Revista de la Facultad de Ciencias Biolgicas Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo.

Per

REBIOL 2011, 31 (2), julio-diciembre

Aislamiento e identificacin de bacterias hetertrofas de suelos contaminados con petrleo provenientes de oleocentros de la ciudad de Trujillo, Per
Isolation and identification of heterotrophic bacteria in soils contaminated with oil from of oleocentros of the city of Trujillo, Peru
Luis A. Llenque Daz
Departamento de Microbiologa y Parasitologa.Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo, Per. lullediaz@yahoo.com

RESUMEN Se procedi a aislar cultivos bacterianos de suelos de Oleocentros de la ciudad de Trujillo, Per; las muestras de suelo recolectadas de aproximadamente 20 cm de profundidad fueron sometidas a incubacin

de pre-enriquecimiento por 5 das con petrleo al 0.5 % e incubados a temperatura ambiente. Luego se prepararon diluciones seriadas hasta 10-2 y fueron sembradas 0,1 ml de las dos ltimas diluciones en agar nutritivo por el mtodo de superficie con asa de Drigalsky. La poblacin hetertrofa aislada se caracteriz por formar colonias blancas, planas, algo extendidas, bordes aserrados y con un brillo metlico; otras colonias de color amarillo, secas, duras. Estos hallazgos preliminares permitieron continuar con los ensayos correspondientes a una seleccin secundaria en cultivo sumergido que se hizo en tubo con caldo de soya triptica, sales biliares y petrleo al 1%, seleccionndose los cultivos que mostraron crecimiento expresado en turbidez del medio a 37C por 48 horas, siendo subcultivados en medio fresco e incubados en las mismas condiciones; finalmente se sembraron en caldo mnimo de sales ms petrleo 1 % y solo 5 cultivos tuvieron crecimiento. Al evaluar su comportamiento bioqumico mediante las pruebas indican una identificacin preliminar que son bacilos pequeos, aerobios, Gram negativos, catalasa y citrato positivo y crecimiento en caldo nutritivo a 42 C; caractersticas que corresponden al gnero Pseudomonas en cada una de las muestras analizadas, resaltando su capacidad de crecer en el ambientes contaminados con petrleo en las condiciones ensayadas; por consiguiente se destaca la viabilidad de la bacteria en las muestras recolectadas as como despus de evaluar su crecimiento con petrleo en medio sumergido, proponiendo su evaluacin posterior en biorreactores agitados. Palabras clave: Bacterias hetertrofas, Pseudomonas, Degradadoras de petrleo.

ABSTRACT
Bacterial cultures were isolated from soils of Oleocentros of the city of Trujillo, Peru; soil samples collected from approximately 20 cm depth were subjected to the incubation of pre-enriquecimiento for 5 days with oil 0.5% and incubated at room temperature. Then prepared serial dilutions to 10 -2 and they were seeded 0.1 ml of the two latest dilutions on nutrient agar surface with handle method. The isolated heterotrophic population was characterized by forming colonies white, flat, somewhat extended, edges serrated with a

metallic sheen; other colonies of yellow colour, dry, hard. These preliminary findings enabled to continue corresponding to a secondary selection tests in submerged culture which became in tube with soy broth media, bile salts and oil 1%, by selecting the crops that showed growth expressed in turbidity of the medium at 37 C for 48 hours, to be subcultured amid conditions and incubated under the same conditions; finally planted in stock sales than more oil 1% and only 5 crops were growing. To be evaluated by biochemical behavior evidence suggests a preliminary identification that are small bacilli, aerobic, Gram-negative, catalase and citrate positive and growth in nutrient broth at 42 C; features that correspond to the genus Pseudomonas in each of the samples analyzed, highlighting its ability to grow in the environment contaminated by oil in the tested conditions; therefore highlights the viability of the bacteria in samples collected and after assessing its growth with oil immersed in the middle, proposing its ex-post evaluation in stirred bioreactors. Key words: Heterotrophic bacteria, Pseudomonas, Petroleum based.

INTRODUCCIN Desde un punto de vista ambiental, las bacterias son muy importantes, pues tienen la capacidad de transformar una gran variedad de contaminantes orgnicos e inorgnicos a sustancias inocuas, que pueden ser reciclados al medio ambiente y tambin de aquellas bacterias que tienen la capacidad de oxidar una gran cantidad de compuestos orgnicos producidos y utilizados industrialmente1. Se estima que de todos los microorganismos presentes en el suelo, las bacterias son aquellas que se presentan en un mayor nmero y tambin las ms importantes en la degradacin de hidrocarburos2. La mayora de las clulas procariotas son hetertrofas; es decir, consiguen su alimento incorporando materia orgnica formada por otros seres vivos, disminuyndolos de los ecosistemas, mediante catabolismos aerbios o anaerbios (fermentaciones), muchas de las cuales son tiles para nuestros propsitos. Por ejemplo existe una gran variedad de microorganismos identificados en la degradacin de compuestos derivados del petrleo3, destacando el gnero Pseudomonas que est constituida por bacterias tipo bacilar Gram negativos, con flagelo polar, catalasa positivos y no forman esporas, demuestra una gran diversidad metablica, y consecuentemente son capaces de colonizar un amplio rango de nichos, siendo aislado tanto en suelos limpios como en suelos contaminados por productos biognicos y xenobiticos, tambin son microbiota predominante en la rizsfera y en la filsfera de plantas; del mismo modo, se han aislado de ambientes acuticos, tanto de agua dulce como de aguas marinas. El petrleo crudo, contiene varias clases de componentes hidrocarbonados que pueden ser clasificados en 4 grupos: saturados, aromticos, resinas y asfaltenos4. Los componentes del petrleo que tienen efectos ms nocivos, son los hidrocarburos aromticos, puesto que algunos actan como txicos agudos y otros, como el benzopireno, tienen actividad carcinognica5. La biodegradacin de hidrocarburos en suelos, es una alternativa que puede emplearse tanto para el tratamiento, como para la disposicin final de los residuos producidos por las refineras del petrleo 6. Las bacterias requieren de una amplia rea de contacto entre ellas y el petrleo, para llevar a cabo, la emulsificacin del petrleo en el medio acuoso circundante7. Loplito8 llev a cabo experimentos de biodegradacin de hidrocarburos utilizando diferentes sustratos como el petrleo, kerosene, aceite lubricante y benceno, y como nutriente un medio mnimo y fertilizante foliar comercial, concluyendo que la inoculacin previa acelera el proceso de degradacin. En tanto que, Acua y col9 observaron que es posible la realizacin de un proceso de biodegradacin de hidrocarburos en la muestra de suelo apoyado por las caractersticas fsicas y qumicas estudiadas en la muestra de suelo, as como, por la composicin de la comunidad bacteriana, que demostr capacidad de producir biomasa en presencia de petrleo, gasoil, kerosn y aceite lubricante. El proceso de biorremediacin aerobia de suelo contaminado con hidrocarburos de petrleo, a nivel laboratorio y piloto, alcanz tasas de remocin del 66 al 93 %, donde el mejor tratamiento fue el que contena lodos residuales (bioslidos) como fuente alterna de nutrientes. La mineralizacin o madurez de los lodos influy en la tasa de remocin de hidrocarburos, entre ms frescos mayor

remocin. La densidad fue tambin un factor importante para aumentar el porcentaje de degradacin11. El inters de la investigacin fue en primer lugar, lograr el aislamiento de una poblacin bacteriana nativa con capacidad de utilizar el petrleo como fuente de carbono para su desarrollo y crecimiento a partir de suelos contaminados; y en segundo lugar, seleccionar un cultivo bacteriano con una gran capacidad de adaptacin para crecer en condiciones de cultivo sumergido en un medio mnimo de sales complementado con petrleo al 1% dentro de un biorreactor agitado. Quedando finalmente, continuar con investigaciones posteriores para trabajar en el mejoramiento gentico y buscar su aplicacin in situ. MATERIAL Y MTODOS Recoleccin de las muestras de suelo Se recolectaron muestras de suelo contaminados, aproximadamente 20 cm de profundidad, de dos grifos de la ciudad de Trujillo en bolsas de primer uso, rotulado y llevado al laboratorio de Fisiologa y Gentica Bacteriana. Pre-enriquecimiento de las muestras A las muestras recolectadas se les coloc en recipientes plsticos de primer uso y se adicion petrleo al 0.5 %, se homogeniz con una esptula y se incub por 5 das a temperatura ambiente. Aislamiento de cultivos nativos Se pes 10 g de muestra en un matraz y se adicion 40 ml de agua destilada estril, se agit manualmente por 10 minutos, se dej en reposo por 15 minutos. Seguidamente se trasvas 1 ml del sobrenadante, en tubos de conteniendo 9 ml de solucin salina fisiolgica estril y finalmente una segunda dilucin en similares condiciones. Se sembr 0.1 ml de la dilucin en agar nutritivo por el mtodo de superficie con asa de Drigalsky, e incub a 37C por 48 h. Caracterizacin de los cultivos aislados A. Morfolgica Se realiz una caracterizacin macroscpica, por medio de la observacin de la morfologa de las colonias en un estereoscopio; a dems se realiz una tincin Gram de las colonias aisladas. Luego se procedi a rotular cada cultivo con un cdigo FGB seguida de un nmero secuencial. B. Fisiolgica Se sembr el cultivo puro en agar nutritivo por la tcnica en camada y se incub a 37C por 24 h. Se cosech la poblacin con SSFE y se coloc 1 ml de inculo, con una turbidez equivalente al tubo n 1 del Nefelmetro de Mac Farlan, a 8,9 ml de caldo soya triptica, sales biliares 0.5 ml (2 g/30 ml) y 1.0 ml de petrleo; se homogeneiz por agitacin manual por 5 min y se incub a 37C por 48 h. Se eligieron los cultivos que mostraron turbidez en el medio y se hicieron siembras en agar soya triptica ms petrleo 1 % y se incub a 37C por 48 h. Cada cultivo fue centrifugado y lavado con solucin salina fisiolgica y se prepar suspensiones bacterianas equivalentes al tubo n 1 del nefelmetro de Mac Farland. Luego, se prepararon tubos de ensayo con 8.9 ml de medio minino de sales (MgSO4,0.1 g; NH4Cl,0.5 g, Ca2Cl,0.8 g; H2K PO4, 0.1 g; NaCl, 0.3 g; 200 ml de agua destilada), y se suplement con 0,1ml de petrleo Diesel y 0,5 ml de solucin de sales biliares (2g en 30 ml); y, finalmente se adicion 1 ml de la suspensin bacteriana a evaluar. Se homogeneiz manualmente por 5 min y se incub a 37C por 5 das. Cada uno de los cultivos fueron sembrados en agar sale minerales con 1% de petrleo en superficie e se incub a 37C por 48 h y se aislaron cultivos puros en agar nutritivo inclinado con petrleo. Identificacin de los cultivos seleccionados Se hicieron tinciones Gram y las pruebas bioqumicas de catalasa, hemlisis, crecimiento en agar citrato, TSI, crecimiento a 42oC19.

RESULTADOS Se hallaron cocos y bacilos, Gram (+), cuyas colonias se caracterizan por ser planas, brillantes o cremas y planas (Tabla 1, Fig. 1). Cuando se hizo el cultivo en medio lquido, apareci turbidez variable, aspecto de nata, con ascenso de micelio mayormente rpido y slo dos cultivos pigmentados, asimismo, se determin que son catalasa (+), hemlisis mayormente positivos y solo dos con pigmentacin positiva (Tablas 2 y 3)
Tabla 1. Morfologa macro y microscpica de las bacterias aisladas de muestra de suelo contaminado provenientes de grifos de la ciudad de Trujillo, Per. Parmetro Cultivo FGB DP 1 2

10

Morfologa Mediana, Mediana, Mediana, Grande, Mediana, Grande, Pequea, Grande, plana, plana plana plana plana, plana plana, de colonia plana, brillante, brillante, brillante, brillante, Brillante, blanca Irregular crema amarilla amarilla blancas blanca Blanca crema Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Gram Coco Coco Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo Forma Leyenda: FGB DP: Fisiologa y Gentica Bacteriana Degradador Petrleo

Grande, Grande, plana, plana, crema crema Negativo Negativo Bacilo Bacilo

Tabla 2. Caractersticas de crecimiento en medio lquido con petrleo 1 % de las bacterias aisladas de la muestra de suelo contaminado de oleocentros de la ciudad de Trujillo, Per. Par-metro Turbidez Aspecto Cultivo FGB DP 1 2 + + Nata y Nata sediment o amarillo Rpido deRpido ++ -

3 + Nata

4 ++++

5 ++

6 +

7 +

8 +

Ascenso micelas Pigmentaci n verde

Rpido +

Nata Nata y sedimen to Lento Rpido +++ -

Nata Nata Nata y y sedim sedim ento ento Rpido Lento Lento -

9 10 ++ ++ ++ Nata Nata y sedim ento Lento Lento -

Tabla 3. Caracterstica bioqumica de las bacterias aisladas de la muestra de suelo contaminado de grifos de la ciudad de Trujillo, Per, con capacidad de crecer en medio en medio lquido con petrleo 1% . Parmetro Catalasa Hemlisis TSI Crecimiento a 42oC Cultivo FGB DP 1 2 3 + + + + K/K K/K K/K -

4 + + K/K +++

5 + + K/K -

6 + + K/K -

7 + K/K -

8 + K/K -

9 + + K/K -

10 + + K/K +

DISCUSIN En los ltimos aos, la ecologa microbiana ha direccionado esfuerzos en determinar los microorganismos capaces de adaptarse y de explorar hbitats contaminados; para ello, han sido desarrollados estudios de diversidad, dinmicas poblacionales y de comunidades presentes en suelos contaminados, especialmente aquellas relacionadas con asociaciones de bacterias

biodegradadoras11. Por lo que los hallazgos logrados por investigaciones sucesivas 12,13,14 para evaluar la microflora presente en los ambientes contaminados constituyndose en una fuente adecuada para el aislamiento de microorganismos con mejores capacidades de degradar los hidrocarburos, los mismos que son evaluados in vitro, mejorados genticamente, y posteriormente lograr su aplicacin in situ para menguar la problemtica ambiental.

Fig. 1. Placa Petri con agar nutritivo, donde se observa la poblacin hetertrofa aislada de la muestra de suelo contaminado proveniente de grifos de la ciudad de Trujillo (izquierda) y observacin microscpica del cultivo FGB DP 4, seleccionado con capacidad de crecer en petrleo, aislado de muestra de suelo contaminado de grifos de la ciudad de Trujillo (derecha).

En la fase de aislamiento utilizando petrleo diesel como fuente de carbono y energa, permiti seleccionar bacilos, que tenan una colonia de tamao mediana y grande, planas brillantes blancas; y cocos Gram negativos, que formaron colonias de tamao mediano, planas, brillantes, amarillas, en cada una de las muestras evaluadas como se indica en la Tabla 1, se indican los 10 cultivos bacterianos seleccionados en el ensayo de crecimiento en medio Agar nutritivo mas petrleo 1 %. Resultados relativamente similares a los obtenidos por Passos y cols13, que investigaron la poblacin bacteriana autctona de efluentes petroqumicos del municipio de Fortaleza, Brasil; utilizando agar nutritivo, encontraron caractersticas morfolgicas de todas las colonias de la primera coleccin presentaban un aspecto cremoso, consistencia mucosas y de coloracin amarillenta, pero que frente a la coloracin Gram fueron Gram-positivos y de forma de cocobacilar. Los cultivos de 48 h de incubacin presentaron abundante crecimiento con morfologas de colonias brillantes grandes y algunas pequeas, borde continuo, cremosas, convexas y coloracin amarilla. De las colonias aisladas fueron seleccionadas 10 colonias con crecimiento abundante y fueron sembradas en agar sale minerales con 1% de petrleo, tal como se presenta en otras investigaciones y tuvieron crecimiento en la totalidad lo que significa que las bacterias utilizan el petrleo como fuente carbonada y energa para su crecimiento y desarrollo. Entre los cultivos seleccionados, el cultivo FGB DP4 se caracteriz por un crecimiento abundante en el medio lquido con petrleo a las 72 h de incubacin, tuvo una pigmentacin color verdoso y con la bioqumica realizada se presume posible bacteria del gnero Pseudomonas15. En esta etapa, fue evidente la formacin de natas blanquecinas en la superficie del tubo (hbitat de biopelcula), la cual fue ms abundante al cuarto da de incubacin, mientras que las algunas muestras presentaron abundante turbidez, nata en la parte superior y formacin de sedimento, el cual se hizo mucho ms abundante el da quinto. Por lo tanto, el cultivo in vitro permiti aislar y seleccionar cultivos de Pseudomonas con caractersticas importantes de tener un buen crecimiento en petrleo en las condiciones ensayadas resultando excelentes para investigaciones cientficas posteriores. Este gnero es uno de los ms proclives a la degradacin de compuestos orgnicos, especialmente cepas de la especie

Pseudomonas putida16 por su amplio potencial catablico del gnero que viene dado en muchos

casos por la presencia de determinantes plasmdicos y transposones autotransmisibles17. Se seleccionaron hasta 5 cultivos con potencial catablico sobre el petrleo, resaltando la ubicuidad y capacidad de este gnero bacteriano para explotar una amplia variedad de nutrientes reflejando una adaptacin al medio ambiente que no encuentra semejanza con otros gneros bacterianos, siendo excelentes para investigaciones cientficas posteriores de biorremediacin de suelos y aguas18,20, pasando de pruebas de laboratorio a pruebas in situ, debido a que muchos factores ambientales podran afectar la habilidad de estas bacterias para degradar hidrocarburos en ecosistemas contaminados. CONCLUSIN Los suelos contaminados con petrleo presentan una poblacin hetertrofa propia, logrndose aislar y seleccionar cultivos con caractersticas del genero Pseudomonas capaces de crecer en un medio mnimo de sales suplementado con petrleo al 1 % en cultivo sumergido REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
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