CATABOLISMO Y ANABOLISMO OBJETIVO GENERAL Evaluar las propiedades metablicas de los microorganismos en cuanto sus capacidades para utilizar

de diferentes sustratos para derivar de ellos sus macro y micro elementos constitucionales as como la energa necesaria para el desarrollo de todas sus actividades de transporte, movimiento, transformacin, crecimiento y reproduccin. OBJETIVOS PARTICULARES Determinar el tipo de sustratos que un microorganismo es capaz de catabolizar (degradar) mediante la deteccin de productos derivados su degradacin. Evaluar la formacin de matabolitos especficos Analizar las habilidades metablicas de los microorganismo en medios de cultivo mnimos y enriquecidos

MATERIALES Cada grupo debe tener cada uno de los siguientes medios: Agar ALMIDON Agar CASEINA Agar DNAasa Agar Sulfur Indol Motility (SIM) Agar Triple Sugar Iron (TSI) en cua Agar Gelatina Nutritiva Agar CITRATO segn Simmons en cua Agar LISINA HIERRO Caldo Methyl Red Voges Proskauer (MRVP) Caldo UREA Caldo NITRITOS Caldo Base ROJO DE FENOL con tubo de Durham + CARBOHIDRATO (Glucosa, Fructosa, Manitol, Galactosa, Sacarosa, Lactosa, Maltosa) Agar TODO PROPOSITO TWEEN, o Agar MRS Agar Mineral M1 Agar Mineral M2 Agar Mineral M3 Asa Bacteriolgica Recta y Asa Bacteriolgica Redonda

MEDIO MINERAL COMPONENTE K2HPO4 KH2PO4 (NH4)2SO4 NH4Cl MgSO4 MgCl2 Glucosa Agar pH M1 (g/L) M2 (g/L) M3 (g/L) 7.0 7.0 7.0 2.0 2.0 2.0 1.0 1.0 0.1 0.1 0.1 5.0 5.0 5.0 15.0 15.0 15.0 6,5 6,5 6,5

AGAR ALMIDON Y CASEINA

* CASEINA (g/L) COMPONENTE ALMIDON (g/L) K2HPO4 7,0 7,0 KH2PO4 2,0 2,0 Triptona 5,0 5,0 Extracto de Levadura 3,0 3,0 ALMIDON 4,0 CASEINA 2,0 Glucosa 5.0 5.0 Agar 15.0 15.0 pH 6,5 8,0 *NOTA: El agar Caseina se esteriliza a 110C por 30 minutos.

REACTIVOS Reactivo de Kovacks Reactivo de Vogues Proskauer Reactivo de Rojo de Metilo Reactivos para nitritos No. 1 y No. 2 Limadura de Zinc Lugol Acido Actico al 10% (p/v) Acido Clorhidrico 0,1 N

MODELOS BIOLOGICOS Se emplearn cultivos en agar CASOY de 24 horas de incubacin de cada uno de los microorganismos: Micrococcus luteus Streptoccocus faecalis Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Bacillus subtilis Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Klebsiella pneumoniae Salmonella enteritidis Serratia marcescens Proteus vulgaris

Se emplearn cultivos en agar MRS de 48 horas de incubacin de cada uno de los microorganismos: Lactobacillus plantarum

PROCEDIMIENTO CATABOLISMO - Produccin De Exoenzimas Para esta actividad necesitaremos cultivos en agar CASOY de 24 horas de los siguientes microorganismos: a) Bacillus subtilis b) Staphylococcus aureus c) Escherichia coli d) Serratia marcescens e) Pseudomonas aeruginosa

Con ayuda de un asa bacteriolgica hacer inoculaciones en estra, como indica la figura, de cada uno de los microorganismos, sobre agar ALMIDON, CASEINA y DNAasa. Incubar a 37C durante 48 horas A la caja de Agar ALMIDON adicionar solucin de Lugol, esperar un minuto y evaluar la reaccin A la caja de Agar CASEINA adicionar solucin de cido actico, esperar un minuto y evaluar la reaccin A la caja de Agar DNAasa adicionar solucin de cido clorhdrico, esperar un minuto y evaluar la reaccin Los microorganismos capaces de producir exoenzimas capaces de degradar los polmeros para utilizarlos como sustrato y fuente de energa presentaran la formacin de un halo claro, de lo contrario el agar permanecer opaco alrededor del cultivo

Figura 1. Patrn de Inoculacin de los diferentes cultivos microbianos

Figura 2. Reaccin positiva para la produccin de exoenzima

CATABOLISMO Asimilacin de Sustratos Para esta actividad necesitaremos cultivos en agar CASOY de 24 horas de los siguientes microorganismos: a) b) c) d) e) f) Micrococcus luteus Streptoccocus faecalis Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Bacillus subtilis Escherichia coli g) h) i) j) k) Pseudomonas aeruginosa Klebsiella pneumoniae Salmonella enteritidis Serratia marcescens Proteus vulgaris

Cada grupo recibir una unidad de cada uno de los siguientes medios a) b) c) d) Agar SIM Agar TSI en cua Agar Gelatina Nutritiva Agar CITRATO segn Simmons en cua e) Agar LISINA HIERRO en cua f) Caldo MR VP g) Caldo UREA h) Caldo NITRITOS i) Caldo Base ROJO DE FENOL con tubo de Durham + CARBOHIDRATO (Glucosa, Fructosa, Manitol, Galactosa, Sacarosa, Lactosa, Maltosa)

A cada grupo de trabajo se le asignar un microorganismo para inocularlo en cada medio segn las indicaciones Agar SIM: Con un asa recta tomar un inculo de una colonia y aplicarla mediante picadura recta en el centro del agar Agar TSI: Con un asa recta tomar un inculo de una colonia y aplicarla mediante picadura recta en el centro de la columna y luego hacer estras sobre la cua. Agar Gelatina Nutritiva: Se realiza una inoculacin similar a la del agar SIM Agar CITRATO segn Simmons: Se realiza igual al agar TSI Caldo MRVP: Con un asa bacteriolgica redonda tomar inculo de una colonia y lo resuspende en el caldo, girando el asa entre el caldo Para los dems medios se aplica el mismo procedimiento aplicado al caldo MR-VP. Incubar a 37C por 48 horas, luego hacer la respectiva lectura e interpretacin de los resultados. Cada estudiante deber consultar y estudiar el anlisis e interpretacin de los diferentes resultados

PRUEBA DE SIM Requiere la adicin de dos gotas de Reactivo de Kovacks. A. Indol Positivo, Sulfuro Positivo, B. Indol Negativo, Sulfuro Positivo, C. Indol, Positivo, Sulfuro Negativo, Movilidad Positiva D. Control http://homepages.wmich.edu/~rossbach/bios312/LabProcedures/ PRUEBA DE TSI La prueba se lee de acuerdo a la reaccin de la columna y la cua COLUMNA ROJA ROJA ROJA y NEGRA ROJA AMARILLA AMARILLA Y RUPTURA DEL AGAR AMARILLA, NEGRA Y RUPTURA DEL AGAR AMARILLA CUA ROJA ROJA y NEGRA ROJA AMARILLA AMARILLA AMARILLA RESULTADO No Oxida, Ni Fermenta Sacarosa ni Lactosa, Aerobio No Oxida, Ni Fermenta Sacarosa ni Lactosa, Produccin de H2S , Aerobio No Oxida, Ni Fermenta Sacarosa ni Lactosa, Produccin de H2S, Facultativo Oxida Sacarosa y/o Lactosa, Aerobio Estricto Fermenta Sacarosa y/o Lactosa, Facultativo Fermenta Sacarosa y/o Lactosa. Produccin de Gas, Facultativo Fermenta Sacarosa y/o Lactosa. Produccin de Gas, Produccin de H2S, Facultativo Fermenta Sacarosa y/o LactosaAnaerobio

AMARILLA

ROJA

http://biology.clc.uc.edu/Fankhauser/Labs/Microbiology/Triple_Sugar_Iron/TSI_Use.htm

GELATINA NUTRITIVA La licuefaccin de la gelatina indica la produccin de gelatinasa A. Gelatinasa Positivo B. Gelatinasa Positivo C. Gelatinasa Positivo http://homepages.wmich.edu/~rossbach/bios 312/LabProcedures/

CITRATO segn Simmons La produccin del color azul indica la utilizacin de Citrato como fuente de carbono http://cienciasbiologicas.uniandes.edu.co/lema/archivos/u ploads/227.jpg

LISINA HIERRO AGAR A. Cua Violeta y Columna Violeta es Decarboxilasa Positivo B. Cua Violeta y Columna Amarilla es Decarboxilasa Negativo C. Cua Pardo y Columna Amarilla es Deaminasa Positivo D. La coloracin Negra es produccin de H2S http://www.scribd.com/doc/5203044/Medios -de-Cultivo-y-Pruebas-Bioquimicas

CALDO UREA Produccin de Ureasa cambia el medio de amarillo a purpura http://www.scribd.com/doc/5203044/Medios-de-Cultivo-y-PruebasBioquimicas

CALDO NITRATOS Despus de incubar se adicionan en su orden reactivo para nitritos 1 y reactivo para nitritos 2 A. Izquierda: Reaccin no concluyente B. Centro : Tubo Control C. Derecha: Reduccin de Nitrato a Nitrito (Positivo)

Se adiciona luego Limadura de Zinc a los tubos A y B A. Izquierda: No cambia entonces el Nitrato se redujo a cualquier otra forma de nitrgeno (N2 o amonio) (Positivo) B. Derecha: El tubo control se torna rojo Nitratos se redujeron a Nitritos por accin del Zinc (Negativo) http://homepages.wmich.edu/~rossbach/bios312/LabProce dures/Nitrate%20reduction%20results.html

CALDO MR VP Despus de incubar el caldo se fracciona y se toma un tubo para la adicin de solucin de Rojo de Metilo y otro para la adicin del reactivo de Voges Proskauer Rojo de metilo A. Si el medio vira de amarillo o mbar a rojo es una reaccin positiva B. Si el medio se mantiene inalterado es una reaccin negativa

Voges Proskauer Adicionar 0, 6 ml de reactivo de Voges Proskauer y homogenizar Adicionar 0,4 ml de KOH al 40% (p/v) A. Si el medio vira de amarillo o mbar a rojo es una reaccin positiva B. Si el medio se mantiene inalterado es una reaccin negativa http://cienciasbiologicas.uniandes.edu.co/lema/nodo.php?id=39

CALDO BASE ROJO DE FENOL + CARBOHIDRATO CON CAMPANA DE DURHAM Despus de incubar se evala la reaccin A. Viraje a amarillo con formacin de Gas (Positivo). Asimilacin del carbohidrato empleado con produccin de gas B. Viraje a amarillo sin formacin de Gas (Positivo). Asimilacin del carbohidrato empleado sin produccin de gas C. Tubo Control sin inocular D. Viraje a Rojo ms intenso (Negativo). No asimila el carbohidrato E. No hay viraje pero si crecimiento a expensas de los otros componentes del medio (Negativo) http://homepages.wmich.edu/~rossbach/bios312/LabProcedures/Phenol%20Red%20Results.h tml

ANABOLISMO Capacidad de Formacin de Biomasa Para esta actividad necesitaremos cultivos de Escherichia coli en agar CASOY de 24 horas 37C y Lactobacillus plantarum en agar MRS de 24 a 48 horas a 37C Cada grupo recibir una unidad de cada uno de los siguientes medios de cultivo: Agar TODO PROPOSITO TWEEN, o Agar MRS Agar Mineral M1 Agar Mineral M2 Agar Mineral M3 Con ayuda del asa bacteriolgica redonda tomar un inculo del cultivo de E. coli y hacer una estria sobre cada uno de los medios suministrados. De la misma manera se procede con L. plantarum. En la figura 4.

Figura 4. Inoculacin para ensayo de anabolismo Incubar las cajas a 37C por 48 horas Cada estudiante deber consultar y estudiar el anlisis e interpretacin de los diferentes resultados

LOS ESTUDIANTES DEBERAN CONSULTAR LAS BASES Y PRINCIPIOS BIOLOGICOS Y QUIMICOS DE TODAS LAS ACTIVIDADES EVALUDAS EN ESTA GUIA