.

CONSIDERACIONES SOBRE METABOLISMO DE NITRGENO EN PLANTAS

El nitrgeno molecular (N
2
) constituye el 80 % de la atmsfera y es, junto con el agua, uno de
los principales factores que limitan el crecimiento de las plantas. El nitrgeno es
necesario, para todos los seres vivos, porque forma parte de los aminocidos, protenas,
coenzimas, fosfolpidos, cidos nuclicos y clorofilas, entre otras molculas.

Las fuentes de nitrgeno utilizadas por las plantas son formas de nitrgeno combinado
(NO
3-
y NH
4+
)

presentes en cantidades variables en el suelo. Las races de las plantas
absorben NO
3-
y NH
4+
(figura 1). Algunas plantas como las leguminosas, pueden tambin
usar como fuente de nitrgeno el NH
4+
producido a nivel de sus ndulos por bacterias
capaces de reducir el N
2
atmosfrico, proceso llamado fijacin biolgica de nitrgeno
(FBN) (figura 1 y 3A).

























Figura 1. El NO
3-
y el NH
4+
son las formas de nitrgeno combinado absorbidas por las
plantas. A su vez, en las leguminosas, el N
2
atmosfrico puede ser reducido a NH
4+
por los
bacteroides que se encuentran en los ndulos de la raz. El NH
4+
asimilado en la raz es
traslocado a diferentes rganos de la planta por el floema. El NO
3-
puede ser reducido en la raz
o transportado a la hoja por el xilema para ser asimilado. Los aminocidos producidos en la
hoja pueden ir por el floema al tallo, a la semilla o a la raz.




La incorporacin de nitrgeno a los compuestos carbonados se llama asimilacin y para que
este proceso ocurra, el nitrgeno tiene que estar bajo la forma de NH
4+
, por lo que si fue
absorbido como NO
3-
, tiene que ser reducido previamente.
1. La principal fuente de nitrgeno del suelo es el nitrato
1.1 Absorcin

Las plantas absorben NO
3-
desde el suelo y son capaces de mantener concentraciones
mucho mayores de este ion dentro de sus clulas o en la savia xilemtica con respecto al
suelo. El NO
3-
atraviesa la membrana plasmtica mediante protenas transportadoras
especficas.
En la mayora de las plantas existen dos tipos de permeasas; una constitutiva, con una K
M
alta para el NO
3-
, y otra inducible, con una K
M
ms baja. Una evidencia importante acerca de
la existencia de un sistema inducible por el NO
3-
, es que la absorcin desciende en
presencia de inhibidores de la sntesis proteica. Otra evidencia es que en plantas crecidas sin
NO
3-
en el medio de cultivo, se encuentra NO
3-
en las clulas de la planta luego de unas horas
de la adicin de ste al medio.
Este tipo de transporte dependiente de ATP decrece con bajas pO
2
en el entorno radicular, o
en presencia de inhibidores o desacopladores de cadena respiratoria.
1.2 Reduccin de nitrato

El NO
3-
puede ser reducido en las clulas de las races, o bien ser transportado por el
xilema al tallo o las hojas para ser reducido en alguno de esos rganos. La importancia
relativa de los distintos rganos en la reduccin del NO
3-
, vara con la especie. Mientras que
en las plantas tropicales la reduccin ocurre preferentemente en el tallo y en las hojas, en
las de clima templado, especialmente las leguminosas, son las races las que reducen la
mayor parte del NO
3-
. A nivel celular en cualquiera de estas plantas, el NO
3-
es reservado en
la vacuola, para lo cual debe ser transportado a travs de la membrana vacuolar o
tonoplasto.
La reduccin de NO
3-
a NH
4+
es un proceso que ocurre en dos reacciones consecutivas;
una catalizada por la enzima nitrato reductasa (NR) que reduce el nitrato a nitrito y otra
catalizada por la nitrito reductasa (NiR) que reduce el nitrito y produce amonio (figura 2).
NAD(P)H.H+ NAD(P)+
NAD(P)H.H+ NAD(P)+ Fd red Fd ox
NO
3-
NO
2-
NH
4+
NR NiR
Figura 2. Reduccin de NO
3-
a NH
4+
catalizada por la nitrato reductasa (NR) y nitrito
reductasa (NiR)
La NR es una enzima citoslica que usa NADH.H
+
o NADPH como donador de electrones,
mientras que la NiR cloroplstica, emplea ferredoxina reducida (Fd red).
Cuando a una planta se le suministra NO
3-
, aumenta en forma notable tanto la protena NR
como su actividad en hojas y races. El aumento de la cantidad de NR se debe a la sntesis de
novo de la protena, y constituye el ejemplo ms conocido de induccin de una enzima por su
sustrato en plantas superiores.




La NiR, al igual que otras enzimas cloroplsticas, est codificada por un gen nuclear y es
sintetizada en el citoplasma como una protena precursora, con una secuencia N-terminal o
pptido de trnsito que hace posible el ingreso al cloroplasto.
2. Algunas plantas se benefician de bacterias que reducen el nitrgeno atmosfrico.
La capacidad de fijar nitrgeno est restringida a un nmero relativamente escaso de
procariotas capaces de reducir enzimticamente el N
2
a NH
4+
. Este proceso, conocido como
fijacin biolgica de nitrgeno (FBN) o diazotrofa, permite la obtencin NH
4+
, forma de
nitrgeno asimilable por las plantas.

Las bacterias fijadoras de nitrgeno pueden realizar este proceso en simbiosis, como es el
caso de los rizobios que nodulan races de leguminosas (figura 3 A). Otros fijadores de
nitrgeno, como las cianobacterias (figura 3 B) y Azotobacter que realizan la reduccin de
N
2
a NH
4+
fuera de la planta, son ejemplos de fijadores libres de importancia agronmica.













A B
Figura 3. Ndulos inducidos por rizobios en races de una leguminosa (A). Cianobacteria
fijadora de nitrgeno en vida libre, el ejemplar mostrado es del gnero Anabaena y fue
aislada de arrozales de Treinta y Tres (B).

La ecuacin que aparece abajo representa la obtencin de NH
4+
por FBN en una reaccin
catalizada por el complejo enzimtico denominado nitrogenasa.


N
2
+ 8e
-
+ 8H
+
+ 21ATP nitrogenasa 2NH
4+
+ H
2
+ 21ADP+ 21P


En la reaccin anterior se gasta gran cantidad de ATP y se forma H
2
. Cuando este proceso se
produce en los ndulos de las leguminosas, las bacterias obtienen energa del metabolismo de
compuestos carbonados suministrados por la planta, derivados de la fotosntesis, tales como
oxalacetato y succinato. Es decir, a nivel de las bacterias que se encuentran en las clulas
vegetales ocurren las vas metablicas que permiten obtener ATP y poder reductor a partir de
molculas carbonadas que proporciona la planta.
La incorporacin de N
2
a la bisfera por FBN se estima a nivel global es de unas 10
8
ton/ao.






La composicin y propiedades de la nitrogenasa son similares en todas las especies de las que se ha
aislado. Dos metaloprotenas conforman el complejo enzimtico: el componente I (protena Fe-Mo) o
nitrogenasa, donde se encuentra el sitio de unin del N
2
hasta su reduccin a NH
4+
y el componente II
(protena-Fe) o nitrogenasa reductasa, que aporta los electrones al componente I segn se observa en el
esquema que aparece abajo.
La transferencia de electrones desde la nitrogenasa reductasa a la nitrogenasa est acoplada a la
hidrlisis de ATP por la nitrogenasa reductasa.










El complejo nitrogenasa es sensible al O
2
y cantidades muy bajas son suficientes para inactivar a la
enzima. En los ndulos (figura 3 A), la protena leghemoglobina es responsable de la proteccin de la
nitrogenasa frente al O
2
.
Dado que el proceso de reduccin de nitrgeno demanda altos niveles de energa, la actividad del
complejo nitrogenasa se inhibe cuando hay baja relacin ATP/ADP. En relacin al costo energtico, es
interesante observar que la nitrogenasa se inhibe cuando hay en el medio nitrgeno combinado (NO
3-

o NH
4+
). Este hecho parece "lgico" en la medida que la utilizacin de estas formas de nitrgeno
requiere menos energa que el proceso de FBN.


3. El amonio es el compuesto clave para que el nitrgeno sea asimilado por la planta
Tanto la reduccin del NO
3-
como la fijacin biolgica de nitrgeno producen NH
4+
que se
incorpora a molculas orgnicas por un proceso conocido como asimilacin (figura 4). En
los tejidos vegetales prcticamente todo el nitrgeno es asimilado por la va GS/GOGAT.
Esta es una va cclica que comprende dos reacciones catalizadas por las enzimas
glutamina sintetasa (GS) y glutamato sintasa o glutamino oxoglutarato amino transferasa
(GOGAT), figura 4.
La GS cataliza la incorporacin del NH
4+
al cido glutmico (glu) para dar glutamina (gln) en
un proceso que requiere ATP y Mg
+2
. El nitrgeno del grupo amida de la glutamina es
incorporado al -ceto glutarato para dar dos molculas de cido glutmico en una reaccin
catalizada por la GOGAT. Una de las molculas de glu sirve como aceptor del NH
4+
nuevamente cerrando el ciclo y la otra molcula de glu es utilizada para obtener otros
aminocidos as como diferentes compuestos nitrogenados.
El bajo K
M
de la GS para el NH
4+
garantiza su inmediata asimilacin lo que evita que este
potente txico quede libre en la clula. El equilibrio de esta reaccin se desplaza hacia la
formacin de producto, debido a la hidrlisis de ATP.
La GOGAT cataliza una aminacin reductiva en la que se utiliza como cofactor al NADH.H
+
o
ferredoxina reducida, segn el rgano de la planta. Tanto la GS como la GOGAT se
encuentran bajo distintas isoformas en todos los tejidos de la planta para asimilar
rpidamente el NH
4+
.
































Figura 4. Esquema de la asimilacin de NH
4+
en plantas por el ciclo GS/GOGAT, de sus
diferentes orgenes y de algunas molculas organonitrogenadas que participan en su
transporte.




Las fuentes primarias de NH
4+
son, el NO
3-
, el propio NH
4+
si es absorbido como tal y en
algunas plantas el N
2
, que es previamente reducido a NH
4+
por algn procariota.

Adems de
asimilar el NH
4+
proveniente de estas fuentes primarias, es necesario que las plantas
asimilen el NH
4+
que se libera como consecuencia de la fotorrespiracin en hojas de plantas C3
(figura 5). En estos rganos en condiciones normales de luz el NH
4+
proveniente de esta va
supera al proveniente de las fuentes primarias.


Otras fuentes de NH
4+
en tejidos vegetales son la asparagina, arginina y ureidos,
compuestos usados por las plantas para transportar nitrgeno entre rganos, como raz-
hoja u hoja-fruto, etc. Otro proceso que produce NH
4+
es la degradacin de protenas que se
produce durante la germinacin de las semillas, o a consecuencia de la senescencia de las
hojas (figura 5).






























Figura 5. Fuentes de NH
4+
para una planta. Las fuentes primarias de NH
4+
son, el propio
NH
4+
si es absorbido como tal o el NO
3-.
Segn se observa en la figura el NH
4+
proviene de
distintos procesos que ocurren en diferentes rganos de la planta. De esta forma las
enzimas GS y GOGAT que participan en su asimilacin estn presentes en distintas formas
enzimticas. En las leguminosas el N
2
es reducido a NH
4+
en los bacteroides.
En el proceso de senescencia, las protenas son degradadas y los aminocidos resultantes
se transaminan para dar glutamato, que a su vez se desamina por accin de la glutamato
deshidrogenasa (GDH) segn la reaccin.

Glutamato + NAD
+
+ H
2
O -cetoglutarato + NH
4+
+ NADH.H
+
El NH
4+
resultante en esos tejidos es asimilado por la GS e incorporado a compuestos que
transportan nitrgeno, como la asparagina, arginina o ureidos, que son aprovechados en
otras partes de la planta.
En situaciones de falta de carbono la GDH por desaminacin reductiva del glutamato
provee de -cetoglutarato al Ciclo del cido ctrico.

4. Cmo se obtienen aminocidos a partir de otros aminocidos?
Las reacciones de transaminacin son centrales en el metabolismo aminoacdico porque
a travs de ellas se sintetizan aminocidos y tambin se degradan. Observe que mediante
reacciones de transaminacin, se transfiere el nitrgeno asimilado desde el glutamato a
esqueletos carbonados para formar otros aminocidos. As, la sntesis de un aminocido
implica por lo general la degradacin de otro aminocido que funciona como donador del
grupo amino (figura 6).




Las transaminasas o aminotransferasas, son enzimas que catalizan la transferencia del
grupo amino del carbono de un aminocido, al carbono de un cetocido, para dar un
nuevo aminocido y un nuevo cetocido (figura 6).

A


COO
-
COO
-
+ PAL
H
3
NCH + C =O
R
1
R
2

(AA1) + (CA2)


COO
-
PAM
C=O
R
1

(CA1)
COO
-
+
+

H
3
NCH
R
2
+ (AA2)



B
COO
-
COO
-
+
H
3
NCH COO
-
PAL
PAM
C=O COO
-
+
CH
2
+ C=O CH
2
+ H
3
NCH
CH
2
CH
3
CH
2
CH
3

COO
-
COO
-

Glu + pirvico -cetoglutrico + Ala


Figura 6. En A reaccin general de transaminacin que muestra como un aminocido (AA1) se
transforma en un cetocido (CA1) y como el cetocido (CA2) se transforma en un
aminocido (AA2). En este proceso se requiere de un cofactor el PAL/PAM que funciona
como aceptor o donador del grupo amino. En B se representa un ejemplo concreto de
transaminacin glutmico - pirvico.

El glutamato es el principal dador de grupos amino, dando origen a distintos aminocidos y -
cetoglutarato, que puede funcionar nuevamente como aceptor del grupo amino de la
glutamina en la reaccin catalizada por GOGAT (figura 4).
Las transaminasas poseen un grupo prosttico unido a su sitio activo; el fosfato de
piridoxal (PAL) que proviene de la vitamina B6. En una reaccin de transaminacin (figura 6A)
el aminocido (AA1) cede su grupo amino al PAL que se transforma en fosfato de
piridoxamina (PAM). Como consecuencia, se produce un cetocido (CA1) que se libera y el
PAM cede el grupo amino al cetocido sustrato (CA2), que se transforma as en el
correspondiente aminocido (AA2) y se regenera el PAL.




En vegetales se han encontrado y aislado transaminasas para todos los aminocidos
proteicos excepto para prolina, que es un iminocido. La reversibilidad de las reacciones de
transaminacin permite cambios de acuerdo a la demanda de aminocidos especficos,
aunque algunas transaminasas tienden a actuar principalmente en una direccin.


5. Slo algunos compuestos transportan nitrgeno entre rganos

El nitrgeno es movilizado dentro de la planta formando parte de molculas tales como
asparagina, glutamina, ureidos, arginina, entre otros. Estos compuestos se caracterizan por
tener una alta relacin N/C, que contribuye a la eficiencia del transporte. El compuesto
nitrogenado transportado vara con la especie vegetal, de todas formas, la asparagina es el
ms comunmente usado por las plantas.
La mayora de las leguminosas transportan el nitrgeno en forma de asparagina por el
xilema independientemente de la forma de nitrgeno disponible por las races. Otras
leguminosas transportan ureidos que tienen una relacin N/C mayor.
En rboles tambin la asparagina es el transportador de nitrgeno de corta distancia, para
traslocar nitrgeno a distancias mayores utilizan arginina, que tambin es usada por
algunos rboles perennes como molcula de reserva de nitrgeno. Cuando se necesita el
nitrgeno, la arginina es degradada por la arginasa, en una reaccin del Ciclo de la urea,
produciendo ornitina y urea. La ureasa convierte la urea en NH
4+
y CO
2
y el NH
4+
producido
se asimila por la GS que forma glutamina, uno de los compuestos que transportan nitrgeno
en las plantas.

El transporte de nitrgeno en la planta puede darse desde diferentes rganos, algunos
ejemplos se resumen a continuacin:
desde los ndulos de leguminosas a hojas y frutos,
desde las hojas senescentes a las hojas verdes y a frutos,
desde las hojas verdes a tallos y frutos,
desde los cotiledones en germinacin a la plntula.
6. Todo el nitrgeno orgnico fue alguna vez parte del nitrgeno de la atmsfera
Las plantas convierten el nitrgeno de formas inorgnicas a orgnicas. Si esta conversin
continuara indefinidamente, el suelo y la atmsfera se empobreceran rpidamente de
formas inorgnicas de nitrgeno.
En la naturaleza existen una serie de procesos interrelacionados, que conforman el ciclo de
nitrgeno, que incluye la interconversin que se produce en la biosfera entre formas
orgnicas e inorgnicas de nitrgeno, como se muestra en la figura 7.

El anlisis del ciclo se puede empezar por la entrada de nitrgeno atmosfrico al
ecosistema. Este proceso reductivo, conocido como fijacin biolgica del nitrgeno, es
realizado por microorganismos fijadores de nitrgeno como rhizobios, cianobacterias y
azotobacter entre otros, que producen NH
4+
. El NH
4+
puede ser usado para sintetizar
diferentes molculas nitrogenadas, o por microorganismos del suelo para obtener energa.
Estos microorganismos son tan abundantes y activos que casi todo el NH
4+
es oxidado a
NO
3-
, proceso conocido como nitrificacin (figura 7).
Las plantas y muchas bacterias pueden reducir rpidamente el NO
3-
a NH
4+
por accin de la
NR y NIR. El NH
4+
as formado pasa a formar parte de los aminocidos de las plantas, que
son usados por los animales para sintetizar sus propias protenas. Cuando los animales
ingieren vegetales degradan las protenas y los aminocidos resultantes son usados por los
animales para sintetizar sus propias protenas. La degradacin de restos animales y




Vegetales permite el retorno del NH
4+
al suelo, donde las bacterias nitrificantes convierten la
mayor parte de ste en NO
3-
(figura 7).
El balance entre el nitrgeno fijado y el nitrgeno atmosfrico es mantenido por bacterias que
convierten el NO
3-
a N
2
. Este proceso llamado desnitrificacin, se da en condiciones
microaerbicas o anaerbicas y es realizado por diferentes bacterias del suelo, que usan
NO
3-
como aceptor final de electrones para producir ATP.





























Figura 7. Ciclo del nitrgeno. Esta representacin de la dinmica del nitrgeno en el suelo y en
la atmsfera relaciona sus diferentes estados redox. En estos cambios de estado de
oxidacin participan enzimas presentes en microorganismos y plantas. Las plantas
absorben NO
3-
y NH
4+
. El NO
2-
no es absorbido por las plantas y el N
2
debe ser reducido
amonio por procariotas antes de ser utilizado por las plantas que no pueden realizar ese
proceso conocido como FBN.