuelto en un medio se elimina por calefaccin de
ste, y se evita la entrada del oxgeno atmosfrico
cubrindolo con una capa gruesa de agar, de
parafina o de vaspar (mezcla a partes iguales de
vaselina y parafina). Tambin pueden ser usadas
las vasijas anaerobias de cultivo. Como ejemplos
de medios de cultivo de microorganismos
anaerobios:
1. Medio carne cocida de ROBERTSON: Est
compuesto de carne picada, cuyas sustancias
reductoras mantiene la anaerobiosis del medio.
Si bien este medio es comercial, resulta menos
efectivo que preparndolo en el laboratorio.
2. Cultivo en masa en tubo: Se hace en tubos o
frascos que contienen un medio slido al que
se la ha aadido una sustancia reductora. Se
puede emplear un agar nutritivo al que se le
aade un 1 % de glucosa como reductor.
3. Cultivo en medio semislido: Estos medios,
evitan la difusin del oxgeno. Se le aade azul
de metileno como indicador del potencial
redox del medio, permaneciendo azul en
presencia de oxgeno y decolorndose en
ausencia del mismo. Un medio de color azul
verdoso debe calentarse antes de ser usado,
siendo suficiente colocando al bao Mara
durante unos 10 minutos. El medio ms
utilizado de este tipo es el denominado medio
de clostridios reforzado que contiene glucosa y
cisterna como agentes reductores.
4. Cultivos en medios lquidos: Los medios
lquidos pueden mantenerse en condiciones
anaerbicas si se utilizan materiales estriles
que garanticen un cierre hermtico. Los tubos
que contienen los medios de cultivo deben ser
sometidos a calefaccin (bao Mara durante
10 minutos) y posteriormente deben ser
sellados (con vaselina, parafina slida o agar)
despus de sembrados, o antes, para lo cual se
deben sembrar posteriormente (utilizando
pipetas capilares) una vez fundido el cierre. Se
ha generalizado el uso del vaspar que se
prepara fundiendo conjuntamente, cantidades
de vaselina y parafina a partes iguales. El uso
de parafina lquida ha sido relegado, pues
resulta imposible la deteccin de la formacin
de gas.

VASIJAS ANAEROBIAS.

Con el fin de cultivar y aislar bacterias
anaerobias, se pueden encerrar en vasijas
anaerobias las placas y los tubos conteniendo
cualquier medio que se va a cultivar en una
atmsfera sin oxgeno.
El aire en una vasija anaerobia puede
sustituirse por nitrgeno sin oxgeno.
La vasija anaerobia tambin aprovecha, la
reaccin cataltica, y no explosiva, que se produce
entre en el hidrgeno y el oxgeno, eliminando ste
ltimo. Estas vasijas, pueden realizar su catlisis
bien en fro o en caliente con suministro elctrico.
Existen varios mtodos:
1. Utilizacin de suministro exterior de
hidrgeno: Donde adems de los cultivos se
coloca un indicador redox. Si utilizamos
placas, conviene separar ligeramente las dos
mitades con una tira estrecha de papel de filtro
para evitar que el agua de condensacin las
una. Es preciso antes de llenar de hidrgeno
(para evitar el peligro de explosin) hacer el
vaco a la vasija para eliminar el oxgeno.
2. Mtodo Gaspak: El suministro de
hidrgeno es interno al poner en un recipiente
metlico borohidruro sdico (que al
reaccionar con el vapor de agua forma
hidrgeno) y una mezcla de cido ctrico e
hidrogenocarbonato sdico (que forma
dixido de carbono en contacto con agua). La
reaccin entre el hidrgeno y el oxgeno se
verifica mediante un catalizador en fro. Como
medio indicador se suele utilizar azul de
metileno.
3. Sustitucin de oxgeno por nitrgeno: Para
hacer mnimo el oxgeno residual, se llena y
vaca varias veces la vasija.
4. Mtodo de la vela: Es un mtodo sencillo y
econmico que utiliza un trozo de vela y un
frasco, preferentemente de rosca, que pueda
ser cerrado hermticamente. Una vez

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dispuesto el cultivo y encendida, al cerrar la
vela consume todo el oxgeno hasta apagarse,
consiguiendo tener as una atmsfera
anaerobia.

CULTIVO EN ATMSFERA DE CO
2
.

Algunas bacterias, como ciertos tipos de
Brucella, crecen solamente en atmsferas que
contengan una elevada concentracin de dixido
de carbono. Otras, aunque no es absolutamente
necesario, crecen mejor en atmsferas enriquecidas
en este gas.
El suministro del dixido de carbono a
travs de botellas rara vez es utilizado.
Como generador interno se suele utilizar
un trozo de mrmol en reaccin con cido
clorhdrico que produce una concentracin
aproximada del 5 %, o mediante el empleo de
generadores comerciales como el utilizado en el
mtodo GasPak.

CARACTERSTICAS MORFOLGICAS
Y DE CULTIVO DE UNA BACTERIA.

Sin querer ser exhaustivos, en una primera
aproximacin deben describirse tanto las
caractersticas morfolgicas de las bacterias
(obtenidas mediante su visualizacin
microscpica), como las caractersticas de los
cultivos, es decir, las caractersticas de las colonias
que se pueden formar en funcin del medio de
cultivo.
1. MORFOLOGA BACTERIANA.

1. Coloracin de GRAM.
2. Forma.
3. Tamao.
4. Ordenacin.
5. Movilidad.
6. Presencia de otros elementos:
Cpsulas.
Flagelos.
7. Coloracin con tinciones especiales:
ZIEHL-NEELSEN.
Tincin negativa.

2. CARACTERSTICAS CULTIVO.

1. Colonias en superficies de medios slidos:
1. Forma:
Circular.
Irregular.
Rizoide, etc.

2. Tamao: Se designa en mm. Se dice
que es puntiforme si en menor de 1
mm.
3. Cromognesis: Color del pigmento y si
es soluble o no en el medio.
4. Opacidad:
Transparente.
Translcido.
Opaco.
5. Elevacin:
Plano.
Elevado.
Convexo.
Prominente, etc.

6. Superficie:
Formas de crecimiento de colonias bacterianas

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Lisa.
Rugosa.
Mate.
Brillante.
7. Forma del borde:
Entero.
Ondulado.
Lobulado.
Dentado.
Rizoide, etc.

8. Consistencia:
Mantecosa.
Viscosa.
Granular.

9. Capacidad de emulsin: Fcil o difcil
en agua; forma una suspensin turbia
uniforme; forma una suspensin
grumosa; no emulsiona.
10. Olor: No existe; existe y descripcin
del mismo.

2. Colonias en cultivo en caldo:
1. Cantidad de crecimiento:
Ninguna.
Escasa.
Moderada.
Abundante, etc.

2. Crecimiento en la superficie: Positivo
o negativo; formacin de un anillo;
pelcula que se desintegra o no al
agitar.
3. Turbidez:
Uniforme.
Floculenta.
Negativa.
4. Depsito: Cantidad; granular,
floculento, viscoso; se desintegra o no
al agitar.

3. Colonias en cultivo en masa: Se debe anotar
el crecimiento y su situacin; en la superficie;
en el fondo, teniendo en cuenta su profundidad
comparndola con la posicin del crecimiento
ptimo.

4. Colonias en cultivo en slant: Se debe anotar
el crecimiento y su situacin en la superficie,
su abundancia y su forma.
Arborescente.
Perlado.
Equinulado.
Filiforme,
Rizide.
Esparcido, etc.

Tipos de Bordes de colonias bacterianas
Tipos de crecimiento en slant
Tipos de crecimiento en caldo
Anlisis Microbiolgicos Unidad Temtica 9. Incubacin y Conservacin de Cultivos

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INCUBACIN.

En microbiologa es el proceso mediante el
cual se consigue el crecimiento de las bacterias
cuando una vez sembradas en el medio adecuado
se introducen en la estufa de incubacin a la
temperatura ms adecuada para cada cultivo. Tanto
la temperatura como el tiempo de incubacin estn
en funcin no slo del microorganismo, sino
tambin en funcin de la observacin o medicin
que queramos realizar, e incluso del tipo y medio
usado para el cultivo.
Como es obvio, el medio ambiente
necesario no slo lo dan los nutrientes y la
temperatura de incubacin, sino tambin la
atmsfera en la cual se lleva a cabo, como ha
quedado expuesto en el tema anterior cuando se ha
hablado del cultivo de anaerobios.
Como norma general las puertas de la
estufa de incubacin no deben permanecer abiertas
ms de lo necesario.
Si fuera posible, es preferible el uso de
estufas diferentes para diferentes temperaturas en
lugar de cambiar en cada estufa su temperatura de
uso.
Los cultivos en placa, en general, deben
ser incubados en posicin invertida para evitar que
la humedad condensada caiga sobre las colonias en
crecimiento y pueda afectarles.

EFECTO TEMPERATURA.

Cuando se estn llevando a cabo estudios
de identificacin, los cultivos deben incubarse a la
temperatura ptima de crecimiento de la bacteria
en cuestin, excepto en el caso de ciertos medios
especiales como, por ejemplo, las siembras por
picadura en gelatina que siempre se cultivan a 22
C.
Si el cultivo se va a llevar a cabo con el fin
de obtener datos sobre la movilidad o los tipos de
flagelos, la incubacin deber realizarse a una
temperatura inferior a 3-5 C de la temperatura
ptima de crecimiento.
Si se trata de estudiar el potencial
deterioro, la temperatura de incubacin depender
de las condiciones de almacenamientos previstas, o
recomendadas, segn el alimento en cuestin.

EFECTO TIEMPO.

El segundo parmetro en importancia de la
incubacin, entendiendo que el medio ambiente es
el ptimo para el crecimiento, es el tiempo.
En general el tiempo deber ser suficiente
para que se formen el nmero de generaciones
suficientes para su identificacin y recuento.
A partir de este tiempo, que estar como
siempre en funcin del tipo de cultivo, del
microorganismo objeto de nuestro estudio y de la
finalidad del trabajo a realizar, cuanto ms tiempo
transcurra ms problemas se pueden ocasionar,
principalmente por dos motivos.
1. El envejecimiento de los cultivos que hace que
no den las reacciones especficas que de ellos
se espera, o incluso puedan dar otras
diferentes.
2. La tasa de mutacin aumenta con el tiempo
con lo que puede cambiar el serotipo
predominante en el medio de cultivo y que no
corresponda al inculo sembrado.

CONSERVACIN DE CULTIVOS.

Una vez conseguido un cultivo puro,
perfectamente identificado, a veces, resulta til su
conservacin durante periodos de tiempo ms o
menos largos.
En los laboratorios, principalmente de
9. Incubacin y Conservacin de Cultivos.

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investigacin, cada uno de los cultivos puros se
conserva para investigaciones ulteriores, o
simplemente para poder corroborar las pruebas, o
incluso, para tomarlos como modelos. A estas
colecciones de cepas puras se las denomina
ceparios.
Existen diversos procedimientos para
conservar y mantener cultivos microbianos. El
mtodo adecuado depende del tipo de
microorganismo y del perodo de tiempo de
conservacin que se requiera.

MANTENIMIENTO PERIODOS CORTOS.

1. Refrigeracin simple: Es habitual emplear la
refrigeracin entre 4-8 C como medio de
mantener los cultivos, puesto que muchos de
los cultivos puros de bacterias, levaduras,
hongos y otros microorganismos, pueden
permanecer como viables durante varias
semanas a las mencionadas temperaturas.
Estos cultivos se deben transferir con cierta
periodicidad, que depender del tipo de
cultivo, a medios de cultivo frescos. No
obstante, debe tenerse presente que algunos
microorganismos (psicrfilos) son capaces de
crecer a la temperatura normal de
refrigeracin.

2. Cultivo en agar inclinado: Son muchas las
bacterias que pueden conservarse sobre la
superficie de agar inclinado (agar nutritivo,
agar extracto de malta) y la eleccin del medio
depender del microorganismo considerado.
Estos cultivos inclinados pueden realizarse en
tubos de ensayo o frascos provistos de tapones
de rosca para evitar que se sequen los cultivos.
Una vez crecidos, los cultivos pueden
almacenarse en una zona oscura, a temperatura
ambiente o en refrigerador, pero en cualquier
caso debe hacerse un paso a intervalos de entre
un mes y dos aos en funcin de la especie a
conservar.

3. Cultivos en medio lquido: Los cultivos de las
bacterias del cido lctico entre otras no se
desarrollan bien en la superficie de medios
slidos incubados en condiciones aerbicas
siendo preferibles mantenerlos en medio
lquido, como la leche tornasolada con
levadura glucosa y yeso, o la carne cocida de
ROBERTSON, para realizar un pase cada 2-4
meses a un ao. Los medios que llevan leche o
azcares aadidos deben tambin contener
yeso que actuar como amortiguador en el caso
de que se produzca un pH demasiado bajo.
Una vez muertas las bacterias en la capa de
leche coagulada del medio, las bacterias
viables pueden quedar mezcladas con el
sedimento de yeso.


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MANTENIMIENTO PERIODOS LARGOS.

1. Conservacin en aceite: Los cultivos que se
dejan crecer en agar inclinado o los cultivos en
profundidad mediante inoculacin por
picadura son posteriormente cubiertos con
parafina lquida estril o aceite mineral estril.
Los cultivos preparados de esta forma
conservarn generalmente su viabilidad
durante varios aos sin necesidad de hacer
pases.
2. Suspensiones en suero desecado: Se suspende
un asa del inculo tomado de un cultivo de 24-
48 horas en 2 mL de suero estril y de esta
suspensin se pone una gota en cada uno de
una serie de tubos de 50 X 6 mm, estriles y
provistos de tapones. Se secan al vaco -en
desecador sobre pentxido de fsforo durante
unos 7 das (volviendo a efectuar el vaco cada
24 horas) a 5 C. Cada tubo, conteniendo una
suspensin totalmente seca, se coloca dentro
de otro mayor de vidrio sdico de fcil
fusibilidad al que se le hace el vaco y se cierra
a la llama As pueden almacenarse en la nevera
o el congelador pudiendo permanecer viables
durante varios aos sin necesidad de pases
continuos.
3. Congelacin: Tambin denominada
crioconservacin. En general los congeladores
habituales que slo alcanzan 20 C no son
recomendables por la proximidad de esta
temperatura con el eutctico (disolucin de
slidos que solidifican como slidos
separados) de varias sales comunes. Por ello se
recurre a congeladores especiales que alcanzan
temperaturas de 70 C, o mejor an, por
introduccin en nitrgeno lquido (-195 C).
Este mtodo tiene un inconveniente, y es que
durante el proceso de congelacin, an siendo
rpido, se destruye una proporcin variable de
microorganismos (incluso con el uso de
crioprotectores) en funcin del tipo de
microorganismo. Un mtodo econmico y
sencillo recurre a la congelacin del medio de
cultivo en viales pequeos que contengan
leche descremada estril al 10 % o glicerol al
15 %. Dependiendo de la temperatura los
periodos de conservacin pueden llegar a ser
superiores a 10 aos.

4. Liofilizacin: La liofilizacin es un proceso
que permite desecar casi totalmente una
estructura biolgica, previamente congelada,
sublimando bajo vaco el agua (hielo) que
contiene. Los microorganismos se liofilizan en
presencia de una agente protector y se guardan
en ampolladas selladas al vaco con lo que se
pueden llegar a lograr periodos de
conservacin de ms de 20 aos.

VELOCIDAD DE CRECIMIENTO.

La determinacin de la velocidad de
crecimiento en un cultivo puro puede ser til
cuando se realizan estudios en relacin con el
deterioro de los alimentos y cuando resultan
insuficientes los anlisis de calidad de la
conservacin o la incubacin de muestras de
comida. Por otro lado, siempre es vlido para

La casa Laboratorios Microkit, S.L.
proporciona Criotecas con viales especiales para
mantener a los microorganismo conservados durante
aos. Cada vial contiene 25 aros de vidrio poroso y un
lquido criognico, CRIOBOX, diseado para asegurar
la supervivencia y una recuperacin cuantitativa
optimizada para gran cantidad de microorganismos,
bacterias gram-negativas y gram-positivas, levaduras y
hongos. Su uso es simple:

1. Introduce una colonia o una suspensin espesa
del cultivo (reciente) en el vial.
2. Cierra el vial y voltea 10 veces para mezclar
perfectamente.
3. Con jeringa (estril) elimina todo el lquido
posible.
4. Cierra el vial. Etiqutalo. Ponlo en posicin
horizontal y da un golpe seco.
5. Congele el vial entre 20 - -60 C.
6. Cuando necesite una cepa pura, tome un aro
del vial con un palillo estril.
7. Rudelo sobre el agar no selectivo. Si es de
difcil crecimiento revitalice antes en caldo.


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determinar si el proceso de incubacin resulta
correcto.

Si es posible deben utilizarse muestras
recin aisladas. El inculo puede consistir bien en
un cultivo en medio lquido (cuando este es el
medio a emplear en la prueba) o bien una
suspensin de bacterias lavadas. El medio de
cultivo se distribuye en cantidades de 100 mL en
matraces cnicos, se esteriliza y se grada la
temperatura correcta de incubacin antes de
proceder a la siembra.
La siembra se realiza de tal forma que la
concentracin bacteriana sea de 10
4
por mL; se
mezcla el matraz hacindolo girar y se extrae una
muestra de 1 mL con el fin de preparar diluciones
decimales y de determinar el recuento de viales y
dar por comenzado el tiempo experimental, t
0
.
Con intervalos frecuentes se extraen las
muestras y se realizan los recuento con el fin de
disponen de datos suficientes, antes de comenzar la
fase estacionaria, como para representar curvas de
crecimiento vlidas y poder realizar un clculo
fiable del tiempo de generacin.
Se representan los resultados obtenidos
como el logaritmo decimal de los recuentos en
ordenada y el tiempo de incubacin en minutos en
abscisas.
Para calcular el tiempo de generacin se
puede aplicar la frmula:

Donde G es el tiempo medio de generacin
y a y b el nmero de bacterias en dos puntos de la
fase de crecimiento logartmico separados por el
intervalo de tiempo t.

Esta tcnica puede resultar particularmente
til para comparar el efecto de la temperatura en la
incubacin y el estudio de preservadores
alimentarios.

T (m) N microorganismos
0 10000
20 10000
40 15000
60 20000
80 40000
100 80000
120 160000
140 320000
160 640000
180 1280000
200 2560000
220 5120000
240 10240000
260 11000000
280 11400000
300 11500000
320 11550000
340 11600000
360 11600000
0 100 200 300 400
10
3
10
4
10
5
10
6
10
7
10
8
t(minutos)

X
(minutos)
Y
(N M icroorganismos)

109

123000

183

1300000

G = 22 minutos

a b
t
G
log log
2 log
=
Anlisis Microbiolgicos Unidad Temtica 10. Identificacin y Recuento

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ANLISIS MICROBIOLGICOS.

La industria tiene el objetivo fundamental
de obtener productos conforme a las disposiciones
reglamentarias, lo que supone:
1. Bajos recuentos de microorganismos, lo que
generalmente prolonga la vida til del
producto, y, por tanto, asegura la calidad
comercial.
2. Ausencia de patgenos, por la peligrosidad
para la salud del consumidor, lo que supone
aumentar la calidad higinica y sanitaria.
Por ello es fundamental la realizacin de
controles cualitativos y cuantitativos de
microorganismos, para poder asegurarnos de los
requisitos anteriores. El anlisis microbiolgico, en
general, tiene como finalidades:
1. Conocer el nmero de microorganismos
totales.
indicadores.
alterantes o de otros grupos especiales.
4. Investigar microorganismos productores de
infecciones e intoxicaciones alimentarias.
5. Detectar los productos metablicos de los
microorganismos (generalmente en
laboratorios especializados).

FASES PARA LA IDENTIFICACIN DE
MICROORGANISMOS.

Existen 7 etapas o fases bien definidas para
la identificacin de microorganismos y
generalmente, como fase previa a la cuantificacin:
1. Obtencin de un cultivo puro.
2. Estudio de los caracteres culturales o de suma
de colonias.
3. Estudio de los caracteres morfolgicos de las
clulas.
4. Estudio de los caracteres sexuales.
5. Estudio de los caracteres bioqumicos y
fisiolgicos.
6. Estudio de los caracteres inmunolgicos.
7. Estudio de patogenicidad.
El primer punto, la obtencin de un cultivo
puro, es un requisito esencial, no solo en el caso de
la identificacin de los microorganismos, sino
tambin en el caso de la cuantificacin de los
mismos, es decir en el recuento o determinacin
del nmero de bacterias viables en una muestra.

ESTUDIO DE LOS CARACTERES
CULTURALES, MORFOLGICOS Y
FISIOLGICOS.

1. CARACTERES CULTURALES.

A partir de un cultivo puro, se realiza el
estudio de los caracteres culturales, o debidos la
unin de colonias en un cultivo. Las caractersticas
observables van a depender del medio de cultivo, y
resumiendo, tenemos:
1. Medio lquido: Se observa sobre el lquido:
Formacin de depsitos.
Formacin de vela.
Formacin de gas, etc.
2. Medio slido: Se observa la colonia:
Forma.
Tamao.
Color. Aspecto, etc.
3. En agar inclinado:
Cultivo rectilneo.
Cultivo invasivo.
Cultivo mucoso,etc.

2. CARACTERES
MORFOLGICOS.

A partir de un cultivo puro se observan los
caracteres morfolgicos, resumiendo:
1. Examen en fresco entre portaobjetos y
cubreobjetos de las bacterias vivas.
2. Examen despus de tincin de Gram.
3. Examen despus de tinciones especiales:
Tincin de esporas.
Tincin de cilios.
Tincin de cpsulas bacterianas.
4. Estudio con potasa:
Gram-positivos, forman emulsin.
Gram-negativos, forman filamentos mucosos.
No es una prueba confirmativa.

3. CARACTERES FISIOLGICOS.

A partir de un cultivo puro, se pueden
determinar como caractersticas fisiolgicas:
1. Tipo energtico y nutricional.
2. Tipo respiratorio.
3. Evidencia de enzimas (oxidasa, catalasa y
peroxidasa, etc.).
4. Metabolismo de las sustancias nitrogenadas
(degradacin de aminocidos, degradacin de
10. Identificacin y Recuento.

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protenas, hidrlisis de la urea, etc.).
5. Metabolismo de los hidratos de carbono.
6. Metabolismo de los lpidos.
7. Otras propiedades (sensibilidad y resistencia a
antibiticos, etc.).

PRUEBAS BIOQUMICAS PARA EL
ANLISIS DE BACTERIAS.

Sin nimo de ser exhaustivos vamos a ver
las pruebas ms comunes utilizadas en el
laboratorio microbiolgico.
Es importante comprobar que los reactivos
estn perfectamente en condiciones con el uso de
una cepa purificada de una bacteria que produzca
la reaccin positiva.
Asimismo, se puede incubar un blanco
limpio con el fin de detectar cualquier falso
positivo producido por impurezas o deterioro de
los medios utilizados o de los reactivos.

1. PRUEBAS RELACIONADAS CON
PROTENAS, AMINOCIDOS Y OTROS
COMPUESTOS NITROGENADOS, AS
COMO PRUEBAS DE ACTIVIDAD
PROTEOLTICA.

1. Hidrlisis de la gelatina.
Gelatina nutritiva:
- Medio: Caldo nutritivo a un pH de 7,2 al que
se le aade un 10-15 % de gelatina.
- Siembra: Picadura en tubo.
- Incubacin: Hasta 30 das a 20-25 C.
- Reactivo: Autorreactivo.
- Lectura: Licuacin de la gelatina.
Agar gelatina de FRAZER:
- Medio: Agar nutritivo a un pH de 7,2 al que se
le aade un 0,4 % de gelatina.
- Siembra: Estra superficial en placa.
- Incubacin: De 2 a 14 das a temperatura
ptima.
- Reactivo: Cloruro de mercurio (II).
- Lectura: La gelatina hidrolizada aparece como
una zona clara sobre fondo blanco opaco, que
forma el reactivo por inundacin, de la gelatina
no hidrolizada
2. Hidrlisis de la casena.
- Medio: Agar leche (descremada al 10 %).
- Siembra: Estra superficial en placa.
ptima.
- Reactivo: Cloruro mercrico con cido
clorhdrico o cido tnico al 1 %.
- Lectura: Zonas claras por hidrlisis de la
casena.
3. Hidrlisis del suero coagulado.
- Medio: Suero LOEFFLER, tres partes de suero
y una de caldo nutritivo glucosado.
- Siembra: En superficie del suero inclinado.
ptima.
- Lectura: Licuacin del suero coagulado.
4. Produccin de indol a partir del triptofano.
- Medio: Agua de peptona a pH 7,2.
- Siembra: Como caldo nutritivo.
ptima.
- Reactivo: Kovacs para indol.
- Lectura: Color rojo intenso en la capa
alcohlica.
C
N
O
H
H3C
H3C
N
TRIPTOFANO CH
3
COCOOH + NH
3
+
ROSINDOL
(ROJO)

5. Produccin de amoniaco a partir de la
peptona o de la arginina.
Agua peptona:
- Medio: Agua peptona.
- Siembra: Como caldo en tubo.
ptima.
- Reactivo: Reactivo de NESSLER.
- Lectura: Color entre rojo y marrn al mezclar
el cultivo con el reactivo en tubo, o en cpsula
de porcelana.
Caldo arginina:
- Medio: Utilizado habitualmente para
estreptococos.
ptima.
- Reactivo: Reactivo de NESSLER.
- Lectura: Color entre rojo y marrn al mezclar
el cultivo con el reactivo en tubo, o en cpsula
de porcelana.
6. Produccin de cido sulfhdrico.
Caldo cistina o cistena:
- Medio: Agua peptona o caldo nutritivo al que
se aade un 0,01 % de cistina o cistena.
ptima.
- Reactivo: Tiras de papel saturado de acetato de
plomo.
- Lectura: Color negro del papel, sujeto al tapn,
al liberarse el gas. Aveces es necesario aadir
gotas de cido HCl 2 N para liberar el gas.
Gelatina cloruro ferroso:
- Medio: Gelatina nutritiva con un 0,05 % de
cloruro ferroso.
- Siembra: Picadura en tubo.

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- Incubacin: Durante 7 das a 20-25 C.
- Lectura: Enegrecimiento del medio.
Agar hierro de KLINGER:
- Medio: Agar que contiene un 0,03 % de
citrato frrico. Contiene lactosa y glucosa.
- Siembra: Picadura en el cilindro y superficial
en la lengeta.
- Incubacin: Hasta 7 das a temperatura ptima.
- Lectura: Ennegrecimiento del medio.
Identifica bacterias que fermentan los
azcares.

7. Produccin de amoniaco a partir de urea.
- Medio: Agar urea de CHRISTENSEN, que
contiene un 2 % de urea.
- Siembra: Cultivo inclinado.
ptima.
- Reactivo: Indicador cido-base.
- Lectura: La formacin de amoniaco vira el
indicador.
8. Reduccin del nitrato.
- Medio: Agua de peptona con un 0,02-0,2 % de
nitrato potsico.
- Siembra: Como caldo.
ptima y con campana DURHAM.
- Reactivo: Reactivo de GRIESS-ILOSVAY
modificados o tiras autorreactivas de nitrito.
- Lectura: Color rojo en pocos minutos al aadir
1 mL de cada reactivo. Si el resultado es
negativo, debe confirmarse por adicin de cinc
en polvo. La formacin de color rojo indicar
que queda un residuo de nitrato. Si resulta
negativo, indica que no queda nitrato al haber
sido reducido ms all del nitrito. La presencia
de gas en la campana Durham, indica la
formacin de nitrgeno gaseoso.
9. Accin sobre la leche tornasolada.
- Medio: Leche tornasolada.
- Incubacin: Hasta 14 das a temperatura
ptima.
- Reactivo: Autorreactivo del propio tornasol.
- Lectura: Pueden producirse diversas
reacciones y combinaciones de estas, al
contener adems del indicador, lactosa, casena
y otros componentes.
Respecto a la lactosa, la produccin de
cido se detecta por un viraje del tornasol a color
rosa. Si el cido producido es abundante coagular
la leche, reaccin conocida como coagulacin
cida. Es posible que haya existido reduccin y,
por tanto, prdida del color del tornasol. Tambin
puede producir gas, si bien es solo visible si ha
existido coagulacin.
Respecto de la casena, su hidrlisis
provoca la coagulacin del medio pero el tornasol
permanece azul. Es conocido como coagulacin
dulce. La accin de la hidrlisis puede aclarar el
medio, reaccin conocida como peptonizacin.
Tambin puede producirse reaccin alcalina como
consecuencia de la produccin de amoniaco.
La utilizacin del citrato en el medio lcteo
produce una reaccin alcalina poniendo de azul
oscuro el tornasol.
La complejidad de todas estas reacciones
hace necesario la observacin diaria, anotndose
cualquier cambio que se observe en el medio.

2. PRUEBAS RELACIONADAS CON LOS
CARBOHIDRATOS Y OTROS
COMPUESTOS CARBONADOS.

1. Hidrlisis del almidn.
- Medio: Se puede ensayar sobre medios
lquidos y slidos, aunque el ms conveniente
quiz sea el agar almidn.
- Siembra: En placa, en superficie mediante una
estra o un botn.
ptima (con campana DURHAM si es medio
lquido).
- Reactivo: Lugol, y tal como se utiliza en la
tincin de GRAM.
- Lectura: Inundacin de las placas con 5-10 mL
de lugol. Si se ha producido la hidrlisis, el
almidn se tie de azul. Las reas de hidrlisis
aparecen como zonas claras, como
consecuencia de la actividad de la -amilasa.
La aparicin de zonas color marrn rojizo
alrededor de la colonia, indica que se ha
producido la hidrlisis de las dextrinas por la
accin de la -amilasa.
2. Produccin de cidos a partir de azcares,
glucsidos y alcoholes polihidroxlicos.
- Medio: Agua de peptona u otro medio bsico
con un 0,5-1,0 % de substrato al que se le ha
aadido un indicador para evidenciar la
formacin de cido, generalmente rojo fenol o
prpura bromocresol.
- Incubacin: Hasta 7 das a temperatura ptima
y con campana DURHAM.
- Reactivo: Autoindicador.
- Lectura: Cambio de color del indicador cido-
base. La presencia de gas se manifiesta por su

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presencia en la campana DURHAM.
3. Diferenciacin entre la oxidacin y
fermentacin de carbohidratos.
- Medio: De HUGH y LEIFSON, con indicador de
pH y un 1 % de carbohidrato.
- Siembra: Por picadura en 2 tubos por cada
carbohidrato utilizado, sellando uno con
parafina lquida, vaspar, o agar estril.
ptima y con campana DURHAM.
- Lectura: Cambio de color de indicador
utilizado. Las bacterias que producen
fermentacin, producen reaccin positiva en
los dos tubos. Las oxidativas solamente dan
reaccin positiva en el tubo abierto.

4. Produccin de dixido de carbono a partir
de glucosa.
- Medio: Medio de GIBSON o jugo de tomate
semi-slido. Este medio se compone de 4
partes de leche y una parte de agar nutritivo al
que se le aade un 0,25 % de extracto de
levadura, un 5 % de glucosa y un 10 % de jugo
de tomate, ajustando el pH final a 6,5. El
tomate puede ser sustituido por manganeso en
1-10 ppm (utilizando como reactivo MnSO
4
al
0,4 %).
- Siembra: En masa, cerrando el tubo con agar.
ptima.
- Lectura: Cualquier produccin de dixido de
carbono queda retenido por el tapn de agar,
cuartendose y formndose burbujas en el
medio, para cuya liberacin necesita a veces
calentar el medio.
5. Prueba del rojo de metilo.
- Medio: Caldo glucosa fosfato (CLARK-LUBS).
ptima.
- Reactivo: Solucin de rojo de metilo en
disolucin hidroalcohlica.
- Lectura: Se aaden unas gotas del indicador a
5 mL de cultivo. Si el medio toma un color
rojo, la reaccin es positiva, lo que indica un
pH menor o igual a 4,5. En caso contrario
aparecer un color amarillo.
6. Prueba de VOGES-PROSKAUER.
Se lleva a cabo para visualizar la
produccin de acetilmetilcarbinol a partir de la
glucosa. Despus de la incubacin se aade al
medio sembrado un lcali que producir su
oxidacin a diacetilo. El diacetilo combinado con
la arginina, creatina (o creatinina), ofrecer un
color rosado.
- Medio: Caldo glucosado fosfato.
ptima.
- Reactivo: Se puede utilizar o creatina y una
solucin de hidrxido sdico al 40 %, segn
OMEARA, o solucin etanlica de -naftol al
6 % con hidrxido potsico al 16 %, segn
BARRIT.
- Lectura: Si utilizamos el procedimiento de
OMEARA, se aade al cultivo una punta de
esptula de creatina y 5 mL de solucin de
NaOH, que por agitacin del tubo produce un
color rosado antes de 30 minutos. En el caso
del procedimiento de BARRIT, se aaden 0,5
mL de -naftol y la misma cantidad de kOH,
que tras agitacin forma una coloracin roja al
cabo de unos 5 minutos. Es ms sensible este
ltimo mtodo, pudiendo detectarse hasta 1
ppm de acetilmetilcarbinol.
7. Utilizacin del citrato como nica fuente de
carbono.
Medio de citrato de KOSER:
- Medio: Medio citrato de KOSER.
- Siembra: Como caldo, pero inoculando con
aguja, con el fin de no introducir demasiado
cultivo y demasiadas sustancias orgnicas.
- Lectura: La formacin de turbidez indica el
crecimiento, lo que implica que el citrato es la
nica fuente de carbono al no existir otra. Es
aconsejable hacer varios pases para asegurar el
resultado positivo comparado con tubos de
control.
Agar citrato SIMMONS:
- Medio: Agar citrato con azul de bromotimol
como indicador.
- Siembra: Con aguja de platino en superficie en
cultivos inclinados con larga lengeta y
pequeo cilindro.
- Lectura: La utilizacin del citrato y el
crecimiento sobre el agar citrato producen una
reaccin alcalina virando el indicador de verde
a azul intenso.
8. Produccin de polisacrido a partir de
sacarosa.

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- Medio: Agar sacarosa, agar nutritivo que
contiene un 5 % de sacarosa.
- Siembra: En placas por estras hasta
agotamiento.
- Incubacin: De 1 a 14 das a 20-25 C.
- Lectura: Si se ha producido la sntesis de
dextrano o levano, a partir de la sacarosa, las
colonias (que deben estar siempre
perfectamente aisladas) adquieren un aspecto
de mucosa.
9. Accin de la leche tornasolada.
Ya visto anteriormente (Seccin 1,
epgrafe 9).

3. PRUEBAS RELACIONADAS CON
GRASAS Y SUSTANCIAS AFINES,
INCLUYENDO PRUEBAS DE ACTIVIDAD
LIPOLTICA.

1. Hidrlisis de la tributirina.
- Medio: Agar tributirina, agar extracto de
levadura a pH 7,5 que contiene tributirina.
- Siembra: En placa, con doble capa, capa de
agar levadura y agar de tributirina, por estra
superficial.
ptima.
- Lectura: La clarificacin del medio formando
un halo claro confirma la hidrlisis,
generalmente, a causa de la lipasa.
2. Liplisis.
Agar grasa de mantequilla o aceite de oliva:
- Medio: Agar extracto de levadura, a pH 7,8,
que contiene emulsionada un 5 % de grasa de
mantequilla o aceite de oliva.
- Siembra: En placa por estra superficial.
ptima.
- Reactivo: Solucin saturada de sulfato de
cobre (II).
- Lectura: Se inundan las placas con 8-10 mL de
la solucin reactiva dejando reposar durante 15
minutos. Se elimina el reactivo y se lava al
agua de grifo durante una hora hasta eliminar
el exceso de sulfato de cobre. La aparicin de
halo de color verde azulado, por formacin de
las sales de cobre insolubles con los cidos
grasos liberados, indica la existencia de
liplisis.
Agar mantequilla o margarina azul victoria:
- Medio: Agar de margarina (ms estable) o
mantequilla que contiene azul victoria como
indicador de cidos grasos libres.
ptima.
- Lectura: Donde se haya producido la actividad
lipoltica, los cidos grasos libres reaccionan
con el azul victoria formando sales de color
azul intenso, como un halo rodeando o debajo
de las colonias, sobre un fondo malva rosado
del medio.
3. Hidrlisis de los compuestos del Tween.
Los Tween son steres comerciales del
cido lurico, palmtico, esterico u olico.
- Medio: Agar Tween, que incluya adems, sales
de calcio para actuar como indicador.
- Siembra: En placa por estra superficial o en
botn.
ptima.
- Lectura: La aparicin de un halo opaco
alrededor de la colonia, debido a la
precipitacin de las sales clcicas de los cidos
grasos libres, indica la actividad lipoltica. No
slo puede actuar la lipasa sino otras esterasas,
sobre todo en las micelas formadas por tween
y agua.
4. Hidrlisis de la lecitina.
- Medio: Agar yema, agar nutritivo al que se le
ha aadido cloruro sdico al 0,9 % y emulsin
de yema de huevo al 10 %.
- Siembra: En placa, por estra superficial.
ptima.
- Lectura: Formacin de un halo opaco
alrededor del rea de crecimiento microbiano.
Tambin puede utilizarse caldo yema, de la
misma composicin y cuya lectura es la
opacidad del caldo y la formacin de un grueso
cogulo.

4. OTRAS PRUEBAS.

1. Prueba de la catalasa.
La mayor parte de las bacterias que crecen
en placas incubadas en condiciones aerbicas
contienen la enzima catalasa, si bien la cantidad de
sta es variable segn la especie y dentro de la
especie incluso de la cepa. En cambio los
anaerobios obligados, dan reaccin negativa a la
catalasa.
- Medio: Agar nutritivo.
ptima.
- Reactivo: Agua oxigenada de 10 volmenes,
recientemente preparado y mantenido en
refrigerador entre ensayos. Se puede utilizar

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adicionando 1 mL en la superficie del cultivo,
o bien emulsionar un asa de cultivo con una
asa de agua oxigenada en un porta, o bien
utilizando 1 mL de agua oxigenada en un tubo
al que se le aade 1 mL de cultivo extrado
aspticamente de un caldo.
- Lectura: Efervescencia producida por la
liberacin de oxgeno.

H
2
O
2
2
CATALASA
H
2
O O
2
2 +

2. Prueba de la oxidasa.
Se utilizan tanto el mtodo KOVACS como
el de STEEL, y est especialmente indicada para
diferenciar pseudomonas de otros bacilos gram-
negativos.
ptima.
- Reactivo: Solucin acuosa de clorhidrato de
tetrametil-p-fenilendiamina al 1 % fresco. Se
puede utilizar vertido sobre la superficie del
cultivo o, mejor, mediante un papel de filtro
impregnado sobre el que se extiende una
porcin del cultivo con un asa de platino
(autentico) o, mejor, varilla de vidrio.
- Lectura: En el caso de vertido sobre placa, las
colonias adquieren un color rosado, que en 10-
30 minutos pasa a ser rojo oscuro, prpura y
negro. Utilizando el papel, se produce el color
prpura en 5-10 segundos. Puede retardarse
hasta 60 segundos, pero si tarda ms tiempo es
considerado como resultado negativo.

N
N
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
e
-
CITOCROMO C
N
CH
3
CH
3
N
CH
3
CH
3
(INCOLORO) (AZUL)
+
+

3. Prueba de la coagulasa.
Diferencia entre los estafilococos
patgenos como St. aureus, de los no patgenos.
Mtodo del portaobjetos:
- Incubacin: Solo 18-24 horas a temperatura
ptima.
- Reactivo: Plasma humano o de conejo. Con un
lapicero se divide un porta en dos mitades. En
cada parte se deposita un asa de suero
fisiolgico emulsionando una pequea
cantidad de cultivo hasta formar una
suspensin homognea. A una de las
suspensiones se aade una gota de plasma y se
agita durante 5 segundos.
- Lectura: La formacin de grumos que no
vuelven a emulsionarse, indica una reaccin
positiva.
Mtodo del tubo:
- Medio: Caldo nutritivo.
- Incubacin: De 18-24 horas mximo.
- Reactivo: Plasma de humano o de conejo. En
dos microtubos se ponen 0,5 mL plasma, a uno
de los cuales se le aaden 0,5 mL de cultivo.
Se incuban a 37 C tomando lecturas a la
primera hora, y luego intermitentemente hasta
las 24 horas.
- Lectura: La aparicin de cogulos indica que
la cepa que se est estudiando es positiva a la
coagulasa. La coagulacin se suele producir
entre la primera y cuarta hora. El tubo de
control no debe mostrar signos de coagulacin.

4. Prueba de la fosfatasa.
Los estafilococos positivos a la coagulasa
producen la enzima fosfatasa, lo que se puede
utilizar para detectar especies patgenas, con la
ventaja de estudiar grandes nmeros de colonias y
no slo colonias aisladas.
- Medio: Agar nutritivo al que se aade fosfato
de fenolftalena al 0,01 %.
- Incubacin: Una noche a 37 C.
- Reactivo: Solucin concentrada de amoniaco.
Se exponen las placas a los vapores de
amoniaco o con una gota del mismo en papel y
ponindola en la tapa de la placa.
- Lectura: Un color rosa o rojo indica la
presencia de la fenolftalena libre por la
actividad de la fosfatasa.

5. Hemlisis de sangre.
- Medio: Agar nutritivo que contiene un 0,85 %
de cloruro sdico y un 5 % v/v de sangre
desfibrinada o con oxalato.
- Siembra: En placa por estra superficial,
monocapa o en doble capa agar sangre sobre
agar nutritivo. Para el caso de estreptococos
puede utilizarse este mtodo en anaerobiosis o

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cultivar en masa en placa.
- Lectura: La formacin de zonas claras
alrededor de las colonias indica la existencia
de la actividad hemoltica. La clarificacin
producida por estreptococos da -hemlisis
con bordes bien definidos. Se denomina -
hemlisis cuando dan zonas verdosas no bien
definidas.

6. Prueba de la potasa.
Sirve para la divisin de los
microorganismos segn GRAM sin la necesidad de
realizar su tincin, si bien a veces los resultados
obtenidos no son los esperados.
Mtodo del portaobjetos:
En un portaobjetos se coloca una gota (10 L)
de una solucin de potasa al 3% y se toma un
asa abundante de un cultivo joven (24 horas) y
puro (una sola colonia bien aislada) para
emulsionar durante 30-60 s. La emulsin debe
quedar espesa.
- Lectura: La formacin de filamentos mucosos
fcilmente observables al tirar de la emulsin
con el asa, indica una reaccin positiva y, por
tanto, lo ms probable es que la bacteria sea
gram-negativa. En caso contrario a la bacteria
se la considera gram-positiva.

MTODOS SEROLGICOS.

La especificidad en el reconocimiento del
antgeno por los anticuerpos (inmunoglobulinas) y
la posibilidad de obtenerlos frente a prcticamente
cualquier molcula, hace que los anticuerpos sean
un arma muy apetecible por la ciencia en general y
para el diagnstico clnico en particular.
Para muchas infecciones virales, fngicas
o bacterianas, el cultivo de rutina del agente
etiolgico, para su aislamiento, identificacin y
cuantificacin, es casi imposible.
Los mtodos inmunolgicos, que detectan
la presencia de anticuerpos frente al patgeno en el
suero u otro fluido corporal del paciente, se usa
como mtodo rpido de diagnstico de la
infeccin.
En otras ocasiones, empleando estas
tcnicas se puede identificar el propio agente
patgeno.
Las ventajas de estos mtodos son, rapidez,
sensibilidad y especificidad. Tenemos entre otros:

1. AGLUTINACIN.

La aglutinacin de antgenos particulados
por anticuerpos es una de las reacciones
serolgicas ms simples. Cuando tenemos clulas
completas en suspensin, al tener todas la misma
polaridad, se encuentran en suspensin
homognea. Cuando forman puentes cruzados
entres ellas, por ejemplo a travs de
inmunoglobulinas, las clulas se agrupan y por
gravedad, una vez aglutinadas, sedimentan.
1. Aglutinacin en porta.
2. Seroaglutinacin en tubo.
3. Hemoaglutinacin directa en microplaca.
Un ejemplo es el kit Staphylo Monotec
Test de la casa Fluka, donde en un solo paso se
determina la coagulasa y la protena A de St.
aureus.


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2. FIJACIN DEL COMPLEMENTO.

Se trata de un bioensayo serolgico de alta
sensibilidad y especifidad que emplea como
sistema la lisis de los eritrocitos por el
complemento.
El complemento es un sistema formado por
unas protenas del suero, generalmente inactivas,
que se pueden activar por diferentes mecanismos,
entre los cuales destaca la reaccin de la IgG o la
IgM con el antgeno.

3. TCNICAS SEROLGICAS DE
PRECIPITACIN EN GEL.

Estas tcnicas se basan en la capacidad de
difusin de molculas o micelas solubles, y en la
incapacidad de los macrocomplejos para hacer lo
mismo, precipitando como bandas o lneas claras
fcilmente visibles.
1. Doble difusin en gel de OUCHTERLONY.
2. Inmunodifusin radial.
3. Inmunoelectroforesis.
4. ELISA (Indirecto).

Es una de las tcnicas serolgicas ms
utilizadas hoy en da. Presenta una elevada
sensibilidad. Permite cuantificar tanto el suero
como el antgeno. Permite que el antgeno sea
soluble o particulado. Los resultados son
objetivables utilizando espectrofotmetros
especiales para microplacas y, adems, permite
determinar el isotipo de los anticuerpos que
reaccionan con el antgeno mediante la utilizacin
de un segundo anticuerpo.

5. SEROINHIBICIN.

Como ejemplo tenemos la prueba de la
Dnasa para la diferenciacin de St. aureus
patgeno de otros no patgenos de su especie.
El St. aureus posee una Dnasa
termoestable (termonucleasa) de especifidad
antignica diferente a la de otras especies
bacterianas. El mtodo consiste en comparar la
actividad nuclesica de un cultivo bacteriano -a
partir de un hemocultivo y pasado a BHI (infusin
cerebro corazn) durante 18 h- en placa que
contenga, o no, el anticuerpo especfico
antinucleasa, estando el antisuero en cantidad
suficiente para inhibir esta actividad. La reaccin
utiliza las propiedades de metacromasia del azul de
toluidina y del DNA incorporado en el agar; una
actividad nuclesica provoca la formacin de un
halo rosa alrededor del inculo en dos o tres horas.
Existe un kit de la casa BioMerieux que facilita su
determinacin.
TCNICAS GENTICAS.

Amplificacin del ADN (PCR).
Enzimas de restriccin.
Electroforesis.
Estudios del rRNA.
Anlisis de plsmidos.
Comparacin de hebras homlogas.
Secuenciacin del ADN.

GALERIAS COMERCIALES.

1.API: Son sistemas comerciales que
permiten la identificacin de un tipo de bacteria
una vez aislada.
As el sistema Api 20 E es un sistema de
identificacin para Enterobacteriaceae y otros
bacilos gramnegativos, que consta de 20
microtubos que contienen los substratos
deshidratados, para ser inoculados con una
suspensin bacteriana capaz de rehidratarlos.
Durante la incubacin, el metabolismo de
la bacteria produce cambios de color espontneos o
provocados al aadir reactivos.
El trabajo se realiza en diferentes fases:
1. Preparacin de la galera.
2. Preparacin del inculo.
3. Inoculacin de la galera.
4. Incubacin de la galera.
5. Lectura de la galera.
6. Obtencin de un cdigo de 7 dgitos.
7. Identificacin del microorganismo, mediante
tablas de identificacin, o mediante
aplicaciones informticas.
8. En algunos casos, el perfil de 7 dgitos no
discrimina de forma suficiente, se deben
realizar las pruebas complementarias:
Reduccin de nitratos a nitritos.
Reduccin de nitratos a nitrgeno.
Movilidad.
Cultivo en agar MCCONKEY.
Oxidacin de glucosa.
Fermentacin de glucosa.
Con estas ltimas reacciones codificadas
se obtiene un perfil de 9 cifras.
9. Asignacin del microorganismo.
10. Esterilizacin del material empleado.
Tambin existen en las versiones Api 20 A
para anaerobios y Api 20 NE para aerobios no
entricos.


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2.BBL: Se trata de las 2 clsicas galeras
de identificacin bioqumica de Roche, ahora de
BBL, para las especies de las enterobacterias:
Arizona, Buttiauxella , Cedecea, Citrobacter,
Edwarsiella, Enterobacter, Escherichia,
Ewingella, Hafnia, Klebsiella, Kluyvera,
Leminorella, Moellerella, Morganella,
Obesumbacterium, Proteus, Providencia,
Rhanella, Salmonella, Serratia, Shigella,
Tatumella, Yersinia (ENTEROTUBE
Ref.KBH260) y para las especies de gram-
negativos no fermentadores: Achromobacter,
Acinetobacter, Aeromonas, Agrobacterium,
Alcaligenes, Bordetella, Flavobacterium,
Moraxella, Pasteurella, Plesiomonas,
Pseudomonas (17 especies), Vibrio
parahaemolyticus/alginolyticus (OXIFERM
ref.KBH262).
Su gran ventaja sobre cualquier otra galera
es la comodidad: Se trata de tubos con 12
compartimentos de pruebas agarizadas y dos
tapones, uno en cada extremo. Un asa de picadura
incorporada asla los diferentes compartimentos a
la vez que permite la inoculacin directa de la
colonia, sin necesidad de disolver colonias, ajustar,
pipetear, etc. Su formato y gran rigidez permiten su
incubacin sin necesidad de la delicadeza
imprescindible en las dems galeras, hasta el
punto de poder sustituirse la estufa de cultivos por
el bolsillo de la bata en trabajos de campo, como si
fuese un bolgrafo ms. Tras la incubacin a 35-37
C, los cambios netos de color de cada
compartimento indican prueba positiva o negativa
en cada uno de ellos.
Posteriormente se obtiene un cdigo de
cinco dgitos que se pueden trasladar a tablas para
la identificacin del microorganismo.

ANTIBIOGRAMA.

Conjunto de procedimientos que permiten
determinar la sensibilidad in vitro de un
microorganismo ante un determinado ATB.
Las pruebas de sensibilidad o
susceptibilidad antimicrobianas que se utilizan
para determinar la actividad de un ATB frente a
una cepa en particular, son principalmente de dos
tipos:
DILUCIN EN CALDO. Puede realizarse en
medios de cultivos lquidos o slidos. Es un
mtodo cuantitativo que sirve para determinar
la sensibilidad y resistencia de las bacterias.
Consiste en determinar el crecimiento de una
bacteria en presencia de concentraciones
decrecientes de ATB. Este mtodo permite
determinar la CIM (concentracin Inhibitoria
mnima) y la CBM (concentracin bactericida
mnima). Para determinar la CIM se utilizan
una serie de tubos de ensayo en los cuales se
va colocando sucesivamente el ATB a doble
dilucin; luego se siembra el microorganismo.
La CIM corresponder al primer tubo de
ensayo donde no se observe turbidez (la
turbidez indica que existe crecimiento
Galera API 20 NE
Galera API 20 E

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bacteriano). Para determinar la CBM
seleccionamos los tubos donde no observemos
turbidez y sembramos su contenido sobre un
medio de cultivo slido, luego observaremos si
hay o no desarrollo de colonias. LA CBM
corresponder a aquella dilucin donde no ha
crecimiento bacteriano alguno.
DIFUSIN EN DISCOS DE AGAR. Se
realiza en medios slidos y es la prueba ms
usada (de rutina) en los laboratorios. Permite
probar la eficacia de varios ATB al mismo
tiempo. Con este mtodo determinamos la
CIM. Para ello se siembra, en un medio de
cultivo slido (Agar), una suspensin de
microorganismos (108 UFC/ml ) y sobre esto
se colocan discos o monodiscos de papel
embebidos en concentraciones arbitrarias y
conocidas de ATB. En el Agar hmedo, el
ATB difunde desde los discos, con lo cual su
concentracin va decreciendo a partir del
disco. Luego se incuba adecuadamente (EJ. 24
48 HS) y a continuacin observaremos los
Halos de Inhibicin del Crecimiento
Bacteriano; inmediatamente medimos (en mm)
el dimetro que poseen los halos de inhibicin.
El Punto de corte de los halos , corresponde a
un valor de CIM equivalente a la
concentracin de ATB que se alcanza en suero.
Finalmente se compara la lectura realizada con
tablas internacionales y se determina la
sensibilidad o resistencia del microorganismo,
clasificando a la cepa como Sensible (S) o
Resistente y/o Intermedia (R) para ese ATB.
CIM (Concentracin Inhibitoria mnima). Es
la concentracin ms baja de un ATB capaz de
inhibir el crecimiento de un microorganismo
en condiciones estandarizadas. CIM por E
Test: Consiste en aplicar sobre un medio de
cultivo, donde se encuentra el microorganismo
a ensayar, tiras plsticas que llevan incluidas
un gradiente de concentracin de un
determinado ATB. Luego se incuba
adecuadamente y se observa la formacin de
una elipse de inhibicin de crecimiento.
CBM (Concentracin bactericida mnima). Es
la concentracin ms baja de un ATB capaz de
destruir una porcin predeterminada de un
inculo (en general el 99,9 %) en un tiempo
determinado. Corresponde a la dilucin donde
no se observa crecimiento alguno de
microorganismos. Es importante que la
concentracin de ATB en el foco de infeccin
supere por lo menos 10 veces la CBM.

PRUEBAS DIRECTAS.

Existen kits comerciales para la deteccin
de la presencia de algunos microorganismos en
pruebas basadas en un una reaccin especfica.
As, la empresa MONLAB tiene las
denominadas pruebas one step para algunos
microorganismos.


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TCNICAS DE RECUENTO.

En muchos estudios microbiolgicos, es
importante conocer con exactitud el nmero de
microorganismos presentes en una muestra. As en
el caso de la alimentacin y la higiene es esencial
conocer la carga microbiana de aguas y alimentos,
superficies de trabajo y medio ambiente, para
determinar la calidad de los productos analizados.
En Clnica es de gran inters con vista tanto al
diagnstico como al tratamiento.
Para estos propsitos existen diferentes
mtodos, habindolos directos como los recuentos
observados por microscopa en hemocitmetros, o
indirectos que son los ms utilizados, como la
turbidimetra, las tcnicas de decoloracin y los
recuentos mediante diluciones seriadas.

DETERMINACIN DEL NMERO DE
BACTERIAS VIABLES EN UNA
MUESTRA.
Estos mtodos permiten el recuento de
bacterias vivas o grupos de bacterias (unidades
formadores de colonias, ufc), que se encuentran
presentes en una muestra, siempre que se utilice
para su cultivo un medio adecuado y unas
condiciones de incubacin ptimas.

1. MTODOS DE RECUENTO DE
COLONIAS.

1. Mtodo de cultivo en masa por siembra en
placa.
En una placa PETRI se mezcla una cantidad
dada de suspensin, o de una dilucin conocida de
esta suspensin, en medio agar. Una vez
solidificadas las placas e incubadas, se cuentan el
nmero de colonias que se han formado en las
placas. Al ser uno de los dos mtodos ms usuales,
lo trataremos de forma independiente.
2. Mtodo del tubo giratorio.
Este mtodo es una modificacin del
mtodo de cultivo en masa en placas, segn el
cual, el agar nutritivo sembrado se deja solidificar
como una capa delgada y uniforme en la superficie
interior de un tubo de ensayo o frasco.
Se toman 0,5 mL de cada una de las
correspondientes diluciones decimales
depositndose en los tubos que son puestos en la
centrifugadora.
3. Utilizacin de gotitas de agar.
Se realizan los recuentos de colonias sobre
pequeas gotas de agar, que utiliza un sistema
automtico de pipeteo de 0,1 mL de medio
sembrado y un visor con condensador ptico para
establecer el recuento.
En una placa normal, se pueden establecer
recuentos quintuplicados de tres diluciones
sucesivas de forma semiautomtica.
4. Mtodo de MILES y MISRA para recuento de
colonias en superficie.
Este mtodo consiste en colocar gotas de
0,02 mL, de una serie de diluciones sobre la
superficie de unas placas de agar, contndose las
colonias que crezcan al incubar las placas. A este
mtodo se le puede aplicar la tcnica del nmero
ms probable (NMP), anotando si existe, o no,
crecimiento y aplicando unas tablas de
probabilidad.

2. FILTRACIN A TRAVS DE
MEMBRANA.

El filtro de membrana consiste en un disco
delgado y extremadamente poroso (de acetato o
mezcla de steres de celulosa) que permiten el paso
de grandes volmenes lquidos gracias a la
aplicacin de presin, positiva o negativa, pero que
impide el paso de cualquier bacteria.
Las bacterias que permanecen en la
superficie de la membrana, pueden cultivarse
colocando la membrana sobre un disco absorbente
saturado de medio lquido o sobre una placa de
agar con medio que puede ser selectivo o no.
Tambin puede realizarse un examen
microscpico previa tincin de azul de metileno,
verde de malaquita o violeta cristal de LOEFFLER.


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3. RECUENTO POR DILUCIN EN
TUBOS.

Tambin denominado como recuento del
NMP, proporciona una idea aproximada del
nmero de bacterias vivas presentes en una
muestra que pueden multiplicarse en un medio
lquido determinado,y en unas condiciones de
incubacin precisas.
Puesto que es uno de los dos mtodos ms
usuales, merece un tratamiento singular.

4. MTODOS DE REDUCCIN DEL
COLORANTE.

Estos mtodos dependen de la capacidad
que tengan los microorganismos para alterar el
potencial de oxidacin-reduccin de un medio. Por
tanto, ms que medir el nmero de
microorganismos presentes, determinan la
actividad de los mismos.
El mtodo se fundamenta en que la
cantidad de tiempo necesaria para reducir una
deteminada concentracin de colorante, depende
de la masa y actividad de las bacterias que se
encuentran en la muestra.
Como colorantes ms usuales se utilizan el
azul de metileno y la resazurina.

DETERMINACIN DEL NMERO
TOTAL DE BACTERIAS DE UNA
MUESTRA.

Estos mtodos permiten la determinacin
del nmero de bacterias o microorganismos,
existentes en una muestra.

1. MTODO DE EXTENSIN DE
BRED.
Recurre al recuento directo al microscopio.
Puede utilizarse cualquier mtodo de tincin, pero
como el examen no diferencia entre bacterias vivas
o muertas, la determinacin se denomina del
nmero total.
En este mtodo resulta esencial la
calibracin previa del microscopio de modo que se
conozca el rea del campo observable.
Una vez conocido, se deposita un volumen
de 0,01 mL de una dilucin conocida para
extenderse en un rea dada de 1 cm
2
.
Sin hacer los clculos, que no presentan la
mayor complicacin, en la mayora de los
microscopios utilizados, una bacteria por campo
observado viene e equivaler a 500.000 bacterias
por mL de muestra.

2. RECUENTO DIRECTO AL
MICROSCOPIO POR FILTRACIN A
TRAVS DE MEMBRANA.
Una vez efectuada la filtracin, se aade
una cantidad suficiente de colorante y se mantiene
el tiempo suficiente (5 minutos en el caso del azul
de metileno de LOEFFLER), para filtrarlo y
posteriormente pasar agua destilada hasta quedar
transparente. Una vez completamente seco, se
satura con aceite de inmersin, hacindolo flotar
sobre este aceite en una placa PETRI, hasta que
quede transparente, y se monte sobre uno o ms
portaobjetos.
Si se conoce el factor del microscopio se
puede calcular el nmero de bacterias totales en la
muestra, si esconocido el rea efectiva del filtro y
la cantidad de muestra que lo ha atravesado.

3. MTODOS TURBIDIMTRICOS.
Se fundamentan en que las bacterias en
suspensin bloquean la luz por absorcin o por
dispersin haciendo que la solucin aparezca
turbia. Cuanto mayor sea la concentracin
bacteriana, mayor ser la cantidad de luz
dispersada. Puesto que la cantidad de luz que no
puede atravesar la suspensin depende, adems de
la cantidad de microorganismos, del tamao y
forma de los mismos, el mtodo slo ser valido
para cultivos puros y cuando las condiciones de
cultivo hayan sido normalizadas.
En cualquier caso, exige la preparacin de
las curvas patrn, o series patrn. Los mtodos ms
usuales son:
1. Tubos de opacidad de Brown. Semi-
cuantitativo.
2. Nefelmetro. Cuantitativo.

4. CMARA DE RECUENTO.
Una cmara de contaje celular es un
dispositivo en el que se coloca una muestra de la
suspensin a medir. El dispositivo presenta unas
seales que determinan un volumen conocido (en
microlitros). Al contar bajo el microscopio el
nmero de partculas presentes en ese volumen se
puede determinar la densidad de partculas en la
suspensin de origen.
La cmara de Neubauer es una cmara de
contaje adaptada al microscopio de campo claro o
al de contraste de fases.
Se trata de un portaobjetos con una
depresin en el centro, en el fondo de la cual se ha
marcado con la ayuda de un diamante una
cuadrcula como la que se ve en la imagen. Es un
cuadrado de 3 x 3 mm, con una separacin entre
dos lineas consecutivas de 0.25 mm. As pues el
rea sombreada y marcada L corresponde a 1
milimetro cuadrado.

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La depresin central del cubreobjetos est
hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma
que cuando se cubre con un cubreobjetos ste dista
de la superficie marcada 0.1 milmetro, y el
volumen comprendido entre la superficie L y el
cubreobjetos es de 0.1 milmetro cbico, es decir
0.1 microlitro.

RECUENTO EN MEDIO SLIDO.

En una placa de PETRI se mezcla una
cantidad dada de suspensin, o de una dilucin
conocida de esta suspensin, con medio agar
fundido. Una vez solidificada la mezcla, se
incuban las placas; finalmente se cuenta el nmero
de colonias.

1. TCNICAS.

Existen diferentes tcnicas. En funcin de
la cantidad de inculo tomado:
1. Recuento en placa por siembra en todo el
medio. Utiliza como siembra 1 mL.
2. Recuento en placa por extensin en superficie.
Utiliza como siembra 0,1 mL.
3. Recuento en placa por siembra con asa de
platino. Utiliza como siembra 0,001 mL.
Corresponde a un asa de platino calibre N 26
(de B&S) cuyo dimetro interno es de
1,45 0,06 mm.
4. Recuento en placa por siembra de gotas en
superficie. Toma como siembra 0,02 mL
(Mtodo DE MILES-MISRA).
5. Recuento por medio del Sistema Spiral.
Toma como siembra 0,05 mL.

2. ETAPAS PARA RECUENTO
ESTNDAR.

1. Hacer las diluciones decimales necesarias.
2. Sembrar alcuotas de 1 mL en las placas de
PETRI por duplicado.
3. Adicionar el agar y homogeneizar.
4. Dejar solidificar.
5. Incubacin (30 C/3 das 37 C/2 das).
6. Recuento.

3. RECUENTO.
Las directrices de la I.C.M.S.F. (Comisin
Internacional de Especificaciones Microbiolgicas
de los Alimentos) dicen que los resultados se
expresarn en ufc/ g o mL.
En general, el recuento se realiza en las
placas de la misma dilucin cuyo contenido en
colonias est comprendido entre 30 y 300. Para
expresar el resultado basta generalmente con hacer
la media aritmtica de los valores obtenidos para
esa dilucin y multiplicar por el factor de dilucin.

Para determinar la validez del recuento, se calculan
los lmites de fiabilidad al 95 % segn:

Donde n es el nmero de placas de esa
dilucin y x la media aritmtica de los recuentos.
En el caso de que una de las placas de la
dilucin elegida presente algo menos de 30 o algo
ms de 300 colonias, se hace como en el caso
general, se recuentan todas las colonias,
expresando el resultado como recuento estndar en
placa.
Si dos diluciones sucesivas presentan un
nmero de colonias entre 30 y 300, se halla el
recuento de cada dilucin y se hace la media.
Existen casos en los que los recuentos dan
valores inferiores a 30 o superiores a 300 colonias,
encontrndonos diversos casos:
1. Las placas sembradas de la dilucin ms
concentrada no presenta crecimiento. Daremos
como resultado el valor de < 1 x Fd de la
dilucin ms concentrada.
2. Las placas sembradas de la dilucin ms
concentrada presentan recuentos inferiores a
30 colonias. El resultado se da como < 30 x
Fd. de la dilucin ms concentrada.
3. Si todas las placas presentan recuentos
n
X n X n ) ( 96 , 1 ) (

2
2 1
. . .
p p
c f u
+
=

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superiores a 300 colonias. El resultado se da
como >300 x Fd de la dilucin ms diluida.
Si pretendemos aproximarnos a un
recuento real, debemos sectorizar las placas, en 2,
4, 8 partes. En cualquier caso el resultado es
como recuento estndar en placa estimado.

4. MTODOS ESTADSTICOS PARA
LA SELECCIN Y ANLISIS DE
COLONIAS.

Cuando se va a realizar un anlisis y se
siembra la muestra de un material que contiene una
poblacin mixta en medios no selectivos, suele ser
necesario realizar un recuento de las distintas
poblaciones bacterianas que crecen en las placas
para as poder calcular la distribucin porcentual
de los diferentes microbios presentes en la muestra
original.
Para garantizar la representatividad y la
aleatoriedad se han puesto a cabo diferentes
mtodos.
1. seleccionar todas las colonias de una placa.
Este mtodo resulta adecuado siempre que el
nmero de colonias presentes sea
aproximadamente igual al de colonias que se
desea examinar.
2. Sectorizar la placa y seleccionar un sector
sencillo o dos sectores opuestos de una placa.
Se puede dividir en:
Cuadrantes en la placa.
Superponer la placa a un disco de HARRIS,
donde para obtener el nmero de colonias
necesario, se van contando las presentes en los
sectores 1 y sucesivos hasta alcanzarlo.
3. Si las placas se han sembrado en superficie, las
colonias pueden transferirse mediante un
mecanismo duplicador como el tampn de
terciopelo estril de LEDERBERG.

RECUENTO EN MEDIO LQUIDO.

Se realiza segn la tcnica del NMP, cuyas
etapas son:
1. Hacer las diluciones necesarias.
2. Sembrar alcuotas de 1 mL por tubo en series
de 2, 3 5 tubos.
3. Homogeneizar.
4. Incubar (30 C / 3 das 37C / 2das).
5. Recuento.
El recuento se realiza en funcin de las
tablas NMP.
Si se han realizado ms de 3 diluciones, se
eligen 3 diluciones, siguiendo las siguientes reglas:
1. Si ms de una dilucin tiene todos los tubos
positivos se elige el grupo de tres incluyendo
nicamente la de dilucin ms alta.
2. Si ms de una dilucin no contiene tubos
positivos, se elige el grupo de 3 diluciones de
tal manera que se incluya nicamente la ms
concentrada.
3. Si quedan afectadas nicamente 3 series de
tubos, considerando los pasos 1 y 2, pueden
aplicarse las tablas. Si quedan afectadas 4
series se anotan los resultados de 2 series de 3
diluciones consecutivas, se determina el log
10

del NMP de cada una de ellas, se hace la
media, y el NMP viene dado por el
antilogaritmo.
4. Se quedan afectadas 4 o ms series no pueden
utilizarse las tablas.
Adems del clculo del NMP debe
calcularse el lmite de confianza aproximado al 95
% de confianza.


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SISTEMAS COMERCIALES.

Adems de los mtodos generales de
laboratorio ya vistos, existen toda una batera de
sistemas comerciales para efectuar los recuentos,
algunos bastante generales (vlidos para
superficies, alimentos y aguas) y otros altamente
especficos como el control de efluentes
industriales. Entre otros tenemos:

1. Sistema hy.food.test
:
Para el control microbiolgico rpido de
alimentos aguas y superficies; til para la
identificacin y realizacin de recuentos
semi-cuantitativos, por comparacin con
diagramas patrn.

2. Sistema Easicult
:
Sistema de control de microorganismos en
efluentes y lquidos de uso industrial de la
casa Orion Diagnostica. El recuento es
semi-cuantitativo y por comparacin con
diagramas patrn.

3. Sistema Swab Test Kit
:
Sistema para el control de superficies y
aguas de la casa Millipore.

4. Sistema Count-Tact
:
Para la deteccin y el recuento de
microorganismos presentes en superficies
de la casa BioMerieux.

5. Sistema Petrifilm
:
Para la deteccin y el recuento de
microorganismos presentes en superficies de la
casa 3M.

TCNICAS INSTRUMENTALES.

Citometra de Flujo.
Recuentos electrnicos.
Nefelometra.
Fotometra.
Impedancia.
Luminiscencia.
Medida de actividad metablica:
o Actividad metablica en crecimiento.
o Determinacin de enzimas
o Indicadores de descomposicin.

Anlisis Microbiolgicos Unidad Temtica 11. Microorganismos Indicadores y Patgenos

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MICROORGANISMOS INDICADORES.

El trmino microorganismos indicadores
se puede aplicar a cualquier grupo taxonmico,
fisiolgico o ecolgico de microorganismos cuya
presencia, o ausencia, proporciona evidencia
indirecta de un determinado suceso en la historia
de la muestra.
Aunque el trmino se asocia generalmente
con microorganismos de origen intestinal, otros
grupos pueden actuar como indicadores de otras
situaciones. As, de los microorganismos de origen
entrico, se puede colegir la falta de higiene en la
muestra y la posible presencia de microorganismos
patgenos en la misma, pero tambin la presencia
de cualquier bacteria gram-negativa en muestras
alimentarias tratadas con calor, indican un
inadecuado tratamiento para la carga inicial de
bacterias, o una contaminacin posterior.
Microorganismos indicadores fecales:
1. Grupo coliforme.
2. Grupo coliforme fecal.
3. Escherichia coli.
4. Enterobacteriaceae.
5. Estreptococos fecales.
6. Clostridium sulfito reductores.
Microorganismos indicadores no fecales:
1. Flora aerbica mesfila.
2. Flora anaerobia.
3. Flora psicotrfica.
4. Estafilococos.
Autores como INGRAM y MOSSEL y dentro de
los indicadores entricos distinguen dos tipos:
1. Microorganismos ndice: Aquellos cuya
presencia seala la posible existencia de
grmenes patgenos, como E. coli.
2. Microorganismos indicadores: Aquellos
cuya presencia indica deficiencias en la
calidad higinica.
La presencia de E. coli, microorganismo
de cuyo origen fecal nadie duda, presupone que
pueden existir otros microorganismos patgenos de
su mismo nicho ecolgico, pero tampoco lo afirma.
Adems, pueden existir dichos patgenos y no
aparecer E. coli.
Como generalmente el anlisis no es
inmediato a la toma de muestras, entonces
dependiendo de la muestra y de sus condiciones de
almacenamiento, pueden darse las siguientes
posibilidades:

1. Que E. coli pueda morir y no se detecte su
presencia. Esto nos puede hacer presumir
incorrectamente que tambin habrn muerto en
la misma proporcin el resto de patgenos
intestinales.
2. Que E. coli permanezca aproximadamente en
el mismo estado lo que no es indicativo de que
los dems, si existieran, hayan tenido la misma
evolucin.
3. Que E. coli, aumente, en cuyo caso, deberemos
interpretar que las condiciones han sido
favorables para el resto de enterobacterias,
incluidas las patgenas.
Es, por tanto, necesario ponerse en el
peor de los casos, puesto que nuestra salud va en
ello.

CARACTERSTICAS QUE DEBEN
REUNIR LOS INDICADORES FECALES.

Los indicadores de contaminacin fecal,
los ms utilizados en los anlisis microbiolgicos,
deben reunir una serie de caractersticas:
Especifidad: En cuanto a su origen, por lo que
debe proceder del intestino humano o animal.
Sensibilidad: En su deteccin, para lo cual
deben representar una fraccin importante de
la flora intestinal.
Nmero suficiente: Para poder ser detectado
incluso a muy alta dilucin.
Resistencia: En cuanto a la duracin de su
supervivencia en un ambiente externo a su
hbitat natural. Debe ser superior a cualquier
especie patgena.
Facilidad, rapidez y fiabilidad: En cuanto a
las tcnicas utilizadas para su investigacin y
recuento. Algunos microorganismos, los ms
abundantes en heces, al ser anaerobios estrictos
no pueden ser usados por dificultades tcnicas.

MICROORGANISMOS INDICADORES,
PATGENOS Y TOXIGNICOS DE
ESTUDIO FRECUENTE.

Adems del estudio de los
microorganismos indicadores e ndices, resulta
necesario, sobre todo en microbiologa alimentaria,
el estudio de ciertos microorganismos patgenos y
toxignicos, puesto que pueden ser ms resistentes
11. Microorganismos Indicadores y Patgenos.

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que sus indicadores. Esto ocurre con las
enterobacterias Salmonella y Shigella. Otros,
tienen nichos ecolgicos diferentes, pero por su
especial patogenicidad y toxigenicidad tienen que
ser estudiados en determinados alimentos, lo que
ocurre con las Pseudomonas aeruginosa o el
Bacillus cereus.
Las bacterias o grupos bacterianos de
estudio ms frecuente son:
Microorganismos aerbicos mesfilos.
Coliformes.
Coliformes fecales.
E. coli.
Enterobacteriaceae.
Estreptococos grupo D de LANCEFIELD.
Clostridium sulfito reductores.
Salmonella.
Shigella.
Staphylococcus aureus.
Menos usuales, pero no por ello son menos
importantes:
E. coli patgeno.
Pseudomonas aeruginosa.
Bacillus cereus.
Clostridium perfringes.
Clostridium botulinum.
Vibrio parahaemolityticus.
Vibrio cholerae.
Yersinia enterocoltica.
Campylobacter.
Listeria monocytogenes.

AEROBIOS MESFILOS TOTALES.

Son un conjunto de microorganismos
capacitados para proliferar en aerobiosis a
temperaturas medias entre 25-40 C.
En general se detectan de forma ptima
despus de incubacin a 31 C durante 72 horas
(37 C / 48 h.), en un agar nutritivo o de recuento
formando colonias visibles.
El conjunto de esta flora incluye grmenes
patgenos y no patgenos (de alteracin,
saprfitos, etc.).

VALOR INDICATIVO.

Su valor indicativo ha sido objeto de
controversia. Una flora alta indica un comienzo de
alteracin, pero slo si estn bien representadas las
bacterias causantes del deterioro.
Por otro lado, no existe una relacin entre
el nmero total de microorganismo aerobios
mesfilos y la presencia de grmenes patgenos.
No obstante, algunos microorganismos no
patgenos en elevadas proporciones pueden ser
agentes etiolgicos de enfermedad, como
Pseudomonas, Proteus y Bacillus.
Se puede concluir diciendo que, un
alimento cuya flora total es elevada debe ser
considerado impropio para el consumo humano.

RECUENTOS.

Tcnica de recuento en masa en medio
slido.
Tcnica de recuento por siembra
superficial.
Tcnica de recuento NMP.
Tcnica de recuento por filtracin en
membrana.
Tcnica de recuento por examen
microscpico directo.
Utilizan como medio slido agar nutritivo
o agar de recuento en placa (P.C.A.), y como
medio lquido caldo nutritivo.
En el caso de la filtracin de membrana, se
suelen utilizar agares especiales de la casa
Millipore
para cada uno de los tipos de

microorganismos, y esta tcnica es aplicable a casi
todos los grupos o bacterias usuales en el anlisis
microbiolgico.
En cualquier caso, exceptuando la
microscopa directa, el cultivo se realiza
preferentemente durante 72 horas y a 31 C.

COLIFORMES TOTALES.

El grupo de los coliformes es una forma de
clasificacin de bacterias en cuanto a su forma de
deteccin y reacciones bioqumicas y no un grupo
de una clasificacin taxonmica.
Son Enterobacteriaceae aerbicas y
anaerobias facultativas, no esporuladas y lactosa
positivas. Se caracterizan porque fermentan la
lactosa con desprendimiento de gas y produccin
de cido en presencia de sales biliares en el medio
de cultivo, dentro de un periodo de 48 horas y a
una temperatura entre 30 y 37 C.

VALOR INDICATIVO.

Los coliformes o coli-aerogenes aunque se
pueden encontrar en el intestino de humanos y
animales, tambin se encuentra en otros ambientes,
por lo que carece de especifidad. No obstante se
usan como indicadores fecales por:
- Su frecuencia en heces.
- Fcil deteccin.

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- Semejanza con algunos de los
miembros de la familia de las
Enterobacteriaceae patgenos.

RECUENTO.

Tcnica de recuento en medio slido.
Se utilizan como medios slidos agares
selectivos como el agar biliado rojo violeta
(V.R.B.A.) o el agar lactosado rojo bilis violeta
(V.R.B.L.), y generalmente se recurre a la tcnica
de la doble capa.
Se incuba a 31 C durante 24 horas y la lectura
positiva son la formacin de colonias rojo prpura
con halo de precipitacin violeta por precipitacin
de las sales biliares.
Tcnica de recuento en medio lquido.
Se utiliza la tcnica del NMP. Como caldos se
pueden utilizar caldo lactosado de prpura de
bromocresol o caldo lactosado biliado verde
brillante (B.G.B.L.) y siempre con campana de
DURHAM.
Se incuba a 37 C durante 24 horas y la lectura
positiva es la formacin de gas en al menos un 10
% del volumen de la campana.

COLIFORMES FECALES.

Estos grmenes poseen las mismas
caractersticas que los coli-aerogenes y, adems, la
aptitud de poder proliferar entre 43-45 C y de
producir indol en agua de triptona (T.W.). Su
origen es estrictamente fecal y debe considerarse
como presunto E. coli.

VALOR INDICATIVO.

Su origen fecal es indudable por lo que
posee la especifidad requerida y una buena
sensibilidad.

DETECCIN.

Se utiliza el medio lquido caldo B.G.B.L.
subcultivando las placas o tubos positivos de los
coliformes totales y con campana de Durham.
Los tubos se incuban a 44,5 C durante
24-48 horas (preferiblemente en bao de agua),
siendo positivos si aparece gas en las campanas.

RECUENTO.

Se realiza en medio lquido (NMP)
utilizando caldo B.G.B.L., a partir de los tubos
positivos del recuento en medio lquido de los
coliformes totales.
Se incuban a 44,5 C durante 24 horas en
bao Mara considerndose positivo cualquier tubo
con gas.

ESCHERICHIA COLI.

Enterobacteria que muestra todas las
caractersticas de los coliformes fecales y algunas
propiedades particulares como su movilidad
general, el ser rojo de metilo positivo y
acetilmetilcarbinol, citrato y ureasa negativos.

VALOR INDICATIVO.

Al ser un husped constante del intestino
de hombres y animales es el testigo ms especfico
de contaminacin fecal. Aunque su presencia no
tiene relacin con la de Enterobacteriaceae
patgenas representa un riesgo potencial.
Su sensibilidad es buena pero se le acusa
de poca resistencia comparada con patgenos,
sobre todo Salmonella, por lo que sta debe ser
investigada siempre. Basta una pasteurizacin o la
congelacin para destruirla, pero su presencia, es
testigo de que la contaminacin fecal es reciente.

DETECCIN.

Se realiza mediante siembra por
agotamiento en estras sobre agar LEVINE eosina
azul de metileno (E.M.B.), para incubar a 37 C
durante 24 horas.
Se consideran positivas las colonias que
presentan un centro azul-negro y, generalmente
pero no siempre, brillo metlico verdoso.

RECUENTO

Tcnica de recuento en medio slido.
El recuento se realiza mediante siembra
en superficie en agar V.R.L.B. o V.R.B.A.
Se incuba a 44,5 C durante 24 horas,
para contar las colonias rojo-prpura rodeadas de
una zona violeta (por precipitacin de sales
biliares).
Tcnica de recuente en medio lquido.
Se efecta segn la tcnica de NMP
utilizando como caldo de cultivo B.G.B.L. con
campana de DURHAM.
Se incuba al bao Mara a 44,5 C
durante 24 horas leyendo como positivos los tubos
que tienen gas en las campanas en al menos un 10
% de la misma.


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CONFIRMACIN GENERAL

Las colonias tpicas obtenidas, bien en
agar V.R.L.B. o V.R.B.A., pueden confirmarse por
subcultivo en B.G.B.L. con campana de DURHAM
y en T.W. durante 24-48 horas a 44,5 C. Las
obtenidas a partir de agar de Levine, deben
subcultivarse previamente en agar P.C.A. (o agar
nutritivo) durante 24 h a 37 C, antes de pasarlas a
los medios lquidos descritos.
Se consideran positivas aquellas colonias
que:
1. Presentan gas en el tubo de B.G.B.L.
2. Al aadir 0.5 mL de reactivo de KOVACS para
indol al T.W. y despus de agitar se forma un
anillo rojo en la superficie.

CONFIRMACIN ABSOLUTA

La confirmacin de forma absoluta,
queda demostrada mediante la aplicacin de las
pruebas bioqumicas siguientes:
Prueba del indol.
Es la prueba anteriormente vista y
realizada con el reactivo de KOVACS. E. coli es una
bacteria que usualmente desamina el triptofano con
la formacin de indol, que se pone en evidencia al
reaccionar con el paradimetilaminobenzaldehdo
del reactivo en medio cido. La formacin del
anillo debe ser bermelln (debido al rosindol) y no
amarilla y aparecer al cabo de un minuto.
Prueba del rojo de metilo.
A partir de un tubo con caldo de CLARK
y LUBS, (MR-VP) o caldo E.C. incubado a 37 C
durante 4 das e inoculado a partir de una colonia
purificada en agar P.C.A., se toman 1-2 mL en un
tubo de ensayo al que se le adiciona 1-2 gotas de
rojo de metilo. El color rojo, verifica que el pH
est por debajo de 4,5 debido a la formacin de
cido a partir de la glucosa. E. coli es rojo metilo-
positivo.
Prueba de VOGES-PROSKAUER.
A partir de un tubo igual al utilizado para
la prueba del rojo de metilo, se investiga la
acetona o acetilmetilcarbinol formado va cido
pirvico en la fermentacin de la glucosa. Se le
aade 0,6 mL de la solucin A de V-P y 0,2 mL de
la solucin B de V-P. Se agita la mezcla, y para
intensificar la reaccin se aaden unos cristales de
creatinina. Una coloracin roja, formada entre 15
minutos y 4 horas, despus de la adicin confirma
la presencia de acetona. E. coli es V-P negativo.
Prueba del citrato.
Se subcultiva una pequea porcin de
una colonia tpica y reciente del agar P.C.A.,
mediante estra nica sobre la superficie inclinada
de agar citrato de SIMMONS, incubando a 37 C
durante 24 horas. Si se observa en ese tiempo un
crecimiento abundante la prueba se da como
positiva, demostrando que la bacteria puede
utilizar como nica fuente de carbono el citrato y
posee una permeasa. A veces tambin se forma
amoniaco alcalinizando el medio. E. coli es una
bacteria citrato negativa.
A este grupo de pruebas se las conoce
como I.M.V.i C. (Indol, Metilo, Voges, Citrato).
Para E. coli, tenemos como resultados:
- I = positivo, aunque a veces da negativo.
- M = positivo.
- V = negativo.
- C = negativo.

ENTEROBACTERIACEAE TOTALES.

Las bacterias de esta familia son
grmenes de forma bacilar, gram-negativos,
aerbicos y anaerbicos facultativos, no
esporulados, mviles o inmviles, que fermentan
la glucosa, reducen los nitratos a nitritos, son
citocromooxidasa-negativos y crecen en medios
que contienen sales biliares.

VALOR INDICATIVO.

Fue MOSSEL quien propuso la sustitucin
de las Enterobacteriaceae por los coliformes como
ndice de contaminacin fecal por los siguientes
motivos:
1. Definicin taxonmica imperfecta de los
coliformes.
2. Porque, los coliformes solo evidencian las
Enterobacteriaceae lactosa positivas, cuando
las especies patgenas, como Salmonella, son
lactosa negativas.
3. La sensibilidad reducida de los coliformes, ya
que su nmero es pequeo respecto de las
Enterobacteriaceae.
En general, se recomienda el uso de
Enterobacteriaceae totales cuando se ha alterado el
equilibrio de la flora en un alimento por diferentes
causas:
- Bajo pH y/o baja actividad de agua.
- Conservacin de alimentos por fro.
- Tratamiento trmico suave del alimento.

PREENRIQUECIMIENTO.

Se utiliza el caldo de triptona y soja
(T.S.B.) durante 2 horas a temperatura ambiente y
agitando de cuando en cuando.
En esta fase, se revivifican los grmenes
lesionados por el tratamiento recibido por la

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muestra como parte integrante de un alimento.

ENRIQUECIMIENTO.

Sobre la muestra preenriquecida, se
aade caldo E.E. de MOSSEL de doble fuerza y se
incuba a 31 C durante 18-24 horas.
Estas etapas de pre y enriquecimiento
slo son necesarias en aquellas muestras de
alimentos que hayan sufrido distintos tratamientos
en su elaboracin.

DETECCIN.

La muestra una vez enriquecida, si es
necesario, se siembra por agotamiento en estras
sobre agar biliado rojo violeta glucosa (V.R.B.G.).
Se incuba a 31 37 C durante 24 horas,
para tomar como presuntas las colonias teidas de
rojo violeta con halo de precipitacin del mismo
color debido a la precipitacin de sales biliares.

RECUENTO.

Tcnica en medio slido en masa.
Se utiliza la tcnica de cultivo en masa y
en doble capa con agar V.R.B.G.
Se incuba a 37 C durante 24 horas,
contndose aquellas colonias del aspecto descrito
en su deteccin.
Tcnica en medio slido en superficie.
Se emplean el mismo medio de cultivo y
la misma incubacin. Slo se diferencia en la
siembra superficial del inculo mediante asa de
vidrio y la cantidad del inculo (0,1 mL en lugar
de 1 mL).
Tcnica de recuento en medio lquido.
Utiliza la tcnica de NMP, utilizando
como diluyente de las diluciones decimales T.S.B.
y como caldo de cultivo caldo E.E. simple, para
incubar a 37 C durante 24 horas.

CONFIRMACIN.

Previamente se purifican las colonias
sobre agar P.C.A. (incubacin a 37 C y siempre a
24 horas), y a partir de las colonias tpicas de
V.R.B.G., para realizar las siguientes pruebas:
Prueba de la citocromo-oxidasa.
La citrocromo-oxidasa en un enzima
ferroporfirnico que oxida el citrocromo c reducido
inactivndolo.
Para su deteccin se coloca un trozo de
papel de filtro de unos 5 cm
2
en una placa de Petri,
para aadir en el centro 3 gotas del reactivo
clorhidrato de N,N-dimetil-p-fenilendiamina. Con
una pipeta de Pasteur de punta cerrada se toma un
inculo y se extiende sobre el papel impregnado en
unos 4-5 mm. La prueba es positiva, si al cabo de
5-10 segundos aparece una coloracin violeta
oscura.
Las Enterobacteriaceae son oxidasa
negativas.
Fermentacin del agar glucosa sal.
Se siembra por picadura en tubo de agar
glucosa sal el inculo obtenido sobre agar
nutritivo, para cubrir con parafina estril e incubar
a 37 C durante 24 horas. Si en este tiempo, el
color del medio vira a amarillo, ha habido
fermentacin de glucosa y el ensayo es positivo, lo
que corresponde a las Enterobacteriaceae.
Prueba de fermentacin sobre agar
KLINGER (K.I.A.).
Esta prueba, adems de confirmativa, nos
ayuda a identificar el microorganismo sembrado.
El medio incorpora dos azcares, la
glucosa y la lactosa, adems de sulfato ferroso
como indicador del sulfhdrico.
Las pruebas de fermentacin, se hace en
un tubo en slant mediante siembra abundante con
asa en la superficie, y mediante picadura con
pincho en el fondo, incubndose a 37 C durante
24 horas a las que se efectuar siempre la lectura,
que ser:
- Fondo amarillo = fermenta glucosa.
- Fondo rojo = no fermenta glucosa.
- Superficie amarilla = fermenta lactosa.
- Superficie roja = no fermenta lactosa.
- Gas = presencia de burbujas en el medio,
entre el medio y el tubo, o rotura del
medio.
- Produccin de SH
2
= ennegrecimiento de
la interfase entre la pendiente y el
fondo. A veces se ennegrece toda la
parte inferior del tubo.

ESTREPTOCOCOS FECALES.

El gnero Streptococcus se encuentra
dentro de los cocos gram-positivos y generalmente,
nos referimos a ellos como Streptococcus D de
LANCEFIELD, que adems de comprender los
enterococos del tubo digestivo humano, comprende
especies cuyo hbitat es el intestino de animales y
aves.
Se caracterizan por su forma cocide, por
presentarse generalmente agrupados (en cadenas) y
ser inmviles, no esporulados, microaerfilos o
anaerobios facultativos y catalasa-negativos.


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VALOR INDICATIVO.

Los Streptococcus del grupo D de
LANCEFIELD se utilizan desde hace tiempo como
ndice de contaminacin fecal en el anlisis
bacteriolgico del agua. En alimentos su valor es
ms discutido.
La especifidad es medianamente
satisfactoria, puesto que algunos son capaces de
proliferar en ambientes extraenterales. Tambin se
le achaca el no poder determinar si la
contaminacin fecal es animal o humana, cuestin

no excesivamente importante habida cuenta que
algunos patgenos, como Salmonella, se
transmiten al hombre a partir de heces de animales.
En algunos alimentos, sobre todos
fermentados, deben considerarse como parte de la
flora normal.
En cuanto a su resistencia, muy elevada,
es defendida por algunos autores, y puesta en duda
por otros, al considerar que es muy superior a la
mayora de los agentes patgenos.
En cualquier caso su presencia en un
nmero elevado puede evidenciar falta de higiene
en la elaboracin de ciertos alimentos o
condiciones de conservacin defectuosas.
Su deteccin se utiliza con xito para
comprobar las condiciones higinicas de plantas
industriales.

DETECCIN.

Para la comprobacin de su presencia o
ausencia se utiliza:
Prueba presuntiva.
Se utiliza el caldo Kanamicina-
Aesculina-Azida (K.A.A.), por incubacin a 37 C
durante 24 horas. Se considera positivo si el medio
se ennegrece como consecuencia de la hidrlisis de
la esculina.
Prueba confirmativa.
De los tubos positivos de K.A.A., se
siembran en superficie sobre agar K.A.A.,
incubando las placas a 37 C durante 24 horas. Se
consideran positivas aquellas colonias rodeadas de
halos negros por hidrlisis de la esculina.

RECUENTO.

Recuento en medio slido en superficie.
Utiliza como prueba presuntiva la
incubacin en caldo K.A.A. a 37 C durante 24
horas, para confirmarlo en agar K.A.A. mediante
siembra superficial e incubacin a 37 C durante
24 horas.
Las colonias tpicas muestran un halo
negro a su alrededor.
Recuento en medio lquido.
Utiliza la tcnica de NMP, con tubos de
caldo K.A.A. o caldo azida de ROTHE. Este caldo
se considera positivo por enturbiamiento.
Para confirmar los tubos se utiliza o bien
el agar K.A.A. o el caldo etil violeta azida (E.V.A.)
tambin conocido como caldo LITSKY. En este
caldo los positivos son violetas.

CONFIRMACIN.

Como pruebas confirmativas adicionales
INTERPRETACIN DE LAS PRUEBAS SOBRE AGAR KLINGER

Fondo Zona inclinada SH
2
Microorganismo
AG A - Enterobacter aerogenes
AG A - Enterobacter cloacae
AG A - Escherichia coli
AG SC + Proteus vulgaris
A o AG SC - Proteus morganii
A SC - Shigella sonnei
A SC o ALC + Salmonella typhi
AG SC o ALC + Salmonella typhimurium
AG SC o ALC + Salmonella enteritidis

AG = formacin de cido y gas (amarillo y burbujas)
A = formacin de cido (amarillo)
SC = sin cambios
ALC = alcalino (rojo)
+ = produccin de SH
2
(negro)
- = no producin de SH
2
(no ennegrece)

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podemos realizar:
Tincin de GRAM.
Cocos agrupados en cadenas cortas
grampositivos.
Prueba de la catalasa.
La catalasa es un enzima ferroprotico
capaz de catalizar la ruptura del perxido de
hidrgeno con liberacin de oxgeno. Su presencia
se determina por adicin de 1 mL de agua
oxigenada de 10 volmenes sobre un cultivo del
germen obtenido en caldo cerebro corazn
(B.H.I.), u otros, pero que nunca contengan azida
sdica. En caso positivo existe desprendimiento de
burbujas, lo que no ocurre con el Streptococcus D
de LANCEFIELD.
Crecimiento en agar esculina bilis.
Todos los Streptococcus del grupo D de
LANCEFIELD crecen en agar esculina bilis.
Crecimiento en presencia de cloruro sdico.
Los Streptococcus del grupo D de
LANCEFIELD crecen en caldo B.H.I. que contenga
un 6,5 % de cloruro de sodio previa incubacin a
37 C durante 72 horas (excepto St. Equinus y St.
Bovis).
Crecimiento a 45 C.
Todo el grupo crece a 45 C en caldo
B.H.I.

CLOSTRIDIUM SULFITOREDUCTORES.

Son grmenes del gnero Clostridium,
que tienen en comn el reducir el sulfito a sulfuro.
Su capacidad para esporular les confiere una gran
resistencia.

VALOR INDICATIVO.

Los grupos anteriormente vistos
indicaban contaminacin fecal reciente al ser su
supervivencia relativamente corta (sobre todo en el
agua). Por el contrario, sus esporas les hacen
resistentes, aunque se debe considerar que aunque
habiten en el intestino humano y de algunos
animales tambin pueden tener un origen telrico.
No obstante, su investigacin debe
efectuarse, porque algunos de sus miembros como,
Clostridium perfringens o Cl. botulinum son unos
grmenes patgenos.

DETECCIN.

Se basa en el crecimiento de medios que
contienen sulfito de sodio y hierro. La reduccin
del sulfito a sulfuro origina coloracin negra al
precipitar como sulfuro ferroso.
La incubacin se debe realizar en
condiciones anaerobias, por lo que se deben:
- Regenerar los medios.
- Emplear jarras de anaerobios, o sembrar
en profundidad y sellar con parafina.
Como medio, se suele emplear el agar
sulfito-polimixina-sulfadiazina (S.P.S.) o el agar de
WILSON-BLAIR.

RECUENTO.

Su recuento se puede realizar mediante la
numeracin de formas vegetativas y esporuladas
conjuntamente, o slo de las formas esporuladas.
Recuento de formas vegetativas y
esporuladas.
Se efecta mediante siembra en masa en
tubo a profundidad con agar S.P.S. regenerado y en
anaerobiosis, incubando a 46 C durante 48 horas.
Las colonias a contar se distinguen
perfectamente por su color negro.
La sulfadiazina del medio es selectiva y
solo inhibe el crecimiento de los grmenes gram-
negativos.
Recuento de formas esporuladas.
Para obtener nicamente las formas
esporuladas, aprovechamos su termo-resistencia
calentando, o bien la disolucin madre, o bien la
serie de diluciones decimales, a 80 C durante unos
10 minutos para eliminar las formas vegetativas y
proceder como en el recuento total.

PSEUDOMONAS AERUGINOSA.

Especie perteneciente a la familia de las
Pseudomonaceae constituido por microorganismos
de forma bacilar, no esporulados ni capsulados y
extraordinariamente mviles mediante cilios
polares. Son microorganismos aerobios estrictos
,gram-negativos y oxidasa-positivos.

VALOR INDICATIVO.

Se utiliza para determinar la
contaminacin en la manipulacin de las aguas,
fundamentalmente la envasada para consumo
humano.

ENRIQUECIMIENTO.

Caldo de enriquecimiento selenito cistina
por incubacin a 42 C durante 24 horas.

DETECCIN Y RECUENTO.

Por siembra superficial en agar Cetrimide

Pgina 100

y posterior incubacin a 42 C durante 24 horas. Se
consideran presuntamente positivas aquellas
colonias que adquieren un color verde.

PRUEBAS BIOQUMICAS.

Tincin de GRAM.
Ps. aeruginosa es gram-negativa.
Prueba de la Oxidasa.
Ps. aeruginosa es citocromooxidasa-
positiva.
Investigacin de pigmentos.
Se realiza mediante siembra en estras de
dos medios: KING A, para la investigacin de la
piocianina, pigmento amarillo-verdoso
fluorescente y soluble en agua y cloroformo, y
KING B, para la investigacin del pigmento
pioverdina, de color azul soluble en agua y no en
cloroformo.
Ps. aeruginosa, da siempre piocianina y a
veces pioverdina.

SALMONELLA.

Gnero bacteriano perteneciente a la
familia Enterobacteriaceae formado por grmenes
de forma bacilar, no esporulados y habitualmente
mviles mediante flagelos pertricos, aunque
existen mutantes y serotipos inmviles. Son gram-
negativos, aerobios y anaerobios facultativos,
citocromo-oxidasa negativos, capaces de reducir
los nitratos a nitritos y fermentar la glucosa con
produccin de cido y gas.
Su reservorio primario es el tracto
intestinal de los vertebrados y los insectos. Su
transmisin es, sobre todo, por contaminacin fecal
de productos alimentarios, y su patogenicidad
provoca enfermedades tifoideas y otros cuadros
clnicos conocidos como salmonelosis.
Dependiendo del serotipo y la virulencia
de la cepa, las dosis infectivas estn entre los 10
5
y
10
9
grmenes/g de alimento.
Su peligro es tal que la legislacin rara
vez utiliza los recuentos, sino el trmino presencia
ausencia (P/A), generalmente en 25 g, para
desechar una partida alimentaria.

PREENRIQUECIMIENTO.

Sirve para revivificar, recuperar y
aumentar la vitalidad del germen, sobre todo
cuando el alimento en estudio ha sufrido
procedimientos de conservacin que comprometen
su viabilidad. Se usan medios de cultivo lquidos
no selectivos, generalmente caldo lactosado o agua
de peptona tamponada (B.W.P.), que se incuba a
37 C durante 16-20 h.

ENRIQUECIMIENTO.

Se utilizan para facilitar la multiplicacin
de Salmonella inhibiendo el crecimiento de
grmenes competitivos. Deben ser lo
suficientemente selectivos, pero a su vez ser
capaces de recuperar todos los serotipos. Como
ningn medio de cultivo lo cumple, generalmente
se usan dos diferentes en paralelo. Se suelen
utilizar caldos con base tetrationato como el de
MULLER-KAUFMANN, o a base de selenito. Son
usuales los caldos de tetrationato bilis verde
brillante, el caldo selenito cistina, el caldo selenito
verde brillante sulfamida y el caldo de RAPPAPOR-
VASSILIADIS.
En cuanto a la incubacin, parece
aconsejable incubar un caldo a 43 C (base
tratetionato) y otro a 37 C (base selenito) durante
24-48 h.

AISLAMIENTO.

Son muchos los medios slidos
selectivos para el cultivo y aislamiento de
Salmonella. En general es un agar base al que se le
adiciona colorantes, sales biliares, antibiticos y
otros inhibidores y un sistema indicador, basado en
la produccin de SH
2
y la fermentacin de
carbohidratos como lactosa, sacarosa o xilosa.
Se pueden utilizar medios poco
selectivos como el agar MC CONKEY,
moderadamente selectivos y diferenciales como el
agar citrato desoxicolato, el agar Salmonella
Shigella (S.S.), el agar Hektoen y el agar xilosa
lisina descarboxilasa (X.L.D), o medios altamente
selectivos y diferenciales como el agar verde
brillante (B.G.A.) y el agar bismuto sulfito.

CONFIRMACIN BIOQUMICA.

Se lleva a efecto sobre las colonias
sospechosas crecidas en medios selectivos de agar.
Prueba de la oxidasa.
Como integrante de la familia
Enterobacteriaceae es oxidasa-negativa.
Siembra en agar KLINGER.
Se caracteriza por fermentar la glucosa
con produccin de gas, no fermentar la lactosa y
producir generalmente sulfuro de hidrgeno.
Siembra en agar urea.
Sobre este agar tambin denominado de
CHRISTENSEN, se siembra abundantemente a partir
de un agar nutritivo reciente, para incubar a 37 C
durante 18-24 h. Si el germen posee ureasa, la urea

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del medio se transforma en dixido de carbono y
amoniaco que alcaliniza el medio virando el
indicador. Es aconsejable utilizar un tubo en
blanco, por si la alcalinizacin procediera de la
degradacin de la peptona del medio.
Salmonella es ureasa negativa.
Siembra en caldo lisina descarboxilasa.
Tambin denominado si es una agar, agar
de TAYLOR; el caldo que se recubre de parafina
estril y se incuba a 37 C durante 4 das se
observa diariamente. La reaccin es positiva si
aparece un color rojo o violeta, como ocurre con
Salmonella.
Pruebas I.M.V. i C.
Salmonella es:
I (-).
M (+).
V (-).
C (d).

CONFIRMACIN SEROLGICA.

Suele utilizarse la aglutinacin en
portaobjetos, desechando las cepas
autoaglutinables en solucin salina, y considerando
como positivas las que se aglutinan mediante suero
polivalente anti O, suero anti Vi, o suero anti H
(flagelar).

SHIGELLA.

familia Enterobacteriaceae formado por grmenes
de forma bacilar, no esporulados, e inmviles
(pero con oscilacin in situ). Son gram-
negativos, aerobios y anaerobios facultativos,
citocromooxidasa-negativos, capaces de fermentar
la glucosa sin produccin de gas ni SH
2
y con poca
actividad bioqumica.
Su reservorio primario es el tracto
intestinal de humanos y primates enfermos. Los
alimentos slo son vectores inespecficos a partir
del hombre. Aunque su presencia es inferior a
Salmonella se aconseja su estudio en los mismos
trminos de P/A.
Provoca disentiras bacilares por
toxiinfeccin (presencia de endotoxinas)
alimentaria, una serie de patologas conocidas con
el nombre de sigelosis.

ENRIQUECIMIENTO.

Son usuales los caldos gram-negativo
(G.N.) o el caldo de MOSSEL.
En cuanto a la incubacin se realiza a 37
C durante 16-18 h.
AISLAMIENTO.

De menor a mayor selectividad se
utilizan el agar MC CONKEY, el agar X.L.D y el
agar HEKTOEN (en el que a veces aparecen falsos
positivos).


Se lleva a efecto sobre las colonias
sospechosas crecidas en medios selectivos de agar.
Prueba de la oxidasa.
Como integrante de la familia
Enterobacteriaceae es oxidasa-negativa.
Siembra en agar KLINGER.
Se caracteriza por fermentar la glucosa
sin produccin de gas, no fermentar la lactosa y no
producir, generalmente, sulfuro de hidrgeno.
Siembra en agar urea.
Shigella es ureasa negativa.
Pruebas I.M.V. i C.
Shigella es:
I (d).
M (+).
V (-).
C (-).
Prueba de la catalasa.
Shigella es catalasa-positiva, excepto Sh.
Dysenteriae 1.
Prueba de la potasa.
Shigella se comporta como gram-
negativa.


Suele utilizarse la aglutinacin en
portaobjetos, utilizando los sueros anti D, anti A,
anti B y anti C.

E. COLI PATGENO.

Existen cepas de E. coli causantes de
enfermedad y cuyo estudio, menos usual, ms
costoso y difcil, a veces se lleva a cabo.
Tres son las cepas patgenas estudiadas:
E. coli enterotoxignico, capaz de producir dos
enterotoxinas denominadas termolbil y
termoestable respectivamente, E. coli
enteropatgeno, de patognesis oscura, y E. coli
enteroinvasivo.
Aunque vara en funcin de la cepa y del
estado general de la persona afectada, se considera
que la dosis infectiva est en 10
5
/g.
Los procedimientos analticos van
encaminados a facilitar la recuperacin de cepas

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atpicas porque se apartan de las caractersticas
peculiares de la especie:
- No fermentan lactosa.
- No producen gas en la fermentacin de la
lactosa.
- Sensible a elevadas temperaturas de
incubacin.
- Inhibicin de su crecimiento en medios
selectivos adecuados.
- Imposibilidad de crecimiento en
presencia de otras Enterobacteriaceae.
- No producen indol, etc.

CONSERVACIN DE MUESTRAS.

En el caso de tener que conservar las
muestras debe evitarse la congelacin, puesto que,
las cepas atpicas empiezan a declinar e incluso a
destruirse a partir de los 6-7 C.

PREENRIQUECIMIENTO.

Se utiliza el caldo de triptona soja
(T.S.B.), manteniendo a 37 C durante 6 horas.

ENRIQUECIMIENTO.

El enriquecimiento selectivo se puede
realizar a travs de dos caldos:
Caldo lauril sulfato triptosa (L.S.T.).
Se incuba a 44 C durante 18 horas
fermentando la lactosa rpidamente.
Caldo EE de MOSSEL.
Se incuba a 41,5 durante 18 horas
fermentando la lactosa lentamente.

AISLAMIENTO.

Se utiliza agar selectivo, de LEVINE para
las cepas que fermentan rpidamente la lactosa, y
de MC CONKEY, para las que la fermentan
lentamente. Se incuban a 37 C durante 24 horas.

PRUEBAS BIOQUMICAS.

A partir de cepas subcultivadas en agar
nutritivo e incubadas durante 24 horas a 37 C se
realizan las pruebas bioqumicas pertinentes,
primero para comprobar que sean E. coli, y
posteriormente otras para encontrar
comportamientos atpicos.
De las primeras se realizan:
Siembra sobre agar tres azcares hierro
(T.S.I.).
En tubo en slant, se siembra en fondo por
picadura y en superficie mediante estra,
incubndose a 37 C durante 18-24 horas.
E. coli da como resultado superficie
amarilla (fermentacin de la lactosa), fondo
amarillo con burbujas (fermentacin de glucosa
con gas) y no ennegrecimiento de la interfase (sin
produccin de sulfuro de hidrgeno).
Siembra en caldo prpura de bromocresol
arabinosa.
Con campana de DURHAM. E. coli
fermenta la arabinosa.
Siembra en caldo urea.
E. coli es ureasa-positivo.
Siembra en caldo triptona (T.W.)
Reaccin de indol-positivo.
De las segundas se realizan, entre otras:
Siembra sobre caldo KCN.
Siembra sobre caldo glucosa tamponado.
Siembra sobre caldo lisina descarboxilasa.
Siembra sobre caldo prpura de
bromocresol adonitol.
Nitratos.
Tincin de GRAM.
Citocromooxidasa.


Se realiza por aglutinacin en porta
utilizando antisuero polivalente inicialmente, para
posteriormente utilizar todos los monovalentes que
lo constituyen. Las especies enteropatgenos
tienen unos serotipo definidos y dan la
aglutinacin tarda, en cuyo caso ser tambin
autoaglutinante en solucin salina.

STAPHYLOCOCCUS AUREUS.

Especie bacteriana perteneciente a la
familia Micrococcaceae, gram-positivos, aerobios
y anaerobios facultativos. Forman masas
irregulares (staphyle: racimo de uvas),
fermentadores de glucosa sin formacin de gas,
capaces de crecer en medios altamente salinos
(hasta un 15 % de NaCl) y en medios que contiene
telurito y bilis. Son oxidasa-negativos y catalasa-
positivos.
Es un germen ubicuitario y su poder
patgeno se basa en supuraciones, septicemias,
gastroenteritis e intoxicaciones alimentarias, sobre
todo las cepas patgenas capaz de producir
enzimas, como la coagulasa, desoxirribonucleasa
(DNsa), fosfatasa, penicilasa, lipasa, etc., y toxinas
como las hemolisinas (, , ,), la leucocidina y
las enterotoxinas (de las que se conocen 8).


Pgina 103

ENRIQUECIMIENTO.

No son necesarios en investigaciones de
intoxicacin estafiloccica alimentaria, pero si es
apropiado cuando se supone un nmero de
grmenes escaso.
Se utilizan el caldo de tripticasa soja con
un 10 % de NaCl (. T.S.B.S.), el caldo de carne
cocida con un 6-10 % de NaCl (C.M.M.) y el caldo
de GIOLITTI-CANTONI. Se incuba en anaerobiosis
utilizando parafina a 37 C durante 18-24 horas.

AISLAMIENTO- IDENTIFICACIN.

El medio ms utilizado es el agar de
BAIRD-PARKER (B-P), medio que adems de
selectivo es diferencial y que contiene telurito
potsico y yema de huevo.
Las colonias tpicas son pequeas,
convexas, negras (por formacin de teluro a partir

del telurito), con borde blanco muy fino y rodeadas
de zonas claras (halo debido a la actuacin de la
lipasa sobre la yema de huevo).
La incubacin se realiza a 37 C y se
observa a las 24 y a las 48 horas definitivamente.
Se utiliza el sistema de resiembra
superficial en agar B-P de los tubos de
enriquecimientos positivos para la determinacin
de su presencia o de su ausencia.

RECUENTO.

Se realiza mediante 2 tcnicas:
Mtodo del NMP.
Con caldo GIOLITTI-CANTONI.
Mtodo de siembra en superficie a partir de
la serie de diluciones decimales.
Con agar BAIRD-PARKER.


.Se utilizan normalmente dos:
Prueba de la coagulasa.
Las colonias tpicas se resiembran en
caldo B.H.I. y se incuban a 43 C hasta
enturbiamiento, que si no sucede en 24 horas se
desecha. En caso positivo, en un microtubo, se
aade 0,3 mL de plasma de conejo con cido
etilendiamino tetraacetato disdico (EDTA) y 0,1
mL de caldo de cultivo B.H.I. Se incuba a 37 C

durante 6 horas y se observa si se ha producido la
coagulacin del plasma.
Prueba de la DNsa.
Partiendo de colonias tpicas, mantenidas
en agar P.C.A. o agar nutritivo, o del mismo medio
BAIRD-PARKER, se resiembra mediante estra nica
en agar DNsa, y se incuba a 37 C durante 18-24
horas. Como agentes reveladores se utilizan cido
HCl 1N con lo que aparecer una zona transparente
alrededor de la estra, o solucin de azul de
Intoxicacin estafiloccica
Fuentes y Ruta

HOMBRE
NARIZ, GARGANTA, BOCA
(Por estornudos, tos, etc. pasan a los
alimentos)
HERIDAS INFECTADAS, OJOS,
FORNCULOS, GRANOS
(Van a las manos)
ALIMENTOS
(permanecen a temperatura adecuada varias horas)
TOXINA
Alimentos txicos

Pgina 104

toluidina, en cuyo caso, aparecer un halo rosa
alrededor de la estra cuando el ensayo sea
positivo.

ESTUDIO DE MICROORGANISMOS
PATGENOS DE INVESTIGACIN
MENOS FRECUENTE.

BACILLUS CEREUS.

Caractersticas generales.
familia Bacillaceae, compuesta de bacilos
voluminosos de extremos rectos y generalmente
mviles (flagelos pertricos). Son gram-positivos y
V-P-positivos.
Hbitat.
Es un germen ubicuitario considerado
como saprfito y presente en alimentos crudos,
secos y elaborados.
Patogenicidad:
- Enfermedades: Capaces de producir
bronconeumona, meningitis, septicemias,
infecciones oculares y sndromes diarricos y
emticos.
- Transmisin: Por intoxicacin debida a varias
enterotoxinas, como la enterotoxina lbil
diarrica, la enterotoxina emtica, la toxina
necrtica, la toxina de permeabilidad vascular
o la toxina hemoltica.
- Dosis infectiva: 10
6
/g aunque en algunos casos
la cifra ha sido inferior.
- Presencia alimentaria: En alimentos muy
variados como salsas, cremas, infusiones,
vegetales, carnes crudas y preparadas, pastas,
arroces, etc.

CLOSTRIDIUM PERFRINGENS.

familia Bacillaceae, tambin denominada Cl.
welchii, est compuesta de bacilos rectos, gruesos,
aislados o agrupados en cadenas cortas.
Esporulados, anaerobios estrictos y gram-positivos.
Hbitat.
Es una de las bacterias ms ampliamente
distribuidas en la naturaleza, incluidas las heces de
animales y humanos.
Patogenicidad:
- Enfermedades: Tres tipos de cepas, A, B y C
elaboran toxinas, la primera y ltima con
importancia alimentaria. La toxina ms
peligrosa es la de la cepa A, hemoltica y, a
veces letal, productora de eritemas.
- Transmisin: Por alimentos y moscas.
6
/g alimento.
- Presencia alimentaria: En carnes y pescados
crudos, platos preparados, frutas y verduras,
hortalizas, pastas, queso, aceitunas, etc.

CLOSTRIDIUM BOTULINUM.

familia Bacillaceae, compuesta de bacilos de
extremos redondeados, solos o agrupados en
parejas o en cadenas cortas, y generalmente
mviles (cilios pertricos). Son gram-positivos y
anaerobios estrictos (en presencia de oxgeno
pueden fabricar toxinas).
Hbitat.
Es un germen habitualmente telrico y
saprfto fecal.
Patogenicidad:
- Enfermedades: Intoxicacin alimentaria por
toxinas botulnicas de cepas A-G. Inhiben la
liberacin de acetilcolina, y, por tanto, la
contraccin muscular y provocando la parlisis
respiratoria hasta la muerte.
- Transmisin: Ingestin de alimentos en los que
previamente se ha multiplicado el germen.
- Dosis txica: 0,1- 1 g de toxina es letal en el
hombre.
- Presencia alimentaria: En salazones,
semiconservas, queso, conservas y alimentos
cidos (como los encurtidos) y fermentados
(como los embutidos).

VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS.

familia Vibrionaceae, compuesta de bacilos
pleomorfos y generalmente mviles (flagelos
polares o pertricos en cultivos slidos). Son gram-
negativos y anaerobios facultativos. Halfilos hasta
el extremo de que se destruyen con agua destilada.
Son catalasa-positivo, oxidasa-positivo, V-P-
negativo, indol-positivo y no forma SH
2
.
Hbitat.
Agua de mar, pescados y mariscos
crudos, aunque tambin cocidos por contaminacin
cruzada.
Patogenicidad:
- Enfermedades: Enfermedades asociadas a la
exposicin del agua marina.

Pgina 105

- Transmisin: Por alimentos de origen marino.
6
-10
7
/g lo que se consigue
fcilmente debido a su elevada velocidad de
reproduccin. G = 10-15 minutos.
- Presencia alimentaria: En pescados y mariscos
frescos, productos del mar cocinados y otros
alimentos.

VIBRIO CHOLERAE.

familia Vibrionaceae, compuesta de bacilos
pequeos, incurvados y con tendencia al
pleomorfismo, mviles (flagelos pertricos), no
esporulados ni encapsulados. Son gram-negativos,
aerobios y anaerobios facultativos, indol-positivos,
nitrorreductores, citrato-positivos, oxidasa-
positivos, catalasa-positivos y ureasa-negativos.
Hbitat.
Agua de lagos, ros y estuarios, sobretodo
salobres, y en verano.
Patogenicidad:
- Enfermedades: Enteritis con nauseas, vmitos,
diarrea, dolores abdominales y prdidas de
electrolitos en heces que pueden provocar la
muerte. Poseen una enterotoxina que activa la
adenilato ciclasa que incrementa la secrecin
de la mucosa intestinal.
- Transmisin: Aguas contaminadas con heces o
las verduras regadas con las mismas. Tambin
las moscas.
- Dosis infectiva: Los enfermos expulsan de 10
6
-
10
8
/g en heces aunque se desarrollan a elevada
velocidad.
- Presencia alimentaria: Frutas y verduras crudas
y otros alimentos por contaminacin cruzada.

YERSINIA ENTEROCOLTICA.

familia Enterobacteriaceae, compuesta de bacilos
ovoides con pleomorfismo en cultivos viejos,
siendo cocoides en cultivos jvenes y
generalmente inmviles a alta temperatura, y
mviles (flagelos pertricos) a baja temperatura.
Son no capsulados y psicotrficos (a temperatura
de refrigeracin), catalasa-positivo, oxidasa-
negativo y ureasa-positivo.
Hbitat.
Es un germen ubicuitario presente en
agua y alimentos, as como en heces de animales
domsticos, salvajes o de ganadera.
Patogenicidad:
- Enfermedades: Yersiniosis, o gastroenteritis
agudas. La patogenicidad est en funcin de la
temperatura de incubacin.
- Transmisin: Por alimentos y aguas.
- Dosis infectiva: Elaboracin suficiente de
toxina termoestable.
variados como leches crudas y pasteurizadas,
helados, quesos, carnes envasadas,
ovoproductos, alimentos marinos, vegetales,
frutas y agua.

CAMPYLOBACTER.

familia Spirillaceae, compuesta de grmenes de
morfologa curvada o espiral, muy mviles (1 2
flagelos polares). Microaerfilos (capaces de
proliferar en atmsferas con menos del 6 % del
oxgeno y ms del 5 % de dixido de carbono), son
gram-negativos, oxidasa-positivos y catalasa-
positivos (con excepciones).
Hbitat.
Flora intestinal de animales y aves
domsticas o salvajes, as como en aguas y
alimentos slidos y lquidos.
Patogenicidad:
- Enfermedades: Gastroenteritis humanas o
campilobacteriosis, sobre todo debida a C.
jejuni y C. coli (con capacidad de crecimiento
a 42 C e inhibicin a 25 C).
- Transmisin: Por contacto, contaminacin
cruzada de alimentos, ingestin de alimentos
infectados mal cocinados y/o refrigerados.
- Dosis infectiva: 2 3 /g.
variados como agua, leche, carnes, etc.

LISTERIA MONOCYTOGENES.

propuesta como familia Listeriaceae, compuesta de
bacilos cortos de extremos redondeados o agudos y
generalmente mviles (1 2 flagelos polares). Son
gram-positivos, aunque al envejecer pueden
convertirse en gram-negativos, no esporulados ni
capsulados, psicotrficos y microaerfilos.
Hbitat.
Es un germen ubicuitario y muy
resistente en cualquier medio. A veces intestinal.


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Patogenicidad:
- Enfermedades: Capaces de producir listeriosis,
meningitis, meningoencefalitis, abortos y
septicemias. Es un patgeno intracelular con
produccin de la toxina hemoltica . Los
mutantes no hemolticos carecen de virulencia.
- Transmisin: Transplacentaria, transgenitales
y alimentarias.
3
/g que pasa a 10
6
-10
9
en
unos 15 das.
- Presencia alimentaria: En quesos y carnes.
Tambin puede estar presente como
contaminacin ambiental.

MOHOS Y LEVADURAS.

No corresponde a un grupo
taxonnomico como tal. Se estudia por sus
caractersticas de cultivo comunes. Poseen un gran
poder alterante de los alimentos y pueden ser
peligrosos por sus micotoxinas.
Hbitat.
Es un germen ubicuitario y bastante
resistente en cualquier medio.
Deteccin y recuento.
Tanto para la deteccin o aislamiento
como para el recuento se utilizan medios slidos,
tanto generales como espefcios (uso de
antibiticos). Se utiliza tambin el cultivo en porta
de Johnson.
Para la dentificacin de las micotoxinas
se suele utiliza la cromatografa en capa fina
(TLC).
Se usan an para la identificacin las
tcnicas microscpicas.
Patogenicidad:
- Enfermedades: Capaces de producir
enfermedades peligrosa, hepatotoxicidad,
necrosis, hemorragias, ergotismo, dermatitis,
edemas y funcionar como potente estrognico.
- Transmisin: Consumo de productos
previamente infectados.
- Dosis infectiva: Depende de la toxina.
- Presencia alimentaria: Prcticamente en todos
los alimentos. Tambin puede estar presente
como contaminacin ambiental.

Anlisis Microbiolgicos Unidad Temtica 12. Control de Superficies

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CONTROL MICROBIOLGICO
AMBIENTAL.

La gran versatilidad metablica de los
microorganismos, como ya se ha comentado, hace
que los podamos encontrar prcticamente en
cualquier entorno. Los alimentos son fcilmente
colonizados (contaminados), ya sea de forma
natural, en origen o, durante su procesado y
manipulacin. De especial relevancia adems del
control de alimentos, incluido el agua, y el anlisis
del aire y del suelo, resulta el anlisis de
superficies y de manipuladores de alimentos.
Cuando se trabaja en microbiologa de los
alimentos es importante determinar el grado de
contaminacin ambiental, ya que de las
condiciones higinicas del lugar de trabajo
(superficies, utensilios, etc.) y del propio
manipulador va a depender en parte el nmero y
tipo de microorganismos presentes en el alimento.

CONTROL DE SUPERFICIES.

El control microbiolgico de superficies es
particularmente til para verificar el estado de
limpieza de las instalaciones de la industria
alimentaria, farmacutica y cosmtica, de las
cocinas industriales y de los centros sanitarios y de
convivencia (guarderas, residencias de ancianos,
etc.).
De forma anloga deben controlarse, de
forma exhaustiva, todos los recipientes usados para
el transporte y la expedicin de las mencionadas
industrias, tales como botellas y otros envases,
bidones, depsitos, etc.
Especial mencin merece el anlisis de las
personas que se dedican a la manipulacin de los
alimentos. Estos denominados manipuladores de
alimentos, pueden ser un vector importante en las
toxiinfecciones alimentarias, que debe evitarse
tanto por la manipulacin en las condiciones
higinicas adecuadas, como mediante la higiene,
limpieza y la eliminacin de la sepsis de estas
personas.

EXAMEN DE INSTALACIONES.

Una inspeccin de las instalaciones,
equipos y superficies de trabajo, no slo nos da una
informacin sobre las condiciones
microbiolgicas generales, sino tambin aporta
informacin en cuanto a los mtodos de limpieza y
desinfeccin utilizados, as como de la validez de
los mtodos de organizacin y transformacin
utilizados.
Asimismo, estos exmenes, por otro lado
sencillos, pueden ayudar a localizar los focos de
infeccin, y sugerir los mtodos adecuados para su
minimizacin o su eliminacin.
Los mtodos generales de toma de
muestras son ya conocidos y se aplican en funcin
del tipo de superficie, su extensin y su
localizacin. En general son utilizados:
Torundas o hisopos: En general para grandes
superficies, o superficies fcilmente accesibles,
y grandes depsitos o envases.
Lavados o enjuagues: Para piezas de pequeo
tamao, superficies no accesibles o pequeos
envases.
Impresin: En casos particulares mediante
cintas adhesivas, cilindros de agar, placas de
contacto, portas de impresin, etc.
Sistemas comerciales: Para los problemas ms
usuales.
Membranas filtrantes: Permiten utilizar
mayores volmenes de lquido de lavado o
enjuagado y, por tanto, utilizar estos mtodos
para recipientes y depsitos mayores.

EXAMEN DE Y EQUIPOS.

Por medio de torundas.
Para comprobar cualquier pieza o equipo
ha de frotarse ms de un rea, prestando especial
atencin a las zonas de difcil acceso a la limpieza,
como juntas, uniones, etc.
1. Preparacin: Pueden usarse torundas de
algodn o alginato y escobillones mayores
estriles. Generalmente se mantienen en
contacto con disolucin RINGER 1:4 y con
inhibidores si previamente se han utilizado
desinfectantes qumicos.
2. Friccin: Se aconseja utilizar al menos 100
cm
2
de superficie (siempre que sea posible).
Antes de friccionar se debe presionar contra su
contenedor la torunda para expulsar el exceso
12. Control de Superficies.

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de lquido. Posteriormente se fricciona
restregando y rodando enrgicamente contra la
superficie, primero con trazos en una
direccin, y despus perpendicularmente a la
primera serie de trazos. Una vez acabado se
introduce de nuevo en el tubo.
3. Examen: Debe efectuarse tan pronto como sea
posible y siempre antes de las 6 horas
posteriores a la toma de muestra. La extraccin
de la carga microbiana se efecta por rotacin
reiterada (al menos 6 veces) en solucin
RINGER, para utilizar el lquido para la
inoculacin de las placas o tubos, segn el
sistema de deteccin y/o recuento considerado.
Mediante enjuagado.
Se utiliza solucin RINGER 1:4 estril para
el lavado o enjuague de la pieza a examinar,
utilizando un volumen mximo de 500 mL, (a
veces se utiliza ms si lo que se desea examinar
son tuberas, etc.).
Los lavados deben someterse a ensayo tan
pronto como sea posible y siempre antes de las 6
horas posteriores al enjuague.
Mediante sistemas de impresin.
Estos mtodos tienen escalas de uso
relativamente limitadas, a superficies pequeas,
que sean planas, etc.
Presentan no obstante una ventaja, la de
proporcionar evidencia directa de la posicin del
microorganismo, y la facilidad de transporte desde
el lugar de uso hasta el laboratorio.

EXAMEN DE RECIPIENTES.

Las botellas y recipientes pequeos, deben
examinarse tras su limpieza, cerrndolos de la
forma ms hermtica posible para evitar su
contaminacin y, en cualquier caso, la siembra
debe efectuarse siempre dentro de las 6 horas
desde la toma de la muestra.
Se utilizan en general dos mtodos, siendo
diferente el mtodo para los grandes recipientes:
Lavados.
Se llenan las botellas (o recipientes) con
unos 20 mL de solucin RINGER 1:4 que contiene
un 0,05 % de tiosulfato de sodio y se cambia de
tapn. Puesta la botella en posicin horizontal, se
rueda una docena de veces en la misma direccin,
se deja reposar no menos de 15 minutos y no ms
de 30 para volver a rodar otras 12 veces y
humedecer totalmente la superficie interna.
Posteriormente se pasa a su siembra en el medio
adecuado.
Cultivo in situ.
Sobre todo utilizado para botellas y
envases transparentes, y consiste en aadir un
medio de agar fundido en la botella en volumen
suficiente para formar una fina pelcula sobre la
superficie interna. Se gira horizontalmente, de
forma lenta, hasta que el agar recubra la superficie
interna (se puede abreviar introduciendo la botella
en un recipiente poco profundo de agua helada). La
botella as esta lista para su incubacin que debe
efectuarse con el tapn boca abajo.
Grandes recipientes.
En el caso de grandes recipientes como
bidones y depsitos, pueden examinarse utilizando
solucin RINGER 1:4 estril en cantidad de 500
mL.
1. Seleccin y examen visual: Los bidones o
depsitos, deben examinarse despus de
lavados, ni antes de media hora ni despus de
una hora de aquel, y realizando previamente su
examen visual, consistente en anotar:
- Dentelladuras, oxidaciones y aperturas
laterales o tapas que no corresponden.
- Presencia de pelculas o costras de los
alimentos.
- Grado de humedad del recipiente.
2. Lavado: Se vierten los 500 mL de disolucin
en el bidn y una vez colocada la tapa, se deja
descansar sobre el costado para completar 12
revoluciones hacia delante y hacia detrs tras
un reposo de 5 minutos, para verter luego
sobre la tapa y de ah al recipiente estril de
transporte.
3. Ensayo de los lquidos de lavado: Deben
analizarse lo antes posible, y siempre antes de
las 6 horas de la toma de muestra. No hay que
olvidar agitar para mezclar el medio,
invirtiendo al menos tres veces el frasco de
transporte, antes de la inoculacin.

SISTEMAS COMERCIALES.

Cada da, son ms utilizados los sistemas
comerciales para anlisis de superficie, y que como
caractersticas bsicas presentan:
1. Gran simplicidad de preparacin.
2. Fcil empleo.
3. Coste acorde.
4. No requieren de personal
especializado.
Entre los sistemas ms usuales estn:
Contact Plate
.
Count-Tact
.
Easicult
.
Petrifilm
.
Swab Test Kit
.
Hy food test
.

Pgina 109

PLACAS CONTACT PLATE.

Son placas menores que las de PETRI (55
mm), sobre las que se encuentra un medio agar
solidificado y en ligero exceso, para permitir el
contacto con la superficie a examinar.
El modo de empleo es muy sencillo.
Mantenindola sobre la palma de la mano, se quita
la tapa, se coloca sobre la superficie a imprimir y
se ejerce una ligera presin vertical, manteniendo
la placa inmvil, durante el contacto. En el caso de
superficies con aristas, un movimiento de
balanceo, permite la toma de huellas de tales
conformaciones. Se cierra la tapa y se coloca en la
estufa de incubacin a la temperatura y tiempo
adecuado al microorganismo estudiado.
Al final de la incubacin, las colonias
desarrolladas en el agar, y gracias a un sistema de
cuadrculas por medio de letras y cifras, se obtiene
una fotografa de la distribucin de los
microorganismos presentes.
Su uso es general.

PLACAS COUNT-TACT.

Lo mismo que las anteriores, se utilizan
para la deteccin y recuento de microorganismos.
Estas placas de 55 mm y con fondo cuadriculado,
estn llenas de agar con un menisco que permite la
aplicacin directa sobre la superficie a controlar.
El modo de empleo es similar al de las placas
Contact Plate, y su uso se recomienda para
establecer o revisar los programas de control
bacteriolgico de las superficies de hospitales,
industrias y servicios pblicos diversos.

PROBETAS EASICULT.

El sistema es un simple procedimiento de
ensayo, vlido para fluidos industriales y, por
tanto, para el anlisis de los enjuagues y lavados de
superficies.
Consta de una lmina plstica recubierta
por ambas caras con un medio nutriente, uno
general para aerobios (T.T.C.) y el otro para
hongos y levaduras (R.B.), aunque existen medios
especiales para distintos controles bacterianos
como el de clostridios sulfito reductores.
En el caso de anlisis de fluidos basta
sumergir la probeta en el mismo, humedecer
totalmente ambas superficies de la misma e
incubarlas, lentamente a temperatura ambiente o
ms rpidamente a unos 30 C.
La obtencin de resultados
semicuantitativos, se verifica mediante
comparacin con la representacin de como deben
quedar las placas a concentraciones entre 10
3
-10
7

microorganismos por mL, para tres tipos de
microorganismos: bacterias aerbicas totales,
hongos-levaduras y bacterias anaerbicas sulfito
reductoras.

PLACAS PETRIFILM.

Las placas Petrifilm es un test listo para
usar en la enumeracin de diferentes
microorganismos en superficies tanto si estas
tienen aristas como curvas al ser un sistema
totalmente flexible.
Existe en los modelos Petrifilm SM con
los componentes habituales de PCA para el
recuento total de la poblacin aerbica, el Petrifilm
VRB (bilis rojo violeta) para el recuento de
coliformes y el Petrifilm E. coli para la
enumeracin conjunta de los coliformes y E. coli,
que contiene un medio biliado con violeta cristal y
rojo neutro, un gelificante soluble en agua fra, un
indicador de -glucoronidasa para la deteccin de
E. coli (color azul) y un colorante de tetrazolium
para la enumeracin de microorganismos gram-
negativos que no son E. coli (color rojo).
Al ser un film, posee ventajas inherentes
en cuanto al transporte, almacenaje, incubacin y
manipulacin en la lectura (fcilmente observable
el gas desprendido).

SWAB TEST KIT.

Son muestreadotes estriles y listos para
su uso. Consisten bsicamente en una lengeta de
plstico que lleva incorporado un filtro de
membrana Millipore (0,45 ) montado sobre un
cartn absorbente. Para la obtencin del inculo
procedente de la superficie lleva un pincel que se
descarga posteriormente en su envase.
Se suministra en los modelo Coli-Count
(para coliformes totales y coliformes fecales) SPC
Total Count para determinar aerobios totales y
Yeast & Mold para hongos y levaduras.

HY FOOD TEST.

Es un laboratorio de bolsillo que se
puede utilizar para el anlisis de superficies entre
otros usos. Consiste en una barrita cuya base est
adherida al tapn de un tubo cerrado
hermticamente y esterilizado el conjunto por

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irradiacin. Cada lado de la barrita contiene un
medio de cultivo que puede ser presionado
directamente sobre la superficie que debamos
controlar. El sistema permite la identificacin y
recuentos semi-cuantitativos con buenos resultados
por comparacin con un diagrama patrn.
Se venden en diferentes combinaciones
comerciales pudiendose ser, las dos caras del
mismo medio o de medios diferentes.
Aerobios totales/aerobios totales.
Aerobios totales/lactobacilos.
Aerobios totales/coliformes.
St. aureus / St. aureus.
Lactobacilos/mohos y levaduras.
Salmonella/Salmonella.
Aerobios totales/mohos y levaduras.

MICROORGANISMOS ESTUDIADOS.

De forma convencional, para obtener la
indicacin del estado general de las superficies
controladas, los microorganismos que se suelen
utilizar son:
Bacterias aerbicas mesfilas.
Para su cultivo se utilizan medios de
cultivo que contienen generalmente triptona,
glucosa, extracto de levadura y agar entre otros
componentes. As las placas Count-Tact, tienen
una composicin en g/L de:
Triptona 15,0.
Extracto de soja 5,0.
Cloruro sdico 5,0.
Lecitina 0,7.
Polisorbato 80 5,0.
Agar 20,5.
La incubacin se realiza a 30-32 C / 24-48
horas.
Bacterias de origen fecal.
Generalmente se utilizan como indicadores
los coliformes totales con ayuda de medios usuales
como el agar MCCONKEY o el agar lactosa
desoxicolato, incubando a 37 C durante 24-48
horas.
Mohos.
Tanto para hongos como levaduras se
emplea como medio de cultivo el agar dextrosa de
SABOURAUD (que incluye inhibidores del
crecimiento bacteriano) para ser incubados a 25-30
C durante 72-120 horas.

EVALUACIN DEL GRADO DE
CONTAMINACIN SUPERFICIAL.

Como en cualquier anlisis
microbiolgico, despus de evaluar el grado de
contaminacin de las superficies, es necesario
tener en cuenta los lmites de aceptabilidad, que
deben ser fijados previamente, tanto en funcin de
las superficies estudiadas, como de los
microorganismos indicadores utilizados.
Los sistemas comerciales, en general,
tienen sus propios criterios de clasificacin, as
para las placas Contact Plate, para el recuento total
de bacterias se cuenta con una clasificacin del
siguiente tipo:

En el caso de las placas Count-Tact, el
nmero de colonias consideradas como aceptables,
no slo depende del tipo de superficie, sino
tambin de donde se encuentra sta (zona
investigada), segn orientaciones dadas por la
APHA:
As, para el control inmediato de las
superficies despus de la limpieza de las
habitaciones de los pacientes en centros sanitarios,
el nmero de colonias contadas por placa, y su
clasificacin microbiolgica es:
- 0 25 = bueno.
- 25 50 = regular.
- > 50 = malo.
Para la evaluacin de superficies
diversas, podemos visualizarlo en la tabla
siguiente.

CONTROL DE LOS MANIPULADORES
DE ALIMENTOS.

Un alimento puede estar contaminado en
su origen o bien puede ser el manipulador quien lo
contamine durante el procesado del mismo.
A los manipuladores de los alimentos
debe exigrseles unas prcticas de su trabajo en
perfectas condiciones higinicas, as como el
control microbiolgico de las superficies que en
N de colonias Evaluacin Clasificacin
En 16 cm
2
en desarrollo
microbiano

0 - Ausencia

1 9 + - Mnimo

10 20 + Ligero

20-100 + + Moderado

> 100 + + + Considerable

Recuento
imposible + + + Considerable

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principio se pondrn en contacto con dichos
alimentos (las manos), sobre todo en aquellos
productos a los cuales posteriormente no se les va
a someter a ningn tratamiento.
Se debe, adems, tener presente, que la
limpieza de las manos, entendiendo que estas son
herramientas de trabajo, deben ser sometidas a
limpieza al cambiar de alimento pues pueden
producir las denominadas contaminaciones
cruzadas (el tocar un alimento ya elaborado para
su comercializacin y libre de grmenes, despus
de haber tocado un alimento crudo, hace que la
carga microbiana del alimento crudo pase al
alimento elaborado).
Por otro lado, es necesario controlar no
slo las manos, sino tambin la cara-cuero
cabelludo y sobre todo la zona nasofarngea; la
primera, porque de forma innata es tocada
constantemente y de forma inconsciente por las
manos; la segunda porque es fuente de aerosoles,
que son fuente de contaminacin (mediante el
estornudo, la tos o la simple respiracin) si no se
utilizan las mascarillas adecuadas.
Hay que recordar que dicha zona
constituye un reservorio importante del
Staphylococcus aureus, que puede originar graves
infecciones estafiloccicas, y que gran parte de la
poblacin es portadora habitual de este
microorganismo.
El objeto de un anlisis de manipuladores
es comprobar que la persona que procesa el
alimento no es una fuente de contaminacin de
ste. Las zonas ms estudiadas son manos, uas y
fosas nasales.

Medios:
1. Agar nutritivo o PCA para el aislamiento y
recuento de aerobios mesfilos totales.
2. VRBG para el aislamiento y recuento de
Enterobacteriaceae.
3. Agar manitol sal o BAIRD-PARKER para el
aislamiento y recuento de Staphylococcus
aureus.
Incubacin:
En general se incuban las placas durante
24-48 horas a 37 C.
Aunque no estn legislados los lmites
de bacterias toleradas en cada caso, unos niveles
elevados de estos microorganismos nos harn
sospechar una mala higiene del manipulador y la
posibilidad de que sea portador de bacterias
patgenas.
La legislacin presente est contemplada
en el R. D. 2002/2000 (B.O.E de 25/02/2001) y es
poco exhaustiva. En la Comunidad de Madrid los
planes de formacin los dirige la Direccin
General de la Salud Pblica dependiente de la
Consejera de Sanidad y se concretan en el Decreto
10/2001 (B.O.C.M. de 07/02/2001).

Nmero de colonias por placa Count-Tact
Zona Bueno Regular Malo
Guardera infantil:
Suelos y mesas

0 5

6 15

15
Habitaciones de pacientes:
Suelos
Mesas

0 25
0 5

25 50
6 - 15

50
15
Cuartos de bao:
Suelos
Lavabos
Retretes

0 25
0 15
0 5

26 50
16 25
6 15

50
25
15

Es de destacar que en el ao 2000 en la Comunidad de Madrid se detectaron 2.187 casos de intoxicaciones
alimentarias (siendo el 68,3 % de las mismas intoxicaciones colectivas), atribuyndose un 33,8 % de las causas a las
prcticas incorrectas en la manipulacin.

Pgina 112

GALERA DE IMGENES.

Anlisis Microbiolgicos Unidad Temtica 13. Control del Aire y del Suelo

Pgina 113


CONTROL DEL AIRE.

El aire, adems de partculas en
suspensin, es portador de bacterias o sus esporas.
Por ello puede ser causa tanto de contaminacin de
los alimentos y superficies, como de infecciones en
el hombre (patologas respiratorias, etc.).
Un control peridico y repetitivo de las
condiciones de higiene del aire ambiental y de la
superficie, desde el punto de vista microbiolgico,
se impone hoy tanto en el mbito de lugares
pblicos (hospitales, guarderas, etc.) como en la
industria (alimentaria, cosmtica y farmacutica
principalmente).
Los valores usuales, dependiendo tambin
de la altura, oscilan de varios centenares / m
3
sobre
la tierra a 0,03 / m
3
sobre el mar abierto.

MTODOS DE CONTROL DEL AIRE.

Existen diferentes mtodos para el anlisis
del aire:
1. Sedimentacin en placa.
2. Filtracin.
3. Choque en lquidos.
4. Precipitacin electrosttica.
De los cuatro mtodos, los dos primeros
son los ms utilizados, y dentro de los sistemas de
filtracin existen sistemas comerciales para una
evaluacin cuantitativa como el SAS (Surface Air
Sistem) vlido tambin para anlisis superficial y
equipado de las placas Contact Plate
.

ANLISIS POR SEDIMENTACIN.

Es el mtodo ms sencillo para la
determinacin de microorganismos del aire, pero
adolece que sus resultados son meramente
orientativos de las cifras de microorganismos
presentes del aire, ya que estos, estn sujetos, a las
corrientes del aire, al tamao de las partculas en
suspensin area, etc.
El mtodo recurre a destapar las placas de
cultivo en el lugar cuyo nivel de contaminacin se
desea examinar, durante intervalos de tiempo
preestablecidos, para posteriormente incubar las
placas en las condiciones de tiempo y temperatura
ms adecuadas al microorganismo a estudiar.

As, para aerobios mesfilos totales se
emplean placas PCA y tiempos de incubacin de
24-48 horas a 37 C.
Para el estudio de microorganismos
especficos como mohos, Legionella, etc. se
pueden emplear medios de cultivo selectivos.
En ambientes sin corriente de aire se
estima que el nmero de unidades formadoras de
colonias por placa abierta en 15 minutos equivale
al nmero de unidades formadoras de colonia que
precipitan en 0,1 m
2
por minuto.

ANLISIS POR FILTRACIN.

Para realizar el mtodo, es necesario
disponer de un sistema de filtracin por aspiracin.
Por tanto, se conecta una bomba de vaco durante
un tiempo predeterminado.
El aire pasa por uno o ms tamices de
dimetro de poro variable donde los
microorganismos quedan atrapados en la superficie
de una o ms placas de agar con el medio de
cultivo deseado, para su posterior incubacin en las
condiciones ptimas de crecimiento para cada
microorganismo.
El sistema permite una mayor precisin en
la carga microbiana, siempre que conozcamos el
caudal de aire aspirado por nuestro sistema y el
tiempo de aspiracin.

ANLISIS POR SAS.

Mediante el sistema SAS, el aire ambiente
a examinar es aspirado a travs de una superficie
perforada a una velocidad preestablecida y durante
una duracin determinada, para ser guiado sobre
una placa Contact Plate que contiene el medio
especfico para los microorganismos que nos
propongamos investigar.
Al final del muestreo, la placa es quitada
del sistema para su correcta incubacin.
Los microorganismos son as hechos
visibles con el fin de ser contados.
Hay que insistir en que el flujo y el tiempo
de muestreo sean correctamente medidos para
calcular el nmero de microorganismos presentes
por unidad de volumen de aire investigado.
Los valores obtenidos se llevan a unos
13. Control del Aire y del Suelo.

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ndices de aceptabilidad predeterminados, a partir
de los cuales podremos emitir un juicio sobre las
condiciones de higiene microbiolgica del
ambiente controlado.

EVALUACIN DEL GRADO DE
CONTAMINACIN DEL AIRE.

Un juicio definitivo no podr ser emitido
ms que despus de haber fijado, con anterioridad,
los lmites de aceptabilidad para cada zona de
muestreo particular.
En los locales provistos de un sistema de
aireacin convencional la cantidad de
microorganismos puede alcanzar valores de 50-200
/ m
3
, segn la importancia de la renovacin del
aire. Sin embargo, en una atmsfera expuesta a un
movimiento ligero del aire, los microorganismos
sern poco numerosos.
Una atencin muy particular deber ser
tenida en el control de las instalaciones de
aireacin.
Como ejemplo, algunos autores estiman
que en un quirfano los valores no deben
sobrepasar los 35-70 microorganismos / m
3
.
En lo que se refiere a los locales destinados
a la produccin y al acondicionamiento de
alimentos, es ms difcil dar valores absolutos. Es
necesario tener en cuenta las condiciones
especficas de las instalaciones, de los productos,
etc., pero en cualquier caso no deberan sobrepasar
los valores de 150-300 microorganismos / m
3
.

EL AIRE ACONDICIONADO.

La mayora de edificios industriales,
comerciales y de oficinas, cualquiera que sea su
tamao, disponen de sistemas mecnicos de
suministro de aire fresco el cual puede ser filtrado,
calentado o enfriado y en ocasiones humidificado.
En estos equipos se pueden dar las
condiciones idneas para el crecimiento y
dispersin de los microorganismos o agentes
biolgicos.
Los microorganismos son transportados
por el agua destinada a la humidificacin, por el
agua de la red general de la ciudad (este agua es
potable, pero eso no implica que sea estril), o por
el agua proveniente de pozos. Tambin son
transportados por el aire exterior que contiene
polen, esporas fngicas, bacterias, o por el aire
reciclado que aporta los aerosoles generados por
las personas que ocupan los edificios.
Si las condiciones son favorables a su
desarrollo, es decir, disponen de elementos
nutritivos y el pH y la temperatura son los
adecuados, los microorganismos proliferan,
produciendo desechos que pueden ser utilizados
como substrato por otros agentes biolgicos,
permitiendo as el asentamiento de nuevas
especies.
La naturaleza del sistema de
ventilacin/climatizacin juega un papel
preponderante en el riesgo de proliferacin

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microbiolgica, en su transferencia al ambiente y
en su inhalacin por parte de las personas
expuestas.
Los principales focos de contaminacin
biolgica relacionados con los sistemas de
ventilacin/climatizacin son:
1. El aire exterior: ste transporta granos de
polen, bacterias y hongos tanto sus formas
vegetativas como sus formas resistentes
(esporas), la mayora son inocuos para el
hombre pero algunos de ellos pueden ser
patgenos.
2. Los sistemas de filtracin: En ellos, y esa es su
misin, queda retenido buena parte del
material particulado que lleva el aire y al que
pueden ir asociados microorganismos, este
material es un buen medio para la proliferacin
de los mismos.
3. El sistema de refrigeracin: Durante la
estacin clida el vapor de agua que contiene
el aire condensa sobre los serpentines de
refrigeracin, ese agua puede quedar estancada
en el suelo del equipo donde, junto a la
suciedad que all est acumulada, se crean las
condiciones adecuadas para el desarrollo de
agentes biolgicos.
Otro foco de contaminacin asociado al
sistema de refrigeracin lo constituyen las
torres de refrigeracin, en ellas las
temperaturas que alcanza el agua no estn lejos
de las que favorecen el desarrollo de las
bacterias causantes de la legionelosis, entre
350 y 45C y de otros microorganismos como
algas, amebas y bacterias.
De las torres de refrigeracin, debido a su
diseo y funcionamiento, se desprenden a la
atmsfera aerosoles que pueden contener
microorganismos, los cuales se suman a la
contaminacin exterior, pudiendo
reintroducirse en el sistema de ventilacin del
mismo edificio o de los edificios situados en la
proximidades, dependiendo de la direccin de
los vientos predominantes en la zona as como
de la ubicacin de las tomas de aire.
4. Los humidificadores: Especialmente aquellos
en los que el agua es reciclada, pueden
convertirse en reservorios y diseminadores de
los microorganismos que se desarrollen en
ellos.
5. Los materiales porosos: En ocasiones estn
presentes en los sistemas de
ventilacin/climatizacin, normalmente como
aislantes acsticos o como material de
construccin de los conductos. En ellos se
pueden dar las circunstancias que favorecen el
crecimiento de agentes biolgicos, por ejemplo
la suciedad que aporta nutrientes y el agua que
transporta el aire.
6. El aire del interior de los locales: El aire ha ido
recogiendo la contaminacin producida en los
diferentes focos. Uno de los ms importantes
son las personas que ocupan el edificio, estas
personas pueden ser portadores sintomticos o
asintomticos de agentes biolgicos. Hay que
tener en cuenta que muchos sistemas de
ventilacin funcionan reciclando el aire
interior por lo que el sistema puede, en
conjunto, convertirse en el diseminador de la
contaminacin generada en una zona, al resto
del edificio.

PATOLOGAS Y MICROORGANISMOS.

Se distinguen dos tipos fundamentales de
patologa causada por agentes biolgicos
relacionadas con los sistemas de
ventilacin/climatizacin:
Manifestaciones de tipo alrgico que
comprenden asma, rinitis, conjuntivitis,
pneumonas hipersensitivas, fiebre de los
humidificadores o fiebre del lunes. Dichas
afectaciones han sido atribuidas a diversos
microorganismos entre los que se pueden destacar
las bacterias filamentosas (Thermoactinomyces
vulgaris, Micropolyspora faeni); los bacilos Gram
negativo (Pseudomonas, Klebsiella, Enterobacter,
Escherichia coli); los hongos (Penicifflum,
Aspergillus, Altemaria) y los protozoos (Naegleria
gruberi, Acanthoameba).
Enfermedades infecciosas, siendo las ms
representativas la Enfermedad del Legionario y la
Fiebre de Pontiac. El agente causal de ambas
enfermedades es una bacteria (Legionella
pneumophila) y su diferencia a grandes rasgos
estriba en que la primera es una neuropata aguda y
en ocasiones mortal mientras que la segunda, ms
benigna, se caracteriza por un sndrome
pseudogripal. No se conoce por qu esta bacteria
causa dos enfermedades con cuadros clnicos
diferentes, aunque se especula con la teora de que
la fiebre de Pontiac es una reaccin hipersensitiva
a las amebas infectadas por Legionella
pneumophila.

EL SUELO COMO MEDIO.

Muchas sustancias tiles como alimentos
para los microorganismos tienden a adsorberse
sobre las superficies sumergidas en medios
lquidos, por lo que una masa particulada como el

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suelo forma diminutos nichos ecolgicos donde la
vida microbiana prolifera, sobremanera en tiempo
caluroso y despus de los das de lluvia.
Aunque casi todos los microorganismos
se encuentran a nivel superficial, tambin existen
hasta casi profundidades de 2 m, si bien son ms
escasos. As a 2,5 cm de profundidad existen unos
4.000.000.000 / g y a 182 cm slo 100 / g.
De cualquier forma cada tierra es un caso
particular siendo muy difcil hablar de promedios.
Podemos hablar de variaciones habituales entre
1.000.000-10.000.000 / g de suelo, teniendo un
lmite inferior de 1.000-10.000 y un lmite superior
de 1.000.000.000-10.000.000.000 / g de suelo.
En una tierra calificada como buena para
la agricultura, se pueden dar proporciones de agua
del 40 % y de aire del 10 %, conteniendo en
solucin cationes (como K
+
, Na
+
, Mg
2+
, Ca
2+
, Fe
3+
,
etc.), aniones (como nitrato, sulfato, carbonato y
fosfato), que junto con un valor de pH
comprendido entre 6,0 y 8,0 y gran cantidades de
sustancias orgnicas (procedentes de la
descomposicin de animales y vegetales), hacen un
medio de cultivo excelente para la proliferacin de
microorganismo entre 15 45 C.

LA RIZOSFERA.

Es una zona de crecimiento y actividad
microbiana mayor que existe en los suelos
alrededor de las races de las plantas, formando un
manto pegado en las mismas pero que a veces se
extiende hasta varios cm de ellas, existiendo gran
cantidad y variedad de microorganismos donde se
encuentran todas las interacciones ecolgicas:
Competencia:
La competencia es un tipo de relacin
interespecfica que tiene lugar entre varios
individuos de distintas especies, pero del mismo
nivel trfico o de obtencin de recursos, cuando
existe una demanda activa de un recurso comn
que puede ser limitante.
Depredacin:
En Ecologa la depredacin es un tipo de
relacin interespecfica que consiste en la caza y
muerte que sufren algunos individuos de algunas
especies (presa), por parte de otros que se los
comen llamados depredadores o predadores.
Parasitismo:
Parasitismo es una interaccin biolgica entre
dos organismos, en la que uno de los organismos
(el parsito) consigue la mayor parte del beneficio
de una relacin estrecha con otro, el husped. El
parasitismo puede ser considerado un caso
particular de predacin o, por usar un trmino
menos equvoco, de consumo. Los parsitos que
viven dentro del organismo husped se llaman
endoparsitos y aquellos que viven fuera del
organismo husped reciben el nombre de
ectoparsitos. Un parsito que mata al organismo
donde se hospeda es llamado parasitoide.
Explotacin:
En ecologa y biologa el trmino explotacin
es un tipo de relacin interespecfica que ocurre
por la interaccin de varias especies en la que unas
resultan beneficiadas a costa de otras que son
perjudicadas, por ejemplo el cuco, que pone los
huevos en el nido de otros pjaros para que le
alimente la cra.
Comensalismo:
Comensalismo se define como una relacin
interespecfica entre dos organismos vivientes,
donde uno de los individuos se beneficia y el otro
no se ve perjudicado ni beneficiado. El trmino
comensalismo proviene del latn com mensa, que
significa "compartiendo la mesa". Originalmente
fue usado para describir el uso de comida de
desecho por parte de un segundo animal, como los
carroeros que siguen a los animales de caza, pero
esperan hasta que el primero termina de comer.
Inquilinismo:
El inquilinismo es un tipo de relacin
interespecfica, parecida al comensalismo, en la
que una especie da cobijo a otra. En esta relacin
la especie que alberga no se beneficia ni se
perjudica y la otra que encuentra el albergue
resulta beneficiada.
Facilitacin:
En Ecologa la facilitacin es una relacin
interespecfica entre individuos de especies
diferentes dentro de un ecosistema en donde al
menos una de las especies se beneficia de crecer
junto a otra.
Simbiosis:
En biologa, la simbiosis es un tipo de
interaccin biolgica entre dos o ms organismos
de distinta especie. A los organismos involucrados
se les denomina simbiontes.
Existe discrepancia sobre si el trmino debe
reservarse para las relaciones de mutualismo (es
decir, aquellas en que todos los simbiontes salen
beneficiados), las relaciones de mutualismo
necesarias para la supervivencia de todos los
simbiontes o extenderse a todas las relaciones
interespecficas
Mutualismo:
El mutualismo es una interaccin biolgica en
la que ambos organismos de una relacin ntima
obtienen algn grado de beneficio. El mutualismo
suele ser temporal y no obligatorio
Exclusin mutua:
En ecologa y biologa, la exclusin mutua es

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un tipo de relacin interespecfica que tiene lugar
entre dos especies de forma que les es
completamente imposible vivir juntos. De tal
forma que cuando una especie aparece, la otra est
ausente y viceversa, por causas achacables al
comportamiento competitivo de ambos.

De todos es conocido que bacterias y
hongos convierten el nitrgeno en formas
asimilables para las plantas, y a cambio, o no,
pueden recibir sustancias carbonadas que son
sintetizadas por las plantas, y que ciertas algas
producen carbohidratos utilizados por bacterias
que no lo pueden sintetizar para formar lquenes.

LOS MICROORGANISMOS EN LA
ACTIVIDAD BIOGEOQUMICA.

Los ciclos de los elementos nutrientes
dentro de la biosfera afectan a miradas de
microorganismos y sus actividades son necesarias
para la propia continuidad de la vida.
La prctica ausencia de materia orgnica
en los suelos pone en evidencia la existencia de
grandes cantidades de microorganismos, as como
su versatilidad metablica.
El suelo, ya de origen orgnico como
mineral, es fruto de una serie de acontecimientos
biogeoqumicos, en el que estn implicados una
gran variedad de microorganismos.
Sin entrar en profundidades, los
microorganismos son, adems de los creadores del
suelo, la panacea y el azote a un tiempo, que
contribuye al control y eliminacin de la polucin,
pero tambin a crearla, pues si bien ayudan a
eliminar agentes contaminantes del suelo
transformndolos en productos inocuos, a veces su
metabolismo puede dar lugar al efecto invernadero
por produccin de gases (dixido de carbono y
metano), o a la eutrofizacin de estanques y lagos,
o a la metilacin mercurial, dando un compuesto,
que puede entrar en la cadena trfica con el
consiguiente riesgo para la salud pblica.

BIODEGRADACIN.

La biodegradabilidad es la caracterstica
de algunas sustancias qumicas de poder ser
utilizadas como sustrato por microorganismos, que
las emplean para producir energa (por respiracin
celular) y crear otras sustancias como aminocidos,
nuevos tejidos y nuevos organismos.
La biodegradacin puede emplearse en la
eliminacin de ciertos contaminantes como los
desechos orgnicos urbanos, papel, hidrocarburos,
etc. No obstante en vertidos que presenten materia
biodegradable estos tratamientos pueden no ser
efectivos si nos encontramos con otras sustancias
como metales pesados, o si el medio tiene un pH
extremo. En estos casos se hace necesario un
tratamiento previo que deje el vertido en unas
condiciones en la que las bacterias puedan realizar
su funcin a una velocidad aceptable.
La degradacin de estos compuestos
puede producirse por dos vas:
degradacin aerobia
degradacin anaerobia
Algunos plazos de tiempo para la
pudricin de varias materias comunes
Bolsas de plstico: 12 a 20 aos.
Botella de vidrio: cerca de 4000 aos.
Calcetines hechos de lana: 1 a 5 aos.
Cscara de naranja: 6 meses.
Cscara de pltano o de banana: 2 a 10 das.
Cuerda: 3 a 14 meses.
Envases de leche (Tetra PACK): 5 aos.
Filtros de cigarrillos: 1 a 2 aos.
Papel: 2 a 5 meses.
Pauelos hechos de algodn: 1 a 5 meses.
Telas de nailon: 30 a 40 aos.
Zapatos de cuero: 25 a 40 aos.
Estaca de madera: 2 a 3 aos.
Estaca de madera pintada: 12 a 15 aos.
En el caso de la madera, actan:
Bacterias
Las bacterias lignocelulsicas , son los primeros
microorganismos que colonizan la madera
expuesta en ambientes hmedos, han sido
encontradas en maderas sumergidas en agua salada
y dulce y en contacto con el suelo. El efecto de las
bacterias sobre la madera es variado, se ha
detectado un aumento en la permeabilidad, como
resultado de la degradacin de las membranas de
las punteaduras, tambin se ha reconocido la
capacidad enzimtica para degradar la pared
celular; algunas poseen la facultad de atacar
maderas que han sido tratadas qumicamente con
preservantes. En general, se considera que el efecto
del ataque de las bacterias sobre la madera es
mucho menor que el de los hongos, sin embargo un
ataque bacterial condiciona la madera para la
sucesin microbial. Algunos gneros de
importancia en la microbiologa de la madera son
Bacillus, Pseudomonas, Flavobacterium y
Brevibacterium.
Hongos
Mohos:
Son los tpicos hongos de humedad, no influyen en
las propiedades de resistencia mecnica de la
madera, solamente se desarrollan en su superficie y

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no en el interior; producen proliferaciones
algodonosas de micelio de diversas tonalidades.
Los mohos crean condiciones para el desarrollo de
los hongos pudridores, debido a que les otorgan
humedad. Se desarrollan en los depsitos y patios
de madera aserrada, cuando el material no se apila
correctamente y se impide de esta forma un secado
rpido. Pueden ser eliminados fcilmente por
medios mecnicos.
Hongos cromgenos:
Son todos los hongos capaces de producir cambios
de coloracin en los tejidos de la madera, los
cuales se alimentan de los azcares que se
encuentran en el tejido parenquimtico, los
desechos metablicos que se dan en el momento
del ataque son coloreados y producen esa
pigmentacin azulada-negruzca caracterstica, el
crecimiento de estos hongos en la madera es muy
rpido, de hasta 1 cm en el espesor en 24 horas. El
ataque se da en el periodo entre la corta y el
almacenamiento de las trozas; bajo condiciones
ptimas para el hongo de temperatura (24 y 35 C)
y humedad (> 30%), las maderas de colores claros
tienden a mancharse ms fcilmente que las
maderas oscuras, lo mismo que las maderas menos
densas. En algunos casos, los hongos causantes del
manchado se asocian con insectos capaces de
transportar las esporas a diferentes sitios,
propagando la infeccin (escarabajos de ambrosa),
tambin son transportadas por el aire y la lluvia,
causando infecciones en patios de secado. La
mancha azul no causa efecto considerable en
esfuerzos de flexin, compresin, pero si es muy
intenso reduce la resistencia al impacto, disminuye
la velocidad de secado y aumenta la
susceptibilidad a la pudricin.
Hongos de pudricin:
Penetran la madera mediante hifas y permanecen
ocultos en ella, lo que hace muy difcil reconocerla
hasta que ya sea tarde, cuando ya se han dado
cambios de color manifestaciones miceliares. En
estados avanzados la madera pierde peso, se estima
que una prdida de peso del 4% representa una
disminucin en la resistencia fsico-mecnica de un
28%. La remocin de los cuerpos fructferos no
detiene la degradacin de la madera.

BIOREMEDACIN.

La biorremediacin es el proceso por el
cual son utilizados microorganismos para limpiar
un sitio contaminado. Los procesos biolgicos
desempean un papel importante en la eliminacin
de contaminantes y la biotecnologa aprovecha la
versatilidad catablica de los microorganismos
para degradar y convertir dichos compuestos. En el
mbito de la microbiologa ambiental, los estudios
basados en el genoma abren nuevos campos de
investigacin in silico ampliando el panorama de
las redes metablicas y su regulacin, as como
pistas sobre las vas moleculares de los procesos de
degradacin y las estrategias de adaptacin a las
cambiantes condiciones ambientales. Los enfoques
de genmica funcional y metagenmica aumentan
la comprensin de las distintas vas de regulacin y
de las redes de flujo del carbono en ambientes no
habituales y para compuestos particulares, que sin
duda aceleraran el desarrollo de tecnologas de
biorremediacin y los procesos de
biotransformacin.
Los entornos marinos son especialmente
vulnerables ya que los derrames de petrleo en
regiones costeras y en mar abierto son difciles de
contener y sus daos difciles de mitigar. Adems
de la contaminacin a travs de las actividades
humanas, millones de toneladas de petrleo entran
en el medio ambiente marino a travs de
filtraciones naturales. A pesar de su toxicidad, una
considerable fraccin del petrleo que entra en los
sistemas marinos se elimina por la actividad de
degradacin de hidrocarburos llevada a cabo por
comunidades microbianas, en particular, por las
llamadas bacterias hidrocarbonoclsticas (HCB).
Adems varios microorganismos como
Pseudomonas, Flavobacterium, Arthrobacter y
Azotobacter pueden ser utilizados para degradar
petrleo. El derrame del barco petrolero Exxon
Valdez en Alaska en 1989 fue el primer caso en el
que se utiliz biorremediacin a gran escala de
manera exitosa, estimulando la poblacin
bacteriana suplementndole nitrgeno y fsforo
que eran los limitantes del medio.

BIOTOXICIDAD.

En el estudio de la toxicidad
medioambiental, adems de mediante los
procedimientos analticos de la qumica se pueden
realizar mediante la medida de la supervivencia de
microorganismos, que quedan afectados de dicha
biotoxicidad.
Es el caso de BioFix
Lumi que para los

ensayos de toxicidad utiliza bacterias
luminiscentes.
El ensayo de bacterias luminiscentes
mide la luz emitida por estas cuando estn en
contacto en la muestra a ensayar, luz que es
comparada con la luz emitida por una muestra de
control.
La diferencia de valores entre la muestra
y el control, se atribuye al efecto de la muestra

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sobre el microorganismo.
Los resultados se suelen dar en
porcentaje de inhibicin.
Para medir la bioluminiscencia de Vibrio
fischerii se emplea un luminmetro, de los cuales
existen incluso equipos porttiles para la
realizacin de medidas in situ.

EXAMEN MICROBIOLGICO DEL
SUELO.

La gran variedad de microorganismos
presentes en el suelo, hace imposible la
generalizacin de un mtodo nico para cultivarlos
o enumerarlos. Generalmente se recurre a dos
mtodos:

MTODOS EN PLACA.

Los mtodos en placa son aplicables para
la enumeracin y aislamiento de bacterias,
levaduras y hongos, utilizando modificaciones de
los medios de cultivo a fin de conseguir una cierta
selectividad.

EXAMEN MICROSCPICO.

Efectuando extensiones coloreadas de
tierra y por observacin microscpica podemos
contar los diferentes tipos de microorganismos
(vivos o muertos) presentes en una muestra. A
veces y para evitar la confusin con las partculas
del suelo se suelen emplear en la tincin
anticuerpos fluorescentes especficos.

Anlisis Microbiolgicos Unidad Temtica 14. Control del Agua

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CONTROL DEL AGUA.

Los seres vivos estn compuestos
mayoritariamente por agua y el agua es esencial
para la vida tal y como la concebimos.
El agua es un disolvente universal y toda la
vida depende de ella. Para los productores
primarios (plantas verdes y algas), el agua sirve
como dador de electrones o de hidrgeno en la
fotosntesis. En los dems seres vivos, toda la
actividad enzimtica (que mantiene) la vida
depende de la presencia de agua.
No obstante, puede ser el vector de
transmisin de grmenes peligrosos, sobre todo,
cuando va a ser usada para su consumo, por lo que
es necesario determinar su potabilidad, es decir, si
es apta para el consumo pblico.
En cualquier caso, debe realizarse un
anlisis microbiolgico del agua, sobre todo para la
determinacin de microorganismos fecales (no
necesariamente patgenos, pero cuya presencia es
indicativa de contaminacin de origen animal o
humano), lo que puede conllevar, o no, la
existencia de microorganismos patgenos.

MEDIOS HDRICOS.

Dentro de los medios hdricos naturales
podemos distinguir entre medios de agua dulce y
medios marinos:

MEDIOS DE AGUA DULCE.

El aporte esencial de agua en casi todos los
medios de agua dulce se debe a la precipitacin
(lluvia, nieve o granizo) que cae sobre la superficie
terrestre, que es evaporada, transpirada, o corre
directamente hacia los torrentes, ros y lagos, o se
filtra directamente a travs de suelo para formar
parte de las corrientes y capas freticas, pudiendo,
o no, salir a la superficie posteriormente.
El estudio de los hbitats de agua dulce se
conoce con el nombre de Limnologa, y abarca
todas las ramas de la ciencia implicadas en su
estudio, incluida la microbiologa acutica.
1. Lagos y pantanos.
Cualquier depresin del suelo terrestre que
retenga el agua de lluvia, de los ros o de los
manantiales, formados naturalmente o no.

En funcin de la cantidad de nutrientes
(autctonos y alctonos) se encuentra su grado de
productividad biolgica que puede ser pequea,
grande o intermedia (oligotrficos, eutrficos y
mesotrficos).
En estos sistemas, las bacterias eliminan el
oxgeno disuelto a travs de la descomposicin
aerobia de las algas y hierbas, para ser
posteriormente agotado, por la oxidacin de
compuestos reducidos como el sulfuro de
hidrgeno y el hierro ferroso, por accin de los
microorganismos anaerobios en el fondo. Todo
ello contribuye a la disminucin del plancton y,
por tanto, de la vida.
En los lagos y pantanos grandes, existe
una estratificacin de la temperatura as como
zonas bien definidas:
Zona litoral.
Zona limntica o ftica.
Zona bntica.
Zona profunda.
Cualitativa y cuantitativamente las
poblaciones microbianas difieren mucho en
funcin de las zonas.
2. Lagunas.
Son esencialmente lagos poco profundos o
envejecidos que se caracterizan por un crecimiento
extensivo de plantas vasculares (aneas) y que
tienen gran cantidad, no slo de nutrientes, sino
tambin de microorganismos. En muchos aspectos
se dira que es una zona litoral enriquecida con una
extensa zona bntica.
3. Cinagas.
Suelen ser el resultado de procesos de
sucesin ecolgica de los lagos. Son medios
escasos de nutrientes, de elevada acidez y bajo
potencial de oxidacin-reduccin, por lo que
florecen en general lo microorganismos anaerobios
y cido-tolerantes.
4. Torrentes y ros.
Son corrientes de agua alimentadas `por
aguas superficiales o de filtracin, por lo que el
aporte de nutrientes deriva principalmente de la
zona terrestre. Las poblaciones microbianas se
encuentran en funcin de la situacin de la zona de
muestreo. No es lo mismo en su desembocadura y
coincidiendo con una gran ciudad, que a su paso
inicial por un prado.
5. Manantiales.
Son fuentes de agua que surgen del interior
de la tierra. Las bacterias presentes en cada
14. Control del Agua.

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manantial se mantienen constantes para cada
manantial y son muy diferentes entre distintos
manantiales, en funcin de la composicin del
agua y de la temperatura de la misma.

MEDIOS MARINOS.

Ms del 70 % de la superficie de la Tierra
est cubierta por el mar, medio acuoso cuya
diferencia esencial respecto de los medios de agua
dulce, es la elevada concentracin de sales en
disolucin, lo que se conoce como salinidad.
En general, los microorganismos deben
soportar esa elevada concentracin salina.
Se puede dividir en diferentes zonas:
1. Zona de estuarios.
Es la zona donde las aguas dulces se
encuentran con la marea. Incluye poblaciones de
microorganismos de agua salada y de agua dulce
(pero capaces de tolerar fluctuaciones extremas de
salinidad).
2. Zona de costa y marea.
La zona costera incluye aguas de bahas,
ensenadas as como la del mar a lo largo de toda la
costa. La zona de marea, es el rea comprendida
entre la pleamar y la bajamar. Su productividad
biolgica es ligeramente superior a las zonas de
tierra de cultivo de secano.
3. Zona pelgica.
Son las zonas de mar abierto,
distinguindose diferentes zonas, euftica, bntica
y abisal en funcin de la profundidad, que a su vez
define la cantidad de nutrientes y la temperatura
del medio.
Las bacterias desempean un papel
esencial en la ecologa del ocano, y sin su
actividad la pirmide de la cadena alimentaria
dejara de existir debido a que estn ntimamente
ligadas al ciclo de los elementos.
El evitar la polucin de los mares es tarea
primordial pues en l se produce la mayor parte del
oxgeno que se necesita para la vida, adems de
casi todos los alimentos necesarios para todos los
organismos vivos.

AGUA POTABLE.

Se denomina agua potable (del latn potus,
bebida, potabilis, bebible, potare = beber) al agua
"bebible" en el sentido que puede ser consumida
por personas y animales sin riesgo de contraer
enfermedades. El trmino se aplica al agua que ha
sido tratada para su consumo humano segn unos
estndares de calidad determinados por las
autoridades locales e internacionales.
En la Unin Europea la normativa
98/83/EU establece valores mximos y mnimos
para el contenido en minerales, diferentes iones
como cloruros, nitratos, nitritos, amonio, calcio,
magnesio, fosfato, arsnico, etc., adems de los
grmenes patgenos. El pH del agua potable debe
estar entre 6,5 y 8,5. Los controles sobre el agua
potable suelen ser ms severos que los controles
aplicados sobre las aguas minerales embotelladas.
En zonas con intensivo uso agrcola es
cada vez ms difcil encontrar pozos cuya agua se
ajusta a las exigencias de las normativas.
Especialmente los valores de nitratos y nitritos,
adems de las concentraciones de los compuestos
fitosanitarios, superan a menudo el umbral de lo
permitido. La razn suele ser el uso masivo de
abonos minerales o la filtracin de purines. El
nitrgeno aplicado de esta manera que no es
asimilado por las plantas es transformado por los
microorganismos del suelo en nitrato y luego
arrastrado por la agua de lluvia al nivel fretico.
Tambin ponen en peligro el suministro de agua
potable otros contaminantes medioambientales
como el derrame de derivados del petrleo,
lixiviados de minas, etc. Las causas de la no
potabilidad del agua son:
Bacterias, virus.
Minerales (en formas de partculas o
disueltos), productos txicos.
Depsitos o partculas en suspensin.

DESINFECCIN DEL AGUA POTABLE.

La desinfeccin del agua para uso humano
tiene por finalidad la eliminacin de los
microorganismos patgenos contenidos en el agua
que no han sido eliminados en las fases iniciales
del tratamiento del agua.
La desinfeccin del agua es necesaria
como uno de los ltimos pasos en la planta de
tratamiento de agua potable, para prevenir que esta
sea daina para nuestra salud. Muchas veces,
tratndose de agua de manantiales naturales o de
pozo, la desinfeccin es el nico tratamiento que se
le da al agua para obtener agua potable.
La desinfeccin puede hacerse por medios
qumicos o fsicos.
1. Medios qumicos
Los compuestos qumicos ms utilizados
para la desinfeccin del agua son:
Cloro: es uno de los elementos ms comunes
para la desinfeccin del agua. El cloro se
puede aplicar para la desactivacin de la
actividad de la gran mayora de los
microorganismos, y es relativamente barato.
Dixido de cloro
Hipoclorito de sodio
Ozono

Pgina 123

Halgenos: Bromo, Yodo
Cloruro de bromo
Metales: cobre , plata
Permanganato
Jabones y detergentes
Sales de amonio
Perxido de hidrgeno
2. Medios fsicos
Los procesos fsicos ms utilizados para la
desinfeccin del agua son:
Luz ultravioleta
Radiacin electrnica
Rayos gamma
Sonido
Calor
Los desinfectantes no solo deben matar a
los microorganismos sino que deben adems tener
un efecto residual, que significa que se mantienen
como agentes activos en el agua despus de la
desinfeccin para prevenir el crecimiento de los
microorganismos en las tuberas provocando la
recontaminacin del agua.

FACTORES QUE AFECTAN A LA
CANTIDAD Y A LAS CLASES DE
MICROORGANISMOS PRESENTES EN
LAS AGUAS NATURALES.

El nmero y el tipo de los
microorganismos presentes en las aguas naturales
depende ampliamente del abastecimiento nutritivo
disponible en el medio, de la presencia de otros
organismos y de factores fsicos:

1. Nutrientes disponibles.
Aunque la mayor parte de las sustancias
minerales necesarias para la vida se encuentran en
la mayor parte de las aguas naturales, estas tienden
a acumularse en la superficie y sobre los materiales
porosos, donde se crean microambientes adecuados
para la vida, y donde la proliferacin es mayor.
2. Presencia de sustancias txicas.
Algunas aguas contienen sustancias
desfavorables para determinados microorganismos
impidiendo su proliferacin. Pero esos mismos
contaminantes, pueden ser utilizados por otros
microorganismos para su crecimiento. As el
sulfuro de hidrgeno es un veneno para la mayora
de los microorganismos, pero algunos,
fotosintticos pueden utilizarlo como dador de
electrones o de hidrgeno para la reduccin del
dixido de carbono.
No obstante, la presencia de sustancias
antrpicas son desfavorables tanto para la vida de
los microorganismos como de los
macroorganismos.
3. Predacin y antagonismo.
Tanto la flora como la fauna microscpica
de las aguas depende de la presencia de otros seres
vivos. La mayora del plancton se alimenta de
bacterias y algas establecindose un delicado
equilibrio. Los microorganismos a su vez se
pueden defender o hacerse su nicho ecolgico
mediante la produccin de sustancias antibiticas
para otros microorganismos.
4. Factores fsicos.
Los factores fsicos tienen importancia
decisiva. La clase y nmero de microorganismos
vienen inevitablemente determinado por:
La temperatura.
El valor del pH.
La presin osmtica (salinidad).
La presin hidrosttica (profundidad).
La aireacin.
La penetracin de la luz solar.

MICROORGANISMOS ACUTICOS.

MEDIOS DE AGUA DULCE.

1. Aguas no contaminadas.
En las aguas libres de contaminacin de
aguas residuales, la concentracin de elementos
nutritivos es inferior a la de aguas contaminadas
por lo que las bacterias que flotan lejos del fondo
son limitadas (unas decenas por mL), entre ellas
ciertas saprfitas del suelo como los gneros
Micrococcus, Flavobacterium, Chromobacterium,
Bacillus, Proteus, Pseudomonas, y otras.
Los medios acuticos, al igual que el suelo,
contiene gran cantidad de bacterias psicrfilas de
los gneros Aeromonas, Alcaligenes.
Corynebacterium, Vibrio, Streptococcus,
Clostridium y otros.
Los microorganismos pueden ser bacilos,
cocos, vibriones, esporas, etc. que pueden ser
gram-positivos o gram-negativos y estrictamente
aerobios, anaerobios o facultativos.
Algunos microorganismos son capaces de
proliferar a temperaturas incluso por debajo de 0
C.
Si existe mucha materia orgnica en el
fondo pueden crecer las especies anaerobias en
grado elevado (100.000 / mL o ms).
2. Aguas contaminadas.
En las aguas contaminadas por aguas
residuales, podemos encontrar adems de las
especies del suelo en gran cantidad, otras especies
como E. coli, familias como Enterobacteriaceae, y
grupos no taxonmicos como estreptococos
fecales, etc.
En el cieno del fondo, el bajo potencial

Pgina 124

redox permite la existencia de gneros anaerobios
como Clostridium, Desulfovibrio y algunas
especies facultativas alcanzndose elevadas
densidades (millones / mL).

MEDIOS MARINOS.

Las bacterias de los medios marinos se
pueden dividir en dos tipos generales:
a) Los indgenas del mar que no pueden crecer en
medio carentes de agua marina.
b) Los microorganismos transitorios, cuyo hbitat
natural es terrestre, no necesitan el agua de mar
pero la toleran hasta un cierto grado.
Las bacterias marinas parecen necesitar ion
sodio y otros iones de forma especfica, y aunque
son prcticamente iguales a las especies de las
familias terrestres son osmticamente ms frgiles.
Podemos diferenciar 2 grandes zonas:
1. Zona de estuarios.
Son las zonas ms contaminadas (ricas en
nutrientes orgnicos) y donde proliferan de forma
predominante organismos tales como Beggiatoa,
Thiovolum, Thiobacillus, y otras bacterias
transitorias hetertrofas como Bacillus,
Corynebacterium, Actinomyces, Sarcina, etc.
En los sedimentos de los estuarios de bajo
potencial redox y alto contenido en azufre pueden
existir altas concentraciones de bacterias verdes
azufradas fotosintticas,
2. Zona ocenica.
Casi todas las bacterias marinas se
adhieren a las superficies de las partculas en
suspensin o en los sedimentos.
Contrariamente a las bacterias de agua
dulce, la distribucin vertical aumenta a unos 20 m
de profundidad. Los grupos ms importantes son
Vibrio y Mycoplama y las podemos dividir en:
Halfilos marinos: Sensibles a
pequeos cambios de salinidad como
Vibrio y Spirillum.
Bacterias barfilas: Resistentes a
elevadas presiones hidrostticas,
algunas de las cuales en laboratorio
slo crecen a 3 C y sometidas a
presiones de 1.000 kg / cm
2
.
Bacterias fotgenas: Presentan
luminiscencia, que la confieren a
peces abisales. Ejemplo prototpico es
Photobacterium phosphoreum.
Se han hecho observaciones interesantes
concernientes al posible papel desempeada por
los microorganismos marinos en la formacin del
petrleo. Las bacterias marinas son
enzimticamente activas transformando en los
fondos marinos toda clase de materia orgnica y
dejando residuos parecidos al petrleo.

TOMA DE MUESTRAS ACUOSAS.

La primera dificultad encontrada en la
investigacin microbiolgica de las aguas naturales
es la toma de muestras representativas. Esta
dificultad es tanto mayor todo lo mayor que es la
profundidad y la existencia de cienos. Se utilizan
recogedores de aguas especiales, dragas y
succionadores.
Como en cualquier muestreo, el mtodo de
toma de muestra debe cumplir los requisitos de:
Esterilidad o asepsia.
Representatividad.
Cantidad suficiente.
Etiquetada.
Mantenida en refrigeracin.
Analizada lo antes posible.
En cualquier caso, siempre debe seguirse
el mtodo oficial sealado para cada anlisis en
funcin de su posterior uso.

ANLISIS BACTERIOLGICO DEL
AGUA.

No existe un slo anlisis bacteriolgico
del agua. Existen diversos tipos, en funcin no slo
del tipo de muestra, sino tambin del posterior uso
de ese agua.
No es lo mismo el anlisis de un agua
embotellada para consumo humano, que el anlisis
del efluente de una granja avcola, como tampoco
lo sern, incluso investigando algunas veces el
mismo tipo de microorganismo, los valores de
aceptabilidad de dicho agua.
En los diferentes anlisis se suele
investigar de forma frecuente:
Grmenes totales.
Coliformes totales.
Coliformes fecales.
Estreptococos fecales.
Salmonella.
Menos frecuentes es el anlisis de:
Shigella.
Clostridios sulfitoreductores.
Staphyllococcus aureus.
Pseudomonas aeruginosa.
Enterovirus.
Bacterifagos fecales.
En cuanto a los mtodos de recuento,
siempre se recurre a la tcnica NMP aunque cada
vez se impone ms, por su facilidad, la tcnica de
filtracin por membrana.


Pgina 125


LEGISLACIN.

La legislacin espaola en el tema de
anlisis microbiolgicos del agua, as como los
parmetros de aceptabilidad de dichas aguas, se
recogen en funcin del tipo de muestra y de sus
usos, en diferentes rdenes y Reales Decretos, que
intentan recoger las diferentes Directivas de la
actual Unin Europea (antes de la Comunidad
Econmica Europea).
Ejemplos de ellas son:
1. R.D. 1138/1990, de 14 de septiembre, del
Ministerio de las Relaciones con las Cortes y
de la Secretara del Gobierno, y por el que se
aprueba la Reglamentacin Tcnico-Sanitaria
para el abastecimiento y control de la calidad
de las aguas potables de consumo pblico.
(B.O.E. de 24-11-90 que rene las directivas
80/778/CEE, 81/858/CEE, 80/778 CEE y
91/692/CEE).
2. R.D. 1164/1991, de 22 de julio, del Ministerio
de Relaciones con las Cortes y de la Secretara
del Gobierno, por el que se aprueba la
reglamentacin Tcnico-Sanitaria para la
elaboracin y circulacin y comercio de aguas
de bebida envasadas. (B.O.E. de 26-07-91 que
rene las directivas 80/777/CEE, 80/1276/CEE
y 85/ 7/CEE).
3. Orden de 8 de febrero de 1988 del Ministerio
de obras Pblicas y Urbanismo relativa a los
mtodos de medicin y a la frecuencia de
muestreo y anlisis de aguas superficiales que
se destinen a la produccin de aguas potables.
(B.O.E. 02-04-88).
4. Orden de 11 de Mayo de 1988 del Ministerio
de Obras Pblicas y Urbanismo sobre
caractersticas bsicas de calidad que deben ser
mantenidas en las corrientes de agua cuando
sean destinadas a la produccin de agua
potable. (B.O.E. 25-05-88).
5. R.D. 734/1988 de 1 de julio del Ministerio de
Relaciones con las Cortes y de la Secretara del
Gobierno por el que se establecen normas de
calidad de las aguas de bao. (B.O.E. 15-07-
88).
6. Directiva del Consejo (79/923/CEE) de 30 de
octubre de 1979 relativa a la calidad exigida a
las aguas para la cra de moluscos. (DOCE
10-11-1979).
7. Real Decreto 1074/2002. de 18 de octubre, por
el que se regula el proceso de elaboracin,
circulacin y comercio de aguas de bebida
envasadas (B.O.E. N 259 de 29-10-2002).
8. Real Decreto 140/2003, de 7 de febrero, por el
que se establecen los criterios sanitarios de la
calidad del agua de consumo humano (B.O.E.
N 45 de 21-02-2003).

Nota: Estos dos ltimo derogan aspectos
contemplados en los anteriores y son de
aplicacin actual.

Ejemplo:
PISCINAS. Condiciones higinico-
sanitarias de las de uso colectivo.
Decreto 80/1998, de 14 mayo BO.
Comunidad de Madrid 27 mayo 1998, nm. 124
[pg. 4]

PARMETRO CRITERIO UNIDADES
Recuento total de Aerobios a 37 C Hasta 200 UFC / mL
Coliformes totales 10 UFC / 100 mL
Coliformes fecales Ausencia / 100 mL
S. aureus Ausencia / 100 mL
Ps. Aeruginosa Ausencia / 100 mL
E. coli Ausencia / 100 mL
Salmonella ssp. Ausencia / 100 mL
Enterococos Ausencia / 100 Ml
Parsitos y protozoos Ausencia -
Algas, larvas u organismos vivos Ausencia -
Anlisis Microbiolgicos Unidad Temtica 15. Control de Alimentos

Pgina 127


CONTROL DE LOS ALIMENTOS.

Los alimentos no son productos estriles.
Algunos de ellos, como los tratados por calor,
mantienen la poblacin microbiana en niveles
bajos, mientras que en los alimentos fermentados
(yogur, embutidos, etc.) alcanza cifras importantes.
En cualquier caso esta poblacin vara
dependiendo del tipo de contaminacin en:
El origen.
El procesado.
El transporte.
El almacenamiento.
Como consecuencia, el alimento puede ser
vehculo de microorganismos patgenos o de sus
toxinas, con el consiguiente riesgo para la salud del
consumidor.
Los microorganismos que ocasionan
problemas en los alimentos no son exclusivamente
las bacterias, sino que tambin intervienen los
parsitos, los mohos y los virus, aunque las
bacterias son las ms importantes, no slo como
posible causa de toxiinfecciones, sino tambin
como productoras de alteraciones durante la
conservacin de los alimentos, pudiendo alterar sus
caractersticas organolpticas y hacerlos no apto
para el consumo.
El anlisis microbiolgico de los alimentos
es, por tanto, una necesidad para la salud del
consumidor (si bien debe tenerse la mxima
precaucin en la interpretacin de los resultados y
en las conclusiones que de estos se deriven), y,
adems, puede ser una valiosa ayuda en el
establecimiento de las normas higinicas durante la
produccin, as como en la determinacin de la
eficacia de los procesos de conservacin.

LOS ALIMENTOS COMO MEDIOS DE
CULTIVO.

Casi todos los alimentos, poseen todas las
caractersticas nutritivas necesarias para la
proliferacin de algn tipo de bacteria, por lo que
todos deben ser sometidos a investigacin, y en
funcin de su tratamiento, o no, de conservacin,
este debe ser ms o menos exhaustivo.
Los alimentos ms usuales son los ms
importantes desde el punto de vista microbiolgico
y, por tanto, los ms investigados:

Carnes y productos crnicos.
Pescados y mariscos.
Huevos y ovoproductos.
Leches y sus derivados.
Frutas y sus jugos y pulpas.
Verduras y sus derivados.
Azcares y jarabes azucarados.
Bebidas alcohlicas.
Pan y artculos de obrador.
Alimentos congelados.
Alimentos enlatados.

CONSERVACIN DE LOS ALIMENTOS.

El objetivo de la conservacin de los
alimentos es evitar que sean atacados por
microorganismos que originan la descomposicin,
y as poder almacenarlo, por ms tiempo.
Segn el tiempo de duracin, los alimentos
se clasifican en:
1. Alimentos Perecederos: Son aquellos que
se descomponen fcilmente, como la
leche, las carnes, los huevos y las verduras.
2. Alimentos semi-perecederos: Son
aquellos que permanecen exentos de
deterioro por mucho tiempo. Ejemplo de
ellos son las papas, las nueces y los
alimentos enlatados.
3. Alimentos no perecederos: No se daan
fcilmente. Ejemplo de ellos son las
harinas, las pastas y el azcar.
Los diferentes procedimientos para la
conservacin de los alimentos los podemos resumir
en:
Procedimientos basados en la disminucin
del pH.
Escabechado.
Encurtido.
Procedimientos basados en la reduccin
del agua.
Concentracin.
Marinado.
Desecacin/Curacin.
Deshidratacin.
Liofilizacin.
Ahumado.
Salazonado.
Procedimientos basados en la variacin del
potencial de xido-reduccin.
Vaco.
15. Control de los Alimentos.

Pgina 128

Atmsfera controlada.
Procedimientos basados en la utilizacin
de sustancias inhibidoras.
Microbicidas.
Microbiostticos.
Procedimientos basados en la utilizacin
de calor.
Pasteurizacin.
Escaldado.
Coccin/Bao mara.
Esterilizacin.
U.H.T.
Procedimientos basados en el uso del fro.
Refrigeracin.
Congelacin.
Ultracongelacin.
Procedimientos basados en la aplicacin
de varios principios.
Fermentacin.
Altas presiones.
Campos elctricos.
Campos magnticos.
Pulsos luminosos.
Irradiacin.

MICROORGANISMOS IMPLICADOS.

Los microorganismos implicados en la
contaminacin bacteriana de los alimentos, as
como los efectos que pueden ocasionar a los
mismos van a ser funcin del tipo de alimento
estudiado, de las condiciones de su procesado y de
los mtodos de conservacin de los mismos, por lo
que no se pueden hacer generalizaciones.
As como ejemplo, dentro de la carne y
productos crnicos, podramos considerar como
diferentes:
1. Carne fresca, refrigerada y congelada.
2. Salchichas frescas, hamburguesas y
productos crnicos similares.
3. Carnes y productos crnicos
conservados por salmuera, adobado y
curado.
4. Pasteles de carne, empanadas de
carne, etc.
5. Carnes cocidas en lonchas, etc.
6. Productos de volatera frescos,
refrigerados y congelados.
Considerando la carne fresca, podemos
afirmar que el tejido muscular de animales sanos,
por lo general, no contiene bacterias pero las
superficies externas y los cortes o secciones se
contaminan fcilmente despus del sacrificio y
durante y despus del despiece. Las bacterias se
pueden multiplicar rpidamente en las superficies
seccionadas, aunque el nmero de bacterias en el
interior de la carne permanece, generalmente,
mucho ms bajo. Las bacterias que pueden hallarse
presentes incluyen:
Micrococcus.
Accinetobacter.
Moraxella.
Pseudomonas.
Microbacterium.
Staphylococcus.
Lactobacillus.
Streptococcus.
Salmonella.
El muclago en la superficie de la carne se
origina generalmente por Pseudomonas y
Acinetobacter, pero pueden ser tambin
responsables Streptococcus, Lactobacillus,
Leuconostoc y Micrococcus.
La causa de la putrefaccin se asocia a
Pseudomonas y Clostridium.
Tambin puede sufrir deterioro por hongos
en la superficie, dando alteraciones fcilmente
visibles:
Vello blanquecino ( Mucor y Rizopus).
Manchas blancas (Sporotrichum).
Manchas negras (Cladosporium).
Manchas verdes (Penicillium).
Por otra parte, las bacterias productoras de
cido lctico pueden determinar un descenso en el
pH de la carne debido a la produccin de cidos
orgnicos.

PREPARACIN DE MUESTRAS
ALIMENTARIAS.

1. Toma de muestras.
La toma de muestras debe efectuarse en
condiciones aspticas. Tanto si las muestras son
superficiales como si son de zonas profundas
deben tomarse con material estril y utilizando
para su transporte y mantenimiento frascos
tambin estriles.
Si transcurre un tiempo entre la toma de
muestra y el anlisis, la muestra se debe mantener
refrigerada a unos 4 C.
En el caso de la carne fresca, que hemos
tomado como ejemplo, las caractersticas
bacterianas de la carne se determinan tomando
muestras de tejidos superficiales y de zonas
profundas.
Aunque la condicin microbiolgica de la
superficie, puede determinarse rpidamente por
examen microscpico por impresin en un
portaobjetos y tincin de GRAM, es preferible la
toma de muestras por cortes finos empleando
escalpelos y pinzas.
Las zonas internas se obtienen mediante el

Pgina 129

uso de tomamuestras, cubiertos o sacabocados.
2. Homogeneizacin.
Se pesan 10 g del alimento en un recipiente
estril para aadir 90 mL de diluyente estril (agua
de peptona o de triptona, suero salino, etc.).
En el caso de la carne, la dilucin se lleva
a cabo en una bolsa mediante el Stomacher.
3. Diluciones decimales.
Teniendo en cuenta que el proceso de
homogeneizacin conduce a la disolucin madre o
10
-1
, se preparan 5 6 diluciones a partir de 1 mL
de la dilucin anterior y 9 mL de diluyente estril.

ANLISIS BACTERIOLGICO DE LOS
ALIMENTOS.

Aunque son diferentes los
microorganismos que pueden aparecer en los
alimentos en funcin del tipo, procesado y
conservacin del mismo, generalmente se analizan
los mismos microorganismos indicadores,
patgenos y toxignicos independientemente de la
muestra, si bien es cierto, que en alimentos
especiales, se suelen investigar algunos
microorganismos ms especficos.
Los ms comunes son:
Flora aerbica mesfila.
Grupo coliforme.
Enterobacterias totales.
Anaerobios sulfitorreductores.
E. Coli.
Salmonella.
St. aureus.
Menos frecuentes son:
P. Aeruginosa.
Shigella.
Listeria.
B. Cereus.
Mohos y levaduras.
Para ellos se utilizan las tcnicas ms
usuales de recuento en placa con medio slido (en
masa y en superficie) y series de tubos con medio
lquido (NMP).
En el caso de la carne fresca y a partir de
diluciones decimales hasta 10
-5
, se realizan:
1. Enumeracin general de grmenes
viables en P.C.A. incubadas a 5, 25 (
20) y 37 ( 35 C) por espacio de 7, 3
y 2 das respectivamente.
2. Recuento de coliformes bien en masa
en V.R.B.A. o bien (si se espera un
pequeo nmero) usando la tcnica del
NMP con B.G.B.L.
3. Investigacin de presencia de
Salmonella.
4. Enumeracin de bacterias anaerobias
viables utilizando series de
disoluciones con medio reforzado
para clostridios, o en placa con agar
sangre incubando en anaerobiosis
durante 2 das.
5. Investigacin de presencia de
Clostridium perfringens.

LEGISLACIN.

De lo anteriormente expuesto, parece que
debe colegirse que la legislacin ser tan variada
como los alimentos de uso comn.
Afortunadamente, existen colecciones
sobre legislacin alimentaria, dentro de las cuales
el ms importante es el ndice de la Legislacin
Alimentaria de la Comunidad Econmica Europea
(actual Unin Europea):

NDICES DE LA LEGISLACIN
ALIMENTARIA DE LA C.E.E.
Seccin N 1. Disposiciones de carcter
horizontal.
Aditivos.
Alimentos de produccin biolgica.
Alimentos tratados con radiaciones
ionizantes.
Alimentacin especial.
Alimentos congelados.
Normas higinico-sanitarias de productos
alimenticios.
Designaciones o certificaciones de
especifidad.
Etiquetado y publicidad.
Acondicionamiento y envasado.
Materiales y objetos destinados a estar en
contacto con los alimentos.
Control.
Metrologa.
Sistemas de informacin.
Proteccin y seguridad de los
consumidores y usuarios.
Seccin N 2. Bebidas alcohlicas.
Vinos generales.
Vinos espumosos y/o gasificados.
Vinos y bebidas aromatizadas.
Vinos de licor.
Vinos. Anlisis.
Bebidas espirituosas.
Seccin N 3. Carnes, Aves, Caza y Derivados.
Carnes. Generales.
Ovino y caprino.
Porcino.
Bovino.
Aves.

Pgina 130

Conejos y caza de cra.
Caza silvestre.
Carnes. Residuos.
Carnes. Control.
Seccin N 4.
Huevos y ovoproductos.
Aceites y grasas.
Zumos de frutas y similares.
Confituras, jaleas, mermeladas y crema de
castaas.
Edulcorantes naturales.
Miel.
Cacao y chocolate.
Caf y achicoria.
Aguas de consumo.
Seccin N 5. Productos de la pesca y de la
acuicultura.
Generales.
Acuicultura.
Moluscos.
Crustceos.
Conservas.
Relaciones multilaterales.
Gestin de los recursos de la pesca.
Contaminacin marina.
Seccin N 6. Leche y productos lcteos.
Generales.
Leche.
Productos lcteos.
Seccin N 7. Productos vegetales.
Frutas, verduras y hortalizas.
Productos transformados a base de frutas,
verduras y hortalizas.
Cereales.

Existen otras normas que para nuestro caso
de la carne fresca, segn la I.C.M.S.F., recomienda
que el recuento general de microorganismos
viables a 35 C debe ser inferior a 10
7
por gramo, y
que Salmonella no debera hallarse presente en
ms de una, entre cinco muestras, de 25 g.
Esta norma de 1974 est ampliamente
superada, y como ejemplo podemos analizar, la
DIRECTIVA DEL CONSEJO (88/657/CEE) de 14
de diciembre de 1988 por la que se establecen los
requisitos relativos a la produccin y los
intercambios de carnes picadas, de carnes en trozo
de menos de 100 g y de preparados de carne
(DOCE de 31 de diciembre de 1988), que se
transcribe al. R.D. 1436/1992 de 27 de noviembre
(B.O.E. de 13 de enero de 1993, y se corrige su
entrada en vigor mediante el R.D. 2275/1993 de 22
de diciembre).

As, a titulo de ejemplo podemos ver los
requerimientos de las PREPARACIONES DE USO
INFANTIL LISTA PARA CONSUMO O QUE SOLO
REQUIERE CALENTAMIENTO.

Plan de muestreo Lmite por gramo
Categora Clase n c m M
Aerobios mesfilos (*) 6 3 5 1 2 10
3
2 10
4

Coliformes 6 3 5 1 < 3 20
E. coli 10 2 5 0 - -
B. cereus 10 2 5 0 - -
C. perfringens (**) 10 2 5 0 - -
St. aureus 10 2 5 0 - -
Salmonella en 25 g 10 2 5 0 -
(*) Excepto para frmulas fermentadas con cultivos bacterianos.
(**) Slo para productos con carne

TEORIA EM Alumnos Janer

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