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LABORATORIO DE MICROBIOLOGA
DOCENTE: Dra. Celia Bowen Fernndez

1. DATOS INFORMATIVOS
MATERIA O MDULO: LABORATORIO MICROBIOLOGA PRCTICAS
CARRERA: MEDICINA
NIVEL: CUARTO
N CRDITOS: 5
-CRDITOS TEORA: 4
-CRDITOS PRCTICA: 1
DATOS DEL PROFESOR:
Nombre: Celia Annabel Bowen Fernndez
Grado Acadmico o Ttulo Profesional: Dra. Bioqumica y Farmacia opcin Bioq. Clnica
Breve indicacin de la lnea de actividad acadmica: Docencia en diferentes en diferentes ramas de la
patologa clnica (Laboratorio clnico y Microbiologa), coordinadora de los laboratorios en el rea de
Destrezas Clnico Quirrgicas
Indicacin de horario de atencin a estudiantes: Martes, Mircoles y Viernes 12:00 a 13.00 horas
Correo Electrnico: bowencelia@yahoo.es
Telfono: 084678618

PROFESOR:
Grado acadmico o ttulo profesional: Dra. Bioqumica y Farmacia opcin: Bioq. Clnica/ Diplomado
Superior en Pedagogas Innovadoras

2. DESCRIPCIN DE LA MATERIA:
La unidad tiene como propsito facilitar el aprendizaje de los principales mtodos de diagnstico
microbiolgico, en lo que se refiere a las enfermedades infecciosas humanas: medios de cultivo,
tinciones, pruebas inmunolgicas y de microscopa y relacionarlos con los objetivos de la teora
de Microbiologa.
3. OBJETIVO GENERAL:
Introducir al estudiante de medicina en los mtodos de identificacin de microorganismos patgenos
responsables de las principales enfermedades infecciosas humanas.

4. OBJETIVOS ESPECFICOS:
4.1. ACTITUDINALES:
a. Cumplir las normativas de bioseguridad
b. Escoger las pruebas de laboratorio adecuadas de acuerdo al tipo de infeccin
c. Compartir conocimientos y experiencias durante el proceso de aprendizaje
4.2. COGNITIVOS:
a. Identificar los diferentes microorganismos como bacterias, parsitos, hongos y virus
causantes de enfermedades
b. Conocer los principales mtodos de anlisis inmunolgico
c. Revisar los principales mtodos, medios de cultivos y coloraciones empleados para la
identificacin de microorganismos infecciosos
4.3. PROCEDIMENTALES:
a. Ejecutar correctamente la toma y recogida de muestras para anlisis microbiolgicos
b. Reconocer a travs del microscopio, los principales microorganismos patgenos a travs de
tinciones y montajes bsicos
c. Realizar siembras en los medios de cultivos comunes
d. Observar las caractersticas de crecimiento y multiplicacin de los microorganismos

5. CONTENIDOS
PARALELO 1,2,3,4
1. Bioseguridad en el laboratorio de Microbiologa:
Primera semana
2. Coloraciones: Gram, Ziehl-Neelsen, Giemsa:
2
Segunda semana
3. Medios de cultivo, requerimientos nutricionales, clasificacin y tcnicas de
siembra; utilizacin de asas y campanas microbiolgicas:
Tercera Semana
4. Tcnica para realizacin del antibiograma: medios apropiados y
antimicrobianos:
Cuarta semana
5. Estudio microbiolgico del esputo: coloraciones, siembras e interpretacin.
Quinta semana
6. Identificacin de cocos gram positivos: estafilococos y estreptococos.
Streptococos del grupo A (Bacitracina, Optoquina, Catalasa, coagulasa):
Sexta semana
PRIMERA EVALUACIN: Sptima semana
7. Urocultivos: medios apropiados, manejo de la muestra, siembra, identificacin
e interpretacin:
Octava semana
8. Identificacin bioqumica y serolgica de bacilos gram negativos; grupo
bacterianos de importancia mdica
Novena semana
9. Coproparasitario, identificacin microscpica de parsitos
Dcima semana
10. Exmen de Heces-Coprocultivos: medios apropiados, manejo de la muestra,
siembra, identificacin e interpretacin. Coproparasitario, identificacin
microscpica de parsitos
Dcima primera semana
11. Infecciones de transmisin sexual: Principales microorganismos que la producen,
diagnstico por laboratorio
Dcima segunda semana
12. Micosis.Toma de muestras y observacin de hongos: montajes y preparaciones
Dcima tercera semana
13. Tcnicas bsicas de inmunologa: aglutinacin, floculacin, micro-ELISA
Dcima cuarta semana
14. Investigacin de hematozoario: frotis, tincin e identificacin microscpica
Dcima quinta semana
SEGUNDA EVALUACIN: Dcima sexta semana
TERCERA EVALUACIN (PRCTICA): Dcima sptima semana
6. METODOLOGA, RECURSOS:
6.1. Mtodos didcticos
a. Charla de fundamentacin terica
b. Explicacin prctica y observacin
c. Realizacin de prcticas de pruebas de laboratorio
d. Lectura e interpretacin de resultados
6.2. Recursos
a. Uso del manual de prcticas de Laboratorio Microbiologa
b. Uso de Atlas de Microbiologa
c. Equipos de Laboratorio de Microbiologa (Microscopio, incubadora,
esterelizadora, etc.)
d. Medios de cultivo
e. Reactivos varios
f. Muestras biolgicas varias
7. EVALUACIN:
CRONOGRAMA DE EVALUACIONES:
a. 1ra. Evaluacin: Sptima semana
b. 2da. Evaluacin: Dcima sexta semana
c. 3era. Evaluacin: Dcima sptima semana
SISTEMA DE CALIFICACIN:
EVALUACIONES PARCIALES PRCTICA Y TERICA: 30 puntos
10 puntos de cada prueba parcial (dos parciales) ms 10 puntos entre examen prctico al
microscopio (6 puntos) y trabajos (consultas, reportes, otros) (4 puntos)
3
Nota final: 20 puntos
Primera parte: 10 puntos con un examen final del rea de Prcticas en la semana 18 de la
rotacin
Segunda parte (examen integrador de la Macrorea de Morfofuncin): semana 18
de la rotacin

8. BIBLIOGRAFA:
TEXTOS DE REFERENCIA:
Forbes-Sahm-Weissfeld, Diagnstico Microbiolgico (Bailey & Scott), 11
a
edicin,
Editorial Mdica Panamericana, Argentina, 2004
ngel M., G. y M. ngel R., Interpretacin Clnica del Laboratorio, 6. edicin, Editorial
Mdica Panamericana, Bogot, 2.001
lvarez, M. V., et al, Manual de Tcnicas en Microbiologa Clnica, Asociacin Espaola de
Farmacuticos Analticos, Salamanca, 1.995
Henry, J. B., Diagnstico y Tratamiento Clnicos por el Laboratorio, 9. Edicin, Editorial
Salvat Mdica, Mxico, 1.993
OPS/OMS, Manual de Tcnicas Bsicas en Bacteriologa Clnica, 1.995
TEXTOS RECOMENDADOS:
Atlas y apuntes de Microbiologa de la Dra. Celia Bowen disponibles en la pgina web
ftp.puce.edu.ec
Francisco Javier Prez Pazmio-Elena Granda Moreno, Manual de Prcticas de Laboratorio
de Microbiologa, para estudiantes de Medicina


PRCTICA No. 1
TEMA: Bioseguridad en el Laboratorio de Microbiologa



EL MECHERO DE BUNSEN
La llama ms utilizada en el laboratorio es la producida por la combustin de un gas
(propano, butano o gas ciudad), con el oxgeno del aire.
La combustin completa (con exceso de oxgeno) produce agua y dixido de carbono,
una llama poco luminosa y de gran poder calorfico.
La combustin incompleta produce, adems de dixido de carbono y agua, carbono,
nonxido de carbono y otros productos intermedios, da origen a llamas de bajo poder
calorfico y altamente luminosas (debido a la incandescencia de las partculas de
carbono que se producen).
Para controlar las llamas se utiliza el mechero de laboratorio que, a pesar de existir
diversos tipos, el mecanismo de funcionamiento es similar en todos ellos.

Esencialmente constan de un tubo, llamado can, a cuya base llega la entrada de gas a
traves de un pequeo orificio (chicl).
En esta zona existen unas aberturas, regulables mediante una anilla (virola), que
permiten la entrada del aire al can.
La expansin del gas a travs del pequeo orificio succiona el aire exterior
produciendose, de este modo, una mezcla gas-oxgeno que asciende por el can hasta
la boca del mismo que es donde se produce la llama.
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Sosteniendo con unas pinzas una cpsula de porcelana en la parte superior de la llama
producida con la entrada de aire cerrada, se observa un ennegrecimiento producido por
el depsito de carbn, lo que indica que la combustin es incompleta.
Sosteniendo con unas pinzas una cpsula de porcelana en la parte superior de la llama
producida con la entrada de aire abierta, se observa el depsito de pequeas gotitas de
agua, lo que indica la combustin completa del gas a dixido de carbono y agua.

Si el mechero arde con la entrada de aire cerrada, la combustin es incompleta y la
llama presenta un color anaranjado debido a la presencia de partculas incandescentes
de carbono.
Al abrir el paso de aire, la combustin es completa y en la llama se aprecian dos zonas
claramente separadas por un cono azul plido.
En el exterior del cono la combustin es completa, existe un exceso de oxgeno y se
producen altas temperaturas (zona oxidante).
En el interior del cono los gases todava no se han inflamado y en el cono mismo hay
zonas donde la combustin no es todava completa y existen gases no oxidados a
dixido de carbono y agua por lo que se tiene una zona reductora de la llama

ENCENDIDO DEL MECHERO
Cerrar totalmente la entrada de aire, abrir ligeramente la llave de paso del gas y
acercar, lateralmente, una cerilla encendida a la boca del can. Regular la llave hasta
obtener una llama con la altura deseada, gradualmente, abrir la entrada de aire. No
abrir repentinamente porque puede apagarse el mechero.
Para obtener mayor temperatura, abrir ms el flujo de gas y la entrada de aire.
EL MECHERO SE APAGA AL CERRAR LA LLAVE DE GAS.
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PRCTICA No. 2

TEMA: Coloraciones: Gram, Ziehl-Neelsen, Giemsa (ver pg. 8 del manual de
prcticas Lab. Microbiologa del Dr. F. Prez y mirar atlas con el nmero de
prctica correspondiente colocado en la pgina ftp.puce.edu.ec)

PRCTICA No. 3

TEMA: Medios de cultivo (ver pg. 13 del manual de prcticas Lab.
Microbiologa del Dr. F. Prez y mirar atlas con el nmero de prctica
correspondiente colocado en la pgina ftp.puce.edu.ec)

Metodologa para realizar un cultivo bacteriano:
Antes de realizar un cultivo es necesario contar con todo el material debidamente
esterilizado, adems de tener la precaucin de trabajar junto a una fuente de calor que
impida tanto un contagio de la persona que procesa la muestra, as como una posible
contaminacin del cultivo donde se va a trabajar.

Para realizar un cultivo bacteriano es necesario tomar el asa e introducirla al fuego
para que se esterilice, dejar enfriar unos segundos y tomar la muestra que se va a
estudiar; abrir la caja petri y flamear delante del mechero, con el asa impregnada de la
muestra se efecta un pequeo inculo en el borde, de all se parte la primera
estriacin; luego de la esquina de una de las estras de la primera estriacin se realiza
la segunda estriacin y finalmente de la esquina de una de las estras de la segunda
estriacin, se realiza la tercera estriacin, procurando hacer las estras mucho ms
separadas de las dos primeras, con la finalidad de separar las colonias que sean
sembradas; se tapa la caja y se lleva a la incubadora, colocndola de lado contrario al
que se sembr y se la deja en las condiciones apropiadas para el crecimiento de cada
bacteria (temperatura, atmsfera, potencial rdox, tiempo, etc.)



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PRCTICA No. 4

TEMA: Tcnica para la realizacin del antibiograma (ver pg. 23 del manual de
prcticas Lab. Microbiologa del Dr. F. Prez y mirar atlas con el nmero de
prctica correspondiente colocado en la pgina ftp.puce.edu.ec)




DISCOS DE ANTIBITICOS USADOS PARA GRMENES GRAM
POSITIVOS Y GRAM NEGATIVOS TOMANDO EN CUENTA AL PACIENTE
AMBULATORI
GRAM POSITIVOS GRAM NEGATIVOS
Oxacilina (ox) Ampicilina (am)
Eritromicina (E) Cefuroxima (cxm)
Clindamicina (cc) Ampicilina + sulbactam (sam)
Cefoxitin (fox) Gentamicina (gm)
Sulfas (sxt) Norfloxacina (nor)
Ciprofloxacina (cip) Nitrofurantona (fm)
Vancomicina (va) Sulfas (sxt)




PRCTICA No. 5

1. TEMA: ESTUDIO MICROBIOLGICO DEL ESPUTO: Coloraciones,
siembras e interpretacin (ver pg. 26 del manual de prcticas Lab.
Microbiologa del Dr. F. Prez)



PRCTICA No. 6

2. TEMA: IDENTIFICACIN DE COCOS GRAM POSITIVOS:
8
Estafilococos y estreptococos (ver pg. 44 del manual de prcticas Lab.
Microbiologa del Dr. F. Prez y mirar atlas con el nmero de prctica
correspondiente colocado en la pgina ftp.puce.edu.ec)

Catalasa: la catalasa es una enzimaque descompone el perxido de hidrgeno
(H
2
O
2
) en oxgeno y agua.El perxido de hidrgeno se forma como uno de los
productos finales del metabolismo oxidativo o aerbico de los hidratos de
carbono. Si se deja acumular, el perxido de hidrgeno es letal para las clulas
bacterianas.
2H
2
O
2
2H
2
O +

O
2
(burbujas de gas)
La prueba de la catalasa, llevada a cabo en portaobjetos o en tubos, es muy
comnmente utilizada para diferenciar estreptococos (negativos) de
estafilococos (positivos).

Coagulasa: la coagulasa es una enzima proteca de composicin qumica
desconocida, con actividad semejante a la protrombina, capaz de transformar el
fibringeno en fibrina, provocando la formacin de un coagulo visible en un
sistema analtico adecuado. En el laboratorio, la prueba de la coagulasa se
utiliza ms comnmente para diferenciar al S. aureus (coagulasa positivo) de
otros estafilococos y micrococos.

La coagulasa se halla en 2 formas, libre y fija, cada una de las cuales
posee diferentes propiedades que requieren el uso de tcnicas separadas:

Coagulasa libre (prueba en tubos): la coagulasa libre es una sustancia
semejante a la trombina, que se haya presente en los filtrados de cultivos.
Cuando una suspensin de bacterias productoras de coagulasa se mezclan en
partes iguales con una pequea cantidad de plasma en un tubo de ensayo, se
forma un coagulo visible como consecuencia de la utilizacin de los factores de
la coagulacin del plasma de manera similar a cuando se aade trombina.

Bacitracina:Las pruebas presuntivas en la identificacin del EbHGA
(Estreptococo beta hemoltico del grupo A) se basan en la susceptibilidad e
inhibicin del crecimiento en una placa de agar sangre, y que tienen la mayor
parte (95%) de las cepas al ponerlas en contacto con discos que contienen dosis
bajas (0.04U) de bacitracina.

Optoquina: se usa el disco de optoquina para diferenciar entre S. pneumoniae
(sensibles) y otras especies de estreptococos a hemolticos (resistentes). La
sensibilidad a la optoquina es una medida de la fragilidad de la membrana
celular bacteriana. La optoquina, que es el clorhidrato de etilhidrocuprena.


2. PARTE EXPERIMENTAL :
2.1.Tcnica o procedimiento: Estudio microbiolgico del esputo
Nota: Se utilizan tres medios de cultivo para el esputo que son: agar Macconkey,
agar sangre y caldo de tioglicolato. En la prctica haremos con agar sangre y caldo
de tioglicolato
a. Siembra en agar sangre (para identificacin de bacterias gram-negativas y
gram-positivas):
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Sacamos el agar sangre de la refrigeradora y esperamos a que adquiera
la temperatura ambiente
Encendemos el mechero de bunsen, colocamos las asas y las muestras
de esputo cerca del mismo
Tomamos un cotonete de algodn estril y tomamos un poco de muestra
de esputo en una lado del agar, luego tomamos el asa lo esterelizamos
en el mechero y luego de enfriar lo pasamos por el agar, justo en el sitio
por donde paso el cotonete, estriamos en tres direcciones alrededor de la
caja
Tapamos el agar y colocamos en la incubadora alrededor de 35- 37C y
dejamos por 24 a 48 horas en la misma
Una vez transcurrido el tiempo de incubacin se realiza la lectura de la
siembra y la interpretacin de la misma
b.Siembra en caldo de tioglicolato
Con el cotonete de algodn que se tom la muestra de esputo y se sembr en agar
sangre, introducir un poco de la misma en el caldo e incubar de 35 a 37C durante
48 horas.

Este medio se usa para determinar el efecto del oxgeno sobre el crecimiento
microbiano. Un tubo con medio semislido contiene tioglicolato para reducir el
potencial redox del medio. As slo hay oxgeno en la superficie y no en el resto del
tubo.

Si el microorganismo es aerobio estricto crecer en la parte de arriba del tubo, si es
anaerobio estricto no crecer en la parte ms alta del tubo y si es anaerobio
facultativo crecer por todo el medio.

c. Observacin de placas coloreadascon coloracin gram de muestra de esputo
Mirar al microscopio con el lente de gran aumento (100 x) y con aceite de
inmersin, las colonias de Stafilococcus, de Streptecoccus, de otras bacterias y
otros elementos patgenos presentes anotar el color y las formas que presentan.

2.2. Tcnica o procedimiento: Identificacin de cocos gram positivos
2.2.1. Catalasa
En una placa portaobjetos aadir 1 o 2 gotas de perxido de hidrgeno al 3%
(diluir la solucin al 30% con agua destilada), transferir clulas del centro de una
colonia bien aislada y mezclar. La rpida aparicin y produccin sostenida de
burbujas de gas o efervescencia indica una reaccin positiva.

2.2.2.Coagulasa
Prueba en tubos (coagulasa libre):
1.- colocar aspticamente 0.5 ml de plasma de conejo reconstituido en el fondo de
un tubo estril.
3.- mezclar por rotacin suave del tubo, evitando remover o agitar el contenido.
4.- colocar el tubo en la incubadora de 4 a 24 horas. Observar la formacin de un
coagulo visible.

La reaccin se considera positiva ante cualquier grado de coagulacin visible
dentro del tubo.

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2.2.3. Prueba de la Bacitracina
Se toma un agar sangre y en un lado de la placa se estria con el asa en forma
continua la cepa de estreptococo beta hemoltico, con una pinza estril se coloca el
disco de bacitracina en el centro del estriado realizado. La placa de agar sangre es
incubada a 35-37 C durante toda la noche. Los resultados son cualitativos y es
positiva para estreptococo beta hemoltico del grupo A si se encuentra cualquier
halo de inhibicin alrededor del disco.

2.2.4. Prueba de la optoquina

Mtodo: se toma una suspensin de colonias puras en caldo Mueller Hinton o
tioglicolato y con un hisopo se estra una placa de agar sangre de carnero al 5 %.
Sobre la estra se coloca el disco de optoquina. Se incuba con atmsfera de CO2 al
5 % ( jarra con vela ). durante 24 hs. a 35 C.
Interpretacin: Sensible, cuando hay inhibicin alrededor del disco. Se considera
como punto de corte 16 mm. (discos de 10 mm) o 14 mm (discos de 6 mm).
Resistente, cuando el crecimiento no es inhibido alrededor del disco. Los casos de
halos intermedios deben resolverse por acumulacin de pruebas a favor o en
contra.

3. MATERIALES Y REACTIVOS (este literal no necesita ser memorizado):

Materiales Reactivos
Asas microbiolgicas Placas coloreadas por
mtodo de gram
Incubadora a temperatura
35-37 C
Agar sangre
Mechero de Bunsen Caldo de tioglicolato
Cajas petri Muestras de esputo
Hisopos estriles Perxido de hidrgeno
Microscopio Plasma de conejo
Placas portaojetos Discos de bacitracina
Tubos de ensayo
Palillos de dientes

PRCTICA No. 7

TEMA: UROCULTIVOS (ver pg. 29 del manual de prcticas Lab.
Microbiologa del Dr. F. Prez y mirar atlas con el nmero de prctica
correspondiente colocado en la pgina ftp.puce.edu.ec)
1. Instrucciones para recoger una muestra parcial de orina para EMO
a. El frasco tiene que ser suministrado por el Laboratorio, o adquirir en la
farmacia uno estril apropiado para la recoleccin de orina.
b. Es preferible que la orina sea la primera orina de la maana.
c. Practicar previo aseo genital, con agua y jabn, sin dejar residuos. Esto es
especialmente importante en la mujer que debe lavarse el rea entre los labios
de la vagina y evitar la contaminacin de la muestra con crema, antispticos y
secreciones vaginales. Los hombres y nios deben limpiarse la cabeza del pene
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d. Deje escapar la porcin inicial de la miccin al inodoro, a continuacin
recolecte en el frasco la porcin media (10 ml) y descarte la porcin final de la
miccin nuevamente en el inodoro.
e. Tape bien el frasco y entrguelo rpidamente al Laboratorio (mximo dos horas
luego de tomar la muestra).
f. NO recoger la muestra durante el Periodo Menstrual
2. Mtodo para el anlisis de orina macroscpico y qumico:

a. Despus de recibir la orina en el laboratorio, analizarla tan pronto como sea
posible. Antes del anlisis las muestras de orina deben estar a la temperatura
ambiente
b. Realizar la homogenizacin de la orina
c. Con movimientos moderados en el recipiente transportado hasta el laboratorio
(bien mezclada y no agitada)
d. Verter en un tubo de ensayo de 16 x 100 mm aproximadamente 10 ml
e. Determinar el color, aspecto (nitidez)
f. Registrar la presencia de un olor inusual y de cantidades anormales de espuma
coloreada
g. Sumergir brevemente la tira reactiva, no ms de un segundo (evitar tocarla con
los dedos, ya sea antes o despus de sumergirla)
h. Eliminar el exceso de orina en la tira,: limpiar el borde de la misma con el
reborde del tubo o con papel secante
i. No permitir que los reactivos de la tira se junten
j. No depositar la tira reactiva directamente sobre la superficie de trabajo
k. Seguir exactamente las recomendaciones en cuanto al tiempo para cada test
qumico
l. Mantener la tira reactiva junto a la carta de colores y leer bajo una buena
iluminacin
m. Tener en cuenta las fuentes de error, la sensibilidad y la especificidad de cada
prueba con la tira reactiva
1.1.Parmetros que se observan en el examen macroscpico :
En el examen macroscpico se analiza el aspecto como por ejemplo si es trasnparente,
ligeramente turbia, turbia, espesa, opaca y el color de la orina que puede ser amarilla
plida, amarilla oscura, mbar, roja, verde, azul entre otros.
1.2.Parmetros que se observan en el examen qumico:
Densidad ( gravedad especfica): Registra la concentracuin inica de la
orina (es decir, qu tan concentrada o diluida se encuentra). Se basa en la
liberacin de protones por un formador de complejos en presencia de
cationes. Esto causa un viraje de color del indicador azul de bromotimol, de
azul hacia amarillo, pasando por verde azulado
pH: Indican la acidez o alcalinidad de la orina. Los valores pH ms
frecuentes en orina fresca de personas sanas se encuentran entre 5 y 6. El test
es especfico para la deteccin de iones hidronio, siendo el valor pH el
logaritmo decimal negativo de la concentracin de iones hidronio. El papel
reactivo contiene los indicadores rojo de metilo, fenolftalena y azul de
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bromotimol.
Leucocitos: Comprueba la actividad estersica de granulocitos. Esta enzimas
desdoblan un ster de indoxilo a indoxilo, que reacciona con una sal de
diazonio formando un colorante violeta. se detectan leucocitos intacto y
tambin los lisados (indicio de IVU)
Nitrito: Los agentes patgenos ms frecuentemente causantes de infecciones
de las vas urinarias, E. coli y la mayora de los grmenes patgenos
urinarios, transforman el nitrato absorbido con la alimentacin en nitrito. Este
es detectado por una coloracin del rosa al rojo de la zona reactiva. El ensayo
se basa en el principio de la prueba de Griess y es especfico para el nitrito.
(indicio de IVU)
Protenas: El test se basa en el principio del error proteico de indicadores de
pH y reacciona de manera especialmente sensible a la albmina.
Glucosa: La deteccin de glucosa se efecta segn el mtodo especfico de la
glucosa-oxidasa-peroxidasa.
Cuerpos cetnicos: La deteccin se realiza en el principio de la prueba de
legal y reacciona ms intensamente al cido acetilactico que a la acetona.
Las cetonas son un subproducto del metabolismo de las grasas, presente con
inanicin y diabetes.
Urobilingeno: Es un producto de degradacin de la bilirrubina. El test se
basa en que una sal de diazonio estable produce con el urobilingeno, casi
instantneamente un colorante azico rojo
Bilirrubina: En la orina es un producto de degradacin de la hemoglobina.
La deteccin se basa en la copulacin de una sal de diazonio con bilirrubina
para formar un colorante azoico. Incluso los ms leves matices rosa ya deben
ser considerados como positivos.
Hemoglobina: Es un indicio de hemlisis. La mioglobina cataliza la
oxidacin del indicador por el hidroperxido orgnico contenido en el papel
reactivo. Puntos verdes aislados hasta acumulados en la zona reactiva
amarilla indican la presencia de eritrocitos intactos. La hemoglobina as
como los eritrocitos hemolizados o la mioglobina son indicados por una
coloracin verde homognea de la zona reactiva.

2. Mtodo para realizar el examen microscpico del sedimento urinario
a. Una vez realizado el examen microscpico y qumico de la orina, se la
centrifuga por 5-10 minutos a 1500-2000 rpm con la orina previamente
homogenizada
b. Eliminar cuidadosamente el sobrenadante. El volumen final utilizado para
resuspender el sedimento puede variar segn el sistema estandarizado que
se use, pero debe ser siempre constante en cualquier laboratorio dado.
c. Resuspender con suavidad el sedimento, eliminar las dos primeras gotas y
colocar la tercera gota en una placa portaobjetos, cubrir con un
cubreobjetos. Dejar que la orina se deposite durante 30 a 60 segundos.
d. Observar al microscopio con objetivos de pequeo y gran aumento. Para
detectar algunas entidades del sedimento con un ndice bajo de refraccin
ser necesaria una luz amortiguada o una iluminacin de contraste de fase.
El foco fino debe variarse continuamente mientras se examina. Progresar
de manera sistemtica a lo largo de toda la placa, teniendo cuidado de
examinar los bordes en busca de cilindros.
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e. Recuento del nmero de cilindros por lo menos en 10 campos de pequeo
aumento (10x) y anotar en el informe el nmero de cilindros por campo.
Puede utilizarse un margen razonable, es decir, 0 a 2, 2 a 5, 5 a 10, etc. Usar
el gran aumento (40x) para indicar el tipo de cilindros. Los cilindros se
apreciarn si se utiliza microscopio de contraste de fase.
f. Identificacin y recuento de los eritrocitos, leucocitos y clulas epiteliales
renales utilizando el objetivo de gran aumento (40x). Efectuar el recuento
por lo menos 10 campo de gran aumento y expresarlo como clulas por
campo. En el informe puede utilizarse un margen razonable.
g. Reportar:
h. Las clulas epiteliales (bajas) y altas si estn presentes en gran nmero o
como fragmentos (clulas transicionales)
i. Bacterias, levaduras, microorganismos. Una bacteriuria detectable a
pequeo aumento puede expresarse por lo menos como 2 +.
j. Los cristales se cuantifican bajo pequeo aumento. La presencia de cristales
anormales debe confirmarse qumicamentey correlacionarse con la historia
del paciente
k. Grandes cantidades de moco

OBSERVACIN: Para el siguiente literal por favor revisar el atlas para segundo
nivel ubicado en el internet cuya pgina es ftp.puce.edu.ec
2.1.Elementos que se observan en el examen microscpico:
Las bacterias y otros microorganismos (normalmente no estn presentes)
Cilindros urinarios
Cristales
Grasa
Moco
Glbulos rojos (un indicio de dao en los tbulos)
Clulas tubulares renales
Clulas epiteliales de transicin
Glbulos blancos (un indicio de infeccin del tracto urinario)

3. PARTE EXPERIMENTAL PARA REALIZAR UN UROCULTIVO:
3.1. Siembra en agar Mc conkey (para identificacin de bacilos Gram
negativo):
3.1.1. Sacamos el agar Mc conkey de la refrigeradora y esperamos a que adquiera
la temperatura ambiente
3.1.2. Encendemos el mechero de bunsen, colocamos las asas y las muestras de
orina cerca del mismo
3.1.3. Tomamos el asa calibrada la esterelizamos en el mechero y luego de enfriar
metemos en la muestra de orina retirando los excesos en el borde del envase
que contiene la orina
3.1.4. Tomamos el agar Mc conkey y realizamos la siembra estriando en cuatro
direcciones alrededor de la caja (colocar el estudiante el grfico de forma
de estriado en el informe)
3.1.5. Tapamos el agar y colocamos en la incubadora alrededor de 35- 37C y
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dejamos por 24 horas en la misma
3.1.6. Una vez transcurrido el tiempo de incubacin se realiza la lectura de la
siembra y la interpretacin de la misma

3.2. Siembra en agar sangre (para cuantificacin de colonias bacterianas
U.F.C./ml)

3.2.1. Sacamos el agar sangre de la refrigeradora y realizamos el mismo
procemiento anterior hasta el literal 4.1.6, variando la tcnica de
estriado
3.2.2. Para el contaje de las colonias que crecieron, contamos las mismas
como U.F.C. (unidad formadora de colonias) en uno de los cuatro
cuadrantes de la caja de agar sangre, multiplicamos por cuatro y
obtenemos el U.F.C contenido en 0.001 ml que nos proporcion el asa
calibrada a ese volumen, luego efectuamos una regla de tres, ejemplo:
350 U.F.C 0.001 ml
X 1 ml
X= 350.000 U.F.C./ml
3.2.3. El resultado obtenido se lo compara con los rangos de valores
normales siguientes:
Menos de 10.000 U:F:C/ml se considera contaminacin
Entre 10.000 y 100.000 U.F.C./ml se considera sospecha de
infeccin
Mayor a 100.000 U.f.c./ml se considera infeccin

B. Materiales y reactivos:

Materiales Reactivos
Asas calibradas 0.001 ml Agar Mc conkey
Incubadora a temperatura 35-37 C Agar sangre
Mechero de Bunsen Muestras de orina
Cajas petri


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PRCTICA No. 8

TEMA: IDENTIFICACIN BIOQUMICA DE BACILOS GRAM
NEGATIVOS (mirar atlas con el nmero de prctica correspondiente colocado
en la pgina ftp.puce.edu.ec)

A. Disponer a la temperatura ambiente en gradilla una serie doble de tubos de
cultivo para reacciones bioqumicas.
B. Resembrar del medio de cultivo que contiene las colonias de bacilos
gramnegativos selecionadas como sospechosas a los medios para bioqumicas
En los medios inclinados sembrar por estrias
En los medios verticales sembrar por picadura
En los medios lquidos sembrar por emulsin
C. Etiquetar con los datos correspondientes. Llevar a la incubadora por 24 horas.
D. Retirar las series de tubos con las reacciones bioqumicas.
E. Interpretar las reacciones bioqumicas en cada uno de los tubos, de la siguiente
manera.

1. ENSAYO DEL ROJO DE METILO
I. Principio
El test se usa para determinar la presencia de iones hidrgeno cuando un
microorganismo fermenta glucosa. Todos los miembros de la familia
Enterobacteriaceae convierten glucosa en cido pirvico por el camino de
Embden-Meyerhof. Los organismos que metabolizan cido pirvico producen
cido y bajan el pH a menos de 4.4. Los organismos que utilizan, en cambio, el
camino del butilenglicol producen acetona y butanodiol (diacetilo). El indicador
del medio, rojo de metilo, es rojo a pH < 5.0 y amarillo a pH > 5.8. El test es til
para la diferenciacin de Escherichia coli (rojo metilo positivo) de Klebsiella (rojo
metilo negativo).

II. Procedimiento
A. Con un asa estril tomar material e inocular un tubo con caldo RM/VP.
B. Incubar a 35 C por un mnimo de 48 horas.
C. Transferir 2.5 ml de la suspensin a un tubo.
D. Agregar 5 gotas del indicador y observar si hay cambio de color.

III. Resultados
Ensayo positivo: el reactivo permanece rojo.
Ensayo negativo: el reactivo se torna amarillo-naranja.
Si el resultado es negativo continuar la incubacin de la bacteria por 24 horas ms.

2. ENSAYO DE VOGES-PROSKAUER
I. Principio
El piruvato es un intermediario en el metabolismo de la glucosa. A partir del cido
pirvico un microorganismo puede seguir varios caminos. Algunos lo rompen para
formar como productos finales cidos lctico, actico o frmico. Otros metabolizan
el piruvato por el camino del butilenglicol para formar como productos finales
acetona (acetilmetilcarbinol) y 2,3-butanodiol (diacetilo). El ensayo de Voges-
Proskauer (VP) detecta estos productos metablicos. En presencia de oxgeno e
KOH, la acetona se oxida a diacetilo, que da un complejo rojo. La sensibilidad del
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-naftol antes del agregado de KOH.

II. Procedimiento
A. Con un asa estril tomar material e inocular un tubo de caldo RM/VP
B. Incubar a 37C por un mnimo de 48 horas
C. Transferir 2.5 ml de la suspensin a otro tubo
-naftol
E. Agregar 0.2 ml del reactivo de KOH
F. Agitar el tubo y dejar descansar 10 a 15 minutos
G. Observar la formacin de un color rosado a rojo

III. Resultados
Ensayo positivo: desarrollo de color rojo dentro de los 15 minutos
Ensayo negativo: no hay desarrollo de color

3. PRUEBA DE LA UREA
I. Principio
La urea es una diamida del cido carbnico, cuya hidrlisis por accin de la ureasa
da 2 molculas de amonaco. La ureasa es una enzima constitutiva que se sintetiza
independientemente de la presencia o no de la urea. La prueba determina la
capacidad de la bacteria de desdoblar la urea, con la consiguiente alcalinizacin del
medio. Es una actividad caracterstica de especies de Proteus y se usa para
diferenciar Klebsiella (+) de Escherichia (-) y Proteus (+ rpido) de Providencia (-
); Yersinia pseudotuberculosis (+) de Yersinia pestis (-)

II. Procedimiento
A) Con un asa estril se toma abundante material y se inocula por puncin
B) Se incuba a 37C y se efectan lecturas a las 2, 4, 6 y 18 horas. Los tubos
negativos se observan
diariamente por 4 a 7 das para detectar reacciones tardas que dan ciertos
miembros de la
familia, registrando los resultados da por da.
III. Resultados
Ensayo positivo: aparicin de color rojo en el medio por una alcalinizacin del
mismo.
Ensayo negativo: no hay cambio de color.

4. PRUEBA DEL SIM (H
2
S, indol, motilidad)
Determinar si la bacteria a travs de Triptofanasas puede degradar el
Triptfano a indol.
Determinar si hay produccin de H
2
S a partir de aminocidos azufrados dando
como resultado un color negro
Determinar si la bacteria es mvil mediante la difuminacin de la misma hacia
los lados, de lo contrario, la bacteria slo crece en la lnea de inoculacin

I. Principio del Indol
El indol es uno de los productos del metabolismo del aminocido triptofano. Con
un medio rico en triptofano, el indol se puede detectar por su habilidad para
combinarse con ciertos aldehidos para formar un compuesto coloreado. El ensayo
constituye un mtodo rpido para detectar organismos productores de indol. Como
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indicador de la presencia del aldehdo se usa el reactivo de Erlich. Es
especialmente til en la identificacin preliminar de Escherichia coli, y para
diferenciar Edwardsiella (+)de Salmonella (-).

II. Procedimiento
1) Con un asa tomar material de una colonia aislada e inocular el caldo que
contiene triptofano.
2) Incubar a 37C por 18 a 24 horas.
3) Transferir 2 ml de la suspensin de caldo a un segundo tubo.
4) Agregar 5 gotas del reactivo de Erlich por la pared del tubo.
5) Agitar el tubo y observar un color rosado en la interfase entre el caldo y el
reactivo.
6) Si el ensayo es negativo, el cultivo se debe reincubar otras 24 horas.

III. Resultados
Ensayo positivo: desarrollo de un color rojo en la interfase del reactivo y el caldo,
segundos despus
de agregar el reactivo.
Ensayo negativo: no hay cambio de color o hay un color amarillo en la interfase.


5. AGAR KLIGLER
I.Principio
El agar de Kligler contiene dos azcares: lactosa (1%) y glucosa (0.1%).
Si el microorganismo fermenta glucosa, tanto la puncin como la estra aparecern
de color amarillo. Si el organismo fermenta lactosa y, la estra permanecer cida
(amarilla). Si no fermenta lactosa, la estra se vuelve alcalina (roja). Los
organismos que no fermentan glucosa no producen cambios en el pH del medio o
producirn productos alcalinos y el medio permanecer rojo. La produccin de
SH2 se manifiesta por un ennegrecimiento del medio.

II. Resultados
A. Estra cida/fondo cido (amarillo/amarillo): fermentacin de glucosa, lactosa
(E. coli)
B. Estra alcalina/fondo cido (rojo/amarillo): fermentacin de glucosa solamente
(Shigella spp.)
C. Estra alcalina/fondo alcalino (rojo/rojo): no fermentador (Pseudomonas
aeruginosa)
D. Precipitado negro en el fondo: produccin de SH2 (Salmonella spp)
E. Burbujas o roturas: produccin de gas (E. coli, Salmonella spp.)


6. PRUEBA DE LA LISINA (CARBOXILASA-DIHIDROLASA)
I. Principio
La descarboxilacin es un proceso en el cual las decarboxilasas atacan el extremo
carboxilo de los aminocidos, formando la correspondiente amina. La
decarboxilacin de lisina da cadaverina (diaminas). Como la decarboxilacin es
una reaccin anaerbica, se debe cubrir el medio con una capa de aceite mineral
estril. El proceso ocurre en dos etapas: por fermentacin de la glucosa se produce
una acidificacin del medio (pH < 6.0), apareciendo color amarillo. La
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acidificacin es necesaria para que ocurra la decarboxilacin. Este ltimo proceso
de lugar a la formacin de las aminas que elevan el pH con el consiguiente viraje
del indicador al color violeta.
La prueba de la lisina ayuda en la diferenciacin de Edwardsiella (+), y Salmonella
(+) de Citrobacter (-); de Enterobacter aerogenes (+) de Enterobacter cloacae (-)
y Enterobacter agglomerans (-)

II. Procedimiento
A. Tomar material con un asa e inocular el tubo control y los tubos con los
aminocidos
B. Cubrir todos los tubos con una capa de vaselina estril.
C. Incubar a 37C
D. Efectuar las lecturas da por da hasta 4 das, registrando los resultados da por
da

III. Resultados
Ensayo positivo: medio turbio y prpura a prpura amarillento
Ensayo negativo: color amarillo
Tubo control: permanece con su color original o se vuelve amarillo si el organismo
es un fermentador
de glucosa (se debe ver turbidez en el tubo)

7. PRUEBA DEL CITRATO
I. Principio
Es uno de los test del IMVIC (Indol, Rojo de metilo, Vogues-proskauer y Citrato)
usado para diferenciar enterobacterias. Hay microorganismos capaces de utilizar el
citrato como nica fuente de carbono produciendo alcalinidad, se detecta en un
medio de cultivo con citrato como nica fuente de carbono mediante el crecimiento
y la alcalinizacin del medio Este aumento de pH se visualiza con el indicador
azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6. Cuando el resultado es positivo el
medio de cultivo se vuelve azul y cuando es negativo se mantiene verde.
II. Procedimiento
Se inocula el agar inclinado en una sola estra en el pico. Utilizar un cultivo de 24
horas en un medio slido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se
pueden producir falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del
inculo. Incubar a 35C durante 4 das. El ensayo es positivo cuando se observa
crecimiento a lo largo de la estra, acompaado o no de un viraje del indicador al
azul.
III. Resultados
(+)Klebsiella spp , ( - ) Escherichia Coli

8. FENILALANINA DESAMINASA
Las desaminasas catalizan la prdida de NH
3
en un aminocido originando un
cido carboxlico. Las bacterias que desaminan la fenilalanina producen cido
fenilpirvico que con Fe3Cl en solucin cida produce un color verdoso ( resultado
positivo) y cuando es negativo es de color amarillo (reactivo es de color amarillo).
9. MALONATO
El fundamento es igual al citrato, para ver si se utiliza al malonato como fuente de
carbono.
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PRCTICA No. 9

TEMA: HECES FECALES. EXAMEN COPROPARASITARIO
(ver pg. 33-41 del manual de prcticas Lab. Microbiologa del Dr. F. Prez y
mirar atlas con el nmero de prctica correspondiente colocado en la pgina
ftp.puce.edu.ec)

1. MARCO TERICO:

1.1.Parsitos
NEMATODOS: Gusanos redondos
Ascaris lumbricoides: Se observan huevos miden aprox. 45-75 x 30-50 mm,
presenta una clula rodeada por tres capas, producen una patologa de dolor de
estmago y desnutricin.
Tricocfalo: El huevo mide de 50-55 x 22-25 mm Tiene la forma de baln de
ftbol americano, produce anemia intensa, dolores abdominales, prolapso rectal
ocasional.
Uncinarias: Tienen una forma elptica, estn cubiertas de una membrana lisa,
transparente y fina, mide de 60 - 40 x mm producen anemia.
Strongyloides stercolaris: Se observan larvas. Produce diarrea, vmito,
desnutricin.
Enterobius vermiculares (Oxyurus):Los huevos son ovoides con una cara convexa
y una plana, presenta una membrana interna y delicada y otra gruesa hialina y
mamelonada, mide de 50-60 x 20-30 mm. Produce prurito en la regin perianal,
insomnio, cambios de conducta.
CESTODOS: Gusanos planos
Taenia: Los huevos miden 20-30 x 30-40 mm, son ovoides con membrana gruesa,
amarillenta que se encuentra estriada en forma de empalizada y encierra un
embrin de seis ganchos poco visibles. Produce trastornos nerviosos.

Hymenolepis nana : Huevos ovoides, mide aprox. 50 mm tiene una membrana
interna y una externa, tambin puede causar trastornos nerviosos.
PROTOZOARIOS: Amebas
Entamoeba histoltica: Se observan quistes miden aprox. 20 mm se observa con
cuatro ncleos. Pueden causar lesin de la mucosa intestinal.
Entamoeba coli: Son quistes ms grandes que los de histoltica, tiene ms de
cuatro ncleos. Es considerada como no patgena.
Endolimax nana: Los quistes son ovalados miden de 6 - 10 mm presentan de uno
a cuatro ncleos.
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Iodamoeba btschlii: Su quiste se caracteriza por la presencia de una vacuola de
yodo, no es una ameba patgena.
Gardia lamblia: Es una ameba en forma de pera simtricamente lateral, con un
extremo ancho y redondeado, el quiste presenta cuatro ncleos y dos cuerpos
parabasales, produce una diarrea amarillenta y vmito.
TREMATODOS : Forma de hoja plana
Fasciola heptica: Dao en hgado . quistes



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1.2.Rotavirus:
Los rotavirus del grupo A constituyen la principal causa de gastroenteritis grave en
nios de todo el mundo. Producen unos 125 millones de infecciones cada ao en
los pases en desarrollo y son causa de 873.000 fallecimientos anuales .
Tres protenas estructurales de rotavirus tienen gran importancia para clasificar a
estos virus segn su antigenicidad. La protena VP6, que constituye la cpsida
interna del virin, es responsable de la existencia de siete serogrupos (A-G). Las
infecciones humanas son producidas principalmente por rotavirus del grupo A y,
en menor medida, o con otras caractersticas epidemiolgicas, por los grupos B y
C. El resto de grupos de rotavirus producen infecciones en los animales, aun
cuando los del A infectan tambin algunas especies animales, adems del hombre.
Los rotavirus humanos del grupo A se subdividen en dos subgrupos (I y II) en
funcin de la especificidad de la VP6.
PRCTICA No. 10

TEMA: HECES FECALES. Coprocultivo. Aislamiento de enterobacterias (ver
pg. 42-43 del manual de prcticas Lab. Microbiologa del Dr. F. Prez y mirar
atlas con el nmero de prctica correspondiente colocado en la pgina
ftp.puce.edu.ec)

AISLAMIENTO.
1. Sembrar una asada de materia fecal sospechosa en el tubo de caldo de
tetrationato. Inocular con asa por emulsin.
2. De la misma manera sembrar otra asada de la misma muestra en el tubo de
caldo nutritivo.
3. Etiquetar con los datos respectivos
4. Levar a la incubadora a 37C durante 24 horas. Colocar los tubos en gradilla, de
tal manera que se mantengan en posicin vertical para evitar que el lquido se
derrame.
24
5. A las 24 horas retirar los tubos de la incubadora.
6. Disponer sobre la mesa el medio selectivo (agar entrico Hektoen) para
resembrar el cultivo del caldo de tetrationato.
7. Resembrar en cada placa el inculo correspondiente
8. Tapar las placas. Etiquetar con los datos correspondientes
9. Llevar las placas a la incubadora. Colocarlas en posicin invertida. Mantenerlas
durante 24 horas.
10. Al da siguiente:
11. Retirar las placas de la incubadora.
12. Efectuar anlisis macroscpico de cada una para valoracin de la prueba
presuntiva
13. Efectuar anlisis microscpico por el mtodo de Gram de cada una de las
placas para confirmacin de la morfologa de los bacilos entricos
gramnegativos

PRCTICA No. 11

TEMA: INFECCIONES DE TRANSMISIN SEXUAL (ver pg. 48 del manual
de prcticas Lab. Microbiologa del Dr. F. Prez y mirar atlas con el nmero de
prctica correspondiente colocado en la pgina ftp.puce.edu.ec)


PRCTICA No. 12

TEMA: MICOSIS (ver pg. 52 del manual de prcticas Lab. Microbiologa del
Dr. F. Prez y mirar atlas con el nmero de prctica correspondiente colocado en
la pgina ftp.puce.edu.ec)

PRCTICA No. 13

TEMA: TCNICAS BSICAS DE INMUNOLOGA (ver pg. 55 del manual de
prcticas Lab. Microbiologa del Dr. F. Prez y mirar atlas con el nmero de
prctica correspondiente colocado en la pgina ftp.puce.edu.ec)
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Durante la prctica los estudiantes se realizarn voluntariamente pruebas de ASTO,
VIH, y VDRL para poder observar la reaccin Ag-Ac. Estas pruebas tienen los
siguientes fundamentos:

VIH:
La prueba VIH 1&2 es un inmunoensayo rpido de un solo uso basasdo en
inmunocromatografa. Emplea reactivos nicos para la deteccin rpida y segura de
anicuerpos a VIH1 y VIH2 en suero y plasma humano sin instrumental.

Las protenas recombinantes que representan las regiones inmunodominantes de las
protenas envoltura y gag de VIH-1 y VIH-2 son inmovilizadas en la regin de Prueba
de la tira de nitrocelulosa y un agente bioqumico que reconoce anticuerpos humanos
es dispersado en la regin de Control de la tira. Las protenas de VIH-1 y VIH-2,
unidas a oro coloidal, son impreganadas por debajo de la regin de Prueba del
dispositivo. Una banda estrecha de la membrana de nitrocelulosa es tambin
sensibilizada como regin de control.

Los complejos de anticuerpos de protena VIH-oro coloidal se desplazan por
cromatografa a lo largo de la membrana nitrocelulosa hacia las regiones de pruebas.
Se indica una reaccin positiva mediante la presencia de dos bandas de color (ver en la
prctica).

ASTO:
Es una prueba rpida por el mtodo de aglutinacin utilizando partculas de ltex para
la deteccin de anticuerpos anti-estreptolisina del grupo O (ASO) en suero humano.

Los anticuerpos ASO son encontrados en el suero del paciente en respuesta a una
infeccin con Streptococo hemoltico del grupo A, C o G (ver el mtodo de
aglutinacin en el atlas).


PRCTICA No. 14

TEMA: INVESTIGACIN DE HEMATOZOARIOS (ver pg. 57 del manual de
prcticas Lab. Microbiologa del Dr. F. Prez y mirar atlas con el nmero de
prctica correspondiente colocado en la pgina ftp.puce.edu.ec)








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