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PROYECTO DE INVESTIGACION

I.INFORMACION GENERAL

1. Título del proyecto:


Identificación de genes de polifenoles mediantes PCR digital responsables de la actividad
antimicrobiana de Jamaica
2. Personal investigador:
2.1 Autores: Bonilla Leon kevin
Fenco Reyes Cesar
Lozano Salazar Mirella
Zapata Santamaria Elvis
2.2 Asesor: Mg. Jhon Garcia Lopez

3. Tipo de investigación:

3.1 De acuerdo al objetivo de la investigación: Básica


3.2 De acuerdo a la respuesta del problema: Descriptiva

4. Localidad e institución donde se desarrollará el proyecto:


4.1. Localidad: Lambayeque
4.2. Institución: Laboratorio de Bi ol ogí a Molecul ar de la Facultad de Ciencias
Biológicas. Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.

5. Duración del Proyecto: 3 meses

6. Fechas de inicio y término:


6.1 Inicio: Noviembre 2018
6.2 Término: Enero 2019

Lambayeque, Noviembre del 2019


II.PLANTEAMIENTO DE LA INVESTIGACION
2.1. Realidad problemática

La PCR digital (dPCR), se encuentra actualmente en el punto de mira de una amplia

gama de especialidades médicas ya que ofrece el potencial para realizar una

cuantificación absoluta con precisión, agregando sensibilidad y exactitud superiores a

los métodos moleculares tradicionales.

2.2. Objetivos generales y específicos


Objetivo general
 Identificar los genes de flavonoides responsables de la actividad

antimicrobiana de Hibiscus sabdariffa mediante la técnica de PCR Digital.

Objetivos específicos:

 Emplear técnicas moleculares para la identificación (dPCR) de genes en

especifico

 Desarrollar un ensayo de PCR digital para detectar los genes responsables de

la actividad antimicrobiana de Hisbiscus sabdarifa


III.DISEÑO TORICO
3.1. Antecedentes

Los cálices de flor de Jamaica (Hibiscus sabdariffa ) representan un importante

recurso alimenticio y etnobotánico ya que son empleados en bebidas (té, vinos),

conservas y colorantes. El consumo habitual de estos presenta propiedades

benéficas para la salud, tales como actividad antihipertensiva, cardioprotectora y

antioxidante; estas propiedades, se ven influenciadas por el método de extracción

de sus compuestos bioactivos.

Los compuestos polifenoles constituyen un amplio grupo de sustancias, se

caracterizan por llevar en su estructura más de un anillo de benceno con grupos

hidroxilo generalmente funcionalizado (Crozier et al., 2009). Existen cerca de 8000

compuestos descritos, con diversas estructuras. En general, los polifenoles se

pueden dividir en al 18 menos diez tipos dependiendo de su estructura básica:

fenoles simples, ácidos fenólicos, cumarinas e isocumarinas, naftoquinonas,

xantonas, estilbenos, antraquinonas, flavonoides y ligninas (Wollgast & Anklam,

2000).

Los flavonoides son especialmente conocidos por ser agentes antimicrobianos

efectivos contra una amplia gama de microorganismos. La actividad se atribuye a

su capacidad para formar complejos con proteínas solubles y extracelulares y con

la pared celular bacteriana . Existen varios informes publicados sobre la actividad

antibacteriana de diferentes extractos de hierbas.


3.2 Bases Teóricas

Los cálices de esta planta son ricos en compuestos fenólicos en los que se

encuentran los flavonoides y las antocianinas con una marcada actividad fisiológica

(Olatunde, 2003)

Respecto al contenido de compuestos bioactivos (principalmente fenoles y

antocianincas), este varia de acuerdo a la variedad de la flor de Jamaica, así como

al método de extracción utilizado.

En un estudio realizado por Peng- Kong et al. (2002), mencionan que de acuerdo

al análisis por cromatografía de liquidos de alta resolución (HPLC), las principales

antocianinas presentes en la flor de Jamaica son la delfina – 3 – sambubiosido

(71.4%) y la cianidina – 3 – sambubiosido (26.6%).

Las antocianinas se sintetizan en determinados tejidos y únicamente durante

determinadas etapas de vida de la planta, las cuales han sido objeto de investigación

genética y bioquímica, cuyos resultados han permitido conocer la ruta biosintética

de los flavonoides (Boss et al., 1996), misma que da información acerca de las

reacciones involucradas y sobre algunos genes que son altamente expresados en

estadio de flores y especialmente en las etapas de maduración del fruto cuando

ocurre el desarrollo del color.

La acumulación visible de estos compuestos usualmente refleja la actividad de las

enzimas involucradas en la ruta biosintética (Jaakola et al., 2002), las cuales, pueden

actuar como complejos multienzimáticos asociados con las membranas, lo que

impacta la regulación, eficiencia y especificidad de la vía metabólica (Jeong et al.,

2004).
Zhang (2004), menciona que la síntesis de estos pigmentos comienza con la

conversión de los precursores fenilalanina y acetato. La chalcona sintasa (CHS)

condensa los precursores activos malonil CoA y 4-cumaronil CoA para formar

naringenina-chalcona (Wesche, 1999). Asimismo, indica que en las flores, la

flavonona 3-hidroxilasa (F3H), enzima del tipo citocromo P450 hidroxilasa,

cataliza la hidroxilacion del carbono 3 del anillo C de naringenina, para

transformarlo en dihidrokaempferol y dirige el flujo de carbono a la síntesis de

Cianidina, Delfinidina y Peonidina en menor proporción (Camire, 2002). Esta etapa

es de gran importancia, ya que los diferentes patrones de hidroxilación que se

distinguen en las antocianinas generan los colores característicos que van desde rojo

hasta púrpura, lo que determina además su capacidad antioxidante (Eder, 1996).

La expresión de los cinco genes que codifican para las enzimas PAL, CHS, F3H,

DFR Y ANS se producen en dos fases: en la floración (temprana) y otra cercana al

cambio de color del fruto (tardía) (Boss et al., 1996). Por lo que, amplificar

mediante PCR digital los cuatro principales genes F3`H, F3`5`H, DFR y ANS

relacionados con la biosíntesis de antocianinas en jamaica (Hibiscus sabdariffa)

constituye el principal obejtivo de trabajo.

Especie Gen Secuencia del primer (5’ 3´)

(Hibiscus sabdariffa F3´H

F3’5’H

DFR

ANS
Fundamentos de dPCR

La reacción en cadena de la polimerasa digital (dPCR) permite la cuantificación

absoluta de los ácidos nucleicos diana presentes en una muestra y alivia las

deficiencias de qPCR. En dPCR, la muestra se divide primero en muchas sub-

reacciones de PCR independientes, de modo que cada partición contiene algunas

secuencias objetivo o ninguna. Después de la PCR, la fracción de particiones

positivas de amplificación se usa para cuantificar la concentración de la secuencia

objetivo con una precisión estadísticamente definida utilizando las estadísticas de

Poisson. Curiosamente, la partición de muestras concentra eficientemente las

secuencias objetivo dentro de los microrreactores aislados. Este efecto de

concentración reduce la competencia de plantilla y, por lo tanto, permite la

detección de mutaciones raras en un contexto de secuencias de tipo salvaje.

Además, también puede permitir una mayor tolerancia a los inhibidores presentes

en una muestra.

La muestra se divide en muchas particiones independientes, de modo que cada una

contiene algunas secuencias objetivo o ninguna. La distribución de secuencias

objetivo en las particiones se puede aproximar con una distribución de Poisson.

Cada partición actúa como un microrreactor de PCR individual y las particiones

que contienen secuencias diana amplificadas se detectan por fluorescencia. La

relación de particiones positivas (presencia de fluorescencia) sobre el número total

permite determinar la concentración del objetivo en la muestra.


IV. DISEÑO METODOLICO

4.1. Diseño de la investigación : Esta investigación es de tipo descriptiva transversal,,

dado que reseña las características de un fenómeno existente

4.2. Población: La población objetiva del presente estudio estará constituida por las

muestras de extracción de ADN de los cálices de Hisbiscus sabdariffa

4.3. Muestra: Se representa por ejemplares de Hisbiscus sabdaruffa procedentes de la

región Lambayeque, con un total de 10 ejemplares.

4.4 Técnicas instrumentos, equipos y Materiales

4.4.1 Técnica:

4.4.1.1 Metodología

El estudio molecular se llevara a cabo en base a protocolos ya establecidos y con la respectiva

accesoria correspondiente.

4.4.1.2Recoleccion de muestras de Jamaica

La recolección de muestras de Hisbiscus sabdariffa se llevara a cabo en la región Lambayeque,

se recolectara un total de 10 ejemplares.

4.4.1.3 Extracción de ADN

El ADN para las pruebas moleculares fue extraído con un kit comercial (Wizard Genomics

Promega, Madison WI. USA), siguiendo el protocolo para bacterias Gram negativas

recomendado por la casa comercial.

4.4.1.4 Aplicación de PCR digital

Haciendo uso de la facultad de emplear el equipo para PCR digital se amplificara los genes

ya previamente establecidos mediante previa revisión bibliográfica.


4.4.3 Equipos y Materiales

Digital PCR system , Balanza analítica, Micropipetas, Aua destilada.

V.ACTIVIDADES Y RECURSOS

5.1 Cronograma
2019 2020
Actividades Noviembre Diciembre Enero

FASE DE PLANEAMIENTO
Revision bibliográfica X
Elaboración del X
Proyecto
Presentación del X
Proyecto
Implementación del X
Proyecto
FASE DE EJECUCION
Recolleccion de X
muestras
Procesamiento de
muestras X
Registro de resultadoso X
Analisis estadístico de
los datos X
FASE DE COMUNICACION
Analisis e X
interpretación
Elaboracion de informe X
final
Presentacion de X
informe final
VI.REFERENCIAS BIBLIOGRAFÍCA

 Salazar Bermeo , Análisis de actividad antimicrobiana del extracto de flor de


Jamaica (Hibiscus sabdariffa L.) sobre microorganismos indicadores de
contaminación en alimento
http://repositorio.ute.edu.ec/xmlui/bitstream/handle/123456789/18833/71045
_1.pdf?sequence=1&isAllowed=y

 Ruban, P. y Gajalakshmi, K. (2012). Actividad antibacteriana in vitro del


extracto de flor de Hibiscus rosa-sinensis contra patógenos humanos. Revista
de biomedicina tropical del Pacífico asiático , 2 (5), 399–403. doi: 10.1016 /
S2221-1691 (12) 60064-1
 Graciela López Guzmán. Aislamiento de los genes de la ruta biosintética de
antocianinas en Jamaica (Hibiscus sabdariffa L)
http://fuente.uan.edu.mx/publicaciones/0308/3.pdf?fbclid=IwAR2u5_6vFLTJ
cqSQg-lU7enRaYdsSve61Nmz4Fo47xfmteaOLCL7-4x-xLM

 Quan, PL, Sauzade, M. y Brouzes, E. (2018). dPCR: una revisión tecnológica.


Sensores (Basilea, Suiza) , 18 (4), 1271. doi: 10.3390 / s18041271