PRCTICA No.

1
DETERMINACION Y CURVA DE
CRECIMIENTO DE MICROOGANISMOS (E. COLI
Y LEVADURA CANDIDA).

EQUIPO No 1.

GUZMN LPEZ AMAYRAN CONCEPCIN.
HERNNDEZ GUZMN MARIO.
JIMNEZ PINTO DIANA CAROLINA.
MENDOZA SANTIAGO DAYANA CAROLINA.

ING. BIOQUMICA. 5to. SEMESTRE.

CATEDRTICA: QBP. AURA FLORES PREZ.



TUXTLA GUTIRREZ, CHIAPAS. NOVIEMBRE DE 2009.


DETERMINACIN DE CRECIMIENTO DE
MICROORGANISMOS

OBJETIVO GENERAL:
CUANTIFICAR EL CRECIMIENTO DE LA BACTERIA ESCHERICHIA COLI Y DE LA LEVADURA
CANDIDA.
OBJETIVO ESPECIFICO:
CUANTIFICAR EL CRECIMIENTO DE LA BACTERIA E. COLI (UFC) EN CALDO NUTRITIVO
MEDIANTE LECTURAS DE TURBIDIMETRIA (NEFELOMETRICO KLETT) CADA 2 HORAS
DURANTE 24 HORAS.

CUANTIFICAR EL CRECIMIENTO DE LA LEVADURA CANDIDA (COLONIAS) INOCULADO
EN CALDO NUTRITIVO MEDIANTE LECTURAS DE TURBIDIMETRIA (NEFELOMETRICO
KLETTS) CADA 12 HORAS DURANTE 96 HORAS.


CUANTIFICAR EL CRECIMIENTO DE LA BACTERIA E. COLI EMPLEANDO LA TECNICA DE
VACIADO EN CAJAS PETRI CON AGAR NUTRITIVO (72 HORAS DESPUES DE SU
INOCULACION) MEDIANTE EL RECUENTO DE UFC. .-

CUANTIFICAR EL NUMERO DE CELULAS DE LA LEVADURA CANDIDA POR UN
RECUENTO DIRECTO (CON DILUCIONES) EMPLEANDO LA CAMARA DE NEUBAUER.

CUANTIFICAR EL CRECIMIENTO DE LA LEVADURA CANDIDA MEDIANTE DIFERENCIAS DE
MASA.









INTRODUCCION

Cuando un microorganismo es colocado en un medio nutricionalmente completo aumenta de
tamao y con el tiempo se reproduce para formar nuevos individuos dando como resultado
una poblacin de clulas vegetativas no diferenciadas.
La Escherichia coli es una bacteria gram (-) que se encuentra generalmente en los intestinos
animales y en aguas negras. es anaerbico facultativo; mvil por flagelos pertricos (que
rodean su cuerpo); no forma esporas; se puede inocular en Agar y caldo nutritivo(por poseer
todo tipo de nutrientes son excelentes para su uso),Agar E.M.B, Agar McConkey, etc.; es capaz
de fermentar la glucosa y la lactosa ;y su prueba de IMVIC es ++--.
Es una bacteria utilizada frecuentemente en experimentos de gentica y biotecnologa
molecular porque es ampliamente conocida su organizacin, estructura y funcin. Adems, se
han modificado E. coli para ser usada en laboratorio sin riesgos patognicos. Generalmente las
bacterias se reproducen por fisin binaria.
Las levaduras en general son clulas esfricas a elpticas cuyo dimetro vara de 3-15m. Si
bien unas pocas levaduras se reproducen por fisin binaria la mayora se reproduce por
brotacin o blastoconidios. Despus de la proliferacin en un medio con agar durante 1-3 das
las levaduras producen colonias plidas y opacas y en general alcanzan un dimetro de 0.5 a 3
mm.
Las especies del gnero Cndida producen levaduras elipsoides o esfricas con brotes que
miden alrededor de 3 a 6 m. De manera habitual se forman mltiples brotes y pseudohifas en
medios deficientes de sustratos fcilmente metabolizables.
Los medios para el recuento de levaduras son:
Medio sabouraud
Oxiteclicina, glucosa, agar (O.G.A)
MEDIO DE PATATA, GLUCOSA AGAR (P.D.A)
Extracto de levadura, glucosa y agar
Medio de jugo de uva (para enologa) o medio mosto de cerveza ( para cervecera)

Estos medios se hacen selectivos frente a numerosas bacterias por la acidificacin a pH
4-3.5.

Existen varios mtodos para medir el crecimiento microbiano:

Mtodos indirectos: son aquellos que utilizan parmetros distintos del n de clulas, pero que
pueden relacionarse de forma directa con ste (masa celular, actividad metablica, etc.).Ello es
posible porque durante el crecimiento de un cultivo hay un aumento ordenado de todos los
constituyentes celulares y as la velocidad de crecimiento de la poblacin puede estimarse por
la velocidad del incremento de cualquiera de estos parmetros. Entre los mtodos indirectos
se encuentran:

Determinacin del peso seco (bacterias y levaduras). Se trata de medir la masa celular
presente en un cultivo y estimar el n de clulas proporcional a sta. Este mtodo,
aunque lleva tiempo, es til como referencia en el trabajo de aislamiento y purificacin
de otros mtodos.
Determinacin del nitrgeno celular. Medir el contenido proteico del cultivo.

Determinacin del DNA

Determinacin de una actividad metablica segn el tipo de microorganismo:
consumo de oxgeno (en aerobios), liberacin de CO2 u otro producto de
fermentacin, aumento de la concentracin de alguna enzima constitutiva,
incorporacin en la clula de algn material radiactivo, etc.

Medida de la turbidez del cultivo (bacterias y levaduras). Se basa en la capacidad de las
clulas y partculas en general de absorber y/o dispersar la luz que incide sobre ellas.
Un cultivo celular aparece turbio porque las clulas dispersan la luz que atraviesa la
suspensin. La turbidez es proporcional al nmero de clulas y puede medirse
utilizando un espectrofotmetro.
El espectrofotmetro es un aparato que hace pasar la luz a travs de una suspensin
celular y detecta la luz no dispersada, es el mtodo mas difundido para la estimacin
de la biomasa total en suspensin.
Las tcnicas turbidimtricas son totalmente tiles para determinar tanto la masa de
clulas durante el desarrollo, como para evaluar los efectos antimicrobianos en
bacterias.
Una aplicacin directa de turbidimetra es la realizacin de una curva patrn en la que
se relaciona la medida de la absorbancia con el nmero de clulas viables del cultivo.
Simultneamente a las medidas de absorbancia se realizan recuentos en placa
(bacterias).
Frecuentemente las muestras naturales tienen un numero muy elevado de microorganismos
(bacterias), por lo que se requiere diluirlas de forma seriadas que posteriormente se siembra
en placas con el medio de cultivo adecuados. Esta tcnica de recuento por diluciones seriadas
nos permite conocer el nmero de microorganismos viables en una determinada muestra.
La inoculacin de la placa con la muestra que contiene los microorganismos pueden realizarse:
a) directamente sobre el medio ya solidificado en la placa (mtodo de extensin sobre placa);
b) mezclndolo previamente con el medio fundido y temperado, para verterlo despus sobre
la caja petri vaca (mtodo en vertido en placa o siembra en profundidad). Es el mtodo ms
habitual para la determinacin de clulas viables se basa en contar el nmero de colonias UFC.
La viabilidad en microbiologa se define como la capacidad del microorganismo para dividirse y
dar lugar a una descendencia. El mtodo ms habitual para la determinacin de clulas viables
se basa en contar el nmero de colonias UFC.


Mtodos directos: son aquellos en los que se cuenta el n total de clulas en un volumen
conocido y as se estima el n total en la poblacin. Entre ellos:

Recuento directo del n de clulas al microscopio (levaduras). Se utilizan portas
especialmente diseados para el recuento celular y son denominados cmaras de
recuento en donde un volumen conocido de muestra es depositado en un
portaobjetos especial para cuenta (hemacitmetros, cmaras de Petroff-Hauser,
Neubauer o de Helber) estas consisten de portaobjetos excavados y cuadriculados que
facilitan el recuento por unidad de superficie y de volumen. Este mtodo tiene el
inconveniente de que no diferencia entre clulas viables y no viables. Es poco preciso.

Contadores electrnicos. Las clulas son suspendidas en un fluido conductor que pasa
Lentamente a travs de una abertura fina por la que pasa una corriente elctrica
permiten medir la distribucin de tamaos y el nmero de clulas en las suspensiones
bacterianas pero son muy costosos.
Cuando en un medio adecuado se inocula con bacterias o levaduras y se toman muestras
pequeas a intervalos regulares, la representacin grafica de los datos dar una curva de
crecimiento caracterstico.
La curva de crecimiento bacteriano se puede dividir en cuatro fases: fase de latencia, fase del
crecimiento exponencial, fase estacionaria y fase de declinacin.
Fase de latencia: durante esta fase hay un aumento de los componentes
macromoleculares, de la actividad metablica y de la susceptibilidad a los agentes
qumicos y fsicos.

Fase de crecimiento exponencial: en esta fase las clulas se encuentran es un estado
equilibrado .Durante este periodo la masa ye l volumen de las clulas aumentan por el
mismo factor y de tal manera que la composicin promedio de las clulas y las
concentraciones relativas de los metabolitos se mantienen constantes.

Fase estacionaria: en esta fase hay productos de desecho, agotamiento de nutrientes,
la variacin del pH y otros factores que ejercen un efecto nocivo sobre el cultivo, lo
que produce una disminucin de la velocidad de crecimiento.

Fase de muerte celular. Las clulas mueren a una velocidad mayor a la que se
originan debido al agotamiento total de la nutriente y/o excesiva acumulacin
de sustancias txicas. A veces la muerte va acompaada de lisis celular y esto
disminuye la absorbancia del cultivo.




MARCO TEORICO

El crecimiento microbiano se define como un incremento en el n de clulas, es decir, se
refiere al crecimiento de poblaciones. Este viene dado como consecuencia del crecimiento de
cada clula individual y su divisin celular. El crecimiento de un microorganismo depende de
varios factores como:

1. El microorganismo en s. As por ejemplo, en condiciones ptimas E. Coli tiene un ciclo de
vida de 15-20 minutos por que en una poblacin joven el nmero de bacterias muertas es
mnimo.

2. La composicin del medio de cultivo. Las clulas crecern ms lentamente en un medio
mnimo (MM) que en un medio rico (MR) con todos los nutrientes. Dependiendo de la fuente
de carbono y de la facilidad con que la asimilen crecern ms o menos rpidamente (por
ejemplo, crecen mejor con glucosa (Glc) como fuente de carbono que con galactosa (Gal).Por
ejemplo el crecimiento de las bacterias sobre un medio de cultivo liquido es claramente
exponencial.

3. Las condiciones de incubacin. La temperatura de incubacin, la concentracin de CO2 en
la atmsfera de cultivo, la agitacin, etc. son factores importantes. Por ejemplo para las
bacterias patgenas el ptimo de crecimiento se consigue a los 37C y para las levaduras y
otros hogos, a 25C.

4. La procedencia y caractersticas del inculo. La curva de crecimiento variar dependiendo
de que se parta de un cultivo estacionario o de uno en crecimiento exponencial, que se pase
un cultivo crecido en MM+Glc a MM+Gal o de MR a MM+Glc.
En general, los hongos se desarrollan mejor a la temperatura de la habitacin (20 a 25C) o a
37C, comnmente en un medio de pH 5.5 a 6.5. La mayora de los hongos son aerobios. Para
el aislamiento se usa con ms frecuencia el medio de ensayo o de conservacin de Sabouraud
y el medio de Pensilvania.
En la mayor parte de los medios de especies del gnero Cndida no pueden identificarse sobre
la base del aspecto de sus colonias. En 24 48 horas producen colonias sobreelevadas, de
color crema y opacas, a aproximadamente 1 a 2 mm de dimetro. Despus de varios das en un
medio con agar es posible observar hifas que penetran en el agar.
El proceso de crecimiento del microorganismo (levadura) se desarrollara en condiciones
aspticas y a temperatura ambiente, la homogenizacin y aire reaccin del medio de cultivo se
realizara en forma manual cada doce horas por 7 das. El medio de caldo de maltosa
Sabouraud esta especificado para el desarrollo de levaduras, mohos y bacterias as como la
investigacin en las pruebas de esterilidad. En este medio de crecimiento de mohos se parece
a esferas de algodn ms o menos grande. Se modifican y adoptan la forma de capas
membranosas mientras que el crecimiento de levaduras o bacterias se manifiesta por turbidez
homognea que se reconoce por investigacin microscpica.
En contraste, las bacterias se reproducen por fisin binaria a un ritmo mximo promedio de
cada 20 min, pero este ritmo se mantiene solo por un corto periodo.

METODOLOGIA

CURVA DE CRECIMIENTO BACTERIANO (E. Coli)
1.- Preparacin del medio de cultivo; Caldo nutritivo (150 ml, 3 matraces
nefelomtricos con 50 ml) y agar nutritivo para la tcnica de vaciado en cajas (por
duplicado).








2.- Toma de muestra de una cepa pura cultivada en el cepario del laboratorio de
microbiologa del ITTG.





3.- Inoculacin

Matraz 1: Colocar 2 ml de la muestra (cepa pura) en un matraz nefelomtrico que
contiene 50 ml de caldo nutritivo, previamente esterilizado. Poner en agitacin el
matraz una vez inoculado a 110 revoluciones /minuto. Hacer lecturas en el
turbidmetro Klett cada 2 horas.

Matraz 2: Inocular 2 ml de muestra a un matraz con 50 ml de caldo nutritivo estril,
agitar y posteriormente hacer diluciones 1:9 para inocular en cajas petri, con la
tcnica de vaciado por duplicado. Cada dos horas tomar las lecturas de densidad
ptica (Klett), hacer las diluciones y la inoculacin en cajas para estudiar su
crecimiento.

Para comprobar el efecto antimicrobiano de un producto comercial y estudiando el
crecimiento de la bacteria. Utilizamos el jabn Escudo. Colocando en dos cajas
petri una pequea proporcin de solucin del jabn preparada con agua, sobre
determinadas reas y en estas inocular por la tcnica de estra masiva.

Matraz 3: Blanco, servir de referencia para verificar el crecimiento (turbidez) de la
bacteria comparndolo con ste.




LEVADURA

1.- Preparacin del medio de cultivo: Caldo YM para el cultivo de la levadura
Cndida. Preparar matraces con 50 ml de caldo YM. Esterilizar.

2.- Inoculacin:
Tomar 2 ml de muestra, inocular en un matraz nefelomtrico con caldo estril,
agitar y leer su contenido de clulas en la cmara de Neubauer. Posteriormente
filtrar el contenido del matraz con ayuda de una bomba de vaco, el papel filtro
debe estar a peso constante, para determinar su biomasa.
..Filtracin:





Para determinar su biomasa: diferencia de pesos.
P
1
= peso del papel filtro a peso constante.
P
2
= peso del papel con la muestra (levadura)
P
2
p
1
= peso neto total de levadura.


Repetir este paso cada 12 horas durante 4 das.


En un segundo matraz inocular 2 ml de muestra en 50 ml de caldo YM, someter a agitacin
(110 rpm) durante 12 horas, posteriormente leer su densidad ptica en el equipo Klett.










RESULTADOS

E. coli
Se realizaron 6 lecturas, cada 2 horas, en las cuales se midieron dos datos,
lectura en el Klett y las UFCs (conteo en placa).
La siguiente tabla muestra los datos obtenidos:
No. De lectura (Hora) Hora Lectura en el Klett UFCs / ml
0 09:00 - -
1 11:00 2.5 68 x 10
6

2 13:00 55 25 x 10
6

3 15:00 102 557 x 10
6

4 17:00 185 1155 x 10
6

5 19:00 209 1314 x 10
6

6 21:00 202 2200 x 10
6

Tabla 1: datos obtenidos de las lecturas cada dos horas de los matraces, en el Klett y
conteo en placa.

Graficando lo datos, para demostrar el crecimiento bacteriano se obtiene la siguiente
curva normal de crecimiento:

.Grafica 1: que muestra el crecimiento microbiano, por los datos de turbidimetra (Klett) y las
lecturas cada 2 horas.

Conteo en placa de UFC de e. coli y turbidimetra en el equipo Klett
0
50
100
150
200
250
0 2 4 6 8 10 12 14
U
n
i
d
a
d

K
l
e
t
t
tiempo (c/ dos horas)
Curva de crecimiento E. coli

Imagen 1: conteo en placa---------------------------------------------Imagen 2: equipo Klett (turbidez, lectura)

Crecimiento de e. coli en caja petri:

-------------Imagen 3: agar nutritivo inoculado con e. coli

Levadura (Cndida)
Se realizaron 6 lecturas, cada 12 horas durante 4 das, midiendo dos tres datos:
a) Turbidimetra (Klett)
b) Conteo de microorganismo (cmara de Neubauer)
c) Biomasa (diferencias de peso en papel filtro)
Los datos obtenidos se muestran a continuacin:
No. Fecha Lectura UFCs Klett Dilucin
1 Lunes 09/11 08:00 5777.5 260 1:10
2 Martes 10/11 10:30 56,500 405 1:100
3
(martes noche)
20:40 66,900 465 1:100
4 Mircoles 11/11 08:40 140,900 485 1:100
5
(Mircoles Noche)
20:40 208,500 >1000 1:100
6 Jueves 12/11 08:40 214,500 >1000 1:100
--------------------Tabla 2: Datos obtenidos en la lecturas del Klett y conteo en placa

Para obtener la grafica que muestre el crecimiento de la levadura, se graficaron dos
datos, la lectura en el Klett y el conteo en la cmara de Neubauer.


..Grafica 2: Conteo de microorganismos en Neubauer vs tiempos de lecturas.

Conteos en cmara de Neubauer:--------------------------------Conteo en placa:

Imagen 4: Conteo en cmara de Neubauer---------------Imagen 5: conteo en placa de levaduras



CALCULO DE LA BIOMASA DE LA LEVADURA (DIFERENCIA DE PESOS)
P
2
-P
1
= PESO NETO TOTAL DE LEVADURA.
P
1
= Peso del papel filtro a peso constante
P
2
=Peso del papel filtro con muestra.
Tabla 3: Muestra los pesos de los papeles filtro a peso constante y con muestra biolgica (levadura
filtrada, por vacio), obteniendo la diferencia de ambos se tiene la biomasa. Graficando dicho dato vs las
lecturas hechas.
0
50000
100000
150000
200000
250000
0 20 40 60 80
C
o
n
t
e
o

N
e
u
b
a
u
e
r
Tiempo (c/ 12 horas)
Crecimiento de la levadura
0
0.18
0.25
0.31
0.3
0.33
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0 10 20 30 40 50 60 70
G
R
A
M
O
S

D
E

L
E
V
A
D
U
R
A
TIEMPO (HORAS)
CURVA BIOMSICA

Graficando Horas de lectura vs Biomasa, se obtiene la siguiente grafica










----------Grafica 3: muestra los gramos de levadura vs los tiempos de lectura hechos.

------Dicha grafica muestra, que conforme las horas de agitacin pasaban, la levadura creci de
una manera impresionante, pesando incluso gramos de organismo. La levadura (hongos), en
general son los microorganismos que pueden pesarse. Se muestra un grafica normal de
crecimiento de microorganismo.





Peso constante. Papel filtro
Peso con muestra Horas de lectura
Biomasa (peso de levadura)
0 0 0 0
0.16 0.34 12 0.18
0.23 0.48 24 0.25
0.23 0.54 36 0.31
0.18 0.48 48 0.30
0.16 0.49 60 0.33
DISCUSION DE RESULTADOS

La cepa utilizada de E. Coli para la inoculacin fue una reserva que llevaba das, dando como
resultado un crecimiento no muy ptimo.
Otro factor importante que provoco un desajuste en los resultados en la segunda lectura de
UFC/ml fue provocado por la contaminacin de una caja inoculada, esto ocurri por una mala
esterilizacin del rea de trabajo. Otro factor prescindible en los resultados de la misma
lectura fue el calentamiento excesivo de la pipeta con la que se inoculo causando la muerte
de las bacterias y dando un resultado muy pequeo.
El resultado total del conteo de UFC/ml se realizo a las 48 despus de las inoculaciones
hechas y no a las 24 horas que era lo correcto.
Las ltimas dos lecturas En equipo Klett se obtuvo un resultado aproximado debido a que el
rango de lectura del equipo no fue suficiente para el conteo de las levaduras.
Los datos en el clculo de la biomasa, as como los datos de los pesos de los papeles filtro, no
fueron correctos.
















CONCLUSIN

Segn los resultados obtenidos en la tabla de E. coli, nos muestra una curva normal de
crecimiento, demostrando as que el crecimiento bacteriano fue casi ideal y continuo.
En el caso de la inoculacin utilizando un producto comercial antimicrobiano (jabn Escudo),
se estudio el efecto de dicho producto, cual funcin fue psima, ya que no hubo inhibicin de
ningn tipo, las colonias fueron notorias en el medio inoculado. Las UFC crecieron alrededor
del agente. Comprobando as la mala funcin de este.
El crecimiento bacteriano fue de mayor rapidez en comparacin del crecimiento de la
levadura, pero su biomasa fue mayor en esta ltima.



















Bibliografa


Bacteriologa principios y practicas, Bryan h. Arthur, Mxico D.F. 1983, editorial
continental S.a. de C.V., 8 ed.

Dicit ; Bacterias y levaduras ;jueves 16 de octubre de 2008

http://dicitblog.blogspot.com/search/label/Divulgaci%C3%B3n%20cient%C3%ADfica

Microbiologa, Zinsser; Argentina 1994, Editorial Medica panamericana, 20 ed.

Microbiologa alimentaria, Bourgeois, Zucca, Mescle; Editorial Acribia S.A.