UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

ANALISIS FITOQUIMICO Y CARACTERIZACION PARCIAL DE COMPUESTOS CON ACTIVIDAD ESTIMULADORA SOBRE MACROFAGOS Y / O ACTIVIDAD ANTIMICROBLANA EN EXTRACTOS DE RAIZ, TALLO Y HOJA DE Cmlowrightia cordifolia A. GRAY.

Como requisito parcial para obtener el Grado de DOCTOR EN CIENCIAS con Especialidad en Biotecnologa

MARZO DEL 2002

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UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

ANLISIS FITOQUMICO Y CARACTERIZACION PARCIAL DE COMPUESTOS CON ACTIVIDAD ESTIMULADORA SOBRE MACRFAGOS Y/O ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA EN EXTRACTOS DE RAZ, TALLO Y HOJA DE Carlowrightia cordifolia A. GRAY.

Aprobacin de la Comisin de Tesis

Dra. Ma.J'ere&a Gjohizle^ Gaza y Barrn Director externo

-^lDra. Ma Julia Verde Star Director interaoy

Dra. Lilia Hortensia Morales Ramos

//
Dra. Catalina Rivas Morales

Dra. Adriana Elizondo Herrera

ESTE TRABAJO DE INVESTIGACIN

FUE REALIZADO EN:

Instituto Mexicano del Seguro Social Centro de Investigacin Biomdica del Noreste Divisin de Biologa Celular y Molecular

Universidad Autnoma de Nuevo Len Facultad de Ciencias Biolgicas Laboratorio de Fitoqumica

RESUMEN

Una de las plantas ms utilizadas en la medicina tradicional en Mxico es la "rnica9, que se utiliza principalmente en lesiones de la piel, traumatismos, golpes e inflamaciones. Su nombre vulgar es derivado de su similitud teraputica con Arnica montana, una planta europea utilizada para los mismos fines y aceptada en la Farmacopea Europea, la cual tiene amplia difusin tanto en Europa como en Norteamrica. En nuestro pas el nombre de rnica no se aplica a una sola especie, existen ms de 20 especies que se denominan con ese nombre. A pesar de utilizarse extensamente existen pocos estudios que corroboren su efecto farmacolgico. En el Estado de Nuevo Len la especie utilizada como "rnica9 pertenece a la familia Ac&nthaceae y se identific como Carlowrightia cordifoiia A. Gray, vouche 11710 del Herbario IMSSM. Dentro del sistema de defensa del organismo los macrfagos juegan un papel importante en la inmunidad inespecfica por su habilidad para ingerir y destruir bacterias, clulas deterioradas o clulas tumorales, para que esto sea posible, es necesario que se encuentren en un estado de activacin, en el cual liberan gran cantidad de compuestos txicos, entre ellos derivados del xido ntrico (NO). Recientemente se ha reportado que el NO tiene efectos tanto inflamatorios como antiinflamatorios ya que acta como un autorregulador. Debido a los efectos antiinflamatorios y antispticos de C. cordifoiia, podra ser que alguno de sus compuestos afecten la actividad de macrfagos, y/o sintetice compuestos con efecto antiparasitario. El objetivo de este trabajo fue efectuar la caracterizacin parcial de los compuestos con actividad biolgica de extractos de raz, tallo y hoja de C. cordifoiia. Los resultados mostraron, que solo los extractos metanlicos y hexnicos de hoja, estimularon macrfagos con produccin cte NO, la cual fue significativa: 92.8 y 156.6 jjM (p< 0.001); lo que podra contribuir a los mecanismos antiinflamatorios atribuidos a C. cordifoiia, esto es considerando los efectos autorreguladores de la inflamacin que ejerce el aumento de ia concentracin de NO, ya que se conoce que el aumento de la concentracin de NO inhibe al factor N-kappa, responsable de la transcripcin de la enzima iNOS y el receptor de membrana VCAM1 ambos directamente involucrados en el proceso inflamatorio. Los extractos metanlico y acuoso de hoja, presentaron actividad antiambica sobre Entamoeba histolytica. Los extractos de hoja, tambin mostraron actividad antimicrobiana y esta fue relevante en el extracto hexnico, sobre Safmonella Sp y Candida albicans, lo que justifica su utilizacin como antisptico. Las pruebas qumicas dieron positivas para saponinas esferoides y triterpenos.

SUMMARY

One of the most used plants in the traditional medicine in Mexico is the "arnica" that it is used mainly in skin injuries, traumatisms, bumps and inflammations. Its vulgar name is derived from its therapeutic similarity with Arnica montana, a European plant used for the same purposes and accepted in the European Pharmacopoeia, having wide diffusion as much in Europe as in North America, tn our country the name of arnica doesn't apply to a single species, there are more than 20 species that are denominated with that name. In spite of a widely use, there are few studies that corroborate their pharmacological efFect. In the Northeastern of Mexico (Nuevo Leon) the arnica species belongs to the Acanthaceae family identified as Carlowrightia cordifolia A. Gray, vouched 11710, IMSSM Herbarium. Inside the organism defense system, macrophages play an important role in the unspecific immunity for its ability to ingest and destroy bacteria, damaged cells or tumor cells. To make this possible, it is necessary that they be in a state of activation in which they liberate a great amount of toxic compounds, among them those derived of the nitric oxide (NO). Recently it has been reported that the NO has inflammatory and anti-inflammatory effects since it acts as a selfregulator. Due to C. cordifolia anti-inflammatory and antiseptic effects, and that some of their compounds affect the macrophage activity and synthesized compounds with anti-parasitical effect. The aim of this study was to make a partial compound characterization with biological activity of C. cordifolia stem and leaf extracts. Results showed that only methanol and hexane extracts from leaves, stimulated macrophages with NO production, turned out important; 92.8 and 156.6 pM (p< 0.001); this could contribute to anti-inflammatory mechanisms attributed to C. cordifolia. This is considering the self-regulatory inflammation effects that develop an increase of NO concentration, since it is known that the increase of NO concentration inhibits the N-kappa factor, responsible for the transcription of the iNOS enzyme and VCAM1 membrane receptor, both directly involved in the inflammatory process. The methanol and aqueous extracts of leaves presented anti-amoebic activity on Entamoeba histolytica trophozoites. Leaf extracts also showed antibacterial activity mainly in the hexane extract on Salmonella Sp and Candida Albicans that justify its use as antiseptic. Chemical tests turned out positives for saponines, steroids and triterpenes.

DEDICATORIA

>4 mis hijos:

Mis grandes amores y mayor motivacin para seguir adelante.

A mis padres:

Por su gran cario y por ei ejemplo a seguir como personas con enormes deseos de superacin, gran calidad moral y eterno apoyo..

A mis hermanos:

Por su cario y apoyo en todo momento.

AGRADECIMIENTOS

Quiero expresar mi eterno agradecimiento a:

Dra. Mara Teresa Gonzlez Garza y Barrn y Dra. Mara Julia Verde Star. Asesoras de mi tesis y apoyo primordial en el inicio de mi carrera en investigacin, por creer en mi y por el apoyo constante en la realizacin de este trabajo. Dra. Catalina Rivas Morales, Dra. Lilia Hortensia Morales Ramos y Dra. Adriana Eiizondo Herrera. Por formar parte del Comit de Tesis, por sus valiosas sugerencias e inters en la revisin del presente trabajo. Dra. Azucena Oranday. Por sus apreciables enseanzas. MCP Noe Salinas. Por su importante participacin en la seleccin y colecta de la planta en estudio. QFB Lorena Siller Campos, Dra. Ma. de los Angeles Verstegui, M.C. Gerardo Lozano Garza, QBP Yesenia Silva Belmares y MHJ. Antonio Luna de la Rosa. Por su apoyo significativo en el desarrollo de este proyecto. Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa por el soporte econmico para la realizacin de mi doctorado. Centro de Investigacin Bomdicas deI Noreste del IMSS, por el apoyo recibido para el desarrollo de este estudio. Todos mis amigos. Que contribuyeron de una forma u otra en ia realizacin de este trabajo.

TABLA DE CONTENIDO

Pgina

1. INTRODUCCIN 2. ANTECEDENTES . . . 2.1 Aspectos generales . . . . 2.1.1 Anlisis qumicos . . . . 2.1.2 Propiedades farmacolgicas ' 2.1.3 Planteamiento del problema . . 2.1.4 Clasificacin Botnica de C. cordifolia . 2.1.5 Antecedentes de la familia Acantfiaceae 2.1.6 Originalidad y Justificacin 2.2 Hiptesis 2.3 Objetivos 3. . . . .

1 5 5 11 12 14 16 17 19 21 21 23 23 24 24 28 30 30

MATERIALES Y METODOS 3.1 Origen de los reactivos . . . . . 3.2 Material vegetal 3.3 Material biolgico . . . . . . 3.4 Preparacin de los extractos . . 3.5 Bioensayos.... 3.5.1 Activacin de macrfagos . . . . 3.5.2 Determinacin de la produccin de NO como efecto de los extractos sobre macrfagos peritoneales de ratn . . . . 3.5.3 Determinacin de NO por el mtodo de Griess. 3.5.4 Determinacin de actividad antimicrobiana 3.5.5 Determinacin de actividad antiamibiana 3.6 Mtodos de Identificacin . . . . 3.6.1 Pruebas qumicas . . . . . 3.6.2 Cromatografa en capa delgada . . . 3.6.3 Revelado en placas cromatogrficas

30 31 32 34 35 35 38 40 42 42

4. RESULTADOS 4.1 Extractos obtenidos . . . . 4.2 Actividad estimuladora de los extractos sobre

macrfagos en ausencia de LPS 4.3 4.4 4.5 4.6 Efecto de los extractos sobre macrfagos en presencia y ausencia de LPS Actividad antimicrobiana . Actividad antiamibiana Caracterizacin parcial

43

46 49 51 54 68

5. DISCUSION 6. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 6.1 Conclusiones. 6.2 Recomendaciones ,

75 76

REFERENCIAS

77

PUBLICACIONES PRODUCIDAS A. Delia E. Cruz-Vega, Abigail Aguilar, Jorge Castro-Garza, and Ma. Teresa Gonzlez-Garza. Anti-amebic activity of aqueous extracts from five medicinal from plants northeastern Mexico. Archives of Medical Research 2000; 31:S17-S18. Delia E. Cruz-Vega, Abigail Aguilar, Ma. Julia Verde-Star, Javier Vargas-Villarreal, and Ma. Teresa GonzlezGarza. Leaf extracts of Carfowrightia cordifolia induce Macrophage nitric oxide production. Life Sciences 2002; 70(11):1279-1284.

86

B.

LfSTA DE TABLAS
TABLA Pgina

1. Plantas utilizadas en medicina tradicional en Mxico, registradas bajo el nombre popular de rnica 2. Lista de cepas bacterianas y levadurformes utilizadas.... Caractersticas de las placas cromatogrficas Produccin de oxido ntrico (pM) por macrfagos peritoneales de ratn en presencia de extractos de C. cordifolia . . . . . . Efecto de extractos de C. cordifolia en la produccin de NO(pM) en cultivos de macrfagos en presencia y ausencia de LPS Resultados de actividad antimicrobiana de extractos de C. cordifolia . . . . . . . Resultados del porciento de inhibicin de crecimiento de los extractos de C. cordifolia sobre E. histolytica Resultados de las reacciones qumicas efectuadas a los extractos metanlico y hexnico de hoja de C. c o r d i f o l i a . . . . . . . . Resultados de la cromatografa en capa delgada, del extracto metanlico de hoja de C. cordifolia observada a la luz visible . . . . . Resultados de la cromatografa en capa delgada, del extracto hexnico de hoja de C. cordifolia, revelado con luz ultravioleta .

10

26 39

3. 4.

44

5.

47

6.

50

7.

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8.

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10.

58

11.

Resultados de la cromatografa en capa delgada, del extracto metanlico de hoja de C. cordifolia revelado con luz ultravioleta . . . . .

59

12.

Resultados de la cromatografa en capa delgada, del extracto hexnco de hoja de C. cordifolia revelado con reactivo de Liebermann-Buchard . . .

61

13.

Resultados de la cromatografa en capa delgada del extracto metanlico de hoja de C. cordifolia revelado con reactivo de Liebermann-Buchard

62

14.

Resultados de la cromatografa en capa delgada del extracto metanlico de hoja de C. cordifolia, revelado con reactivo de cloruro de antimonio (SbCb) Resultados de la cromatografa en capa delgada del extracto hexnco de hoja de C. cordifolia, revelado con reactivo de cloruro de antimonio. .

65

15.

65

LISTA DE FIGURAS

FIGURA

Pgina

1.

Fotografa de C. cordifolia, una de las plantas utilizadas corno rnica en la regin del norte Grfica de la produccin de NO (^iM) por macrfagos peritoneales de ratn en presencia de extractos de C. cordifolia . . . . . . . Grfica del efecto de extractos de C. cordifolia, en la produccin de NO (fjM) en cultivos de macrfagos en presencia y ausencia de LPS. . . . . Efecto inhibitorio de los extractos de C.cordifolia sobre E. histolytica Cromatograma de los extractos hexnico y metanlico de hoja de C. cordifolia. Observado con luz visible . Separacin cromatografica del extracto hexnico y metanlico de hoja de C. cordifolia, revelado con luz ultravioleta. . . . . . . Separacin cromatogrfica del extracto hexnico y metanlico de hoja de C. cordifolia, revelado con reactivo de Liebermann-Buchard. . .

15

2.

45

3.

48

4.

53

5.

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7.

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8.

Separacin cromatogrfica de los extractos hexnico y metanlico de hoja de C. cordifolia, revelado con cloruro de antimonio, observado con luz visible Separacin cromatogrfica de los extractos hexnico y metanlico de hoja de C. cordifolia, revelado con cloruro de antimonio, observado con luz ultravioleta.

66

9.

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ABREVIACIONES Y SIMBOLOS UTILIZADOS

A ce!
CI50

C. cm ED EtOH etal DMSO DTH

g h H3PO4 Hex H. IMSS IMSSM NOs 1 L-B LPS MeOH mi mm NaN0 2 NF-kB NaOH

- Arnica - clula - concentracin inhibitoria 50 - Carlowrightia - centmetros - dosis efectiva - etanlico - y colaboradores - Dimetil sulfxido - respuesta de hipersensibiliadad tarda - gramos - hora - Acido fosfrico - hexnico - Heterotheca - Instituto Mexicano del Seguro Social - Herbario del IMSS - Oxido ntrico sintasa, inducible - litro - LiebermannBurchard - lipopolisacridos - metanlico - mililitros - milmetros - Nitrito de sodio - Factor nuclear kappa B - Hidrxido de sodio

NO OMS PBS PH PMA Rf SbCI3 sp UANL

UFC

Vis Xg

%
\M Mi M9 C

- Oxido ntrico - Organizacin Mundial de la Salud - amortiguador de fosfatos salino - Potencial de hidrgeno - acetato de forbol miristato - Relacin de frentes - Cloruro de antimonio - especie - Universidad Autnoma de Nuevo Len - unidades formadoras de colonias - visible - gravedad - porciento - micromolar - microlitro - microgramo - grados centgrados

1. INTRODUCCION

En la ltima dcada la utilizacin de la herbolaria medicinal ha retomado especial importancia, bajo el enfoque de una nueva biotecnologa, que augura revolucionar el mundo de los medicamentos provenientes de plantas (Wagner, et al., 1985; Schultes, et al., 1972). Este renacimiento de la herbolaria se acompaa tambin con el descubrimiento de propiedades curativas y conceptos farmacodinmicos novedosos, reincorporando muchos recursos vegetales que fueron vistos como placebos en el campo farmacutico del pasado (Farnsworth, et al., 1985).

Actualmente, se ha estimado que el 60% de las drogas en desarrollo que se encuentran en ensayos clnicos, son de origen natural, y la gran mayora de stas no son econmicamente sintetizares, por lo que todava son obtenidas de cultivos silvestres (Yue-Zhong, 1998).

El inters de las drogas de origen vegetal es debido a varias razones, la medicina convencional puede ser ineficiente, debido al abuso y/o uso incorrecto de sta, originando efectos secundarios y drogo-resistencia, adems de que un

gran porcentaje de la poblacin mundial, no tiene acceso al tratamiento farmacolgico convencional, mientras que la medicina tradicional y los conocimientos etnobotnicos sugieren que estos productos no son inofensivos. Sin embargo el uso de estas substancias no siempre est autorizado por autoridades legales, debido a que se prescriben los productos fitomedicinales y son distribuidos comercialmente, sin control de calidad en su produccin, lo que tiene repercusin en su eficacia (Rates, 2001).

La Organizacin Mundial de la Salud (OMS) considera a la fitoterapia en sus programas de salud, y sugiere procedimientos bsicos para la validacin de drogas de origen vegetal dentro de su desarrollo (Vulto and Smet, 1998).

Pases asiticos como China e India tienen bien establecida su industria de plantas medicinales. Por otro lado, los pases latinoamericanos estn invirtiendo en programas de investigacin de plantas medicinales, por medio de estandarizacin y regulacin de los productos fitomedicinales, siguiendo el

ejemplo de pases europeos tales como Francia y Alemania. En ste ltimo pas el 50% de los productos fitomedicinales son vendidos con prescripcin medica, y el costo es cubierto por las compaas de seguros (Gruenwald, 1997).

En Norteamrica los productos fitomedicinales son vendidos como "alimentos saludables" (Gruenwald, 1997; Calixto, 2000). Los consumidores y profesionales se han esforzado para modificar esto, solicitando informacin acerca de la eficacia y seguridad de estos productos. Esto ha dado lugar a una

nueva pauta para su registro, con supervisin como es el caso en Estados Unidos de Amrica por la Food and Drug Administration (FDA), Organismo que regula los medicamentos de patente (Rates, 2001).

Resumiendo, el contexto moderno, social y econmico visto en los servicios de salud, la carencia de falta de mercado farmacutico y el

reconocimiento de la investigacin sobre las plantas medicinales usadas en la medicina tradicional, ha originado un satisfactorio acercamiento para el desarrollo de nuevas drogas, reflejndose esto en un incremento del nmero de publicaciones en este campo, adems de que instituciones

gubernamentales y privadas alrededor del mundo se interesen, y sean las que apoyan financieramente, programas de investigacin en este rubro (Calixto, 1996).

En Mxico, e! conocimiento de las propiedades curativas de las plantas es utilizado permanentemente entre las poblaciones indgenas, y las plantas medicinales constituyen el recurso ms grande y valioso de la medicina

Tradicional Mexicana (Lozoya, 1976).

En el mbito nacional el inters en el medio cientfico y mdico en relacin con el estudio de la Medicina Tradicional y de las plantas medicinales tambin se ha incrementado recientemente. Aunado a esto, se encuentra la situacin provocada por la crisis econmica del pas, donde ios costos de medicamentos de patente hacen cada vez ms difcil su adquisicin. Todo esto

lleva a la conviccin de que ios recursos vegetales del pas deben ser estudiados, para medicamentos. de esta manera afrontar las carencias y costos de los

Existe una

gran cantidad de plantas registradas y clasificadas

taxonmicamente en los diferentes herbarios del pas, donde adems se ha tomado en cuenta el conocimiento popular, y se ha interrogado en forma programada sobre su uso a curanderos, chamanes y hierberos. Sin embargo, an existe un gran nmero de plantas que a pesar de que su uso es popular, no se encuentran incluidas en dichos acervos.

Por otra parte, en la mayora de los casos, la comprobacin cientfica de su valor teraputico no existe, ni se conocen los componentes qumicos responsables de la supuesta accin farmacolgica. Es por ello que el anlisis de aquellas plantas utilizadas en medicina tradicional resulta importante, ya que permitir comprobar si efectivamente tienen un valor teraputico,

caracterizar el o los compuestos responsables de esa actividad y dilucidar su mecanismo de accin.

2. ANTECEDENTES

2.1

Aspectos generales de la plantas medicinales

Las plantas pueden ser utilizadas como fuentes teraputicas de varias maneras. Pueden ser utilizadas como t u otros remedios hechos en casa. Pueden tambin ser usadas como extractos crudos o fracciones concentradas en preparaciones farmacuticas tales como tinturas, extracto fluido, polvos, tabletas y cpsulas cuando son consideradas como preparaciones

fitofarmacuticas o medicinas herbolarias. Finalmente las plantas pueden ser sujetas a extracciones sucesivas y procedimientos de purificacin, para aislar compuestos de inters, tos cuales pueden ser ellos mismos los activos y ser usados directamente como droga. Ejemplos de estos casos son la quinina, ergotamina y digoxina; o bien pueden ser utilizados como precursores como en el caso del baccatin, el cual es precursor del taxol en donde por medio de procesos de semisntesis se obtiene el compuesto activo, o utilizarse como modelos para su sntesis total (Rates, 2001).

Se ha demostrado que algunas de las plantas utilizadas en la medicina tradicional contra diversos agentes infecciosos, no tienen actividad citotxica directa contra dichos agentes. Sin embargo, han sido utilizadas con gran xito.

Estudios recientes han demostrado que dicho xito, se debe a una accin directa sobre el sistema inmunolgico, el cual es estimulado permitiendo el control de la enfermedad. Tal es el caso de Spiraea prunifolia (So, et al., 1999) y Dichroa febrfuga (Murata, et al., 1998) usadas en el tratamiento de la malaria y de Kalanchoe pinnata planta utilizada contra la infeccin causada por Leishmania (Da-Silva, et al., 1999). En los estudios efectuados con los extractos de estas plantas, se encontr que actan estimulando a los macrfagos con la consecuente produccin de xido ntrico (So, et al., 1999; Da-Silva, et al., 1999).

E xido ntrico (NO) ha demostrado ser uno de los principales efectores contra agentes infecciosos (Nathan, et al., 1991; Abbas, et al., 1991). Esto

sugiri que el efecto de los extractos vegetales sobre el control de la infeccin, es actuando de manera indirecta, mediada macrfagos. por la estimulacin de los

El xido ntrico, antiguamente conocido como factor de relajacin endotelial, es una molcula de tipo radical libre, con un electrn libre centrado en el tomo de nitrgeno. En el mbito biolgico es producido por accin de la sintetasa del oxido ntrico (NOS), actuando sobre el aminocido L-arginina.

Existen diferentes isoformas de NOS y se pueden clasificar de acuerdo al tipo de enzima (constitutiva o inducible) y de acuerdo al tipo de clula (macrfagos, clulas endoteliales, neuronas, clulas musculares lisas) en el que encontramos la enzima (Moneada, et al., 1993; Knoweles, et al., 1994).

La produccin de NO por los macrfagos es mediada por una estimulacin de estas clulas por antgenos a nivel de membrana, la seal se traduce en una fosforilacin del inhibidor del factor nuclear kappa-B (1-NF-kB) el cual es degradado, una vez liberado el NF-kB, se traslada al ncleo, y

promueve la trascripcin de iNOS, enzima responsable de la produccin de NO (Lee, et al., 1998). actividades tan Como un resultado como de esto NF-kB esta envuelto en inmune e inflamatoria,

divergentes

respuestas

patognesis de ciertas enfermedades, respuestas de fase aguda, control del ciclo celular, diferenciacin y respuesta a infecciones virales. La inhibicin de NF-kB puede ser un blanco teraputico para la prevencin o tratamiento de respuestas biolgicas no deseadas, causadas por la activacin de NF-kB.

El factor NF-kB es uno de los mensajeros rntracelulares llamados tambin factores de transcripcin. Fue identificado por primera vez por Sen y Baltimore (1986), como una protena nuclear especfica de cel B. Sin embargo NF-kB es ahora conocido por ser un factor de transcripcin de respuesta rpida en una amplia variedad de clulas e involucrado en la generacin de un gran nmero genes, como son los que codifican para citoquinas, quimiocinas, molculas de adhesin, factores de crecimiento, inmunoreceptores, protenas

de fase aguda, factores de transcripcin y enzimas relacionadas con el estrs oxidativo; Todos ellos contienen sitios de unin a NF-kB en sus promotores. NF-kB esta presente en el citoplasma como un complejo inactivo asociado con un inhibidor llamado lkB. Como un resultado de esto, NF-kB esta envuelto en actividades tan divergentes, como respuestas inmune e inflamatoria, a la patognesis de ciertas enfermedades, respuestas de fase aguda, control del ciclo celular y su diferenciacin y respuesta a infecciones virales.

Dentro de la investigacin de plantas medicinales, la seleccin de las plantas a estudiar, se realiza basndose en diferentes estrategias que den como resultado una medicina herbolaria o un compuesto activo aislado. Esto es realizado, tomando en cuenta su uso en medicina tradicional (preparacin, parte de la planta utilizada, forma de administracin), reportes de contenido qumico y toxicidad.

Una de las plantas ms utilizadas en el territorio nacional es la "rnica", la cual es utilizada principalmente en lesiones de la piel, en el tratamiento de traumatismos, magulladuras y dolores musculares, golpes e inflamaciones, padecimientos gastrointestinales infecciosos, bronquitis y el tratamiento postoperatorio de tromboflebitis (Martnez, 1984; Daz , 1976; Lozoya, et al., 1987; Aguilar, et al., 1994). Sin embargo el nombre de "rnica" no se aplica a una sola especie, dentro del grupo de plantas denominadas "rnica", la ms conocida es la Heterotheca inuloides Cass (Lozoya, et al., 1987).

Su nombre comn es derivado de su similitud teraputica con rnica montana L , una planta europea utilizada para los mismos fines y de amplia difusin tanto en Europa como Norteamrica (Baillargeon, et al., 1993; Schrder, et al., 1990).

Como resultado de estudios etnobotnicos realizadas dentro del territorio nacional, se encontr, que se denomina como "rnica" a diferentes plantas,

dependiendo del fugar de utilizacin.

Se han reportado 20 diferentes plantas, 17 especies correspondientes a la familia Compositae, y tres especies ms correspondientes a las familias Leguminosae, Onagraceae (Aguilar, et al., 1994; Daz 1976); donde la especie encontrada en mayor proporcin dentro de la Repblica mexicana es la Heterotheca inuloides.

Estas plantas a pesar de presentar diferencias por sus caractersticas botnicas, son utilizadas para las mismas aplicaciones en medicina tradicional, por su similitud en sus atributos medicinales, en la Tabla 1, se pueden apreciar las diferentes plantas utilizadas como rnica, as como su ubicacin dentro del territorio nacional.

TABLA 1
Plantas usadas en medicina tradicional en Mxico registradas bajo el nombre popular de rnica. NOMBRE POPULAR Amica Amica Amica8 Amica" Amica Amica8"10

FAMILIA Acanthaceae Compositae Compositae Compositae Compositae Compositae Compositae Compositae Compositae Compositae Compositae Compositae Compositae Compositae Compositae Compositae Compositae Compositae

NOMBRE CIENTFICO Cariowrightia cordifolia Baha absinnthifolia Gaillardia sp Grndea inuloides Grindeiia squarrosa Heterotbeca inuioides Cass

LOCALIZACION Nuevo Len Nuevo Len San Luis Potos Ed. de Mx Edo. de Mx.

Centro y Sur de la Rep. San Luis Potosi, Gto Zacatecas Nuevo Len Nuevo Len No especificada Yuc,Tab,Gro,Oax, Chis. Chis.,Ver., Tamps. Oaxaca Dgo a Aguas. Tam., Nay., hasta Yuc. Sinaloa a Oaxaca Puebla, Veracruz Chiapas Chiapas

Heterotheca ieptoglobosa DC Amica8 Amica morada0 Machaeranthera brevilingulata Machaeranthera scabrela Machaeranthera spinulosa Mentzeiia conzatti Neurolaena lobata L. Taraxacum officinale Tithonia diversifolia Gray. Trxis angustifolia DC Trxis radaiis DC Verbesina Greenmani Urb Zexmenia Pringeli Greenm Amica8 Amica Amica10 Amica" Amica8 Amica** Amica8 Amica9
Amica de la costa"

Amica*10 Amica8 Amica8

Leguminosae Desmmodium sp. Onagraceae Oenothera laciniata

2.1.1

Anlisis qumicos

El estudio fitoqumico de este tipo de plantas se ha centrado en las plantas europeas: Arnica montana, Arnica chamissonis y en la especie mexicana Heterotheca inuloides. En las dos primeras se han identificado glucsidos flavonoides en los extractos de flores (Merfort, et al., 1987) y

sesquiterpenl acto as del tipo helenalin y esteres 11,13-dihidrohelenalina en las partes verdes de la planta (Schrder, et al., 1990). En las flores de Heterotheca inuloides se han identificado 10 glucsidos flavonoides adems de otros compuestos como cido cafico, cido protocatquico, cido clorognico y umbeliferona (Jerga, et al., 1990; Jerga, et al., 1990).

Los estudios en la planta mexicana H. inuloides se han realizado principalmente para encontrar diferencias qumicas con la especie europea A. montana, ms no por sus propiedades teraputicas, los estudios pretenden encontrar algn marcador qumico que les permita detectar la presencia de H. inuloides en sus mezclas, por considerarse a sta como adulterante de los preparados de A. montana (Pietta, et al., 1994).

Posteriormente se han reportado estudios con Heterotheca inuloides. Haraguchi, et al., (1997) reportaron dos sequiterpenoides: 7-hidroxi-3,4-

dihidroxicadalin y 7-hidroxicadalin; y aislados de la planta.

flavonoides: quercetin y kaemferol

Se han aislado apartir de extractos con dclorometano de flores, compuestos 7-hidroxicadalin y 7-hidroxi-3,4-dihidrocadalin, los cuales se comprob que eran

los

sesquiterpenoides

los compuestos responsables de las

propiedades antiinflamatorias, en experimentos en ratones (Segura, et al., 2000). Delgado et al., (2001), aislaron 3 nuevos sesquiterpenoides de hoja, los que tambin reportan con actividad antiinflamatoria.

2.1.2

Propiedades farmacolgicas

Se sabe que A. montana ha sido utilizada por aos en la medicina tradicional en Europa y Norteamrica por sus propiedades antiinflamatorias y curativas en heridas. Tambin ha sido utilizada como estimulante cardiaco y analptico leve (Schrder, et al., 1990). Adems del uso externo extractos de A. montana y A chamissonis, de los

la tintura de rnica se ha

administrado oralmente para mejorar la circulacin sangunea, pero debido a los frecuentes efectos colaterales esta va de administracin es discutible (Baillargeon, et al 1993).

Se ha demostrado que las sesquiterpenlactonas, y los Flavonoides aislados de la especie A montana, tienen actividad citotxica contra dos lneas celulares humanas: GLC4 (carcinoma de clulas pequeas de pulmn) y COLO-320 (cncer colorectal), donde los flavonoides muestran una moderada citotoxicidad y las sesquiterpenlactonas son hasta diez veces ms txicas comparadas con el compuesto de referencia cisplatino (Woerdenbag, et al., 1994). A las sesquiterpenlactonas tambin se les han atribuido las reacciones alrgicas de tipo dermatitis que produce el contacto con las plantas (Pirker, et al., 1992). Tambin se ha informado de polisacridos con actividad

estimuladora sobre macrfagos induciendo en estos la produccin de TNF (Puhlmann, et al., 1991). Lo que resulta muy interesante considerando la actividad antiinflamatoria y antisptica atribuida al rnica.

Con respecto a los estudios de actividad biolgica de H. inuloides, a la fecha se han reportado sesquiterpenoides con actividad antimicrobiana contra bacterias gram positivas, lo que tambin va muy de acuerdo con su uso antisptico (Kubo, et al., 1993). Tambin se han reportado propiedades

antioxidantes (Haraguchi, et al., 1996; Kubo, et al., 1996; Haraguchi, et al., 1997). En extractos de flores (acuosos y con diclorometano) probados en

modelos in vivo, se demostr actividad antiinflamatoria y analgsica (Gene, et al., 1998; Segura, etal., 2000).

2.1.3

Planteamiento del Problema

Una de las plantas conocidas comnmente como "rnica9 en ei estado de Nuevo Len, es la Carlowrghtia cordiflia A. Gray, familia Acanthaceae la que es utilizada con fines curativos, principalmente como anti-inflamatorio y antisptico. Sin embargo, a pesar de su uso popular en la regin, inclusive dentro de la medicina homeoptica, no se tienen antecedentes en las recopilaciones herbolarias ni existen antecedentes cientficos, que corroboren su utilizacin. Recientemente fue identificada por personal del Herbario IMSSM y se registro bajo el nmero de voucher 11710. (Figura 1).

FIGURA 1
Carlowrightia cordifolia, una de las plantas utilizadas como rnica en la regin del norte.

.4

Clasificacin botnica de la Carlowrghtia cordifolia.

Reino: Plantae vegetal

Divisin: spermatophyta

Clase: angiospermae

Subclase: dicotiledoneae

Orden: tubiflorae

Suborden: acanthinae

Familia: Acanthaceae

Gnero: Caiiownghtia

Especie: C, cordifolia

2.1.5

Antecedentes de la familia Acanthaceae.

En la literatura se tienen reportes de estudios cientficos efectuados a plantas correspondientes a esta familia, como es el caso de estudios realizados a 103 agentes antineoplsicos de frica del Este, donde como resultado de stos se encontr en arbustos Hypoestes verticiflaris dos alcaloides. Los que fueron aislados e identificados como: fenantro-indolizidina e hipoestestatin, compuestos que probaron tener una fuerte inhibicin en el crecimiento de la lnea P-388 (leucemia limfoctica murina) con una dosis efectiva (ED) de 10 pg/ml (Pettit, etal., 1984).

Estudios realizados sobre otras especies de esta familia, como Justicia spicigera (muicle) se reporta que extractos etanlicos utilizados en

experimentos in vitro con Giardia lambia, presentan actividad microbicida, resultando ms activos que el control (tinidazol), siendo este control, el

medicamento de eleccin comnmente en estos casos (Ponce-Macotela, et al., 1994).

En Ruellia praetermissa, se efectuaron estudios sobre fragmentos de ileum aislado, en los cuales se encontr actividad contrctil, se probaron

extractos metanlico, acuoso y etil-acetato resultando con actividad ios tres.

Sugiriendo que los compuestos luteolin y apigenin pueden ser los responsables de esta actividad (Saiah, et al., 2000).

Andrographis paniculata (Burm. f.) Nees., es una planta utilizada en medicina natural como antiinflamatorio, conocida como "el rey de los amargos". De sta planta, se obtuvo el compuesto andrografolido, el cual es una lactona diterpenoide (Shen, et al., 2000), y se le atribuye la habilidad, para prevenir la produccin de especies de oxigeno reactivo, compuestos inducidos por el

acetato de forbol miristato (PMA), as como la inhibicin de adhesin de los neutrfilos (Basak, et al., 1999). Se efectuaron tambin, estudios de toxicidad subcrnica, con la utilizacin de dichos extractos, reportando estudios negativos de efectos txicos testiculares en ratas (Burgos, et al., 1997). En otros estudios en animales de experimentacin se encontr como efecto, tanto del actividad inmunoestimuladora

extracto etanlico, como del compuesto aislado de

dicho extracto (dlterpeno andrografolido), debido a que induce estimulacin significativa de anticuerpos y respuesta de hipersensibilidad tarda (DTH), tambin se encontr que estimula la respuesta inmune no especfica en animales (Puri, et al., 1993).

De la planta "Heine" (Astercantha auriculata Nees,) utilizada en medicina indgena para tratamientos hepticos, se probaron los extractos metanlicos de semillas, para estudiar el efecto antihepatotxico. Utilizando un modelo de toxicidad, inducido por dosis de los medicamentos paracetamol y tioacetamida, los resultados mostraron una significativa actividad hepatoprotectora, como

efecto de dicho extracto, esto se realiz monitoreando hepticas, (Singh, et al., 1995).

varias funciones

2.1.6

Originalidad y Justificacin

La Carlowrghtia cordifolia A. Gray es una planta anual, que crece en forma silvestre, durante los meses de mayo a agosto, en terrenos semiridos del estado de Nuevo Len principalmente. Al igual que muchas otras plantas medicinales, a pesar de su uso difundido en la medicina herbolaria, no se tienen estudios fitoqumicos, ni farmacolgicos que puedan teraputico. confirmar su valor

Se sabe que los macrfagos juegan un papel importante tanto en los procesos inflamatorios, como microbicidas (Abbas, et al., 1991) y siendo una de sus principales armas para esta ltima actividad la produccin de NO, compuesto implicado en la inflamacin ya que desencadena una serie de eventos llevan que a la produccin de prostaglandinas las cuales son responsables de ios eventos de inflamacin, dolor y enrojecimiento en el caso de traumatismos y que actualmente, se conoce que tiene tambin efectos antiinflamatorios ya que en concentraciones elevadas bloquea la activacin del factor NF-kB (Abbas , et al., 1991; Yim, et al., 1993; Hibbs, et al., 1987;.Peng, et al., 1998).

Considerando que los macrfagos y su produccin de NO juegan un papel importante en la inflamacin y que se desconoce el mecanismo por el cual Carlowrghtia cordifolia, acta en este proceso, se plante la posibilidad de demostrar un efecto sobre los macrfagos.

Por otro lado, a pesar de los grandes avances en medicina, las enfermedades por parsitos protozoarios sigue siendo un problema de salud. Y aunque actualmente se cuenta con frmacos que en la mayora de los casos resultan eficientes; estos presentan diversos grados de toxicidad. Debido a esto se continua la bsqueda de nuevos antiambicos mas potentes y menos txicos. En nuestro pas se ha detectado mas de 100 plantas utilizadas como antiambicos o antidiarreicos (Agular, et al., 1994), Por lo que resulta importante, probar toda planta de la que se tenga sospecha, de que sintetice compuestos con actividad antiparasitaria.

Aunado a esto, se encuentra tambin el hecho de que el tratamiento con antibiticos ha dado lugar a modificaciones genticas de la microflora patgena, sobre todo en el ambiente hospitalario, donde el uso continuo de dichos frmacos ha favorecido ia aparicin de cepas multi-drogoresistentes. Esta realidad remarca la necesidad de encontrar nuevos frmacos con actividad antibitica (Ros, 1998). Considerando el uso antisptico de C. cordifolia, es posible que tambin presente compuestos con actividad antimicrobiana.

2.2

Hiptesis

Es posible que la Cariowrightia cordifofa A. Gray., sintetice compuestos con efecto activador sobre macrfagos y/o actividad antimicrobiana.

2.3

Objetivos

2.3.1 General

Caracterizacin parcial del o ios principios activos responsables de la actividad estimuladora sobre macrfagos y/o actividad antimicrobiana en los extractos de hoja, tallo y raz de Carowrightia cordifolia.

2.3.2 Especficos

1. Obtencin de extractos etanlicos a partir de material fresco de hoja, tallo, y raz de Cariowrigbtia cordifoia utilizando el mtodo de maceracin y determinar el efecto activador en cultivos de macrfagos peritoneaies de ratn.

2. Obtencin de extractos hexnico y metanlico a partir de material seco de hoja, tallo, y raz de Carlowrightia cordifoia utilizando el mtodo de extraccin por reflujo continuo y determinar el efecto activador en cultivos de macrfagos peritoneaies de ratn.

3. Determinacin de actividad antimicrobiana por el mtodo de difusin en placa y monitoreo del compuesto activo por la tcnica de bioautografa en los extractos obtenidos.

4. Determinacin de actividad antiprotozoaria de los extractos obtenidos.

5. Caracterizar parcialmente los principios activos de los extractos donde se detecte la actividad, realizando investigacin por medio de reacciones

qumicas de identificacin de grupos funcionales y cromatografa en capa

delgada.

3. MATERIAL Y MTODOS

3.1

Origen de los reactivos, material y equipo.

Los solventes utilizados en las extracciones se obtuvieron de Productos Monterrey (Mxico), el medio RPMI-1640 y el LPS de Sigma Chemical Co. (Saint Louis Missouri, USA), el tioglicolato y Silica Gel 7G de Merck (Mxico), el suero fetal bovino fue obtenido y esterilizado en nuestro laboratorio, reactivos utilizados fueron de J.T. Baker (Mxico). otros

Incubadora de CO2 (National, USA), Microscopio invertido Mod. "D"- Cari Zeiss), Microscopio compuesto (Cari Zeiss), Lector de microplacas EIA

multiwell reader (Sigma, USA), Centrfuga refrigerada (Damon/IEC, USA) B20, rotor 11/79 y 289, placas de calentamiento (CORNING, USA) PC-320.

Hemocitmetro (American Optica! Scientific Instruments Div. USA), material de diseccin, microplacas de poliestireno de fondo plano con 96 pozos (Sigma, USA),

3.2

Material vegetal

Las muestras de hoja, tallo y raz de C. cordifolia (70 cm de altura y en floracin), fueron colectadas durante el mes de Julio, en la zona suburbana de la ciudad de Monterrey, N.L., de las muestras colectadas se envi un ejemplar al Herbario 1MSSM para su certificacin y extender el voucher correspondiente as como al Herbario de la UANL para su depsito.

Del material colectado se separaron en tres tipos de muestras: hoja, raz y tallo, se secaron a temperatura ambiente, y se molieron. De cada una de fa muestra se obtuvieron extractos acuoso, etanlico, metanlico y hexnico.

33

Material Biolgico

Cepas bacterianas y levaduriformes.

Las cepas bacterianas

utilizadas {Escherichia coli, Bacillus cereus

Enterobacter aerogenes, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeuriginosa, y Salmonella sp), y Levaduriformes (Candida albicans), se obtuvieron de la coleccin del Laboratorio de Microbiologa, de la Facultad de Medicina de la Universidad Autnoma de Nuevo Len (UANL), las cuales se presentan en la Tabla 2.

Los microorganismos se mantuvieron en refrigeracin a 4 C en medios slidos. Se utiliz el medio slido C. Rivas (glucosa, peptona de colgena,

extracto de levadura y agar) (Rivas, 1998; Velsquez, 1997), preparndose con 8.5 g en 100 mi de agua destilada, se esteriliz en autoclave y se vaci a cajas de Petri en volmenes de 20 mi.

Para la activacin de los mismos se utiliz el medio caldo C. Rivas (glucosa, peptona de colgena y extracto de levadura), preparndose 8.5 g en 100 mi, y se vaci a tubos de ensaye 18 X 150 mm con tapn de rosca en volmenes de 5 mi y se esterilizaron en autoclave. Se inocularon con las diferentes cepas en estudio con una asada a cada tubo previamente identificado. Se incubaron de 12-18 h a 37 C.

En el caso de la cepa levaduriforme se utiliz medio caldo C. Rivas (Saboraud modificado) dndoles un tiempo de incubacin de 2 das para las cepas levaduriformes.

TABLA 2

Lista de cepas bacterianas y levaduriformes utilizadas

BACTERIAS

LEVADURA

Escherichia cofi

Candida albicans

Bacillus cereus

Enterobacter aerogenes

Pseudomonas aeuriginosa

Salmonella sp

Staphylococcus aureus

Cepa de Protozoarios

Se utiliz la cepa de Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Las amibas se mantuvieron en condiciones axnicas, en medio PEHPS (Said-Fernndez, et al., 1988), a 37 C, con subcultivos cada 4 das.

Macrfagos peritoneales de ratn.

Obtencin: Se utilizaron ratones machos de la cepa BALB/c, de 6 a 8 semanas de edad, proporcionados por el bioterio del Centro de Investigacin Biomdica del Noreste (CIBIN). La obtencin de los macrfagos peritoneales se realiz mediante la inoculacin intraperitoneal de 2 mi de caldo tioglicolato al 2 % en amortiguador de fosfatos salino (PBS). Cuatro das despus se recuperaron los macrfagos mediante lavado de la cavidad peritoneal con 10 mi de medio RPMM640. El volumen recuperado de! lavado se deposit en un tubo cnico de polietileno estril con tapn de rosca. La suspensin celular, se centrifug 15 minutos a 450 x g a 4 C. Se desech el sobrenadante y el

precipitado conteniendo los macrfagos, se resuspendi en 1ml de medio, se tom una muestra para determinar viabilidad con solucin de azul de tripano, y posteriormente se determin el nmero de macrfagos por mi con un hemocitmetro. Los macrfagos se cultivaron en microplacas de 96 pozos, colocando 200 pl por pozo con 2 x1o 5 cel, e incubando a 37 hmeda con 5 % de CO2 durante 24 h, en atmsfera en

despus de este tiempo

condiciones aspticas, se elimin el medio de cultivo utilizando vaco y se adicionaron nuevamente 200 jj I de medio RPMI complementado con 10 % de suero fetal bovino.

3.4

Preparacin de extractos

Extracto acuoso

A 1 I de agua en ebullicin se agregaron 40 g de las muestras por analizar cada una en forma independiente e inmediatamente se retir del fuego. Esta solucin se dej en reposo hasta que la infusin alcanz la temperatura ambiente. El extracto resultante se filtr a travs de un lienzo de algodn y se esteriliz por filtracin, utilizando membrana de tamao de poro de 0.22 pm, con esta solucin se prepararon las diluciones necesarias para las diferentes pruebas utilizando PBS estril.

Extracto Etanlico

Muestras de corteza, tallo y hoja se cortaron en pequeos pedazos de aproximadamente 0.5 cm, de ste material se pesaron 60 g y se maceraron con 60 g de etanol (76.4 mi) hasta obtener una pasta. El material se dej reposar por una semana en un frasco oscuro. Posteriormente se filtr por presin mecnica a travs de un lienzo de algodn crudo. Se esteriliz por filtracin, utilizando membrana de tamao de poro de 0.22 nm, con esta

solucin se prepararon las diluciones necesarias para las diferentes pruebas utilizando PBS estril.

Extracto Hexnico.

Muestras de la corteza, tallo y hoja, se llevaron a pequeos pedazos de aproximadamente 0.5 cm y se molieron, se pesaron 60 g y se pusieron con 700 mi de hexano en un sistema de reflujo continuo utilizando de soxhlet por 7 das. El extracto resultante se evapor a sequedad en un rotavapor. Para las prueba biolgicas el extracto obtenido fue resuspendido en dimetilsulfxido (DMSO), se esteriliz por filtracin utilizando membrana de acetato de 0.45 pm. Se

realizaron las diluciones necesarias en cada prueba biolgica con PBS estril.

Extracto Metanlico

Las muestras residuales de la corteza, tallo y hoja de la extraccin por hexano se pusieron con 700 mi de metanol bajo reflujo en soxhlet por 7 das. El extracto resultante se evapor a sequedad en un rotavapor. Para las pruebas biolgicas se resuspendi en etanol, se esteriliz por filtracin utilizando

membrana de acetato de 0.22 pm. Se realizaron las diluciones utilizadas en cada prueba biolgica con solucin PBS estril.

3.5

BIOENSAYOS

3.5.1

Activacin de macrfagos:

Para activar a los macrfagos en cultivo se utilizaron: Lipopolisacridos (LPS) 25 pg/1 x 106 (1|jg/ml) los cuales se agregaron a las 24 h, directamente a la microplaca, conteniendo un volumen de 200 pl de medio RPMI adicionado con 10% de suero fetal bovino con 2 x 105 cel. Esta prueba se utiliz como control positivo en todos los ensayos. Como control negativo se utiliz PBS, o en su caso los solventes diluidos en PBS de acuerdo a las soluciones preparadas de los extractos. La produccin de NO se cuantific a las 48 h, por la tcnica de Griess.

3.5.2 Determinacin de la produccin de NO como efecto de los extractos sobre macrfagos peritoneales de ratn.

Cultivo de macrfagos no estimulados con LPS.

Ai cultivo de macrfagos obtenidos 24 h despus, se adicionaron 10 pl de las diluciones 1:10 de cada uno de ios extractos previamente esterilizados por

filtracin. La produccin de NO se determin, a las 48h despus de adicionar los extractos, utilizando la tcnica de Griess.

Cultivo de macrfagos estimulados previamente con LPS

Al cultivo de macrfagos obtenidos 24 h despus, se adicionaron Lipopolisacridos 1 pg/ml y a las siguientes 24 h se adicionaron 10 pl de las diluciones 1:10 de cada uno de los extractos previamente esterilizados por filtracin. La produccin de NO se determin, a las 24 h despus de adicionar los extractos, utilizando la tcnica de Griess

3,5.3

Determinacin de NO por el mtodo de Griess

La concentracin de NO se cuantific de manera indirecta por la determinacin de nitritos en el medio de los macrfagos en cultivo, por el mtodo colorimtrico de Griess (Stuehr et al., 1989, Mauel et al., 1991). Se tomaron 100 pl del medio sobrenadante de los macrfagos cultivados y se le agregaron 50 pl del reactivo A de Griess (di-hidro-cloruro de Naftil-etilendiamino al 0.1 %) mas 50 pl del reactivo B (sulfani lamida al 1 % en cido fosfrico al 2.5 %), se incubaron por 10 minutos a temperatura ambiente. Se determin la lectura de densidad ptica, en un lector para microplacas (ELISA)

a una longitud de onda de 545 nm.

Como estndar se utiliz una curva,

utilizando una solucin de nitrato de sodio, en concentraciones de 0.244 a 125 pM. La concentracin de nitritos se obtuvo por extrapolacin en la curva estndar. Los ensayos se realizaron por triplicado.

3.5.4

Determinacin de actividad antimicrobiana

Mtodo de Difusin en Placa

Se utiliz el mtodo de difusin en placa (Koneman, et al., 1989), utilizando discos de papel filtro Whatman No. 1 estriles, a los cuales se les adicionan 50 pl de los extractos a probar as como cada uno de los solventes utilizados, sobre placas slidas de medio de cultivo previamente inoculados con 100 pl de una suspensin 1 X 10"6 del microorganismo de prueba. Se incub a 37 C por 24 h, despus de este periodo se midieron los halos de inhibicin en mm para cada prueba. triplicado y en condiciones de esterilidad. Las pruebas se llevaron a cabo por

Los extractos que presentaron mayor actividad microbiana se utilizaron en las pruebas cromatogrficas y qumicas para la separacin e identificacin parcial de las fracciones activas.

Localizacin por bioautografa

Para la localizacin del compuesto activo se realiz esta metodologa la cual se apoya en los mtodos de difusin y cromatografa. Esta tcnica es

adecuada para localizar el compuesto responsable de la actividad biolgica, cuando se estudia un extracto crudo que tiene una mezcla de compuestos muy abundante (Hamburger, et al., 1987).

En este estudio, se utiliz el (Verastegui, 1998),

mtodo de Hamburger modificado de silica G con

utilizando placas cromatogrficas

dimensiones de 2.5 x 7.5 cm, previamente corridas con los extractos en los sistemas de solventes adecuados para la mejor separacin y esterilizadas con luz ultravioleta. Dichas placas se colocaron en cajas de Petri, sobre de estas, se coloc una tira de medio slido C. Rivas de 1x 6 cm, con un espesor aprox. de 0.3 mm.

Posteriormente se aadieron 150 pl de la dilucin 1 x 10"6 UFC del microorganismo de prueba sobre la tira de agar y se distribuy _

homogneamente. Las condiciones de humedad se mantuvieron colocando dentro de una caja de petri un fragmento de algodn hmedo con 4-5 mi de

agua estril. Como control negativo se utiliz un cuadro de agar inoculado con el mismo microorganismo pero separado de la placa cromatogrfica.

Se incubaron 24 h a 37 C. La zona de inhibicin de los microorganismos en la tira de agar se midi y se correlacion con el registro previo de las fracciones separadas cromatograficamente facilitando as el aislamiento y la identificacin del compuesto responsable del efecto antimicrobiano.

3.5.5 Determinacin de actividad antiamibiana

Se utiliz

la cepa de E. histolytica HM-1:IMSS, los trofozoitos se

mantuvieron en condiciones axnicas en medio PEPHS, mantenidos en cultivo y resembrados cada 96 horas.

Se prepararon tubos de vidrio con tapn de rosca, conteniendo 5.5 mi de medio PEPHS y se inocularon con 5.5 x 103 cel. Posteriormente se

adicionaron 50 \j\ de cada una de las diluciones (0.05 - 100.00 pl) de los extractos preparados, as como controles preparados con nicamente los solventes utilizados en los extractos, todos se realizaron por triplicado. Se incubaron a 37 C por 72 h.

Los trofozoitos fueron separados por enfriamiento durante 10 min en agua hielo, y fue calculado el nmero de trofozoitos/ml de cada uno de los tubos, utilizando un hemocitmetro y fue calculado el porcentaje de inhibicin de crecimiento en los cultivos tratados con respecto al control no tratado (GonzlezGarza, et al., 1988).

3.6

Mtodos de identificacin

3.6.1

Pruebas qumicas

Oxhidrilos fenlicos

Prueba de cloruro frrico: Se disolvieron 2 mg de la muestra en 1 mi de agua o etanol, despus se le aadieron unas gotas de cloruro frrico al 12.6% en agua; la aparicin de un precipitado rojo, azul violeta o verde se consider positivo.

Esferoides v Triterpenos

Prueba de Liebermann-Burchard: Se disolvi una pequea muestra en cloroformo para aadir el reactivo que se prepara agregando una gota de cido sulfrico en una mezcla de anhdrido actico con 1 mi de cloroformo; la

aparicin de cualquier color en el lapso de 1 hora indic que la prueba result positiva.

Se disolvieron 2 mg de la muestra en una solucin de hidrxido de sodio (NaOH) al 10%; si aparece una coloracin amarilla que desaparece al acidular, fa prueba fue positiva.

Sesauiterpenlactonas

Prueba de Baljet:

Se utilizaron dos soluciones que se mezclaron en

volmenes iguales antes de usarse. Solucin A: 1g de cido pcrico en 100 mi de etanol; solucin B; 10 g de NaOH en 100 mi de agua. Para la prueba se pusieron 3 mg del compuesto a estudiar y 4 gotas del reactivo, siendo positiva al producirse una coloracin naranja o roja oscura.

Flavonoides

Prueba de Shinoda: La muestra disuelta en etanol, se trat con limaduras de magnesio, se aplic calor (60C) y se agregaron unas gotas de cido

clorhdrico concentrado, la prueba se consider positiva al presentar colores naranja, rojo, rosa-azul y violeta.

Prueba de Salkowski: una pequea cantidad de muestra se disolvi en cido sulfrico concentrado y si la prueba fue positiva para fiavonas y flavonofes se observaron coloraciones amarillo; naranja-guinda para fiavonas y rojo-

azuloso para chalconas; y si presentaron coloracin roja- prpura indic la presencia de quinonas.

Grupos carbonilo

Prueba de 2,4- dinitrofenilhidracina: en un tubo de ensaye se disolvi 50 mg de 2,4-dinitrofenilhidracina en 1 mi de etanol caliente. Se agregaron 50 mg del compuesto carbonlico y se calentaron en bao mara por 15

minutos; se dejaron en reposo y se enfriaron en bao de hielo, la aparicin de un precipitado indic la presencia de grupos carbonilo.

Alcaloides

Prueba de Dragendorff:

el reactivo que se utiliz consta de dos

soluciones: solucin A, 5 mi de subnitrato de bismuto al 1.6 % en cido actico al 20 %. La solucin B, se prepar mezclando 5 mi de yoduro de potasio al 40 % y 20 mi de cido actico aforando a 100 mi con agua destilada.

Se disolvieron 1-2 mg de la muestra en etanol y se colocaron unas gotas en una placa de porcelana, luego se le aadi unas gotas del reactivo de

Dragendorff; la prueba se consider positiva al aparecer un precipitado naranja marrn.

Identificacin de Lactonas

Prueba de Shinoda: A la muestra disuelta en etanol se agregaron 4 gotas de NaOH al 10%. Un color amarillo que se desaparece al agregar 3 o 4 gotas de ac. sulfrico fue positivo.

Azcares

Prueba de Molisch: en un tubo de ensaye se coloc la muestra, se aadieron 3 gotas del reactivo de Molisch ( 1 g de a-naftol en 100 mi de etanol al 95 %) y se agit. Despus se inclin el tubo y depositaron por la pared 2 mi de cido sulfrico concentrado. La prueba fue positiva al formarse un anillo coloreado en la interfase.

3.6.2

Cromatografa en capa delgada

Se realizaron cromatografas ascendentes utilizando como adsorbente silica gel 7G en una proporcin de 10 g de siiica en 40 mi de agua, ia mezcla

anterior se verti sobre placas de vidrio previamente desengrasadas, se dejaron secar al aire y enseguida se activaron en una estufa durante 1 h a 115 C. La dimensin de las placas fueron de acuerdo a las necesidades de

los ensayos como se resumen en la Tabla 3.

TABLA 3 Caractersticas de las placas cromatogrficas utilizadas

Base cm Altura cm Espesor mm Aplicacin Mi Funcin

2.5

7.5

en punto

preliminares seleccin fase mvil con capilar ensayos de bioautografa

5.0

10

en banda 20

revelado con agentes cromognicos

20

20

en banda 100

aislamiento

La fase mvil se determin probando varias mezclas de solventes de diferente polaridad hasta encontrar el mejor desarrollo cromatogrfico.

La muestra se aplic de acuerdo al tipo de ensayo realizado, como se indican en la tabla 3 a una distancia de 1 cm del inicio de la placa, se dej evaporar el solvente para efectuar el corrimiento dentro de una cmara de vidrio con la mezcla de solventes elegidos, hasta una distancia de aproximadamente 1 cm del extremo superior de la placa, se sac de la cmara y se sec a temperatura ambiente para evaporar los solventes.

3.6.3

Revelado en placas cromatogrficas.

La observacin de las fracciones separadas en las placas de cromatografa desarrolladas, se efectu utilizando varios mtodos:

Observacin con luz visible.

Observacin con luz ultravioleta (lmpara de 254-366 nm).

- Aspersin con reactivo de Liebermann-Burchard, el revelado indic la presencia de esterles y triterpenos, al obtenerse cualquier coloracin despus de transcurrida una hora.

- Aspersin con tricloruro de antimonio al 10 % en cloroformo con calentamiento a 120 C por 10 min, El revelado con cloruro de antimonio, indic la presencia de di y triterpenos dando coloracin de roja a violeta en visible. Y observando con luz ultravioleta (365 nm) dando principalmente

coloracin rojo-violeta, azul y verde fluorescente.

Las bandas separadas se marcaron en la placa cromatogrfica y se determin el Rf de cada una midiendo la distancia del punto de aplicacin de la muestra a la mitad de la mancha detectada, y dividiendo el valor entre la distancia del punto de aplicacin y el frente del eluerrte (Harris, 1992).

4. RESULTADOS

4.1 Extractos Obtenidos

Se obtuvieron los extractos de cada parte de la planta en estudio: tallo, hoja y raz utilizando diferentes metodologas:

a) Infusin: (acuoso) b) Maceracin (etanlico) c) Extraccin continua con solventes de polaridad creciente (hexnico y metaniico)

Con los extractos obtenidos se realizaron los bioensayos y pruebas de identificacin.

4.2 Actividad estimuladora de los extractos obtenidos sobre macrfagos, en ausencia de LFS.

Los extractos que demostraron tener una actividad estimulatoria sobre macrfagos con produccin de NO fueron el etanlico de tallo siendo 9.85 pM.

Los extractos de raz que presentaron actividad fueron: el etanlico, metanlicoy hexnico47.1, 21.7, 25.2 pM respectivamente.

En los extractos de hoja el acuoso y etanlico la produccin de NO fue de 3.46 y 17.5 pM; mientras que con los extractos metanlicos y hexnicos se obtuvieron 92.8 y 156.6 pM, siendo este ltimo el ms activo. Los extractos acuoso, metanlico y hexnico de tallo y acuoso de raz no hubo produccin de NO. En los controles negativos utilizados (DMSO, etanol y PBS) no hubo produccin de oxido ntrico.

Como control positivo de estimulacin de macrfagos se utiliz el LPS, con el que se obtuvo un valor de 6.07 pM.

La viabilidad celular comprobada con azul tripano al 1% al final de cada experimento fue de 98 %. Por lo que no se observ efecto citotxico en presencia de los extractos probados.

Anlisis estadstico utilizado

Los experimentos se efectuaron por triplicado, los resultados se analizaron comparando la produccin de NO entre los extractos probados, contra el control utilizado (LPS), aplicando una prueba de ANOVA

Los resultados sobre el efecto de los extractos probados se resumen en la Tabla 4 y Figura 2.

TABLA 4 Produccin de xido ntrico (pM) por macrfagos peritoneales de ratn en presencia de extractos de C. cordifofia.

Extractos
Acuoso

NO (pM) hoja

NO (MM) tallo

NO (MM) raz

3.46

Etanlico

17.5

9.85

47.1

Metanlico

92.8*

21.7

Hexnico

156.6*

25.2

LPS

6.07

*p< 0.001

FIGURA 2 Grafica de la produccin de NO (pM) por macrfagos peritoneales de ratn, en presencia de extractos de C. cordifolia.

4.3 Efecto de extractos de hoja de C. cordifolia, en la produccin de NO en cultivos de macrfagos, en presencia y ausencia de LPS.

Todos los extractos de hojas mostraron efecto inhibitorio sobre las cantidades de NO liberado por los macrfagos estimulados con LPS (24.47 pM). Los extractos acuoso y hexnico produjeron 11.9 y 10.56 pM, los cuales corresponden a un 51.4 y 56.9 % de inhibicin respectivamente. Los

extractos etanlico y metanlico incubados con los macrfagos estimulados con LPS, inhibieron completamente la produccin de LPS. No se observ inhibicin en los cultivos de macrfagos estimulados con LPS que se incubaron con los controles de solventes utilizados en las diluciones (etanol-PBS). Cuando los cultivos de macrfagos no estimulados con LPS fueron incubados con ios extractos de hojas, se detect NO en todos ios sobrenadantes. El extracto

hexnico dio la ms alta concentracin con un incremento de 2.25 veces ms con respecto al determinado en los sobrenadantes macrfagos estimulados con LPS. de los cultivos de

Debido a los altos niveles encontrados de nitritos se realizaron determinaciones de nitritos en los extractos, encontrndose presencia de estos solo en el extracto hexnico (105 pM). Este fue considerado para el resultado final, no se determinaron nitritos en los dems extractos.

La concentracin de NO en los sobrenadantes de los cultivos de macrfagos con los extractos metanlicos fue 1.36 veces menor que el control de LPS y con los extractos acuosos mostraron una concentracin menor pero con menor inhibicin (33.8 %) que el control de LPS, presentan en la Tabla 5 y Figura 3. los resultados se

TABLA 5

Efecto de extractos de hoja de C. cordifolia, en la produccin de NO (|JM), en cultivos de macrfagos en presencia y ausencia de LPS.
Extractos de hoja NO (pM) (macrfagos s/LPS) NO (pM) (macrfagos c/LPS)

Acuoso

22.3**

11.9

Etanlco

16.2*

Metanlico

33.2"

0.3

Hexnico

55.0**

10.56

LPS 24.47 pM de NO

*(P<0.02), **(p< 0.001)

Acuoso

Etanlico

Metanlico

Hexnico

LPS

FIGURA 3
Efecto de extractos acuoso, etanlico, metanlico y hexnico de hoja de C. cordifolia, sobre la produccin de NO, en cultivos de macrfagos s/LPS ( ) y c/LPS (H), comparadas con los macrfagos estimulados con LPS, *(P<0.02), **(P< 0.001).

4.4 Actividad antimicrobiana

Mtodo de difusin en placa

Los

extractos

de

C.

cordifolia que

mostraron

actividad

antimicrobiana corresponden a los hexnico y metanlico de hoja. El espectro ms amplio fue el del extracto hexnico al inhibir a las 6 especies bacterianas (Salmonella sp, Badilas cereus, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterobacter aerogenes, y Escherichia coli) y una especie fngica (Candida albicans) obtenindose la mayor inhibicin del crecimiento en el caso de Salmonella sp. El extracto metanlico fue de menor actividad sobre:

Staphylococcus aureus, Enterobacter aerogenes y Bacillus cereus; y nulo en Escherichia coli, los resultados se muestran en la Tabla 6.

TABLA 6 Resultados de la actividad antimicrobiana de extractos de hoja de C. cordifoiia.

Microorganismos Inhibicin extracto MeOH inhibicin Extracto Hex

Salmonella sp

++

+++

Pseudomonas aenjginosa

++

Candida albicans

++

++

Staphylococcus aureus

++

Enterobacter aerogenes

++

Bacillus cereus

+
+

Escherichia coli

Inhibicin de: +++ 11-15 mm, ++ 6-10 mm, + 1 - 5 mm, - sin inhibicin.

Mtodo de bioautografa

Con relacin al mtodo de bioautografa, en el cual se requiere conjuntar aspectos microbiolgicos y fisicoqumicos, para realizarse se requiere

primeramente tener compuestos separados por la cromatografa en capa fina. Se realizaron las bioautografias del extracto hexnico de hojas de C. cordifolia que present mayor actividad biolgica, se utiliz el cromatograma desarrollado en la fase mvil: benceno: cloroformo: agua (80:10:10) que fue el que mostr

mayor separacin de bandas, y el microorganismos utilizado fue Salmonella sp con el que se obtuvo la mayor actividad (+++); Los resultados en la

bioautografa fueron negativos para todas las fracciones a pesar de concentrar la muestra Aunque este mtodo es l mas adecuado para los casos en que la actividad es completamente inherente al compuesto separado y no cuando el resultado es indirecto por la accin de otros compuestos como podra ser este caso.

4.5 Actividad antiamibiana

Los extractos metanlico, hexnico y acuoso de hojas de C. cordifolia presentaron inhibicin sobre E. histolytica. Los resultados de inhibicin en porcentaje de los extractos acuoso y metanlico fueron muy semejantes: 50 y

52 % respectivamente, mientras que el extracto hexnico result menor 27 %. Los resultados se presentan en la Tabla 7, Figura 4.

TABLA 7

Resultados de porcentaje de inhibicin de crecimiento de los extractos de C.cordifolia sobre E. histolytica.

Extracto

%IC hoja

%IC tallo

Hexnico

27

3.3

Metanlico

50

8.3

Acuoso

52

FIGURA 4 Efecto inhibitorio de los extractos metanlicos y hexnicos hoja y tallo de C. cordifolia, sobre E. histolytica.

4.6

Caracterizacin Parcial

Reacciones Qumicas:

Para la determinacin

parcial de los compuestos responsables de la

actividad biolgica, se efectuaron reacciones qumicas indicativas de la presencia de grupos funcionales y cromatografa en capa delgada.

Los resultados obtenidos de los extractos metanlico y hexnico de hoja de C. cordifolia, revelaron la presencia de: saponinas, esterles, esteroides y triterpenos. Ver Tabla 8.

TABLA 8 Resultados de las pruebas qumicas para grupos funcionales de los extractos metanlico y hexnico de hoja de C. cordifolia.
Grupo funcional (P. Q.) Extracto Metanlico Extracto Hexnico

Esteroides y Triterpenos (L-B)

positiva

positiva

Saponinas (Molish)

positiva

positiva

Esterles (Salkowski)

positiva

positiva

Lactonas

negativa

negativa

Alcaloides (DragendorfF)

negativa

negativa

Fiavonoides (Shinoda)

negativa

negativa

Sesquiterpenlactonas (Baijlet)

negativa

negativa

Cumarinas

negativa

negativa

Cromatografa en Capa Delgada.

a)

En la cromatografa en capa delgada (Silica - Gel 7GF), el sistema

de elusin que separ mas eficientemente los extractos fue: benceno, cloroformo, agua (80:10:10). Al observar con luz visible se detectaron en el extracto metanlco dos fracciones con Rf de 0.89 y 0.92. En el extracto hexnico no se observ ninguna fraccin a la luz visible. Esto se muestra en la Tabla 9, Figura 5.

TABLA 9

Resultados de la cromatografa en capa delgada del extracto metanlco de hoja de C. cordifolia, observada a la luz visible.
Fraccin del extracto metanlico Rf Color luz vis

0.89

verde

0.92

verde

FIGURA 5
Cromatograma de los extractos hexnico y metanlico de hoja de C. cordifolia, observada a la luz visible

Al observar el cromatograma

con

luz ultravioleta, en el carril

correspondiente al extracto metanlico, se percibieron nueve fracciones en el rango de Rf de 0.1 - 0.5 y 10 fracciones en el rango de 0.51-0.09. Con

respecto al carril del extracto hexnico se observan 3 fracciones con Rf de 0.01, 0.34 y 0.92, como se puede apreciar en las Tablas 10 y 11, Figura 6.

TABLA 10

Resultados de la cromatografa en capa delgada, del extracto hexnico de hoja de C. cordifolia, revelado con luz ultravioleta.

Fraccin Ext. Hexnico

Rf

color a la luz UV

0.01

azul

0.34

azul

0.92

azul fluorescente

TABLA 11 Resultados de la cromatografa en capa delgada del extracto metanlico de hojas de C. cordifolia revelado con luz UV.
Fraccin extracto metanlico Rf Color a la luz UV

1,2,3,4

0-0.2

azul

0.21

rojo

6,7,8

0.22-0.5

azul

0.5

azul fluorescente

10, 11

0.51-.6

rojo

12,

0.65

rojo

13,14,15,16

0.7-0.88

rojo

17

0.89

violeta

18

0.9

rojo

19

0.92

azul fluorescente

extracto hexnico

extracto metanlico

FIGURA 6

Cromatograma de los extractos hexnico y metanlico de hoja de C. cordifolia, revelada con luz ultravioleta

Se utilizaron otros reactivos para el revelado de acuerdo a los resultados de las reacciones qumicas. Con el reactivo de Liebermann-Buchard, el cual detecta esferoides y triterpenos cuando se obtienen bandas de cualquier color que permanezcan despus de una hora.

Las bandas positivas que se obtuvieron en

el extracto metanlico,

fueron 4 fracciones en el rango de Rf de 0.01 0.17 y dos fracciones en el rango de Rf de 0.9 - 0.93. En el extracto hexnico, se obtuvieron dos con Rf de 0.72 y 0.89, como se observa en las Tablas 12 y 13, Figura 7.

TABLA 12

Resultados de la cromatografa en capa delgada del extracto hexnico de hoja de C. cordifoHa revelado con reactivo de Liebermann-Buchard.
FRACCIN Extracto Hexnico Rf Color c/luz vis

0.72

azul

0.89

verde

TABLA 13

Resultados de la cromatografa en capa delgada del extracto metanlico de hoja de C. cordifofia revelado con reactivo de Liebermann-Buchard.

FRACCIN extracto metanlico

Rf

COLOR c/luz vis

0,01

verde

0.07

azul

0.1

azul

0.17

azul

0.9

verde

0.93

verde

extracto metanlico

extracto hexanico UP*-

; ', i '*'" i'"" t t4* 1 6

FIGURA 7
Separacin cromatogrfica del extracto metanlico de hoja de C. cordifolia revelado con reactivo de Liebermann-Bouchard.

Utilizando uno de los reactivos especficos para saponinas el cloruro de antimonio (II). Donde son positivas a la observacin de luz visible coloraciones de rojo a violeta y con luz ultravioleta principalmente coloracin de rojo a violeta y azul y verde fluorescente.

Las bandas positivas para saponinas, con luz visible en el extracto metanlico, fueron tres fracciones, en el rango de Rf entre 0.1 - 0.26 y una con Rf de 0.75 de color violeta. Y con luz ultravioleta, positivas para

saponinas con los mismos Rf, pero con colores: verde fluorescente, roja, violeta y violeta respectivamente.

En el caso del extracto hexnico se obtuvo una sola banda, positiva para saponinas, con un Rf 0.75 color violeta tanto con luz visible como con luz ultravioleta. Lo anterior se observa en las Figuras 8 y 9, Tablas 14 y 15.

TABLA 14 Resultados de la cromatografa en capa delgada del extracto metanlico de tipja de C. cordifofia, revelado con reactivo de cloruro de antimonio (SbCI3)
FRACCIN extracto metanlico Rf COLOR (c/luz vis, SbCl3) COLOR (c/luz vis, SbCla)

0.1

violeta

verde fluorescente

0.17

violeta

roja

0.26

violeta

violeta

0.75

violeta

violeta

TABLA 15 Resultados de la cromatografa en capa delgada del extracto hexnico de hoja de C. cordifolta, revelado con reactivo de cloruro de antimonio (SbCl3
FRACCIN extracto metanlico Rf COLOR (c/luz vis, SbCls) COLOR (c/luz vis, SbCl3)

0.75

violeta

violeta

Punto de aplicacin

Extracto Hexnico

Extracto Metanlico

Frente solvente

FIGURA 8 C r o m a t o g r a m a del extracto hexnico de hoja de C. cordifolia, revelado con reactivo de cloruro de antimonio.

Extracto Hexnico

Extracto metanlico

FIGURA 9
Cromatograma de extractos hexnico y metanlico de hoja de C.cordifolia revelado con cloruro de antimonio y observado con luz Ultravioleta.

5. DISCUSIN

El principal objetivo del estudio de las plantas medicinales es validar la eficacia de su uso como remedios caseros tradicionales contribuyendo de esta manera con su valor cientfico, por lo general las plantas medicinales son

utilizadas como extractos acuosos o etanlieos, donde la presencia y concentracin de los compuestos activos depende de varios factores: aun en una misma especie, lugar de recoleccin, poca del ao, porcentaje de humedad, mtodo de preparacin, cantidad empleada, etc. Factores que

debern tomarse en cuenta, cuando se pretende valorar una planta utilizada en medicina tradicional. La colecta de la especie estudiada en esta trabajo se realizo siguiendo el conocimiento popular local.

Por otra parte los resultados cientficos de una planta medicinal nos llevan no solo a validar su eficacia, sino en muchas ocasiones al descubrimiento de nuevos compuestos con resultados, no precisamente relacionados con los usualmente reportados en medicina tradicional.

Las tcnicas de extraccin diferentes a las utilizadas de la manera tradicional nos llevan a encontrar compuestos con otras actividades biolgicas, donde los resultados no necesariamente son similares a fas que ocurren con los procedimientos tradicionales; esto posiblemente sea debido a que se extraen diferentes compuestos dependiendo del tratamiento de la muestra.

Se han reportado inclusive, casos donde es posible encontrar efectos opuestos como en el extracto acuoso y el metaniico de la raz de Spiraea prunifolia que se ha demostrado efectos opuestos sobre la generacin de NO como efecto del INF-gamma en la lnea celular de macrfagos RAW 264.7; los extractos acuosos inducen la generacin de NO mientras que los metanlicos lo inhiben (So, et al.,1999).

En el presente trabajo se estudio el efecto de la liberacin de NO en macrfagos peritoneales murinos, por extractos de la planta Carlowrightia cordifolia, los cuales se prepararon utilizando por separado hojas, raz y tallo preparados por diferentes maneras: infusin, maceracin (acuoso y etanlico) y extraccin por reflujo continuo con solventes de polaridad creciente (hexnico y metaniico).

De los resultados obtenidos los correspondientes a hoja fueron los que presentaron efecto en los cuatro extractos, fueron estadsticamente

significativos el hexnico

y metaniico en la produccin de NO como efecto

activador de macrfagos (156.6 y92.8pM, p< 0.001),

Cuando los macrfagos fueron incubados con los extractos de hojas de C. cordiflia, sin estimulo de LPS, fue detectado produccin de NO en todos los casos.

Los

extractos

hexnicos

fueron

los

que

produjeron

la

mayor

concentracin de NO, con un incremento de 2.25 veces

con respecto a la

determinada en los macrfagos estimulados con LPS. La concentracin de NO producida por los extractos metanlicos fue 1.36 veces menor que el control de LPS.

Los extractos

acuosos, inducen liberacin de NO en cantidades

similares al control de LPS. Los cultivos de macrfagos que se incubaron con el extracto etanlico muestran una reduccin en la concentracin de NO, pero con menor inhibicin (33.8 %) que el control de LPS.

En los ensayos de los extractos con los macrfagos estimulados con LPS, los resultados mostraron que todos inhiben la generacin de NO. Los extractos metanlico y etanlico resultaron ms potentes que los extractos acuosos y hexnicos. La actividad inhibitoria detectada en el extracto etanlico muestran una actividad biolgica con una aparente correlacin con los atributos antiinflamatorios reportados de la planta. Los resultados obtenidos no son suficientes para confirmar que la actividad antiinflamatoria en este caso es

mediada por ei NO. Sin embargo contribuyen al controversia! estudio del papel del NO en los procesos inflamacin-antiinflamacin.

Todos los extractos probados mostraron un efecto inhibitorio sobre las cantidades liberadas de NO por ios macrfagos estimulados con LPS

(24.47 pM). Los extractos acuoso y hexnico produjeron 11.9 y 10.56 pM los cuales corresponden a un 51.4 % y 56.9 % de inhibicin respectivamente. Los extractos etanlico y metanlico inhibieron completamente la produccin de NO en cultivo de macrfagos estimulados con LPS.

Por otro lado el incremento de la concentracin de NO observada en macrfagos no estimulados con LPS, podra ser relativo a ios atributos

regulatorios de retroaimentacin del NO en el proceso inflamatorio (Peng, et al.,

1998).

Se comprob un efecto activador en macrfagos con produccin de NO tanto en los extractos hexnicos como en los metanlicos de hoja, pero no en tallos y raz, io que podra contribuir a ios efectos antiinflamatorios atribuidos a C. cordifolia, donde principalmente se utilizan las hojas.

Esto es, considerando

los efectos autorreguladores de ia inflamacin

que ejerce el aumento de la concentracin de NO, ya que se sabe que el aumento de la concentracin de NO inhibe al factor N-KAPPA el cual es responsable de la transcripcin de la enzima iNOS y el receptor de membrana

VCAM1, por incremento en ia expresin y traslocacin de su inhibidor Ik-B ambos directamente responsables de que se mantenga el proceso inflamatorio (Spiecker, etal., 1997).

Este incremento estimulados-LPS,

de concentracin de NO liberado en macrfagos no resultado a los atributos regulatorios de

podra ser

retroalimentacin en procesos de inflamacin (Peng, et al., 1998; Colasanti and Persichin, 2000). Esto va de acuerdo con los efectos inhibitorios de donadores exgenos de NO sobre la produccin de citoquinas inflamatorias tales como IL-1 y MIP-1alfa en macrfagos alveolares humanos (So, et al., 1999). Tambin se ha demostrado in vivo que el NO exgeno atena la interaccin leucocitoendoteiial.

En la medicina tradicional muchas plantas han sido usadas por sus propiedades antiinflamatorias, la investigacin del mecanismo de accin de los procesos inflamatorios han mostrado que ellos pueden inhibir la generacin e NO (Karaca, et al., 1995) o ser capaz de inhibir la produccin de NOS al nivel de genes (Kang, et al., 1999), la expresin del RNAm para produccin de iNOS y/o inhibicin de NF-kB (Bork, et al., 1997; Hehne, et al., 1998; Guido, et al., 1998; Lys, et al., 1999; Wong, et al., 1999). La utilizacin de plantas

medicinales para combatir problemas inflamatorios se ha incrementado. De ah que sea importante tratar de esclarecer su posible modo de accin para evaluar los efectos farmacolgicos y su posible efecto en este uso.

Por lo que se infiere que el mtodo de extraccin por reflujo continuo (no convencional) que se utilizo fue ms eficiente, en los resultados de las pruebas de identificacin qumica que se efectuaron fueron positivas para saponinas, triterpenos, esteroides y azucares. Las saponinas utilizadas en drogas oficiales son principalmente derivados triterpnicos, con una pequea cantidad de esteroides. Su caracterstica hemoltica varia dependiendo del tipo de

sustitucin. Las saponinas triterpnicos poseen un sistema de anillo pueden ser cidos debido a la presencia de uno o dos grupos carboxlicos y /o un grupo carbohidratos, el cual contiene unidades de 1 -6 monosacridos siendo los mas comunes glucosa, galactosa, ramnosa, arabinosa, fucosa, xilosa, cido glucurnido y cido galacturonico. Por otra parte las saponinas esteroidales son principalmente derivados del furostanol (bisdesmosido), los cuales no y no

presentan grupos carboxlicos y poseen pocas unidades de azucares,

presentan actividad hemoltica. Por lo que se propone que los extractos metanlicos y hexnico de C. cordifolia podran presentar una mezcla de saponinas ( Wagner, et al., 1983) que pueden ser las responsables de la actividad antiinflamatoria de la planta.

Con relacin a los resultados obtenidos en la actividad antibacteriana que se presenta en la tabla 6, apoyan el uso popular de esta planta como antisptica.

En cuanto a los resultados de inhibicin de crecimiento de E. histolytica de los extractos metanlico y acuoso de hoja, presentados en la tabla 7, dan pauta para investigar mas a fondo, con el objeto de obtener el compuesto o compuestos responsables de esta actividad, as como recomendable estudiar el efecto de estos extractos en otros protozoarios aminocondriate como Trchomonas vaginalis y Gardia lamba, tambin causantes en la actualidad de problemas de salud pblica.

Es necesario experimentacin para

realizar mas investigaciones utilizando animales de comprobar su efectividad in vivo y llegar a la

caracterizacin final y purificacin del compuesto responsable con el propsito de identificar y proponer una droga nueva, que podra ser ms poderosa y menos txica.

6. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

6.1

CONCLUSIONES

1)

La actividad antiinflamataria de C. cordifolia, puede ser justificada, por la estimulacin de macrfagos con produccin de NO.

2)

La mejor actividad biolgica se encontr en hojas, lo que coincide con su utilizacin en medicina tradicional.

3)

Los extractos de hoja de C. cordifolia en las pruebas qumicas y cromatogrficas utilizadas, dieron positivos para saponinas, compuestos que pueden ser responsables de la actividad inmunoestimulante.

4)

El extracto hexnico de hoja de C. cordifolia, present actividad antmcrobiana sobre todos los microorganismos probados, y fue relevante sobre Salmonella, sp y Candida albicans.

5)

El extracto acuoso y metanlico de hoja de C. cordifolia, presentaron actividad antiamibiana sobre Entamoeba histolytica, lo que plantea la

presencia de algn compuesto con actividad antiparasitaria.

RECOMENDACIONES

1)

Aislar caracterizar los compuestos activos responsables de las actividades encontradas.

2)

Efectuar estudios con los compuestos activos sobre la inhibicin de activacin del factor nuclear kappa B.

3)

Estudiar otras especies mexicanas correspondientes a la familia Acanthacea, para buscar el mismo efecto biolgico presentado con la Carlowrightia cordifofia.

4)

Implementar mtodo de micro propagacin de la planta estudiada. *

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Archives of Medical Research

ELSEVIER

Archive*of M e d i c a lR v s e a r c h M

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Antiamebic Activity of Aqueous Extracts from Five Medicinal Plants from Northeastern Mexico
Delia E. Cruz-Vega,* ** Abigail Aguilar,*** Jorge Castro-Garza* :>nd Ma. Teresa Gonzlez-Garza*
* Pi vi,stn Je tiolt/tifo Celular y Moleta lar, Ceir de Investigati'! ** facultad de Ciencias Biolgicas. **'Herbar> Hiomd a ik Sorestc. bf-niuin Sini" VV/. Mexico Citx. Me titano Mexico </</ Ssxuro Social Mexico (IMSSl. Universidad Autnoma de huevo ts<in, Monterrex, Nuevo jcn,

IMSS, Centro Mdico Alacnal

Key Words: Eniatnoelxi histolytica. Therapy. Folk mcdicine. Plant aqueous extracts.

Introduction Amebiasis is a parasitic disease that extends worldwide, and is a public health problem in developing countries (1). To date, there is no ideal treatment for amebiasis. This is mainly due to the toxicity of antiamebic drugs and the emergence of resistant strains (2). Accordingly, the search for new anriaroebic drugs that are more potent and less toxic than those currently used is one of the priorities of research (3). Research on plants used in traditional medicine as antiamebic medication offers an alternative to the development of new drugs and/or validation of their use in folk medicine. In addition, it is important because it is a common form of medication for people who embrace traditional medicine as an alternative, or as the only available medicine. Considering that teas or infusions are one of the most frequent routes of administration in traditional medicine, (he aim of this study was to verify in vitro the possible antiamebic activity of aqueous extracts from five plants used in Northeastern Mexico.

separated and allowed to dry at room temperature. Ten grams of each dried sample were extracted with 250 mL boiling water for 10 min (aqueous extract). The samples were then filtered through a raw cotton filter, sterilized by filtration, and used immediately. Amehas. Entamoeba histolytica, HM-I:IMSS strain was used in all experiments. The trophozoites were maintained in axenic conditions in PEHPS medium (4). and subculturcd ever)' 4 days. A.t.wv method. The assay was performed as described previously (5). Briefly, culture tubes containing 11 mL of PEHPS medium were inoculated with 1.1 X 104 amcbas. after which the culture tubes were added (in triplicate) with 100 | i L of each aqueous extract. The tubes were incubated for 72 h at J 6C , cooled in ice water for 10 min, and the number of truphozoites/mL in each tube determined with a hcmocytometer. The results are expressed as the percentage of growth inhibition with respect to untreated controls.

Materials and Methods Plains. Lepidimtt virginicum L. ( Cruciferae), Acacia famesiana L. ( Leguminosae), Acacia rigidula Benth ( Leguminosae), Parkinsonia aculeata L. t and Carlowrightia cordifoita A. Gray (Acanthaceae) were included in this study. All plants were collected around the city of Monterrey, with the exception of L. virginicum, which was collected near Mexico City. The taxonomic identification was made at the IMSS Herboliirium in Mexico City. After collection, the specimens were cleaned and the roots, stems, and leaves Results and Discussion All aqueous extracts tested inhibited growth of E. histolytica trophozoites. The highest activity was detected in leaf extracts, with exception of L virginicum. in which stem extracts were more potent inhibitors. Acacia rigidula showed the highest inhibitory activity of all plants included in this study (Table 1). These results support the popular use of these plants. It is important to emphasize that activity was tested in aqueous extracts because teas or infusions from whole plants or their components are an extended practice to treat amebiasis in folk medicinc around the world. This also suggests an inexpensive alternative for antiamchic medication. The*c aqueous extracts should be further investigated to define their reliability as antiamebic medications through

A d d r e s s reprint requests io: M a . T e r e s a G o n z l e z G a r z a y

B a r r o n , Cener
Nuevo Ijctin.

d e l i n c e i i iici('n D i o m c i i i c a d e l N i w e s i c , A d m i n i s t r a c i n d e C o r r e o s N o . 4 . Apdo. Pi l a i 20. Col. Independencia. 64720 Monlerrey. M e x i c o . T e l e f a x : ( + 5 2 l ( K ) 1 9 0 - 4 0 3 5 : Fi-mail: m t o n / a l ( 0 , m u i l . m i y . i l c s n i . n H P r e s c n i i n j ! a u t h o r : IX-lia tv. C r u z - V e g a ,

(II S S - 4 4 ( W / I K I S sc'C I r o n ! n u n l o r . C o p y r i g h t O 2(HX) I M S S . P u b l i s h e d h y l i l s c v i c r S c i e n c e Ino I'll Sill KK-44(lliH)(l|l)(ll2K-4

Life Sciences
ELSEVIER Life Sciences 70 (2002) 1279-1284

Leaf extracts of Carlowrightia cordifolia induce macrophage nitric oxide production

Delia E. Cruz-Vega 3 *, Abigail Aguilai^, Javier Vargas-Villarreai41, Ma. Julia Verde-Star 0 , Ma. Teresa Gonzlez-Garza 8 **
Divisin de Biologa Celular v Molecular. Centro de Investigacin Biomdica del Noreste. MSS, Administracin de Correos No. 4. Apartado Postal 020. Col. Independencia,
b

Monterrey. NL, 64720, Mxico Herbario MSS, Centro Medico Nacional Siglo XXI, Apartado Postal 21 580,04000 Mxico Df. Mxico c Drv3n de Postgrado, Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Aulnonia de Nuevo Len. Ciudad Universitaria, Apartado Postal F-I6. San Nicols de los Garza, NL, 66450. Mxico Received 14 November 2000; accepted 7 September 2001

Abstract
Carlowrighiw cordifotia (Acanthaccae) is a medicinal plant used in northeastern Mexico as a traditional remedy against inflammation. As tissue release of nitric oxide (NO) has been correlated with both inflammatory and anti-inflammatory processes, the aim of this study was to determine the effect of C. cordifolia leaf extracts on macrophage NO production. Lipopoly&accharide (LPS)-stimu1ated and non- LPS-s ti m ulated mouse peritoneal macrophages were incubated with aqueous.ethanol. methanol and hexane extracts of C. cordifolia leaves. AH extracts inhibited NO release from LPS-stimulated macrophages, with methanol and hexane extracts showing the greatest inhibition. On the other hand, macrophage cultures treated with extracts without LPS-stimulation produced high releases of NO. These unexpected results suggest two different ways by which leaf extracts may act, depending on cell status. On the other hand, data on NO activity in relation to inflammatory/anti-inflammatory auto-regulatory feedback and high concentrations of N O release by non-stimulated macrophages agreed with the hypothesis that NO may have an inhibitory effect in vascular inflammation. 2002 Elsevier Scicncc Inc. All rights reserved. Keywords: Nitric oxide: Anti-inflammatory: Macrophages: Traditional medicine: Carlowrightia cordifolia

Introduction
Nitric oxide (NO) has been correlated with the inllammatory process, in which multiple cytotoxic effects are related to the ability lo increase vascular permeability and edema. This
* Corresponding author. Tel.: +52-8-1904035: fax: +52-8-1904035. E-mail address: mtgonzal@mail.mty.itsem.mx ( M X Gonzalez-Garza) 0024-3205/02/$ - sec front mailer 2002 Elsevier Scicnce Inc. A l l rights reserved. PI 1: S 0 0 2 4 - 3 2 0 5 ( 0 1 )01 5 0 4 - 1

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