ESTRUCTURA Y FUNCION CELULAR

La cooperacin armnica de todos los seres surgi, no por ordenes de una autoridad externa a ellos mismos, sino al hecho de que todos ellos son parte en una jerarqua de conjuntos formando un modelo csmico y lo que obedece son los dictados internos de su propia naturaleza. Chuang, Tzu (Tercera Centuria A.C.)

CONTENIDO
Prefacio PARTE I. BIOLOGIA DE LA CLULA 1. EL DENOMINADOR COMN DE LA MATERIA VIVIENTE 2. LA VIDA Y LA SEGUNDA LEY DE LA TERMODINAMICA 3. LA HISTORIA NATURAL DE LA CLULA

PARTE II. ESTATICA BIOLGICA 4. 5. 6. 7. LA VIDA Y LA TABLA PERIDICA EL AGUA Y LA VIDA LAS PEQUEAS MOLCULAS DE LA MQUINA VIVIENTE LOS CIDOS NUCLEICOS, PORTADORES DE INFORMACIN BIOLGICA 8. LAS PROTEINAS, AGENTES DE ESPECIFICIDAD BIOLOGICA

PARTE III. DINMICA BIOLGICA 9. LA CATALISIS DE ENZIMAS, MECANISMO DE CONTROL BIOLOGICO 10. CAMINOS METABLICOS. 11. EL MITOCONDRIO Y LA FIJACIN DE LA ENERGIA 12. EL NCLEO Y EL ALMACENAMIENTO Y TRANSMISIN DE INFORMACIN 13. EL RIBOSOMA Y EL USO DE LA INFORMACIN. 14. LA SUSTANCIA FUNDAMENTAL Y LA CONVERSIN DE LA ENERGIA QUIMICA EN TRABAJO. 15. EL SISTEMA DE LA MEMBRANA Y EL INTERCAMBIO DE MATERIALES. 16. DESARROLLO Y CONTROL DE LA ESTRUCTURA Y FUNCIN CELULAR

PREFACIO
La dcada pasada fue testigo de una acumulacin explosiva de conocimientos profundos dentro de la maquinaria molecular de la clula. Comenzamos a vislumbrar un modelo molecular que incluye fenmenos tales como la autoduplicacin del material hereditario celular y el control que ejerce en la formacin de las catlisis de la clula. La especificidad biolgica, una propiedad tan caracterstica del mundo viviente, est en relacin con la estructura y la interaccin de las macromolculas. El microscopio electrnico cre repentinamente un nuevo mundo, rico e intrincado en detalles, el cual est siendo activamente interpretado en trminos moleculares. La regulacin de esta maquinaria celular tan complicada, est ahora examinndose en una forma tal, que dentro de muy poco tiempo, tendr un rigor operativo. Estos adelantos han dado por resultado la comprensin de que existe una relacin intrincada entre la estructura y la funcin celulares. Las disciplinas ms clsicas de citologa, fisiologa celular, bioqumica y biofsica se estn fundiendo dentro de una estructura comn que frecuentemente se refieren como la biologa celular de la clula". El propsito de este libro es reunir todos estos extraordinarios adelantos y hacerles accesibles al estudiante que empieza. Tenemos la conviccin de que, puesto que la clula es el denominador comn de los sistemas vivientes, es sumamente importante que el principiante se familiarice con los principales hechos y teoras de la biologa celular. Esta introduccin servir para un doble propsito: proveer al estudiante de una base firme desde la cual pueda examinar los otros mltiples fenmenos de la vida del universo y tambin lo convencer, desde que se inicia, de la importancia crucial de las ciencias fsicas para el estudio de los sistemas vivientes. A causa de lo reducido de su tamao, este libro omite tanto ciertos tpicos como trata a otros con inevitable brevedad. Sin embargo, el material contenido en las lecturas que se sugieren al final de los captulos, ampliar considerablemente el alcance del texto mismo. No fue intencin de los autores hacer un libro elemental, en el sentido de limitarlo necesariamente a los aspectos ms simples y accesibles de la biologa celular. Aun as, esperamos que ste sea un libro para principiantes puesto que creemos que es precisamente el principiante el que necesita una visin actualizada de este campo de estudio. A.G.L. PoS.

PARTE I

BIOLOGIA DE LA CELULA

Huso mictico como se observa con el microscopio de luz polarizada. Las fibras del huso que separan a los cromosomas se ven como rayas brillantes. Arriba: Oocito de un gusano marino, el Chaetopterus pergamentaceous. Abajo: Clula endosprmica del fruto del lirio sanguneo del Africa, el Haemanthus katherinae. Los pares de cromosomas se observan en el momento de la separacin. (Fotografa cortesa e S. Inou, Dartmouth Medical School y de Chromosoma)

CAPITULO UNO
EL DENOMINADOR COMUN DE LA MATERIA VIVIENTE

E1

estudio del mundo viviente es tan antiguo como el hombre porque la clasificacin y comparacin de la enorme cantidad de formas vivientes est ntimamente ligada a la supervivencia del hombre. Nuestros antepasados conocan las diferencias entre un murcilago y un pjaro mucho antes de saber que haba una similitud entre los tejidos de una seta y del hombre. El conocimiento de que todos los organismos comparten ciertos principios comunes se remonta hasta la teora celular. Esta teora, enunciada por Schleiden y Schwann en 1838, estableca que todos los organismos vivos estn compuestos de clulas y de sus productos. En la actualidad este principio parece evidente, pero no debemos olvidar que durante mucho tiempo lo hemos considerado implcitamente conocido. Para los predecesores de Sehleiden y Schwann, el concepto de que el organismo es la unidad fundamental de la actividad biolgica era un principio fcilmente observable, bien establecido y comprensible. El hecho de que los organismos estn a su vez compuestos de subunidades ms pequeas, cada una de las cuales es un ente individual fue una revelacin extraordinaria. Ciertamente, hasta donde la clula tiene una individualidad propia y una capacidad independiente de vivir no fue, de ninguna manera, una cosa clara aun para Sehleiden y Schwmm. Slo, hasta ltimamente, hemos comenzado a reconocer el grado en el cual, todas las clulas comparten un importante papel en los principios que llamamos la "maquinaria de la vida". Hemos aprendido que las clulas, ya sean protozoos o clulas del hgado humano, duplican su material gentico de la misma forma, utilizan su poder hereditario para sintetizar protenas de la misma manera, al igual que transfieren la energa, regulan el intercambio de materiales, convierten la energa qumica en trabajo y as todo lo dems. Es ms, fue muy desconcertante para aquellos interesados en la diferenciacin o en el problema del cncer, que tan pocas diferencias fundamentales puedan ser descubiertas entre clulas de diversos tipos. El propsito de este libro es describir las caractersticas comunes de la maquinaria celular, porque creemos que es el "mdulo" bsico, el comn denominador, de todas las variedades de formas vivientes. Sin embargo, no debemos olvidar que todas las clulas desempean papeles determinados dentro de la diversidad de funciones y formas biolgicas; la clula generalizada que vamos a describir es una abstraccin

Fig. 1-1. Varios tipos de clulas encontrados en los reinos microbiano, vegetal y animal

que no existe en la naturaleza. En su lugar, se han encontrado clulas especiales adaptadas para funciones especficas (Fig. 1-1 ): los microorganismos unicelulares simples con su periodo de generacin corto y su adaptacin metablica rpida; la clula vegetal con su vacuolo grande y su pared celulsica delgada manteniendo la rigidez estructural durante el equilibrio osmtico con el medio ambiente; y la clula animal, desnuda y frecuentemente mvil, capaz de ingerir grandes partculas de alimento. En cada uno de estos tres grandes reinos y aun en cada organismo dado hay muchos tipos de clulas diferentes. (Fig. 1-1). El cuerpo de los mamferos, por ejemplo, posee clulas musculares estriadas, alargadas y fibrilares, clulas nerviosas delgadas y ramificadas y clulas intestinales metablicamente activas. Estas y

muchas otras representan especializaciones que capacitan a las clulas a desempear sus papeles especficos. Dado el propsito de este libro, no incluye el tratamiento de estas funciones especializadas sino que ocasionalmente sern mencionadas. Sin embargo, es importante reconocer que muchas de estas funciones celulares especializadas se originan en fenmenos celulares generales que tienen lugar, en forma atenuada, en todo el mundo celular. La conduccin nerviosa est basada en potenciales de accin que aparecen en todas las clulas. La contraccin muscular se basa en un mecanismo de conversin de la energa qumica en trabajo, que parece ocurre universalmente. Por ejemplo, el trabajo osmtico encontrado en forma bastante activa en las clulas del rin, tambin parece ser una propiedad universal de la materia viviente. De manera que si no existe una clula generalizada o arquetipo es conveniente crear una para que sirva como modelo conceptual y en ste se pueden incorporar y discutir la mayor parte de las funciones celulares. Nuestro estudio de la clula arquetipo se basar, como la mayor parte de los enfoques experimentales de la biologa, en la presuposicin de que todos los fenmenos biolgicos pueden analizarse en funcin de principios fsicos y qumicos. Esto, reconocidamente, es un acto de fe que no puede justificarse en terrenos a priori; aunque es un acto de fe eminentemente til y representa la base filosfica de un acercamiento que est proporcionando resultados comunicables y que se pueden comprobar, de una significacin cada vez ms extendida y siempre con creciente rapidez. En verdad, el propsito de este libro es exponer el desarrollo explosivo del conocimiento molecular a la biologa de la clula, LISTA DE LECTURAS QUE SE SUGIEREN Bourne, G. H., 1962. Division of labor in cells. New York: Academic Press. Brachet, J., "The living cell," Scientific American, September 1961.

CAPITULO DOS
LA VIDA Y LA SEGUNDA LEY DE LA TERMODINAMICA

Se ha estimado que hace entre dos y cuatro mil millones de aos que la vida
comenz en nuestro planeta. Si sta principi espontneamente partiendo de materia no viviente o si vino a nuestro planeta de sistemas solares distantes, bajo la forma de esporas a travs del universo, no lo sabemos. En cualquiera de los casos, debemos suponer que la vida empez primeramente transformando materiales no vivientes en materia viva. Existen muchas especulaciones en aos recientes sobre el mecanismo implicado en tal conocimiento tan notable. Hemos dicho que la vida se form de materia no viviente. Esto presupone que existe una diferencia entre estos dos estados de materia y es, por lo tanto, lgico preguntarse cul es esa diferencia. No es posible dar una definicin completa de materia viviente puesto que esto implica un conocimiento y entendimiento totales de la misma. No obstante, puesto que por regla general estamos capacitados para distinguir entre animal", "vegetal" y mineral", es lgico preguntamos sobre qu criterio se han basado tales juicios. Existe unicidad de criterios sobre la materia viviente? Generalmente, contestamos esta pregunta enumerando una serie de caractersticas que asociamos a la materia viviente, tales como movimiento, reproduccin, metabolismo, sensibilidad, crecimiento, etc. Se admite comnmente que cada una de estas propiedades se pueden encontrar en el mundo no viviente, pero se arguye que en la materia viviente se hallan presentes simultneamente y en su grado ms complejo de expresin. As, es verdad que se puede reproducir el trabajo de las locomotoras, el pensamiento de las computadoras y algunas mquinas automticas. Hasta ahora no poseemos computadoras que caven zanjas, se reproduzcan, encuentren placer en la poesa y hagan juicios morales. Pero, si consideramos que la materia viviente est sujeta a las leyes de la qumica y de la fsica, entonces debemos aceptar la posibilidad de que tales monstruos puedan, en principio, ser construidos. Concluiremos entonces que no hay necesidad de que exista una diferencia esencial entre el hombre y el monstruo? Pensamos que si, pero con una condicin crucial: los orgenes histricos del hombre y del monstruo son diferentes. El hombre construy al monstruo y no el monstruo al hombre. Entonces nosotros presentamos un criterio de materia viviente de carcter histrico. La vida es un proceso que parti de un nivel poco complicado, el cual se hizo espontneamente ms complejo durante un proceso que llamamos evolucin. Este proceso ha tomado mucho tiempo y encuentra su expresin actual ms compleja en la forma del Homo sapiens. La organizacin anteriormente mencionada y siempre en expansin, est

siendo, al presente, ms profundizada por el homo sapiens a su mundo fsico, de manera que las diferentes formas de organizacin, tanto concretas (edificios, mquinas, etc.) como abstractas (conocimiento, percepcin y aun la sabidura), se van acumulando a velocidad creciente. Si esta nueva forma de organizacin extraorgansmica que llamamos civilizacin establece evolutivamente, llevando a descubrimientos nunca soados en la evolucin social del hombre o si est influida con las contradicciones biolgicamente enraizadas incapaces de solucin en un nivel social, solamente el futuro lo dir. A pesar de las grandes hazaas recientes en la construccin de complicadsimos aparatos mecnicos, capaces de efectuar muchas manipulaciones hasta ahora restringidas a la materia viviente, no debemos menospreciar la intrincada organizacin de los sistemas vivientes. La escala casi infinitamente pequea en la cual la organizacin biolgica es capaz de ser reducida, es una de las ms asombrosas maravillas de la naturaleza. Uno solamente necesita comparar las monstruosas computadoras electrnicas accionadas por megawatios de energa con el infinitamente ms sofisticado cerebro humano accionado con slo microwatios de energa, para reconocer la notable economa espacial y energtica con que trabajan los sistemas biolgicos. El hecho de que el esperma humano sea capaz de llevar en su diminuto volumen, la mitad de todas las determinantes genticas de los individuos maduros, es otro ejemplo del grado de microminiaturizacin que lleva a cabo la materia viviente. Nuestros ingenieros deben aprender an estos trucos fundamentales de la naturaleza. Hemos dicho hasta ahora, que las caractersticas fundamentales del mundo viviente son la evolucin, la conservacin y la extensin de un grado tremendo de organizacin, capaces de ser colocados dentro de pequesimos volmenes. Es este proceso de organizacin, conservacin y extensin una propiedad nica de la materia viviente? La Segunda Ley de la Termodinmica, que es una ley fundamental del universo fsico, establece que los sistemas aislados, espontneamente tienden hacia estados de mayor desorganizacin. A primera vista aparece como si la Segunda Ley no fuera obedecida por la materia viviente y, en verdad, esto fue lo que sospech G. N. Lewis, uno de los creadores de la termodinmica. Sin embargo, a fin de examinar este problema ms cuidadosamente, debemos hacer un enunciado ms preciso de la Segunda Ley de la Termodinmica. El grado de desorganizacin, o entropa, de un sistema, no es la nica propiedad implicada en un proceso espontneo. La "energa libre" es un parmetro importante y se puede definir como la "energa capaz de rea]izar trabajo". Un proceso solamente puede continuar espontneamente cuando hay una prdida de energa libre. En un sistema aislado, a temperatura constante, el cambio en la energa libre y el cambio en entropa estn en relacin, el uno con el otro, por medio de la siguiente ecuacin: F = H - TS en donde

F es el cambio en energa libre H es el cambio en el contenido de calor o entalpa T es la temperatura absoluta S es el cambio en la entropa Aunque la Segunda Ley de la Termodinmica empez como una generalizacin emprica, ha sido posible desde entonces, explicarla, aplicando mtodos estadsticos de anlisis a las partculas de que se compone la materia. Aunque la Segunda Ley predice que un sistema cuando se abandona a si mismo, tender a decrecer su estado de organizacin, permite, sin embargo, un aumento de ella cuando se le proporciona energa libre al sistema. Y esto parece que es lo que ocurre en el caso de la materia viviente. El elevado contenido de energa libre y el bajo estado de desorganizacin de la materia viviente se conservan, y algunas veces se aumentan ms, por medio de un constante abastecimiento de energa libre. Tan pronto como ese abastecimiento se suspende, los sistemas vivientes prosiguen espontneamente hacia un estado de mayor desorganizacin (la muerte). Este tipo de sistema lbil que se conserva a cierto nivel de organizacin por medio de un continuo abastecimiento de energa libre, se describe frecuentemente como estado estacionario. No representa un equilibrio en el cual el sistema ha ganado la ms baja energa libre posible y la ms elevada desorganizacin posible. De hecho, un estado estacionario es un sistema fuera de equilibrio que solamente se puede conservar en su aparente estabilidad por medio de un suministro continuo de energa libre. Un modelo fsico de tal gnero, sera un bao de agua, regulada trmicamente, conservada a una temperatura constante, diferente a la de sus alrededores. Aqu, otra vez el modelo fsico sera diferente al equivalente viviente (esto es, en lo que se refiere a la regulacin de la temperatura de los mamferos) primordialmente por su origen histrico. Despus de todo, nosotros somos los que construimos el bao de temperatura constante. El suministro constante de energa libre es slo uno de los requisitos para la conservacin de un estado estacionario. Debe existir, asimismo, una organizacin mnima capaz de absorber y canalizar la energa para su mejor aprovechamiento. Como bilogos, nosotros creemos que en el caso de la historia de los seres vivientes, esta organizacin ha aparecido bajo la forma de hechos fortuitos, ligados unos a otros, en una progresin de constante aumento de complejidad, por medio del fenmeno de la seleccin natural. Nosotros creemos que este fenmeno de evolucin repentina no viola la Segunda Ley de la Termodinmica, puesto que estuvo "reforzado" por un abastecimiento continuo y generoso de energa libre que tuvo su origen en las reacciones atmicas del sol. Con la aparicin de la inteligencia humana, la evolucin de diversos tipos de organizacin ya sea sta una biblioteca, una teora cientfica, o una computadora no se puede considerar por ms tiempo como hecha al azar, como se cree que se verifican las mutaciones genticas,

aunque en stas tambin son vlidos los principios generales; a saber, que la energa libre es necesaria para permitir la elaboracin de estos productos de la imaginacin humana. Hace cinco mil millones de aos, antes de que apareciera la vida en nuestro planeta, toda la energa libre vertida sobre l, procedente del Sol, era rpidamente disipada como calor intil y radiada al espacio exterior. Entonces se formaron diminutos sistemas, capaces de atrapar algo de esta energa libre, la cual fue utilizada para conservar y aumentar la organizacin de estos sistemas. A medida que progres la evolucin, este proceso se hizo ms eficiente y de mayor extensin. En la actualidad, los rayos recogidos del Sol constituyen la fuente de abastecimiento de energa libre que sirve para construir ciudades o para volver la materia viviente en si misma, en la investigacin de los principios por los cuales es gobernada. El estado estacionario de la vida ha adquirido algo de la energa libre del Sol y la est reteniendo bajo la forma de "biosfera" siempre creciente. Existe una Tercera Ley de la Termodinmica que establece que, en el cero absoluto, la entropa de toda sustancia es cero. Quiz pudiramos enunciar una "cuarta ley" que estableciera que, dando el tiempo suficiente, los bloques atmicos de construccin necesarios, la temperatura adecuada y un constante abastecimiento de energa libre posiblemente fluctuando en un ciclo diurno, se desarrollara, por necesidad, un "bios" de creciente complejidad, que tendera el efecto total de disminuir la velocidad en la cual la energa libre comienza a degradarse. Los puntos de vista comnmente sostenidos por los astrnomos de que los soles del universo estn, probablemente, acompaados por planetas, de los cuales un nmero finito seran semejantes al planeta Tierra, nos llevan a la conviccin de que no estamos solos en el Universo. Ya no pensaremos ms en la evolucin como "una gran coincidencia" de la naturaleza sino como una ley, en todo el sentido de la palabra. Concluyamos, la materia viviente no est fuera del mundo fsico sino que es una parte integrante de l. Es un caso especial fascinante de la materia fsica que se distingue por la larga y caracterstica historia de su desarrollo. LISTA DE LECTURAS QUE SE SUGIEREN BLUM, H. F., 1955. Time's arrow and evolution. Princeton, N.J.: Princeton University Press. OPARIN, A. I., 1961. Life, its nature, origin and development. New York: Academic Press. PENROSE , L. S., "Sel-reproducing machines", Scientific American, June 1959. UREY, H., "The origin of the earth," Scientific American, October 1952. WALD, G., "The origin of life," Scientific American, August 1956.

CAPITULO TRES
LA HISTORIA NATURAL DE LA CELULA

La clula es la unidad biolgica de la actividad. Aunque es divisible en partculas

subcelulares que conservan algunas de las propiedades de la unidad funcionante original, la clula representa, no obstante, una unidad mnima de actividad relativamente independiente. Es la porcin ms pequea del organismo que exhibe el conjunto de propiedades que nosotros hemos asociado con la materia viviente. En este captulo, trataremos con ese conjunto de propiedades, a fin de dar al lector una semblanza de la "personalidad" de la clula. TAMAO Y FORMA DE LA CELULA En el mundo de las matemticas, una ecuacin permanece inalterable si ambos miembros de ella se aumentan en la misma proporcin. Esto no es verdad en el mundo fsico, en donde las relaciones entre los objetos estn demasiado influidas por sus dimensiones absolutas. Es claro que el mundo en expansin y en contraccin de la Alicia de Lewis Carroll, es el producto de la imaginacin de un matemtico, no el de un fsico o de un bilogo. Uno de los primeros investigadores del tamao y forma de las clulas en los sistemas biolgicos, fue el bilogo britnico D'Arcy Thompson, quien seal, por ejemplo, que un elefante que pesara el doble, debera ser soportado por huesos de las piernas que tuvieran una rea transversal cuatro veces mayor. A pesar del libro de D'Arcy Thompson, interesante y ampliamente ledo, los bilogos, en conjunto, han sido tardos en reconocer la importancia de las dimensiones absolutas. Y todava el mundo de la vida cae en un mbito de tamao que, desde un punto de vista csmico, est restringido a una angosta banda de magnitud. La Fig. 3-1 es una sntesis de las relaciones de tamao observado en un nivel csmico, biolgico y atmico. As, por ejemplo, la clula ms grande es mayor que el mamfero ms pequeo, el virus ms grande, mayor que la clula ms pequea, y la macromolcula ms grande, es mayor que el virus ms pequeo. Ilustra el hecho de que los sistemas biolgicos caen dentro de mbitos de tamaos definidos y superpuestos.

Fig. 3-1. Relaciones de tamaos en los niveles atmicos, molecular, biolgico y csmico

Si las clulas caen dentro de cierto mbito de tamao, cules son las leyes que gobiernan este hecho? Nosotros, por conveniencia, definiremos a una clula como una unidad de actividad biolgica, delimitada por una membrana semi-impermeable y capaz de autorreproducirse en un medio libre de otros sistemas vivientes. A un virus lo definiremos como una unidad biolgica autorreproducible que carece de una membrana semi-impermeable definida y que es capaz de autorreproducirse solamente dentro de una clula viva.

Las clulas vivientes ms pequeas se encuentran entre las bacterias. Se han observado especies tan pequeas como esferas, que tienen 250 m de dimetro. (1000 micras [] = 1 milmetro [mm]; 1000 milimicras [m] = l.) Se han observado organismos como el de la pleuroneumonia, llamados "corpsculos elementales" con dimetros de 100 m. Parecen ser formas en reposo de la bacteria, que pueden desarrollarse dentro de cuerpos de 250 m de dimetro durante el metabolismo activo del organismo. Parece ser que 200 a 250 m de dimetro, es el lmite ms bajo de tamao para una clula viviente en actividad. El limite ms bajo se puede establecer por el nmero mnimo y el tamao de los componentes necesarios para una existencia celular independiente. El volumen de una clula de 200 m de dimetro ser de 4 106 m3 aproximadamente. Suponiendo que el 80% de la clula es agua, sta deja un "volumen seco" de 8 l05 m3. Suponiendo un dimetro promedio de 10 m, obtenemos un volumen promedio por macromolcula de 5 102 m3. Ignorando el volumen de los dems componentes principales de la clula, aparte de las protenas y los cidos nucleicos, y dividiendo el volumen promedio de las macromolculas por el volumen seco de la clula, encontramos que existe un espacio solamente para 1600 macromolculas. Suponiendo que existe un mnimo de 500 reacciones metablicas necesarias para una existencia independiente, y que cada paso implica la presencia de una macromolcula de cido desoxirribonucleico, ADN (gen), una de cido ribonucleico, ARN (mensajero) y una de protena (enzima), aparecera que en estas clulas ms pequeas existe lugar solamente para una o dos de cada una de las macromolculas necesarias. Esta es una conclusin interesante, porque ilustra el hecho de que la clula es capaz de comportarse en una forma que se puede predecir y reproducir, utilizando macromolculas, cada una de las cuales se encuentra presente en una cantidad "no estadstica". Los problemas que afectan el lmite superior del tamao de las clulas son muy diferentes. Antes que todo, se debe reconocer que, aunque la gran mayora de las clulas queda en el rango de 0.5 a 20 de dimetro, hay algunas clulas verdaderamente gigantes, cuya existencia est relacionada con ciertas circunstancias biolgicas muy especiales. Las condiciones que afectan el lmite superior en el tamao de las clulas parece que estn relacionadas entre si. Primero, existe una relacin entre el ncleo y el resto de la clula. Como vetemos ms adelante, hay fundamento para aseverar que el ncleo emite ciertos "mensajeros" que determinan la sntesis de las protenas de la clula. Claramente esto determinar la cantidad de citoplasma que determinado ncleo puede "controlar". Algunas clulas, sin embargo, sobrepasan este limite por tener varios ncleos, como sucede en las clulas gigantes de la ameba Chaos chaos o en el alga verde Nitella. Segundo, existe una relacin entre las diferentes partes de la clula. Cuanto ms grande sea la clula, mayor ser el problema de la difusin. En las clulas multinucleadas grandes como las de la Nitella o en les mohos mucosos, este problema se resuelve por una muy activa forma de corriente protoplasmtica. Tercero, existe una relacin entre la

clula y su medio ambiente. La membrana del protoplasma es una cubierta extremadamente impermeable. Cuanto ms grande sea la clula, la relacin entre volumen superficie ser menor. Este factor tiene una tendencia para aislar a la clula de su medio ambiente, situacin que la clula vence, algunas veces, por medio de diversas modificaciones anatmicas. El aumento del rea superficial por medio de una extensa invaginacin, es una de las estratagemas. Otro carcter anatmico distintivo, encontrado en las clulas nerviosas, que pueden tener varios pies de longitud, en los animales ms grandes, es el desarrollo de una geometra en forma de hilos. En un hilo, largo y delgado, el aumento del rea superficial permanece proporcional al volumen, y as, el grado de contacto entre la clula y su medio ambiente, no se reduce. Se puede ver por lo expuesto anteriormente, que la forma de la clula est en intima relacin con su funcin. Esta relacin por si misma es un tpico de grandes proporciones de la biologa celular comparada y est ms all del alcance de este volumen. FUNCION DE LA CELULA Un sistema viviente es un lugar de funcionamiento. Que este funcionamiento tiene una base estructural, es un principio que se considera como tema central de este libro. Pero en ltima instancia, es el funcionamiento de las unidades de la vida el que mejor caracteriza su naturaleza, y es por lo tanto ms conveniente que empecemos nuestra descripcin de la anatoma celular con una descripcin muy generalizada de la funcin de la clula. Como dijimos en el captulo anterior, la materia viviente representa un grado elevado de organizacin (baja entropa) conservado en una condicin de estado constante y lbil, por medio de un abastecimiento continuo de energa libre. Al mismo tiempo (y esto debe ser el aspecto fundamental de tales sistemas), se necesita una organizacin compleja para conducir energa por canales tiles para el mantenimiento de la organizacin. As, la energa es necesaria para el mantenimiento de la organizacin, y sta es necesaria para la utilizacin apropiada de la energa. La Fig. 3-2 es un diagrama de flujo que sintetiza, en trminos muy generales, las diversas transformaciones de la energa verificadas per la clula. Se aprecia que las plantas y los animales se asemejan mucho entre si, excepto en lo que respecta a la fuente primaria de energa, de la cual ellos deben depender. La planta utiliza la energa de la luz para fabricar carbohidratos, grasas y protenas, en tanto que el animal ingiere estas sustancias como alimentos. Los carbohidratos, grasas y protenas no son los combustibles inmediatos que echan a funcionar a la maquinaria de la clula; en su lugar, el TFA (trifosfato de adenosina) realiza esta funcin. La energa liberada per el metabolismo respiratorio de la clula, durante el cual, los carbohidratos, grasas y protenas, son descompuestos en bixido de carbono, agua y

Fig. 3-2. El flujo de energa a travs de los sistemas vivientes. Las lneas llenas se refieren al contenido de "alta energa" y las punteadas al de baja energa

amonaco, es utilizada en diferentes etapas para convertir el DFA (difosfato de adenosina) en TFA (vase el Cap. II). Para resumir, los carbohidratos, las grasas y las protenas son los "combustibles crudos" empleados para producir el combustible de "alto grado" TFA, el que echa a funcionar a toda la maquinaria de la clula. Cul es esta maquinaria de la clula y qu funcin realiza? Trabajo qumico (vanse los Caps. 13 y 14 ) La maquinaria que hemos considerado en la Fig. 3-2 como la que verifica el trabajo qumico est, en realidad, compuesta de muchas mquinas separadas, algunas de las cuales comenzamos a comprender. A diferencia de las mquinas que construimos, la clula tiene que verificar la combustin de los carbohidratos, grasas y protenas en una matriz estructural compuesta de los mismos materiales. As, la clula tiene que reemplazar constantemente a los componentes que se han alterado durante su funcin. Adems, una de las caractersticas de la vida es que la materia viviente siempre se extiende a

s misma. La clula no solamente se repara se extiende as misma. La clula no solamente se repara a s misma sino que tambin se duplica (vase Cap. 12). No sabemos si esto es una necesidad fisiolgica o una consecuencia evolutiva de la seleccin natural, pero cualquiera que sea su origen, el hecho es que una gran cantidad de energa que fluye dentro de la clula se utiliza para el crecimiento y duplicacin de la clula. El concepto de material herediterio es necesario para comprender cmo la clula lleva a cabo estas funciones vitales. Se ha reconocido desde hace tiempo que la clula ni construye todo sus componentes de una "zarpazo". Cierta proporcin de su organizacin estructural se conserva de generacin en generacin. Esta porcin del material de la clula es lo que se denomina material hereditario y se caracteriza por el hecho de que est implicada en su propia sntesis (vase Cap. 12). Sin embargo, el material hereditario no servira de nada, si sta fuera su nica funcin. Adems est el papel de autoduplicacin inicia tambin las funciones fisiolgicas que verifica la clula. Una gran proporcin de la entropa negativa (organizacin) de la clula, se localiza en el material hereditario y la clula tiene que gastar energa tanto en duplicacin como para llevar a cabo su misin con respecto a la funcin fisiolgica como de crecimiento.

Trabajo osmtico (vase el Cap. 15)

Ya hemos dicho que el material viviente difiere mucho de su medio ambiente, en su relativa abundancia y tambin en la concentracin absoluta de sus partes componentes. Para obtener y mantener esta situacin, la clula debe realizar trabajo osmtico. Debe hacerlo tanto para acumular materiales que se encuentran en bajas concentraciones en el medio ambiente, como tambin arrojar a su seno aqullos que se hallan en elevada concentracin en el medio que la rodea. Pero no slo esta acumulacin y eliminacin de materiales requiere trabajo, sino tambin lo necesita la conservacin de esta poco probable situacin termodinmica. En fin, este proceso de conservacin sera imposible en trminos de energa , si no fuera por la presencia de la membrana plasmtica, la cual, creando una barrera extremadamente slida a la difusin, le ahorra a la clula gran cantidad de energa.

Trabajo elctrico (vase el Cap. 15)

La membrana plasmtica de la clula, nunca es igualmente permeable a cationes y aniones especficos; tampoco se pueden acumular en la misma proporcin. Por estas razones, todas las clulas deben ejecutar una ligera separacin de carga a travs de su membrana, dejando la exterior positiva con respecto a la interior o viceversa. Esta diferencia elctrica se utiliza en las clulas nerviosas para la comunicacin, por medio de la transmisin de un impulso elctrico, bajo la forma de una ruptura en la separacin de carga. Esta actividad, como cualquier otra forma de trabajo, necesita energa.

Trabajo mecnico (vase el Cap. 14)

Toda la vida est conectada con alguna forma de movimiento ya sea la contraccin de las clulas musculares, el batir de los cilios, el fluir de la ameba, la ciclosis del protoplasma en una clula vegetal o el movimiento de los cromosomas. El movimiento requiere energa que debe penetrar en una mquina para convertir la energa qumica en trabajo. Adems, de estas cuatro categoras generales de actividad que requieren energa, las clulas pueden invertir en otras diversas funciones que no son tan comunes. Las clulas interreaccionan y se influyen entre s en el desarrollo y crecimiento de un organismo como tambin en el funcionamiento fisiolgico de los sistemas pluricelulares. Algunas clulas hasta producen luz ! Desde el punto de vista evolucionista, quizs el descubrimiento reciente ms significativo en la termodinmica de la vida es que algo de la organizacin de la clula es transportado al exterior de los lmites celulares; esto es, los sistemas vivientes pueden utilizar energa para organizar su medio ambiente. Esta fase social de la evolucin biolgica tiene lugar ms extensamente en los niveles de organismo y de poblacin, siendo ms evidente en las actividades humanas.

LA ANATOMIA FUNCIONAL DE LA CELULA

Vivimos en el centro de una revolucin, en lo que se refiere a la anatoma de la clula - una revolucin ocasionada por el microscopio electrnico, el cual nos ha dado, francamente, un nuevo aspecto de la clula, amplio en visin y rico en detalles (Fig., 3-3 y 3-4): Una breve descripcin de este valioso instrumento es digna de hacerse aqu. La visualizacin de un objeto depende de la onda electromagntica particular que se utilice. Para que un objeto pueda ser visto, debe absorber y reflejar ondas electromagnticas de longitudes de onda no mayores que dos veces el dimetro del objeto. Esto determina el poder resolutivo del microscopio, el cual se define como la distancia ms corta entre dos puntos, que permite observarlos como entidades separadas. El poder resolutivo del microscopio de luz es aproximadamente 250 m, ya que el lmite ms bajo de la luz visible es de ms o menos 500 m. En el microscopio de luz ultravioleta se puede disminuir el lmite de resolucin a 80 m aproximadamente. El microscopio electrnico utiliza un rayo de electrones con una longitud de onda menor de un Angstrom ( A; 0,1 m) en lugar de luz. En lugar de vidrio, emplea campos electromagnticos como lentes y condensadores, capaces de refractar el rayo de electrones, casi en la misma forma que lo hace el clsico microscopio de luz con el rayo luminoso. En lugar de la retina del ojo, el microscopio electrnico produce una imagen en una pantalla fluorescente o en una placa fotogrfica. Aunque el poder resolutivo terico del ME es menor que 1 A, los problemas de ingeniera que se presentan en la produccin de unidades convenientes son enormes y solo una resolucin de 6 a 8 A se ha conseguido con muy poca frecuencia. Por otro lado, la resolucin de 20 a 40 A se puede obtener con bastante

facilidad. La principal desventaja del ME, el cul aumenta el poder resolutivo unas 100 veces ms que el microscopio de luz, es que los especmenes deben ser de "hueso seco" y ultradelgados. Por lo tanto, podemos decir que nosotros slo vemos "perfiles" de estructuras que carecen completamente de vida. Volvemos a crear en nuestras mentes una imagen de la estructuras reales, por medio de la integracin de los perfiles.

Fig. 3-3. Diagrama estilizado de una "clula tpica", tal como se ve con un microscopio electrnico. Las diversas estructuras no se encuentran en todas las clulas, pero ilustran las diferenciaciones que tienen lugar entre los tipos de clulas.

Fig. 3-4. Clula colocada bajo el microscopio electrnico (X 19 500). Una microfotografa electrnica de una clula heptica mostrando el ncleo (N), con tres nucleolos (n), mitocondrios (M), perfiles del retculo endoplasmtico (ER), la zona de Golgi (g), depsitos de glucgeno (G) y la membrana plasmtica (PM). (Cortesa de G. Palade. Rockefeller Insfitute )

Cual es, entonces, el aspecto presente de la anatoma de la clula ya que se ha extendido y modificado profundamente por medio de la aplicacin de tcnicas recientes? La superficie de la clula est delimitada por una "piel" precisa y muy rigurosamente definida. Como veremos en el Cap. 15, sta es la membrana plasmtica, osmticamente activa, la cual es capaz de disminuir la velocidad de penetracin de las molculas, as como de hacer una distincin entre ellas. Sospechamos que la membrana plasmtica posee regiones activas catalticamente y que la energa utilizada en esta maquinaria para efectuar d trabajo osmtico, tambin se encuentra localizada ah. La membrana plasmtica es aproximadamente de 75 A de grueso y parece que est compuesta de tres capas separadas (Fig. 15-1 ). Antes del advenimiento del microscopio electrnico creamos que la membrana plasmtica se encontraba muy estirada sobre toda la clula. Ahora sabemos que esto no es, seguramente lo que acontece. La superficie de la clula se dobla ya sea hacia afuera para formar microvellos, o se invagina dando lugar a vesculas (Fig. 3-5). Estas y otras modificaciones de la superficie celular estn ntimamente relacionadas con condiciones osmticas particulares de la clula en las cuales ellas se han encontrado. Uno tiene la impresin de que la membrana del plasma es una estructura estndar, razonablemente invariable al nivel molecular y que se adapta por si misma, a las variaciones de la funcin celular por medio de modificaciones en su anatoma. Como veremos en el Cap. 15, frecuentemente las invaginaciones observadas en la superficie de la clula parece que dan lugar, por medio de un movimiento hacia adentro de la membrana del plasma, a algunas de los vacuolos que se observan en el interior de la clula (Figs. 3-5 y 15-6). Este mtodo de ingerir lquido atrapado dentro de las vesculas se denomina pinocitocis (Cap. 15). Si uno explora la superficie celular con mayor detalle, descubre que algunas de las invaginaciones no estn limitadas por vesculas sino que conducen directamente al interior de la clula (Fig. 15-6). Ah, unos canales se unen a un complejo con junto de vesculas que entrelazan la estructura de la clula y se denomina retculo endoplasmico (Fig. 13-2). La estructura y funciones de estas membranas se discutirn ms detallada mente en el Cap. 13 y en el 15. La membrana del retculo endoplsmico tiene la misma apariencia que la superficie de la membrana plasmtica. Este sistema de vesculas varia mucho de forma tanto de un tipo a otro de clula, como tambin en las diferentes etapas fisiolgicas y de desarrollo del mismo tipo de clula. La apariencia del retculo endoplsmico puede ser "rugosa" cuando tiene en su lado citoplasmtico numerosos grnulos muy juntos (de 150 A de dimetro) llamados ribosomas (Figs. 13-2 y 15-6) o puede ser "lisa cuando no contiene ribosomas (Fig. 15-6). El examen del retculo endoplsmico revela que ste tiene conexin con otras dos estructuras. Primero, se contina con un sistema de vesculas, fuertemente unidas y de superficie lisa, con una posicin caracterstica en la clula cerca del ncleo.

Fig. 3-5. Microfotografas electrnicas de reedificaciones de la membrana plasta tica. A: Microvellos como borde de cepillo de una clula mucosa intestinal (x 69750). B: Vesiculas pinoctticas observadas en una clula endotelial de un vaso capilar en un msculo del esqueleto (X 46500). UM, membrana unidad; PM, membrana plasmtica; L, lumen; C, citoplasma; PS, espacio perlcapilar; Pv, vesculas pinocticas. (Cortesa de Palade)

Esta estructura llamada complejo de Golgi (aparato) ha sido objeto de controversia por muchas dcadas hasta que al fin, su existencia fue claramente demostrada con el microscopio electrnico. La funcin del complejo de Golgi es, hasta la fecha un misterio, aunque se le ha acreditado que desempea una misin en la secrecin de molculas gigantes (macromolculas) en la clula animal. Segundo, la membrana del retculo endoplsmico es una continuacin de la membrana ms externa de las dos que en vuelven al ncleo (Fig. 15-6). La estructura de las dos membranas posee poros, los cuales pueden o muchos no pueden ser cerrados, de manera que topolgicamente y, quizs, fisiolgicamente, la parte interior del ncleo est unida con el interior de la clula. Hasta ahora hemos concretado nuestro examen a la parte exterior de la clula y a la porcin interna que es continuacin de ella. Si penetramos a travs del grosor de la membrana, encontramos el interior de la clula, una rica mezcla de macromolculas, compuestos orgnicos ms pequeos e iones, que forman la sustancia fundamental o matriz citoptasmtica. Este material coloidal, tiene la propiedad inusitada de comportarse como una corriente viscosa como si fuera liquido o sufrir una deformacin elstica como si fuera slido. Adems, puede variar hasta convertirse totalmente en slido o en lquido. En conjunto, la matriz citoplasmtica, cerca de la membrana exterior, tiende a ser ms bien slida, en tanto que la interior tiende a ser ms bien liquida. Pero mucho depende del tipo o del estado fisiolgico de la clula. Desde hace aos, ha habido muchas controversias acerca de la existencia de una estructura organizada en la sustancia fundamental, a un nivel submicroscpico. Aunque hasta ahora no se ha descubierto un claro esqueleto citoplasmtico con el microscopio electrnico, tenemos ciertos ejemplos de organizacin fibrilar en la matriz citoplasmtica. Existe, por ejemplo, el par de centriolos con su hermosa organizacin, exacta y universal, de fibras "3 x 9" (Fig.36). Estos dos cuerpos estn en ngulo recto uno con respecto del otro cerca del ncleo, y parece que desempean un papel en la formacin del huso durante la divisin celular. Aqu en el huso, se encuentra otro ejemplo de organizacin fibrilar en la matriz citoplasmtica, la cual, como se muestra en la Fig. 3-6, se puede observar en un material viviente con la ayuda del microscopio de luz polarizada (vanse tambin las fotografas de la Pag. 2). Muchas clulas son ciliadas o flageladas. Estas prolongaciones mviles de la matriz citoplasmtica son capaces de convenir energa qumica en trabajo. Parece que se originan de los cinetosornas o cuerpos basales. Tanto stos como el propio cilio tienen una organizacin fibrilar que mucho se asemeja a la del centriolo (Fig. 3-6). La organizacin fibrilar "9 + 2" de los cilios y de los centrosomas tiene una dramtica uniformidad en todo el mundo vegetal y animal, que va desde la planta unicelular Euglena hasta el esperma del hombre. Otro ejemplo de organizacin fibrilar en la matriz citoplasmtica se encuentra en la altamente especializada clula muscular (Figs. 14-3 y 14-4). Aqu se han organizado dos tipos de fibras de protena en una forma altamente regular y se supone que son las responsables de las propiedades contrctiles del msculo. En

conjunto, parece que la matriz citoplasmtica es capaz de varias formas de organizacin fibrilar que se supone estn implicadas en la conversin de la energa qumica en trabajo mecnico. Puesto que la rpida corriente citoplasmtica de las clulas primitivas, como las de los mohos mucosos, ha demostrado contener macromolculas capaces de convertir la energa qumica en trabajo, deducimos que, aun cuando no sean visibles estructuras fibrilares en el citoplasma, es posible, para elementos submicroscpicos contenidos en l, iniciar una actividad organizada en el citoplasma en una escala macroscpica. La matriz citoplasmtica sostiene o rodea a varios "orgnulos", cada uno de los cuales est envuelto por una membrana. Estos son los mitocondrios, los cloroplastos (en las plantas verdes), los lisozomas, el ncleo y otros diversos cuerpos o granlos, como los grnulos de grasa.

Fig. 3-6. (Arriba y al frente). Algunas organizaciones fibrilares de la matriz citoplasmtica, o sustancia fundamental. Arriba: Centriolo en una clula del timo de rata. Izquierda, corte transversal; derecha, corte longitudinal (x73300). ( Cortesa de E. de Harven, Rockefeller Institute. ) Al frente; arriba, cilios de la agalla del mejilln de agua dulce Anodonta catarecta. El conjunto de cilios se extiende hacia fuera desde los cuerpos basales del citoplasma de la clula epitelial (x 34000). (Cortesa de I. Gibbons, Harvard University.) Abajo a la izquierda, corte transversal de un flagelo del protozoo Trichonympha (x127500). Cortesa de Gibbons.) Abajo a la derecha, corte transversal de un cuerpo basal en al Trichonympha ( x127500). (Cortesa de Gibbons)

El mitocondria (vase Cap. 11) es una estructura con doble membrana, estando la exterior fuertemente adherida alrededor de l y la interior invaginada dentro del cuerpo del orgnulo en forma de pliegues, o crestas, para formar una enorme superficie (Fig. 11-1 ). El mitocondrio es el centro del metabolismo respiratorio de la clula, en donde sus alimentos son oxidados, originando bixido de carbono y agua, y la energa liberada es empleada para convenir el DFA en TFA. Nosotros sospechamos que la amplia rea de la membrana interior lleva la gran cantidad de enzimas que necesita este proceso. La localizacin y nmero de mitocondrios en una clula estn en nfima relacin con la funcin de la misma.

Fig 3-6

Fig. 3-7 Varias etapas del ciclo mittico en microsporas del Trillium erectum (Cortesa de A.H. Sparrow y R.F. Smith, Brookhaven National Laboratory)

Los cloroplastos son corpsculos altamente organizados de las plantas verdes y son los centros de la actividad fotosinttica. Una descripcin ms detallada de estos interesantes orgnulos se encontrar en La Planta Viviente, de esta serie. Los lisomas son cuerpos esfricos que parecen contener varias enzimas "digestivas' de la clula. La funcin de estos corpsculos apenas se est comprendiendo. Se ha sugerido que fagocitarias pueden estar implicadas en la digestin de partculas extraas, como las bacterias. El ncleo, como su nombre lo indica, es el orgnulo central o crucial de la clula. Es el lugar donde se encuentra la mayor parte del material hereditario de la clula. (vase Cap. 12). El materia hereditario est localizado en hilos muy largos y finos (cromosomas) agrupados relativamente muy juntos en el ncleo, y dentro de la clula tiene lugar un ingenioso proceso, por el cual, (los cromosomas autoduplicades son repartidos de la misma forma en las clulas hijas (vase Gentica, en esta sede). Este proceso (Fig. 3-7) implica el acortamiento y engrosamiento de los hilos (profase), acompaado por la ruptura de la membrana nuclear, la formacin de un huso polar extendindose entre los dos centriolos, la emigracin de los cromosomas dobles al plano ecuatorial (metafase), y la separacin de estos cromosomas dobles con el subsecuente movimiento a las puntas del huso (anafase). Finalmente, se verifica la inversa de la profase esto es, el alargamiento y adelgazamiento de los cromosomas, la ruptura del huso, la duplicacin del centrosoma, y la formacin de la membrana nuclear (telofase). Este proceso, llamado mitosis, esta en correlacin en tiempo con la contraccin o divisin de la clula en dos clulas hijas. Debido a que es un asunto intrigante y a causa de que los cortos y gruesos cromosomas, durante la divisin, se tien rpidamente con colorantes y son visibles al microscopio de luz, la mitosis ha sido objeto de estudios intensivos en la primera mitad de este siglo. El sorprendente resultado de estos estudios ha sido la correlacin de la conducta de los cromosomas visibles con el comportamiento de las unidades genticas como se observan a travs de sus efectos hereditarios. La localizacin del gen abstracto, en los cromosomas visibles, ha sido el triunfo de la biologa de principios del siglo veinte. Sin embargo, el estudio de los cromosomas con el microscopio electrnico, ha probado, hasta ahora, ser uno de los fracasos ms notables de la citologa moderna. Con pocas excepciones, muy poco se puede ver, excepto unas burbujas amorfas, y todo mundo espera que, con un mejoramiento tcnico en la fijacin, teido o corte, se remediar esta situacin poco satisfactoria. El ncleo que no se divide, en el microscopio de luz, no est completamente vaco. Contiene uno o ms corpsculos que se tien rpidamente con los colorantes basofilicos y que se les ha denominado nucleolos (Figs. 3-3 y 3-4). Esta estructura puede verse fcilmente en el microscopio electrnico como un conjunto rico de grnulos que son aproximadamente del tamao y apariencia de los ribosomas. Puede

ser que verdaderamente sean un conjunto de ribosomas que son sintetizados en el ncleo y que en realidad pasa o son arrojados, a travs del poro nuclear, dentro de la matriz citoplasmtica, pero hasta ahora, slo podemos especular. Una vez fuera del ncleo, probablemente permanecen libres, o bien se unen al retculo endoplasmtico. Como veremos con ms amplitud en los Caps. 12 y 13, los ribosomas parecen ser recibidores de "mensajes" especficos procedentes de los genes del ncleo. Estos mensajes presuntamente permiten las sntesis de protenas catalticas y estructurales especficas, que regulan la vida de la clula. Ha sido nuestro intento en este captulo, discutir en trminos generales, la conducta y la estructura de la clula e indicar el nivel en el cual se encuentran en relacin la estructura y la funcin. Es claro que una comprensin ms profunda de estos fenmenos solamente se puede obtener, estudindolos desde un punto de vista molecular. Para hacer esto eficientemente, el estudiante debe tener fundamentos adecuados sobre la qumica de las molculas de la clula (Caps. 4 al 8). Armado con estos recientes conocimientos, puede volver de nuevo sobre sus pasos y reexaminar el objeto de este captulo en el lenguaje de la moderna biologa molecular (Caps. 9 al 16). LISTA DE LECTURAS QUE SE SUGIEREN Bloom, W., and Fawcett, D. W., 1962. Textbook of histology. Philadelphia: Saunders. Brachet, J., and Mirsky, A. E., eds., 1959-1961. The cell. New York: Academic Press. Brachet, J., 1957. Biochemical cytology. New York: Academic Press. Davson, H., 1959. A textbook of general physiology. Boston: Little, Brown. De Rovertis, E. D. P., Nowinsky, W. W., and Saez, F. A., 1960. General cytology, 3d ed. Philadelphia: Saunders. Engstrom, A., and Finean, J. B., 1958. Biological ultrastructure. New York: Academic Press. Giese, A. C., 1962. Cell physiology, 2d ed. Philadelphia: Saunders. Mazia, D., "How cells divide." Scientific American, September 1961. Picken, L. E. R., 1960. The organizarion of cells and other organisms. Oxford: Clarendon Press. Thompson, D'Arcy W., 1961. On growth and form, abridged ed. Cambridge: Camht'idge University Press. Wilson, E. B,, 1928 (reprinted in 1953). The cell in development and heredity. New York: Macmillan.

CAPITULO CUATRO
LA VIDA Y LA TABLA PERIODICA
Una propiedad caracterstica de la materia viviente es la de ser selectiva en sus relaciones con el medio ambiente. Un ejemplo de esta selectividad es la considerable diferencia entre la abundancia de elementos que se encuentran en la tierra y los que se hallan en los organismos vivientes. La corteza terrestre est formada principalmente de oxigeno, silicio, aluminio, sodio, calcio, hierro, magnesio y potasio; los elementos restantes constituyen menos del 1% del total. Los organismos vivientes, por otra parte, estn constituidos primordialmente de hidrgeno, oxigeno, carbono y nitrgeno, con los elementos restantes constituyendo menos del 1% del total (vase la Tabla 41). As, con la excepcin del oxigeno, los elementos ms abundantes no se presentan en comn en la corteza terrestre y en la materia viviente. El oxigeno, con un nmero atmico de 8, es el ms pesado de los principales elementos de la materia viviente y, al mismo tiempo, el ms liviano de los principales elementos de la corteza terrestre. De todo esto concluimos, que la materia viviente selecciona, de preferencia, a los elementos livianos que se encuentran disponibles en la corteza terrestre y en la atmsfera. Es sorprendente a este respecto, que la materia viviente sea muy semejante al cosmos como un todo. Las estrellas, as como la materia interestelar, estn compuestas principalmente de elementos livianos. Nuestra tierra no es ms que una "ceniza mineral" de elementos pesados que quedaron despus de que los elementos livianos pasaron al espacio debido a la dbil atraccin gravitacional de la pequea tierra. La Fig. 4-1 muestra el paralelismo que, con excepcin del helio, se encuentra entre los 30 primeros elementos en el cosmos y en el organismo viviente. Si el sorprendente paralelismo es una coincidencia o una forma de conservacin biolgica de la composicin qumica del ambiente presente cuando se origin la vida, es, hasta la fecha, un asunto de especulacin. Aunque la materia vivientc con frecuencia contiene vestigios de todos los elementos que se hallan en su medio ambiente, se ha demostrado que slo 20 elementos son esenciales para la vida. Por conveniencia se han clasificado en tres categoras principales de acuerdo con su concentracin relativa en la clula (Tabla 4-2): constituyentes principales, elementos, vestigios y elementos ultravestigios.

TABLA 4 -1. ABUNDANCIA RELATIVA DE LOS 14 ELEMENTOS PRINCIPALES EN

EL UNIVERSO, EN LA CORTEZA TERRESTRE (RECALCULADOS POR EDSALL Y WYMAN) Y EN EL CUERPO HUMANO

___________________________________________________________________ Abundancia relativa en porcentaje de tomos

Elemento Nmero atmico Universo Corteza Cuerpo terrestre humano

___________________________________________________________________
Hidrgeno Carbono Nitrgeno Oxigeno Sodio Magnesio Aluminio Silicio Fsforo Azufre Cloro Potasio Calcio Hierro 1 6 7 8 11 12 13 14 15 16 17 19 20 26 91 0.91 0.42 0.057 0.00012 0.0023 0.00023 0.626 0.00034 0,0091 0.00044 0.000018 0.00017 0.047 60 11 2.4 26 0.7 0.01 0.00091 0.13 0.13 0.033 0.037 0.22 0.00059

62.6 2.6 1.8 6.5 21.2

1.4 1.9 1.9

___________________________________________________________________ Se ha demostrado que no todos estos elementos son requeridos por todas las especies. Sabemos que algunos de ellos son de importancia universal (H, C, N, O, Na, Mg, P, S, Ca, K) en tanto que otros son requeridos por un gran nmero de especies y, por lo tanto, probablemente tambin sean de importancia general (Fe, Cu, Mn, Zn). Hasta ahora no se ha establecido la universalidad de los elementos restantes (B, Si, V, Co. Mo. ). El estudio de los elementos ultravestigios esenciales es an un problema; nunca se puede tener la certidumbre de que un elemento en particular no es requerido, puesto que es un proceso muy laborioso y tcnicamente complicado probar que es necesario. El procedimiento implica el empleo de agua y de reactivos ultrapuros y aun al material de vidrio. As, la necesidad alimenticia de algunos elementos ultravestigios no se sospech hasta que su ausencia casi total en ciertos suelos ocasion la aparicin de enfermedades y anormalidades en plantas o animales. La ausencia de cobre en algunas regiones de Australia caus una enfermedad en las ovejas originando efectos permanentes en el sistema nervioso, anemia y deterioro de la lana con prdida del ensortijamiento. Se ha observado que una deficiencia de boro en el suelo ocasiona la "podredumbre del corazn" en las remolachas, el "agrietamiento del tallo" en el apio, el "corcho interior" en las manzanas y muchas otras anormalidades en las plantas.

TABLA 4-2. ELEMENTOS FUNCIONES

NECESARIOS

PARA

LA

VIDA

ALGUNAS

DE

SUS

___________________________________________________________________ Nmero Algunas funciones Categora Elemento Simbolo atmico desconocidas ___________________________________________________________________
Componentes Hidrgeno H 1 Universalmente requeridos principales Carbono C 6 para los compuestos 2-60 tomos Nitrgeno N 7 orgnicos de la clula por ciento Oxigeno O 8 _______________________________________________________________________________ Sodio Na 11 Importante ion contrasrestador implicado en el potencial de accin. Magnesio Mg 12 Cofactor de muchas enzmas Fsforo P 15 Universalmente implicado en reacciones de transferencia de energa. Azufre S 16 Encontrado en las protenas y en otras sustancias importantes Elementos vestigio Cloro Cl 17 Uno de los principales aniones. 0.02-0.1 % Potasio K 19 Importante ion contrarrestador implicado en la conduccin nerviosa, en la contraccin muscular, etc. Calcio Ca 20 Cofactor en las enzimas, importante componente de las membranas y regulador de la actividad de stas. _______________________________________________________________________________ Boro B 5 Importante en las plantas, probablemente como cofactor de enzimas. Silicio Si 14 Encontrado en abundancia en muchas formas inferiores. Vanadio V 23 Encontrado en ciertos pigmentos de formas inferiores Elementos Manganeso Mn 25 Cofactor de muchas enzimas Ultravestigio menos de Hierro Fe 26 Cofactor de muchas enzimas 0.001% de oxidacin. Cobalto Co 27 Componente de la Vit. B12 Cobre Cu 29 Cofactor de muchas enzimas de oxidacin. Cinc Zn 30 Cofactor de muchas enzimas Mo Molibdeno 42 Cofactor de unas cuantas enzimas.

Fig. 4-1. Abundancias relativas de los primeros 31 elementos en el cosmos ( por cada 100 tomos de Si) y en los organismos vivientes sobre la superficie terrestre ( por cada 100 tomos de C). (Cortesa de G. E. Hutchinson, 1943; sin corregir para los datos recientes)

La mejor forma de demostrar la necesidad en la nutricin de elementos ultravestigios tales como el boro, es curando la enfermedad por deficiencia por medio de la adicin de estos elementos al suelo. Una centsima parte del elemento por mil millones de suelo causar la enfermedad, una dcima parte por mil millones la curar y una parte por mil millones es una concentracin lo suficientemente elevada para envenenar a la planta. Cul es el papel de los veintitantos elementos en la mquina viviente? Los elementos H, C, N, O, P y S son los materiales de construccin de los compuestos orgnicos de la clula. La mayor parte de los carbohidratos y de los lipidos

contienen H, C, y O en tanto que las protenas contienen adems, N y S y los cidos nuclicos, N y P. As, estos seis elementos son los componentes principales de la mquina viviente. La capacidad para permutaciones y combinaciones diferentes de estos elementos para dar origen a la diversidad molecular de la clula, los hace nicos en su idoneidad para sostener la vida. Las molculas celulares, en la naturaleza, parten desde el bixido de carbono gaseoso, a travs del agua en estado lquido, hasta la celulosa slida, y desde los aminocidos altamente polares, a travs de la glucosa menos polar, hasta las grasas no polares. Se ha sugerido, de vez en cuando, que en otro sistema planetario, el silicio podra reemplazar al carbono. Esto parece poco probable cuando uno se pone a considerar todo el conjunto de compuestos y propiedades que se encuentran en el mundo del carbono que difcilmente se puede comparar con el mundo del silicio que se supone. Muchos de los elementos se encuentran, generalmente, bajo la forma de iones; as Na+, Mg+2, PO4-3, SO4-2, Cl-, K+ y Ca+2 y de los principales elementos bajo la forma de CO3-2, y NO3-. La importancia de estos iones para el bienestar de la clula se ha reconocido desde hace mucho tiempo. As, la literatura sobre fisiologa de la dcada de los veintes y de los treintas, est llena de observaciones sobre el efecto de iones tales como el Na+, Mg+2, K+ y Ca+2 sobre la consistencia fsica y funcionamiento de gran variedad de clulas. Las cantidades absolutas y el equilibrio relativo de estos iones se conservan en los sistemas vivientes dentro de lmites muy estrechos y cualquier variacin experimental de estas cantidades, da por resultado cambios muy notables en las propiedades biolgicas tales como permeabilidad celular, irritabilidad, contractibilidad, viscosidad protoplasmtica y divisin celular. La importancia del equilibrio entre estos cationes, se puede comprender considerando el hecho de que frecuentemente se ha observado que pares de estos iones poseen efectos antagnicos el uno sobre el otro. Asi, se sabe que el K+ disminuye la viscosidad protoplasmtica y causa el relajamiento muscular, en tanto que el Ca+2 origina la gelacin del protoplasma celular y tambin inicia la contraccin muscular. La importancia de la composicin inica y el equilibrio en los sistemas vivientes, tambin se puede ilustrar por el grado de conservacin tan notable de este parmetro a travs de toda la evolucin biolgica. La Tabla 4-3 da la composicin inica de varios organismos de diferentes tipos de evolucin, comparada con la composicin inica del agua de mar. A. B. Macallum fue el primero en deducir que el paralelismo que se muestra en ella, significa que la vida se origin en el mar y que la evolucin subsecuente hizo poco, para cambiar el equilibrio inico. Despus de mil millones de aos de evolucin sobre la tierra, aunque nuestros fluidos corporales estn menos concentrados que el agua de mar, todava llevamos el equilibrio inico del agua de mar en nuestras clulas y liquidos del cuerpo. Hay hasta la fecha, muy poca comprensin sobre una base molecular del papel de estos iones. Tanto las protenas como los cidos nucleicos (que son los principales componentes macromoleculares de la clula) son iones polivalentes negativamente

cargados y necesitan de cationes como iones compensadores. Adems, se ha demostrado que existen relaciones especiales entre ciertas macromolculas y cationes especficos. As, la concentracin del Mg+2 se ha demostrado que afecta al estado de agregacin de los ribosomas, probablemente debido a su accin sobre los componentes del ARN, de estos cuerpos. Se ha demostrado que estos pequeos orgnulos citoplasmticos de los cuales trataremos ms adelante, se desdoblan en dos componentes ms pequeos cuando se disminuye la concentracin del Mg+2. Es casi seguro que el calcio es un ion contrarrestador para los componentes fosfolpidos de los sistemas de la membrana celular, y el efecto del Ca+2 en la disminucin del umbral de la excitabilidad nerviosa, es un ejemplo de esto. Y finalmente, se ha demostrado que el potasio interreacciona selectivamente con la miosina, la protena contrctil del msculo. Estos son slo unos cuantos ejemplos de un campo de la biologa de la clula que an tiene que ser explorado completamente en el nivel molecular. Pero, qu sucede con los elementos ultravestigios? Qu papel razonable podra desempear un elemento si se encontrara presente en una concentracin de 10-8 M? La respuesta parece sencilla y clara. En todos los casos que se han examinado en detalle, estos iones resultaron ser "cofactores" necesarios para ciertas enzimas biolgicas. Puesto que las enzimas, a causa de su naturaleza catalitica, son requeridas por lo regular slo en muy bajas concentraciones, se deduce que sus cofactores, asimismo, se les necesita igualmente en muy bajas concentraciones. Un pequeo porcentaje de los elementos vestigios mencionados anteriormente, tambin estn implicados en la activacin de la enzima. La Tabla 4-4 da unos cuantos ejemplos de reacciones que utilizan enzimas que requieren ciertos cofactores metlicos especficos. Algunos de los iones metlicos pueden ser impedidos de desemperar su papel por la presencia de ciertos inhibidores. Los cuatro tomos de hierro de la protena hemoglobina son el lugar de la funcin transportadora de oxigeno de esa molcula. El cianuro o el monxido de carbono pueden ligarse, de preferencia, con el hierro y en consecuencia, interferir con la capacidad de la protena para transportar oxigeno. Tales compuestos son venenos y aun, a muy bajas concentraciones, capaces de causar la muerte de las clulas.

TABLA 4-3. COMPOSICION IONICA DEL AGUA DE MAR Y DE LOS FLUIDOS DEL
CUERPO DE VARIAS ESPECIES. (LOS NUMEROS SUPERIORES ESTAN EXPRESADOS EN CONCENTRACION MILIMOLAR (mM) POR LITRO; LOS INFERIORES SON RELATIVOS, EXPRESADOS EN TERMINOS DE 100 UNIDADES DE Na+)

___________________________________________________________________
Na+ VERTEBRADOS Hombre (mamfero) Rata (mamfero) Rana (anfibio) Lophius (pez) INVERTEBRADOS Hydrophilus (insecto) Cangrejo (artrpodo) Venus (molusco) Pepino de mar (equinodermo) Agua de mar K+ Ca+2 Mg+2 ClSO4-2

___________________________________________________________________
145 (100) 145 (100) 5.1 (3.5) 6.2 (4.2) 2.5 (1.7) 3.1 (2.1) 2.0 (1.9) 2.3 (1.0) 1.1 (.93) 10.5 (2.3) 9.5 (2.2) 9.3 (2.2) 1.2 (.83) 1.6 (1.1) 1.2 (1.2) 3.7 (1.6) 20 (17) 4.8 (1.0) 25 (5.7) 50 (12) 103 (71) 116 (80) 74 (72) 164 (72) 40 (34) 498 (110) 514 (120) 487 (120) 0.14 (.13) 10 (2.2) 26 (5.9) 30 (7.2) 2.5 (1.7)

103 2.5 (100) (2.4) 228 6.4 (100) (2.8) 119 13 (100) (11) 465 8.6 (100) (1.9) 438 7.4 (100) (1.7) 420 9.7 (100) (2.3)

417 9.1 9.4 50 483 30 (100) (2.2) (2.3) (12) (120) (7.2) __________________________________________________________________

TABLA 4-4. ALGUNAS REACCIONES ENZIMATICAS QUE REQUIEREN METALES

________________________________________________________________ hexoquinasa, Mg+2

glucosa + TFA

glucosa-6-P + DFA

Triptofano + H20

triptofanasa,K+ o Rb+ indol + piruvato + NH3 Fibrinasa,Ca+2

fibrina soluble

fibrina insoluble

arginina + H2O

arginasa, +2 Co , Mn+2 o Ni+2 urea + cido 2,5diaminovalrico descarboxilasa de histidina, Fe+3 o Al+3 histamina oxidasa de fenol,Cu+2

histidina

CO2

catecol

o-benzoquinona

deshidro genasa lctica, Zn+2 cido lctico + DPN cido pirvico + DPNH reductasa de nitrato, Mo+2 nitrato + TPNH + H+ nitrito + TPN+ + H20 __________________________________________________________________

Hemos visto que la materia viviente selecciona, de un medio ambiente, alrededor de 20 elementos especficos con los cuales construye su tejido. En los prximos cuatro captulos examinaremos algunas molculas que son elaboradas por la clula y que desempean las ms importantes funciones de la maquinaria de la vida. LISTA DE LECTURAS QUE SE SUGIEREN EDSALL, J. T., and WX, MAN, J., 1958. Biophysical chemistry. New York: Academic Press. Fowler, W. A., "The origin of the elements," Scientitic American, September 1958. Henderson, L. J., 1958. The fitness of the environment. Boston: Beacon Press.

CAPITULO CINCO
EL AGUA Y LA VIDA

El agua es el medio de dispersin de la materia viviente. Aun se ha encontrado

que, en realidad, el medio acutico es el ambiente de los organismos terrestres que a primera vista parece que viven en un medio gaseoso, cuando se les examina en el nivel celular. Las clulas vivas en actividad contienen de 60 a 95% de agua y la importancia de sta, se puede apreciar por medio de la observacin de que hasta clulas en estado de vida latente y tejidos como esporas y semillas contienen de 10 a 20% de agua. La ubicuidad del agua no hace desmerecer sus propiedades especiales y nicas. Es precisamente esta propiedad de ser nica, lo que hace al agua especialmente apropiada para el papel biolgico que desempea. El gran fisilogo L. J. Henderson escribi un libro titulado The Fitness of the Environment, en el cual demostr que los fenmenos de la adaptacin biolgica se podan considerar, no solamente desde el punto de vista de la adaptacin de los organismos a su medio ambiente, sino tambin desde el punto de vista inverso principalmente considerando lo apropiado del medio fsico para el sostenimiento de la vida. El agua es un hidruro de oxigeno que posee un fuerte y desigual grado de interaccin entre sus molculas. La Fig. 5-1 muestra el calor de evaporacin como una medida de la resistencia de la fuerza intramolecular. Vemos que en el caso de la serie del carbono existe una fuerte proporcionalidad entre el elemento que forma el hidruro y su calor de evaporacin. Este no es el caso en las otras series en las cuales el primer miembro es muy atpico, siendo el agua el ms atpico de todos. La razn para estos grados excepcionalmente fuertes de interaccin, es el hecho de que el oxigeno, el flor y el nitrgeno, forma hidruros en los cuales solamente algunos de sus electrones estn implicados en enlaces covalentes con el hidrgeno, mientras que los restantes permanecen muy cerca del tomo, proporcionando fuerte electronegatividad. As, estas molculas tienen un alto grado de polaridad elctrica, la cual, a su vez, ocasiona muy fuertes fuerzas intermoleculares. Vamos a considerar el caso de la molcula del agua. La forma de esta molcula es la de un tringulo issceles, con cada uno de los hidrgenos compartiendo dos electrones. La poderosa atraccin del ncleo del oxigeno tiende a atraer a los cuatro restantes electrones fuera de los protones, dejando as el rea alrededor de ellos con una franca carga positiva.

Fig. 5-1. Calores de evaporacin de series isoelectrnicas de molculas de hidruros. (Cortesia de L. Pauling)

Estos dos pares de electrones no compartidos, tienden a concentrarse en una area fuera de los tomos de hidrgeno, dando a esta rea una carga negativa. La geometra de esta siuacin es tal, que si consideramos al tomo de oxigeno como el centro de un tetraedro, los dos centros de carga posivos y los dos negativos, ocuparan los cuatro vrtices del tetraedro. Estos centros de carga originan interacciones, de manera que cada molcula posee un efecto orientador sobre sus cuatro vecinos ms cercanos. As, dos reas negativas atraen cada una a un

hidrgeno (protn) de otras dos molculas y cada protn atrae al oxigeno de una vecina. Cada tomo de oxigeno viene a ser, en este po de interaccin, el centro de un tetraedro de otros oxigenos. Existen, por tanto, en el agua, no slo fuertes fuerzas atractivas sino tambin un arreglo geomtrico de estas mismas, que se prestan muy bien para la informacin de estructuras tridimensionales. La Fig. 5-2. es una representacin del arreglo del agua cristalina.

Fig. 5-2. Coordinacin tetradrica de las molculas del agua en el hielo. Las molculas 1 y 2, as como la molcula central de H20 quedan completamente en el plano del papel. La molcula 3 queda arriba de este planos y la 4, abajo; de manera que los oxigenos 1, 2, 3 y 4 quedan en los vrtices de un tetraedro regular.

Las ligaduras, representadas por lneas punteadas, se conocen como enlaces de hidrgeno. Estos enlaces tambin se forman cuando el nitrgeno y el flor sustituyen al oxigeno, y sta es la razn del porqu el fluoruro de hidrgeno y el

amonaco (vase Fig. 5-1), tambin poseen muy elevados valores de calor de evaporacin. Pero en el caso del amoniaco y del fluoruro de hidrgeno, la geometra de las interacciones es tal, que solamente se forman anillos y cadenas, siendo as imposible para ellos, constituir celdillas continuas y tridimensionales. De esto se deduce que las propiedades del agua son absolutamente nicas y sera inverosmil que el amoniaco o el fluoruro de hidrgeno fueran apropiados como medios de dispersin para sistemas vivientes en otros planetas. Esta forma notable de interaccin del enlace de hidrgeno es ms fuerte que las fuerzas usuales de Van der Waals, pero ms dbil que los enlaces covalentes encontrados en los compuestos orgnicos. Su relativa resistencia la dota de la capacidad para formar estructuras, y su debilidad relativa la dota de movilidad. Sin lugar a duda, la facultad para formar estructuras lbiles da al enlace de hidrgeno una posicin preeminente en la conducta del material viviente, un hecho al que tendremos amplia oportunidad de referirnos a travs de este libro. La aglomeracin de las molculas de agua en la celdilla del cristal de hielo es floja. Cuando ste se derrite, el acomodamiento regular y flojo cambia a un arreglo al azar pero ms compacto, originando un aumento en la densidad. Al estarse derritiendo, la ruptura de la estructura es slo parcial, dejando una gran cantidad del liquido en un estado "paracristalino", una propiedad nica e interesante del agua. A medida que se eleva lentamente la temperatura, se rompe ms y ms la estructura regular y contina el aumento de la densidad, alcanzando un mximo a 4C. Por lo tanto, debido al efecto de la temperatura sobre el aumento en la distancia promedio entre las molculas del agua, la densidad de sta disminuye. Esta propiedad especial del agua es responsable de la congelacin de los cuerpos de agua procediendo de arriba hacia abajo, y no al revs. La capa de hielo formada, aisla el agua de abajo de prdida de calor, disminuyendo de esta manera la congelacin de lagos y ros, y protegiendo de esta manera la vida en ellos. Las formas estructurales que hemos tratado hasta aqu son la causa de otros diversos valores nicos para el punto de fusin, el punto de ebullicin, el calor latente de fusin, la capacidad calorifica, la tensin superficial y la constante dielctrica. Cada una de estas propiedades tiene consecuencias importantes para la materia viviente. Existen otros tres aspectos de la conducta del agua que son de la ms fundamental importancia. Primero, el agua es un excelente solvente para muchos compuestos orgnicos. A causa de la polaridad del agua y su capacidad del enlace de hidrgeno, es capaz de disolver los compuestos orgnicos que contengan grupos hidroxilo ( OH ), carboxilo ( -COOH ), amino (-CNH2), y cetnico (C = 0). Al mismo tiempo, tambin es capaz de disolver sales que estn completamente disociadas en iones. De esta manera, el agua tiene un amplio espectro desigual de accin disolvente. Segundo, el agua por si misma es capaz de un ligero grado de disociacin en la siguiente forma:

H / O- H....O / \ H H / H-O .... H-O

\ H

La constante de equfiibrio (Kw) de esta reaccin es de 1014, lo que significa que un kilogramo de agua contiene solamente 107 moles de iones H3O+ (generalmente, se representan por H+ ), y 107 iones OH-. Tercero, el agua provoca la disociacin de diversas sustancias llamadas "electrlitos dbiles". Si tal sustancia emite un protn (H+), se denomina cido dbil. Los grupos carboxilo y amino son los electrlitos dbiles que ms frecuentemente se encuentran en los compuestos orgnicos de la clula (vase el Cap. 6). Es posible derivar una ecuacin sencilla, relacionando la acidez (pH o logaritmo negativo del protn o concentracin del ion hidrgeno) con el pK (o sea, el logaritmo negativo de la constante de equilibrio) y la relacin de concentraciones base a cida. pH = pK + log [base] [acido] Esta ecuacin es sumamente til. Por ejemplo, se puede observar que cuando las concentraciones de base y cido son iguales, entonces el pH de una solucin de un electrlito dbil es igual a su pH (puesto que el logaritmo de 1 es igual a 0). En ese punto, la capacidad reguladora del sistema esto es, su resistencia al cambio del pH cuando se aaden o se quitan protones est al mximo. Otra forma de expresar esto es diciendo que a un valor del pH numricamente igual a su valor del pK, la mitad del cido est disociada en su base conjugada. Como veremos en los siguientes captulos, las macromolculas, las cuales son las entidades tanto estructurales como funcionales de la clula, son polielectrlitos dbiles, que deben su estado de disociacin, y de aqu muchas de sus caractersticas fsicas, a la presencia del agua o de soluciones salinas diluidas. El agua, por lo tanto, no es solamente el medio de dispersin de la clula, sino tambin, influye mucho sobre las propiedades de las molculas que dispersa. Las propiedades del agua que hemos discutido, tienen innumerables conexiones con el funcionamiento de la mquina viviente. No es cualquiera sino la presenda simultnea de todas estas propiedades que hacen del agua el solvente nico para el mundo de la vida.

LISTA DE LECTURAS QUE SE SUGIEREN Buswell, A. M., and Rodebush, W. H., "Water," Scientific American, April 1956. Edsall, J. T., and Wyman, J., 1958. Biophysical chemistry. New York: Academic Press. Henderson, L. J., 1958. The ftness of the environment. Boston: Beacon Press.

CAPITULO SEIS

LAS PEQUEAS MOLECULAS DE LA MAQUINA VIVIENTE

La qumica orgnica, o sea, la qumica del mundo viviente, es la qumica del

carbono. Una sorprendente propiedad de los compuestos del carbono, utilizados por el mundo de la vida, es que son notablemente inertes, reaccionando slo en proporciones infinitesimalmente bajas, unos con otros, con el agua y con el oxigeno atmosfrico. Esto es as, a pesar del hecho de que grandes cantidades de energa, frecuentemente, se ponen en libertad cuando estos compuestos reaccionan. En el Cap. 9 veremos cmo la clula vence esta lentitud de los compuestos orgnicos y la utiliza para fines de control molecular. Una segunda propiedad sorprendente del carbono es su versatilidad para formar un nmero casi ilimitado de compuestos que varan enormemente en sus propiedades. Esta falta de actividad aunada con la versatilidad de los compuestos orgnicos de la clula es debida a las siguientes propiedades del carbono. Primero, el carbono es un elemento liviano con nmero atmico 6. Comparte, con otros elementos en la segunda fila horizontal de la tabla peridica, la incapacidad para ensanchar su octeto. Asi, los compuestos de carbono tetravalente, no son complejos o solvatados en una cantidad apreciable. Puesto que las reacciones de otros elementos generalmente se verifican por medio de intermediarios coordinados, no es de sorprenderse que la mayora de las reacciones de los compuestos del carbono sean lentos, aunque algunas de stas puedan poner en libertad gran cantidad de energa. Segundo, estando el carbono situado en el centro de la tabla peridica, es capaz de reaccionar tanto con los elementos electronegativos como el oxigeno, nitrgeno, fsforo, azufre y cloro, asi como con el hidrgeno, que es un elemento electropositivo.

Fig. 6-1. Grupos alfticos principales

De manera que se conocen compuestos de carbono, en los cuales se le puede asignar al tomo de carbono, estados de oxidacin de -4, -2, 0, +2 y +4. Esta capacidad para reaccionar con una variedad de elementos tanto electropositivos como electronegativos, se ha extendido aun ms con la propiedad del carbono de formar enlaces simples, dobles o triples con otros tomos de carbono.

Fig. 6-2. Grupos aromticos principales

Puesto que las largas cadenas de carbono son estables, es posible, para los compuestos de carbono formar cadenas rectas o ramificadas, anillos, redes y combinaciones de estas estructuras. Los dos conjuntos de propiedades discutidos anteriormente, son compartidos por separado, respectivamente, por el carbono con los miembros de las mismas filas horizontales y verticales en la tabla peridica. Sin embargo, el carbono es el nico elemento que posee ambos conjuntos de propiedades: la lenta reactividad y la casi infinita versatilidad. Uno se encuentra obligado a concluir que el carbono es verdaderamente un elemento nico y es imposible que un bios basado en otro elemento diferente, pueda evolucionar en el universo. Discutiremos brevemente la qumica de las pequeas molculas orgnicas de la clula. El material viviente es una fuente rica de compuestos orgnicos que reflejan la interminable variabilidad de las especies microbianas, vegetales y animales, pero debemos restringir nuestra atencin solamente a unos cuantos de los ms importantes compuestos encontrados universalmente en la materia viviente. AGRUPAMIENTOS QUIMICOS Las Figs. 6-1 y 6-2, son diagramas que muestran los grupos orgnicos principales encontrados en el material viviente. Los carbohidratos, las grasas, las bases de nitrgeno, los aminocidos y otros compuestos son combinaciones de estos agrupamientos. Las flechas en los diagramas no indican necesariamente pasos por medio de los cuales se pueden sintetizar estos compuestos sino, simplemente, sealan las relaciones de familia. Las propiedades qumicas y fsicas de cada grupo, son la materia base de la qumica orgnica y se remite al estudiante a un libro de texto de qumica orgnica elemental para un estudio ms detallado. Antes de comenzar a enumerar algunas estructuras importantes biolgicamente, debemos hacer mencin de unos cuantos fenmenos que son importantes en la qumica orgnica de los sistemas vivientes. Disociacin Los principales cidos orgnicos de la clula son los cidos carboxlicos y los fosfatos orgnicos. O // R- C \ OH
Grupo Carboxilo

O // R-C + \ OpKCOOH = 3 - 4 H+

O R - O - P - OH pK1 = 2 OH
Fosfato orgnico

O R - O - P - O OH

O R-O-P-O pK2 = 7 O-

Las principales bases orgnicas de la clula son los compuestos que contienen nitrgeno. R - NH2
Grupo amino

H+

RNH3+

pKNH3 = 9 - 10 + H+ pKNH = 6 - 7 R - === HN NH+

R - === HN N

\ //
Grupo imidazol

\ //
H

NH +

NH2+

R - N - C - NH2
Grupo guanidino

H+ R - N - C - NH2 + pKNH2 = 12 -13

Solubilidad Los grupos orgnicos pueden clasificarse como hidroflicos si activan la solubilidad en solventes acuosos e hidrofbicos si lo hacen en solventes orgnicos "no polares" como el benceno, el tolueno, etc. Los grupos hidrocarburos como el CH3, C2H5, y el C6H5 son altamente no polares y, por consiguiente, hidrofbicos, en tanto que los grupos disociados como el COO-, el NH3+, son fuertemente polares y, por lo mismo, hidroflicos. Entre estos dos extremos queda un nmero de grupos que les proporciona a sus respectivos compuestos una solubilidad intermedia. La siguiente lista es una aproximacin burda, en orden ascendente, de las propiedades hidroflicas de varios agrupamientos orgnicos.

O O // -(CH2)n-CH3; -CH3; - C - O - C - ; - C - C - O - C \ H O

- C - NH2

+H3N
\ /

COOC

- C - OH ;

C-NH3+

- C - O- ; / H

\ R

Enlaces de hidrgeno Como ya hemos dicho, los enlaces de hidrgeno son fuerzas de valencia secundaria dbiles entre el hidrgeno y tomos fuertemente electronegativos como el F, O o N. O ....... HO // \ R1 - C C - R2 \ // OH ....... O == - C6H4 - OH ....... N NH \\ /
Tirosilo Histidilo

/ C = O ....... H - N / \

H \ O ....... H / \ H O / H

-CH2OH ...... O = C / -O Aspartilo Serilo

Los ejemplos anteriores de enlaces de hidrgeno (lneas punteadas), se encontrarn frecuentemente en las discusiones subsecuentes. La formacin del enlace de hidrgeno juega un importante papel en la solubilidad de los compuestos orgnicos en solventes acuosos.

Isomerismo ptico Cuando un tomo de carbono est unido a cuatro grupos diferentes, se forman dos posibles configuraciones espaciales distintas que se encuentran relacionadas una con la otra como un objeto con su imagen en un espejo.

una solucin de uno de los miembros de este par de imgenes hace rotar el plano de la luz polarizada. Su ismero ptico har lo mismo, pero la rotacin ser en direccin opuesta. Absorcin de la luz ultravioleta Varios compuestos orgnicos de importancia biolgica, carecen de color a la luz visible pero la absorben intensamente cerca del rango del ultravioleta. Esta absorcin se debe a que los fotones de la luz ultravioleta excitan a los electrones de la molcula a niveles superiores de energa, por lo cual se dice que estn en un "estado excitado". Tales "molculas en estado excitado" son generalmente de tan corta vida, que no pueden reaccionar qumicamente sin que antes entreguen su energa a las molculas que las rodean. Sin embargo, en la fotosntesis, y en otros importantes procesos biolgicos, la energa de los estados excitados se emplea para efectuar reacciones bioqumicas importantes. La facilidad con que un electrn en una molcula determinada puede ser excitado, depende de la estructura de la misma. Los compuestos sin doble o triple ligadura requieren, generalmente, considerable energa para la excitacin del electrn y la absorben en la regin ultravioleta ms lejana, en donde la longitud de onda es ms corta y, por lo tanto, la energa es ms elevada. Los compuestos que contienen enlaces mltiples, particularmente aquellos en los cuales dos o ms enlaces mltiples estn adyacentes, absorben cerca de la regin ultravioleta o en el rango de la visible. Ejemplos biolgicos importantes de tales molculas son las bases de nitrgeno de los cidos nucleicos (Cap. 7) y los aminocidos tirosina, triptofano y fenilalanina (Cap. 8). La absorcin ultravioleta proporciona una herramienta conveniente para la medicin de la concentracin de estos importantes compuestos.

Afortunadamente para el bilogo, el mximo de absorcin, para los cidos nucleicos, se encuentra en 260 nm y para los tres aminocidos en 280 nm.

COMPUESTOS DE FOSFATOS DE ELEVADA ENERGIA Se ha dado el nombre de fosfatos de elevada energia a aquellos steres de fosfato cuya hidrlisis conduce a una liberacin elevada de energa bajo la forma de calor. Entre estas sustancias se encuentran algunas que trataremos ms adelante, tales como el trifosfato de adenosina (TFA), los trifosfatos de uridina, citidina y guanosina (TFU, TFC, TFG), la fosfocreatina, el cido fosfoenolpirvico, los adenilatos de aminocidos y el difosfato de uridinglucosa. Por ejemplo, la hidrlisis del TFA conduce a valores de H (vase Cap. 2) de aproximadamente 9 000 calorias por mol, en tanto que otros compuestos, como el fosfato-6-glucosa, tienen valores de H de aproximadamente la mitad de ste. En realidad, el contenido de elevada energa del comp.esto est dado ms correctamente por la energa libre de la hidrlisis, el F (vase Cap. 2). Los valores de F se obtienen de las medidas de las concentraciones de los compuestos de elevada energa en las reacciones en las cuales participan; son una medida de diferencias entre las energas libres de los reactantes y de los productos. Si la ltima es ms elevada, entonces debe aportarse energa para que se produzca la reaccin. No se conocen con exactitud las causas de la naturaleza de la "elevada energa" de estos compuestos, pero se cree que son debidas a varios factores que hacen a estos compuestos nicos: existen sorprendentes diferencias entre los compuestos y los productos de su hidrlisis, as como en sus estabilidades de resonancia, sus ionizaciones y las repulsiones electrostticas intramoleculares. Lipmann y Kalckar, en 1941, observaron que una caracterstica notable de los compuestos de elevada energa es que son anhdridos del cido fosfrico con un segundo cido, como un sustituto del cido fosfrico, para formar los di y trifosfatos de nuclesido; o con un compuesto del cido carboxlico (cido actico), para formar el acetilfosfato; o aun con un enol, para formar el cido fosfoenolpirvico. Sin embargo, en otras ocasiones, el cido fosfrico se combina con un compuesto de nitrgeno bsico, como en la fosfocreatina. En todos los casos, la formacin del enlace anhdrido reduce el nmero de grupos resonantes en la molcula y puesto que la estabilidad termodinmica de una sustancia aumenta con su capacidad para adquirir muchas formas resonantes, los compuestos de elevada energa son menos estables y sus hidrlisis producirn gran cantidad de calor. La Fig. 6-3 muestra algunas de estas propiedades.

1.

Formas resonantes de Fosfatos Inorgnicos.

O=P-O

O- - P - O- O- - P = O OH OH

OH

2. Anhdrido de fosfato-carboxilado como en el acetilfosfato.

CH3 - C - O - P = O O3. Anhdrido fosfato-fosfatado como el di y trifosfato de nuclesido. Adenina O O \ Ribosa - O - P - O - P - O

O4. Ligadura fosfato-nitrgeno bsico. como en la fosfocreatina

O-

N+ - P = O

HN = C

O-

N - CH2 - COOH CH3 Fig. 6-3. Propiedades de compuestos de "elevada energa"

El compuesto ms importante de elevada energa es el TFA. En la Fig. 6-4 se muestra su frmula y en los Caps. 11 y 14 se dan las diversas maneras de su formacin por la clula. Puede reaccionar de varias formas: (1) como un agente fosforilante, transfiriendo pirofosfato inorgnico a un aceptor, como en la reaccin de la hexoquinona para formar el fosfato-6-glucosa (Fig. 10-1); (2) como agente fosforilante, transfiendo pirofosfato inorgnico a un aceptor; o (3) como un adenilante, transfiriendo la mitad del adenilato a un aceptor adecuado, como en la formacin de los adenilatos de aminocidos (Fig. 13-4). En todos estos casos, el producto sintetizado puede estar a un nivel de energa inferior, igual o aun superior que el del TFA. En la clula, el TFA funciona principalmente como un agente fosforilante en todos aquellos casos en que se necesita energia para dirigir una reaccin. El TFA acta como un mensajero entre las reacciones que proporcionan energa (exergnicas) y las que utilizan energa (endergnicas); lo hace asi porque puede actuar en ambos tipos de reacciones. De igual manera, los otros difosfatos de

nuclesidos: guanilico, citidlico y uridilico, pueden fosforilarse con el TFA para dar los correspondientes trifosfatos.

Fig. 6-4. Frmula qumica del TFA

Estas reacciones son importantes ya que todos los trifosfatos de nuclesidos son instrumentos en las reacciones de sntesis. El TFA entra en la sntesis de los cidos grasos y en la sntesis de las protenas (vase Cap. 13); el TFC en la sntesis de los fosfolipidos; el TFU, en la del glucgeno (vase Cap. 14); y el TFG, en la sintesis de los carbohidratos y de las protenas. El ltimo requisito de energa para las necesidades de sntesis de la clula, est en el TFA, ya que solamente ste se forma en las fosforilaciones gliclica (vase Cap. 14) fotosinttica y de oxidacin (vase Cap. 11). Pero del TFA, la energa se canaliza, por medio de incontables reacciones de transfosforilaciones, a otros compuestos "donadores de energa". Por ejemplo, el glucgeno se forma a partir del DFAG, un compuesto que se sintetiza en la reaccin del TFU con el fosfatolglucosa; el TFU se forma del TFA a travs de la reaccin TFA + DFU DFA + TFU. Adems, el TFA puede fosforilar a la creatina, formando la fosfocreatina utilizada en las fibras musculares (vase Cap. 14). Tambin puede fosforilar al acetato, dando el acetilfosfato, o puede transferir la mitad de su adenilato al acetato, formando el acetiladenilato. Estos dos compuestos pueden transformarse en la acetilcoenzima A, la cual es la precursora inmediata de los cidos grasos. En la Fig. 6-5 se dan las interconversiones entre las diferentes clases de compuestos del fsforo. El problema presentado por tales esquemas es de cmo la clula puede regular, a travs de los cambios de los grupos de alta energa,

DEPOSITOS DE ENERGIA n-fosfatos como la fosfocreatina Acetilfosfatos como el acetilfosfato

AGENTES FOSFORILANTES TFA TFU TFG TFC

INTERMEDIOS

Aciladenilatos,co mo los de aminocidos Aciltiosteres como el acetilo de la coenzima A

TFA DFA +
Fosfato inorgnico

DFA +
Fosfoenolpiruvato

DFA +

AMP +

Fosfato Pirofosfato Inorgnico Inorgnico

Fig. 6-5. Interrelaciones entre los compuestos de "elevada energa"

las innumerables reacciones de sntesis que tienen lugar dentro de ella. En algunos casos, como el estado de energa del compuesto aceptor fosforilado es el mismo que el del TFA, o menor, parecera que la disponibilidad del compuesto aceptor, sea ste DFU o glucosa, se empleara como un medio regulador. En otras ocasiones, como sucede en el caso de la fosfocreatina o del acetiladenilato, el contenido de energa es ms alto que el del TFA; entonces la reaccin no ira en la direccin de la sntesis del compuesto aceptor fosforilado, a menos que la concentracin del ltimo compuesto sea reducida, utilizndolo todava en otra reaccin aparte de la sntesis. De esta manera, la energa es empleada en la reaccin de sntesis; el fosfato o el pirofosfato se rompe, y la reaccin completa, a partir del TFA, ser en la direccin de la sntesis del fosforilado intermedio, y por lo tanto, en la direccin de la sntesis del glucgeno, de la protena, o de cualquier otro que sea el caso.

ESTRUCTURAS ORGANICAS Los compuestos orgnicos de la clula frecuentemente se clasifican en cinco categoras: carbohidratos, lpidos, protenas, cidos nucleicos, y "otros". En este captulo nos restringiremos a ejemplos solamente de la primera y de la segunda categoras. Carbohidratos Los carbohidratos son un grupo de compuestos caracterizados por tener la frmula general (CH2O)n.

La d-glucosa, una hexosa, es el azcar de 6 carbonos ms ampliamente extendido en el mundo viviente. Tiene cinco grupos hidroxilos y un grupo aldehido. En solucin se le encuentra principalmente en la forma de un anillo de 6 miembros que est en equilibrio con una pequea cantidad de la forma de cadena abierta. La forma en anillo (piranosa) origina que el grupo aldehido sea relativamente poco reactivo.

Puesto que la glucosa tiene cuatro tomos de carbono asimtricos, tiene 16 ismeros, de los cuales solamente tres se encuentran en la naturaleza. A causa de la abundancia de los grupos hidroxilo con enlaces de hidrgeno, la glucosa es muy soluble en agua. La d-ribosa es un azcar de cinco carbonos (pentosa), que veremos es extremadamente importante en la qumica de la herencia (ya que es un componente del ADN y del ARN ) y en el metabolismo de la transferencia de energa (puesto que es una parte constitutiva del TFA). Su derivada es la desoxirribosa.

D-ribosa

El d-gliceraldehido es un importante intermediario en el metabolismo anaerbico de los carbohidratos (vase el Cap. 14).

D-gliceraldehdo Las hexosas y las pentosas pueden polimerizarse en cadenas rectas o ramificadas de variable longitud para formar polisacridos, los cuales son materiales estructurales como la celulosa o productos de almacenamiento como el almidn (en las plantas ) o el glucgeno ( en los animales ). Lpidos Los lpidos no estn relacionados, necesariamente, en una estructura qumica, ya que estn definidos por su propiedad fsica comn de solubilidad en solventes orgnicos no polares. Acidos grasos de la variedad "saturada", tienen la siguiente frmula general. O // CH3-(CH2)n -C \ OH Un ejemplo tpico es el cido palmitico CH3 - (CH2)14 - COOH Los cidos grasos no saturados tienen uno o ms enlaces dobles. Por ejemplo, el cido oleico, que posee solamente un enlace de esta naturaleza, tiene la siguiente frmula CH3(CH2)7CH = CH(CH2)7COOH

Los cidos grasos tienen la propiedad especial de estar compuestos de una cadena bastante no polar e hidrofbica de hidrocarburos, y un grupo carboxilo disociado muy polar. Esto origina que el cido graso forme una capa orientada monomolecular en una interfase de agua, un efecto que baja considerablemente la tensin superficial del agua.

Esto explica el poder de desengrase de los jabones que son sales de potasio y sodio de cidos grasos. Las grasas son steres del glicerol y de los cidos grasos. H

CH2O - H

+ +

HO - OC(CH2)n CH3 HO - OC(CH2)n' CH3 HO - OC(CH2)n'' CH3

Acidos grasos

H - C - O - C - (CH2)n - CH3 O

CH2O - H

H - C - O - C - (CH2)n' - CH3 O

CH2O - H +
Glicerina

H - C - O - C - (CH2)n'' - CH3 H
Grasa

Debido a que los grupos carboxilos polares estn unidos en las grasas en forma de ligaduras ster, mucho menos polares, las grasas son altamente insolubles en agua. Los fosfolpidos son steres del glicerol (glicerina) y uno o dos cidos grasos, que contienen, adems, algunos compuestos de nitrgeno y fsforo. La frmula es la de una lecitina que contiene cido fosfrico y una base de nitrgeno llamada colina. A causa de las dos cargas en un extremo y las caractersticas no polares en el otro, los fosfolpidos tienden a ser muy activos de superficie. Se encuentran en la clula como componentes estructurales de las membranas semipermeables.

Lecitina

Los esteroides son lpidos que se derivan de una estructura de fenantreno, por lo cual son muy diferentes en su constitucin qumica de los cidos grasos, de las grasas y de los fosfolpidos. Los esteroides se encuentran como componentes estructurales de las membranas y tambin como hormonas, y en este caso desempean un importante papel en la regulacin fisiolgica del metabolismo animal. El colesterol es un esteroide bien conocido y ampliamente distribuido.

Colesterol

Las bases de nitrgeno y los aminocidos son los materiales de construccin de los cidos nucleicos y de las proteinas, respectvamente, y se tratarn, por lo tanto, en los dos captulos siguientes. Otros compuestos, tales como los cidos orgnicos, los intermediarios fosforilados, etc., se discutirn en los Caps. 10 y 11. Hemos tratado aqu de las molculas pequeas ms importantes de la clula. Ms adelante aprenderemos algo del papel que desempean en el "flujo metablico" que es tan caracterstico del mundo viviente.

Como hemos visto en el Cap. 3, la clula no es una gotita de liquido conteniendo una mezcla de pequeas molculas en solucin. Es, ms bien, materia en un estado coloidal de agregacin, poseyendo tanto las propiedades elsticas de un slido como las propiedades viscosas de un lquido. Adems, la clula no est hecha de un solo material "protoplasmtico", sino que est formada por organelas suspendidas en una sustancia base, que est entrelazada por una malla de membranas hidrofbicas. Ciertamente, la clula tiene una fina e intrincada estructura dentro de la cual el flujo metablico de las pequeas molculas es regulado delicadamente. Los materiales de construccin que dan origen a esta fina estructura, son las macromolculas de la clula, los cidos nucleicos y las protenas. Es, por lo tanto, importante, a fin de comprender la estructura y la funcin de las organelas celulares, estudiar con ms detalle la qumica estructural de las macromolculas celulares. LISTA DE LECTURAS QUE SE SUGIEREN BALDWlN, E., 1957. Dynarnic aspects of biochemistry, 3ded. Cambridge: Cambridge University Press. Fruton, J. S., and Simmons, S., 1958. General biochemistry, 2d ed. New York: Wiley.

CAPITULO SIETE
LOS ACIDOS NUCLEICOS, PORTADORES DE INFORMACION BIOLOGICA

La historia de la ciencia frecuentemente, se la representa como un proceso en una

sola direccin, de una percepcin que constantemente se ensancha y se profundiza dentro de la unidad de la naturaleza. Pero la ciencia es tambin una actividad humana y su progreso revela mucho acerca de la mente y del espritu del hombre. Ilustra su capacidad para despojarse a si mismo de prejuicios; su disposicin para aceptar la soledad que sobreviene a travs de una separacin de la corriente principal del pensamiento humano; su habilidad para comunicarse con provecho con sus semejantes a travs de barreras nacionales y aun ideolgicas. Este significado humanstico de la ciencia puede comprenderse mejor cuando examinamos las biografas de los ms extraordinarios profesionales. Uno de ellos fue Friedrich Miescher (1844-1895) el cual anticip un enfoque de la biologa celular que ha venido verificndose solamente durante los ltimos veinte aos. En 1868, Miescher se impuso la tarea de estudiar la qumica del ncleo. En ese tiempo, la importancia del ncleo era escasamente comprendida, pues fue hasta 1876 cuando Oskar Hertwig demostr que la fecundacin del erizo de mar comprenda la fusin de dos ncleos, uno procedente del vulo y el otro del esperma. Varios pensadores, incluyendo a Leonardo da Vinci (1452-1519), haban sealado anteriormente que, puesto que la herencia resulta de determinada unin y no se afecta por la direccin en la cual se haga el cruzamiento, tanto el macho como la hembra, por lo tanto, deban contribuir por igual a la herencia de la descendencia. Miescher debi estar al tanto de esto como tambin del hecho de que el esperma consiste, casi en su totalidad, de material nuclear. Debi haber hecho conjeturas, aun antes de las observaciones de Hertwig de la fusin nuclear, de que el ncleo es el depsito de los hechos hereditarios. Provisto de esta brillante y proftica conjetura, Miescher enfoc su problema en una forma que se adelant medio siglo a sus contemporneos. Para empezar, l supuso que el fenmeno de la herencia deba tener una base qumica. Segundo, escogi un material biolgico muy adecuado para el aislamiento del ncleo: las clulas de pus, obtenidas de las vendas de desecho de las heridas de los soldados, con las cuales contaba en abundancia debido a la Guerra Franco-Prusiana.

Tercero, emple una tcnica asombrosamente moderna para romper con delicadeza a sus clulas: la digestin con cido clorhdrico-pepsina, seguida de la extraccin con ter que dejaba una capa de ncleos intactos en el fondo del tubo de ensayo. As, sin el auxilio de la centrifugacin diferencial, Miescher fue capaz de aislar, por primera vez, a una organela celular. Tratando al ncleo con una solucin salina seguida de acidificacin, Miescher obtuvo un material que tenia una propiedad observada, hasta entonces, solamente en algunas fracciones de lpidos: contena grandes cantidades de fsforo. Miescher denomin a este material nucleica. Posteriormente se le denomin cido desoxirribonucleico (ADN) y est reconocido, en la actualidad, como la estructura qumica en la cual se almacenan las caractersticas hereditarias de las clulas. Miescher sigui su descubrimiento a travs de muchos aos con cuidadosa experimentacin. Fraccionando las cabezas del esperma del salmn del Rin a bajas temperaturas, fue capaz de demostrar que la nucleina era una sustancia de elevado peso molecular y que estaba asociada con una protena inusitadamente bsica que denomin protamina. Su medida del contenido de fsforo de la "nucleina" (9.95%) corresponde con nuestros modernos valores del ADN (9.22 a 9.24% ) y es un tributo a la excelencia de sus preparaciones. Cuando muri Miescher. Le dej a su estudiante Altmann los firmes cimientos de un campo completamente nuevo en biologa, que l, un solo individuo, haba iniciado. As nacieron nuestros conocimientos de la base molecular de la herencia, precisamente en el tiempo en que Mendel estaba descubriendo algunas de sus manifestaciones biolgicas.

LA QUIMICA ORGANICA DE LOS ACIDOS NUCLEICOS

Durante los cuarenta aos que siguieron a la muerte de Miescher, se encontr la explicacin de la qumica orgnica de los cidos nucleicos. Se hizo aparente que existan dos clases de estos cidos. El cido desoxirribonucleico (ADN) se encontr que est compuesto de (1) las bases nitrogenadas de purina: adenina y guanina, (2) las bases nitrogenadas de pirimidina: citosina y timina, (3) el azcar pentosa desoxirribosa y (4) el cido fosfrico (Fig. 7-1). El cido ribonucleico (ARN) se encontr que est compuesto de los mismos materiales de construccin excepto que el uraciIo de la pirimidina sustituye a la timina y la pentosa ribosa a la desoxirribosa (Fig. 7-1 ). En los ltimos veinte aos, con el auxilio de enzimas especiales llamadas nucleasas que tienen la propiedad de romper ya sea al ADN o al ARN en diversos sitios especficos en su estructura macromolecular, ha sido posible encontrar cmo estos materiales de construccin del ADN y del ARN, se encuentran colocados dentro de la molcula.

Fig. 7-1

Los materiales de construccin del ADN y del ARN

Timina una pirimidina

Timidina un nuclesido de pirimidina

Morofosfato de timidina un nucletido de pirimidina

Un nucletido de ADN

Adenina una purina

Adenosina un nuclesido de purina

Monofosfato de adenosina un nucletido de purina

Un nucletido de ARN
Fig. 7-2. El nucletido, subunidad fundamental de los cidos nucleicos

Tanto en el ADN como en el ARN, las bases nitrogenadas de la purina y de la pirimidina se encuentran ligadas a la desoxirribosa o a la ribosa respectivamente, para formar nuclesidos (Fig. 7-2), en tanto que el fosfato est unido a los azcares para dar lugar a los nucletidos. Cmo se encuentran unidos los nucletidos en el polimero? Conocemos ahora, a travs de muchos hechos evidentes separados, que tanto el ADN como el ARN son polmeros lineales, no ramificados, de nuclesidos ligados por medio de grupos de fosfato. Las bases nitrogenadas, como mostramos en la Fig. 7-2, se encuentran unidas a las unidades de pentosa. La Fig. 7-3 representa cadenas de muestra o "polinucletidos" del tipo del ADN y del ARN.

INDICACIONES DE LA FUNCION BIOLOGICA

En tanto que estas laboriosas investigaciones sobre la qumica orgnica de los cidos nucleicos estaban en progreso, un gran nmero de investigaciones importantes condujeron al esclarecimiento de su funcin biolgica. En los Caps. 12 y 13 y en la Gentica de esta serie, se discuten los ms recientes descubrimientos en este campo. No trataremos aqu de las tcnicas por medio de las cuales se hizo la separacin del ADN y del ARN, uno del otro y de otros constituyentes de la clula, como las protenas. Baste decir que todos los descubrimientos qumicos y biolgicos quedaron cimentados precisamente en los avances hechos en el rea de la purificacin.

Polinucletido del ADN

Forma esquemtica de los polinucletidos del ADN y del ARN

Polinucletido del ARN

Fig. 7-3. Estructura de los polinucledos del ADN y del ARN

De igual importancia fue el saber que el ADN reacciona con el reactivo de Schiff para dar un brillante color prpura (la reaccin de Feulgen ), que tanto el ADN como

el ARN reaccionan con los colorantes bsicos y que ambos absorben la luz ultravioleta con gran intensidad en la regin de los 240 a los 280 m con una absorcin mxima, proximada a los 260 nm, (Fig. 7-4). Al analizar estos descubrimientos, se desarrollaron un gran nmero de mtodos ingeniosos para localizar al ADN y al ARN en la clula. Carspersson desarroll microscopios de luz ultravioleta, microespectrofotmetros y varios mtodos microqumicos diseados para calcular el contenido de cido nucleico en las partculas celulares.

Fig. 7-4. Espectro de absorcin de un cido nucleico

De estos estudios hemos aprendido que (1) el ADN est localizado principalmente en los cromosomas aunque existen algunos informes que indican habelo encontrado en los cloroplastos y aun en el citoplasma de los huevos, (2) que la mayor proporcin de ARN se encuentra en el citoplasma y (3) que de la pequea cantidad de ARN encontrada en el ncleo, una parte est localizada en el ncleo y el resto est asociado con los cromosomas o se encuentra libre en el jugo nuclear. Como veremos en el Cap. 13, la mayor parte del ARN citoplasmtico se encuentra en los ribosomas. Pero los experimentos ms significativos que se han efectuado sobre el papel biolgico de los cidos nucleicos, se han hecho con los microorganismos. Puesto que estos experimentos se han examinado con algn detalle tanto en Gentica como en la Vida microbiana, de esta serie, simplemente haremos una mencin de ellos. (1) El aislamiento y purificacin de muchos virus y la demostracin de que estos sistemas autoduplicantes son la desoxirribonucleoprotena o la ribonucleoproteina. (2) El trabajo de Avery, MacLeod y McCarty que demuestra que el ADN extraido

de la cepa de neumococo S (capsulado) puede, completa y permanentemente, transformar clulas del tipo R (no capsulado) al po S. (3) El trabajo de Hershey y Chase que demuestra que durante la infeccin por virus, el ADN del virus T2 penetra en la clula bacteriana en tanto que la mayor parte de las protenas del virus permanecen afuera. (4) El trabajo de Fraenkel-Conrat y Schramm mostrando que para el virus del mosaico del tabaco transportador de ARN, era nicamente ste solo el que determinaba las caractersticas especiales de una determinada cepa de virus. As, por la mitad de la dcada de los cincuentas, estos y otros experimentos haban conducido a la creencia general de que el ADN es el material hereditario de la clula y que la sntesis de las protenas se hace, hasta cierto punto, mediante el ARN. Puesto que el gen debe ser el ltimo determinante de la especificidad de la protena, se supona que el metabolismo, tanto del ADN como del ARN, estaba relacionado. Trataremos en los Caps. 12 y 13 hasta qu punto estas predicciones de la dcada de los cincuenta, se ha comprobado que son esencialmente correctas. Aqu, sin embargo, examinaremos con ms detalle la estructura tridimensional de los cidos nucleicos.

LA ESTRUCTURA DEL ADN

Sabemos, hasta este punto, que el ADN y el ARN son polinucletidos que forman largas cadenas sin ramificaciones. Este conocimiento no nos dice, sin embargo, cmo estas molculas estn organizadas tridimensionalmente. Como veremos una y otra vez, la configuracin precisa tridimensional de las macromolculas biolgicas es de suma importancia para comprender su funcin biolgica, y es en este campo de la biologa celular donde han tenido lugar los ms sorprendentes descubrimientos durante la dcada pasada. En 1950, Chargaff seal que en el ADN, la cantidad de adenina es igual a la de timina y la de guanina es igual a la de citosina. Al mismo tiempo Wilkins y un gran nmero de otros investigadores en Inglaterra, obtuvieron medidas exactas efectuadas sobre fibras "tejidas" procedentes del ADN, utilizando el mtodo de la difraccin de los rayos X. Este mtodo tan poderoso, el cual est desempeando un papel cada vez de mayor importancia en la biologa molecular, emplea la difraccin de los rayos X para detectar la forma peridica o repetida en la estructura molecular o cristalina. Las mediciones del ADN mostraron que existe una forma repetida a intervalos de 28 a 34 A. Estas dimensiones causaron verdadera extraeza, puesto que nada en la estructura qumica, a lo largo de la longitud del polmero lineal, pareca corresponder con estas medidas: la distancia de un fosfato al siguiente es aproximadamente de slo 7 A. Las mediciones fsicas en soluciones de ADN de propiedades tales como la viscosidad y la dispersin de la luz, indican que la molcula del ADN es muy grande (pesos moleculares de 105 a 107) y tiene la forma de bastoncillos muy largos y tiesos.

Watson y Crick, cuando colaboraban en el Cavendish Laboratory, en Cambridge, Inglaterra, propusieron en 1953, una estructura para el ADN que satisfaca las observaciones anteriores. Empleando lo sabido hasta entonces acerca de las distancias de los enlaces y los ngulos de enlace en las molculas orgnicas, construyeron un modelo a escala de la molcula del ADN. Se les ocurri que de 28 a 34 A repetidos en el modelo podan satisfacer a una espiral. Que la molcula era una doble espiral de dos espiras separadas de ADN, torcindose una alrededor de la otra; les debi haber sido sugerido cuando consideraron la complementariedad de A = T y G = C descubierta por Chargaff. El modelo a escala de la espiral de doble espira que result, prob tener propiedades interesantes. Primero, Watson y Crick sealaron que para tener la mxima simetra, las dos espiras deban ir en direcciones opuestas. Haciendo referencia a la Fig. 7-3, se observa que las espiras de ADN, no tomando en consideracin el orden de las bases, no son las mismas si se leen desde la izquierda y desde la derecha. Segundo, encontraron que la estructura de dos espiras est estabilizada por las bases de nitrgeno, que apuntan unas hacia las otras y son capaces de formar enlaces de hidrgeno. Se concluye que estos puentes que sostienen unidas las dos espiras de la doble espiral se pueden formar solamente entre purinas y pirimidinas, puesto que no hay espacio suficiente para dos purinas y existe demasiado para dos pirimidinas. Adems, como se puede observar de la Fig. 7-5, los nicos pares de purina y pirimidina capaces de formar enlaces de hidrgeno son la adenina-timina

Fig. 7-5. Enlaces de hidrgeno entre adenina-timina y guanina-citosina

(dos enlaces de hidrgeno) y la guanina-citosina (tres enlaces de hidrgeno). Esta conclusin ha sido desde entonces sostenida por un conjunto abrumador de evidencias estereoqumicas y de otra clase y es una de las ms excitantes en la historia de la biologa. As, la igualdad A = T, C = G sugiere una doble espiral, esta doble espiral est construida de tal manera que uno encuentra que tiene las propiedades estereoqumicas de determinar nicamente la igualdad A = T, C = G.

Tercero, llega a ser claro que la naturaleza del modelo no pone restricciones en la secuencia de cmo se continan uno al otro el par de bases. As, parece que molculas diferentes de ADN son idnticas en su arquitectura en general, difiriendo solamente en la secuencia especfica de sus pares de bases. La Fig. 7-6 muestra dos modelos del ADN de Watson-Crick de doble espiral. La primera ilustra el ahora famoso modelo geomtrico bsico de la "escalera de cuerda curvada con peldaos slidos y muestra la posicin de los bloques que construyen el armazn, los fosfatos, los azcares y las bases unidas en pares por medio de enlaces de hidrgeno. El segundo modelo utiliza los volmenes atmicos correctos e ilustra el espacio ocupado por los diversos grupos. En los ltimos aos se han obtenido, muchas evidencias para hacer de la hiptesis de Watson-Crick una de las ms firmes generalizaciones de la teora biolgica. Estas evidencias incluyen (1) ms estudios y en forma ms extensa de la difraccin de los rayos X; (2) la inspeccin directa por medio del microscopio electrnico (Fig. 7-7) la cual muestra que la masa por unidad de longitud est de acuerdo con el modelo; (3) los datos fisicoqumicos del llamado "punto de fusin" del ADN, que es la temperatura en la cual se rompen ambos enlaces de hidrgeno, causando la ruptura de la rgida molcula del ADN; (4) los estudios de la digestin enzimtica, en los cuales la cintica observada sigue una norma predicha, como consecuencia de la estructura de doble espiral, y, finalmente, (5) el trabajo espectacular de Konrberg y su grupo al efectuar la sntesis del ADN en un tubo de ensayo (vase el Cap. 12).

Significado biolgico
Se ha sugerido desde hace tiempo que el material hereditario o gentico de la clula debe tener dos funciones por separado. Debe ser capaz de autoduplicarse y de iniciar acciones que finalmente encuentren expresin en una estructura o funcin celular determinada. Como resultado del trabajo de gentica bioqumica comenzado por Ephrussi y por Beadle y Tatum (vase Gentica de esta serie) parece ser ahora que la expresin de la accin del gen es la formacin de una protena, ya sea una protena enzimtica o estructural. El ADN debe ser, por lo tanto, capaz tanto de duplicarse a si mismo como de proveer la informacin necesaria para la sntesis de la protena. Es claro que la estructura del ADN proporciona un medio conveniente por medio del cual una molcula en particular con una secuencia particular de pares de bases, se podra duplicar. As cada espira de la molcula podra determinar el crecimiento de una "espira complementaria", resultando la formacin de dos molculas idnticas (Fig. 7-8A). Un modelo geomtrico exacto, por medio del cual puede tener lugar la duplicacin de la molcula del ADN, en una forma continua, sin necesitar la separacin previa de la espira, fue sugerido por Levinthal y Crane (Fig. 7-8B).

Fig. 7-6A. Modelo diagramtico de una pequea porcin de la molcula del ADN

Ellos sugirieron que la duplicacin poda empezar en uno de los extremos, abriendo as la espira y proporcionando la energa necesaria para la rotacin de las dos espiras hijas en crecimiento, as como tambin para el acortamiento de la espira progenitora. Sacaron en conclusin que haba suficiente energa para vencer la resistencia viscosa que se opone a esas rotaciones y bastante fuerza mecnica en la espiral para soportar la torsin necesaria sin originar una seria dilatacin de los enlaces. La duplicacin de la hlice del ADN que se muestra en la Fig. 7-8B es, en la actualidad, un smbolo familiar de la biologa molecular.

Fig. 7-6B. Modelo atmico a escala de la molcula del ADN. (Cortesa de M. H. F. Wilkins, King's College, Inglaterra)

Fig. 7-7. Molculas de ADN del esperma de salmn ( 108150). (Cortesa de C. E. Hall y M. Litt, Massachusetts Institute of Technology)

Por lo que respecta al papel del ADN de almacenar y transmitir informacin para ser utilizada en la sntesis de la protena, podra parecer que la secuencia especifica de las bases a lo largo de esta estructura lineal proporciona el cdigo necesario para determinar la estructura de la protena. En un captulo posterior diremos algo ms sobre esta funcin crucial de la clula. Es suficiente apuntar aqu la sugestin de Crick de que, si uno se imagina los pares de bases correspondiendo a los puntos y rayas de la clave de Morse, existe cantidad suficiente de ADN en la clula humana para poner en clave Morse, 1000 voluminosos libros de texto. Hemos sugerido en captulos anteriores que un signo caracterstico de la maquinaria viviente es su capacidad para la "microminiaturizacin". Aqu tenemos, en verdad, un asombroso ejemplo de esta propiedad celular: la capacidad de 20 10-12g de ADN en el huevo humano fecundado para determinar todas las caractersticas hereditarias del individuo humano maduro, pesando 5 1015 cuando ms. O, como se ha enunciado, todo el ADN que determina los caracteres hereditarios de toda la poblacin de la tierra, se podra encerrar en la cabeza de un alfiler.

Fig. 7-8. La rplica de la molcula del ADN

ESTRUCTURA DEL ARN

Nuestro entendimiento de la estructura y funcin biolgica del ARN es de origen ms reciente y menos completo que el del ADN. Existe actualmente evidencia de por lo menos tres tipos de ARN celulares no contando al ARN de los virus vegetales y de algunos virus animales. En los Caps. 12 y 13 discutiremos la funcin biolgica del ARN con ms detalle. Y, por lo tanto, concretaremos nuestra presente discusin solamente a consideraciones estructurales. Aproximadamente 60 al 80% del ARN de la clula se encuentra en las partculas de ribosoma. Estas grandes partculas de ribonucleoproteina pueden extraerse para proporcionar preparaciones de ARN de muy elevado peso molecular (5 10 5 a 2 106). Hace muy poco se ha identificado una nueva forma de ARN a la que se ha dado el nombre de ARN mensajero. Se cree actualmente que es fabricado en el ncleo y que despus de pasar al citoplasma, se une a los ribosomas. Parece que esta unin depende de la concentracin de Mg2+; una concentracin de 10-2M favorece la unin y una de 10-4 M provoca la disociacin. Las estimaciones hechas hasta el presente del peso molecular del ARN mensajero indican que es un material polidisperso, cuyo peso molecular varia de 5 104 a 5 105 y posiblemente ms.

Una tercera forma de ARN, denominada ARN transporte, es de bajo peso molecular (30 000) y por razones que se harn claras ms adelante (Cap. 13 ), se espera encontrar en la clula 20 especies moleculares diferentes, una para cada aminocido encontrado en las protenas. La organizacin estructural del ARN hasta recientemente, haba sido un completo misterio. En junio de 1962, Wilkins y sus colaboradores informaron que haban tenido xito en la cristalizacin de las sales de sodio del ARN transporte. Los estudios cristalogrficos de estos cristales, efectuados por medio de los rayos X, revelaron los mismos principios estructurales encontrados en el ADN; es decir, una doble espiral formada por cadenas antiparalelas, mantenidas juntas por medio de enlaces de hidrgeno entre las bases complementarias. La diferencia en el ARN parece ser que la doble espiral est formada por una sola cadena doblada en el centro y retorcida alrededor de si misma (vase la Fig. 7-9).

Modelo de ARN tansporta 80 nucletidos peso molecular 30 000

Estructura hipottica del ARN ribosomtico, mostrando las regiones en espiral y |as de no espiral.

Fig. 7-9. Modelos de doble espiral de cadenas aisladas de ARN transporte (cortesa de M. H. F. Wilkins) y estructura hipottica del ARN ribosomtico.

Los investigadores sugirieron que esta disposicin deja tres bases impares en un extremo capaces de unirse mediante enlaces de hidrgeno con tres bases posiblemente en el ARN mensajero. Las implicaciones de esta sugestin se harn ms claras en el Cap. 13. Wilkins y sus colaboradores sugieren que las otras formas de ARN tambin contienen extensas regiones de doble espiral como tambin lo han hecho numerosos estudios fisicoqumicos diversos. Pero, puesto que el ARN ribosomtico, a diferencia del ARN transporte y del ARN mensajero no tiene igualdad en A = T y G = C, solamente algunas porciones de este ARN se puede esperar que sean de doble espiral (vase la Fig. 7-9). Se cree que el papel del ARN es convertir el mensaje del ADN en una forma que pueda ser utilizada para la sntesis de las protenas y en el Cap. 13 tendremos que decir algo ms acerca de esto. Sin embargo, es apropiado considerar ahora a las protenas, las cuales son las macromolculas fisiolgicamente activas y estructuralmente significativas de las clulas. ___________________________________________________________________ LISTA DE LECTURAS QUE SE SUGIEREN
ALLEN, J. M., ed., 1962. The molecular control of cellular activity. New York: McGraw-Hill. CHARGAFF, E., and DAVlDSON, J. N., eds., 1955. The nucleic acids. New York: Academic Press. CRICK, F. H. C., "Nucleic acids," Scientific American, September 1957. --------, The structure of the hereditary material," Scientific American, October 1954. DAVIDSON, J. N., 1960. The biochemistry of nucleic acids, 4th ed. New York: Wiley. KORNBERG, A., 1962. Enzymatic synthesis of DNA. New York: Wiley.

CAPITULO OCHO
LAS PROTEINAS, AGENTES DE ESPECIFICIDAD BIOLOGICA

Las protenas, como la derivacin de la palabra lo implica, son de primordial

importancia para la vida de la clula. Como muestra la Tabla 8-1, las protenas constituyen el componente principal de la sustancia seca de una clula en desarrollo TABLA 8-1. RESULTADOS ANALITICOS TIPICOS OBTENIDOS DEL FRACCIONAMIENTO DE CELULAS EN RAPIDO DESARROLLO
(Estos resultados son caractersticos para clulas que carecen de paredes con polisacridos o grandes cantidades de materiales estructurales o de almacenamiento )

___________________________________________________________________
Material Criterios empleados para la fraccin Porcentaje en peso de la materia seca

___________________________________________________________________ Pequeas molculas "fraccin soluble en cido" Lipidos "fraccin soluble en solvente orgnico" Acidos nucleicos "fraccin soluble en cido caliente" solubilidad en cido tricloroactico al 5% en frio solubilidad en alcohol-ter a 50C solubilidad en cido tricloroactico, al 5% a 90C durante 30' 2-3

10-15

10 - 20

Protetnas "fraccin insoluble en cido insolubilidad en cido triclorocaliente" actico, al 5% a 90C durante 90' 55 - 85 ___________________________________________________________________

activo. Lo que es ms notable acerca de las protenas es que ellas no son solamente el material principal con que se ha fabricado la estructura celular, sino que tambin son las reguladoras de todas las actividades que se llevan a cabo en la mquina viviente. Para realizar su funcin reguladora, las protenas estn dotadas de especificidad, o sea, la capacidad para distinguir entre molculas diferentes. Esta propiedad, ms que cualquier otra, es caracterstica del fenmeno de la vida misma. Se cree que esta especificidad de las proteinas no solamente permite la regulacin de la multitud de los procesos celulares, sino que es tambin la base molecular de las diferencias que existen entre individuos y entre especies. Una ley constante de la naturaleza es que la estructura y la funcin se encuentran relacionadas. As, nosotros creemos que la clave para comprender cmo se comportan las protenas es conocer en detalle cmo se encuentran agrupadas. En los ltimos quince aos, una asombrosa serie de adelantos se ha aadido a nuestro conocimiento de la estructura de las protenas. Intentaremos dar aqu una informacin de estos adelantos, con el fin de construir en la mente del estudiante un cuadro vivo de la molcula de la protena.

PURIFICACION DE LAS PROTEINAS

Con el fin de estudiar determinada protena debemos obtenerla en estado puro, separndola de las otras protenas del "extracto" inicial obtenido del tejido vivo. Los procedimientos empleados constituyen un arte altamente refinado y en rpido desarrollo, que no trataremos de describir aqu. El primer xito notable en la purificacin de las protenas fue obtenido por James Sumner (1926), quien cristaliz la protena ureasa del tejido del haba americana. Esta importante realizacin marc el fin de una era durante la cual los bilogos haban considerado a las protenas con un pavor que impeda la utilizacin de enfoques qumicos directos para el estudio de estos complicados compuestos. En verdad, muchos bilogos dieron poca importancia al descubrimiento de Sumner por varios aos. Actualmente, se han cristalizado unas 75 proteinas diferentes y un nmero mucho mayor se ha preparado en un alto estado de pureza. Dos propiedades especiales de las protenas tienen una influencia importante en el xito de la purificacin de ellas. (1) Las protenas son compuestos lbiles capaces de perder sus propiedades biolgicas especficas bajo diversos tratamientos qumicos y fsicos relativamente dbiles (desnaturalizacin). As, despus de cada purificacin es necesario demostrar que no ha tenido lugar una desnaturalizacin significativa. (9.) A causa del tamao de la molcula de las protenas y la floja estructura del cristal protenico, se puede introducir una cantidad considerable de impurezas en un preparado cristalino. En aos recientes, se ha empleado un nmero cada vez mayor de pruebas rigurosas para valorizar la pureza u "homogeneidad" de una preparacin de protena. As, una purificacin exitosa de una protena es aquella, que comprende un mnimo de desnaturalizacin y satisface diversas pruebas de homogeneidad.

TAMAO Y FORMA DE LAS MOLECULAS DE LAS PROTEINAS

El tamao muy grande de las molculas de las protenas y su relativa labilidad, presentan al qumico que estudia su estructura un nmero de problemas que no puede resolver con los mtodos que se aplican a molculas pequeas. Por lo tanto, se han desarrollado y perfeccionado diversos mtodos durante los ltimos veinte aos, que han hecho posible determinar, con bastante precisin, el peso molecular y en menor escala la forma de las macromolculas. Por ejemplo, en la ultracentrfuga, las macromolculas pueden girar a velocidades superiores a 60 000 rpm, aumentando as la fuerza gravitacional sobre las molculas a ms de 100000 veces la de la gravedad. TABLA 8-2 PESOS MOLECULARES DE ALGUNAS PROTEINAS, DETERMINADOS POR VARIOS METODOS DIFERENTES ___________________________________________________________________
Presin osmtica Dispersin de la luz Proporcin de sedimentacin y de difusin Equilibrio de sedimentacin Mtodos qumicos

Protena

___________________________________________________________________
Insulina Ribonucleasa Pepsina Ovalbmina Hemoglobina Albmina de suero bovino Hemocianina ( Polinurus ) Virus del achaparramiento del tomate Virus del mosaico del tabaco 9000000 12000 36000 40000 46000 67000 69000 12000 12700 35500 38000 77000 461000 44000 63000 65400 450000 10600000 13000 39000 40500 43500 68000 450000 7600000 *6000 12000

66800

40000000

40700000

___________________________________________________________________
*La discrepancia en el caso de la insulina se debe a la tendencia de sta a dimerizarse.

Esta fuerza, que origina la sedimentacin'' de las molculas, es contrarrestada por la difusin al azar de las molculas. Puesto que el equilibrio entre estas dos fuerzas est en relacin con el peso molecular, la ltima se puede medir para las macromolculas con bastante precisin. Otros mtodos utilizan las propiedades de la dispersin de la luz que poseen las macromolculas, la presin osmtica de las soluciones de protenas, la proporcin de sedimentacin en un elevado campo gravitacional combinada con el coeficiente de difusin, la difraccin de los rayos X por los cristales de protena y la visualizacin directa y conteo en el microscopio electrnico y, en algunos casos, el anlisis qumico directo tambin se ha desarrollado. La Tabla 8-2 es una lista de los pesos moleculares de algunas protenas y nucleoproteinas que han sido determinados por varios mtodos; se puede ver que, en las principales, los valores obtenidos concuerdan muy bien. Por otra parte, la determinacin de la forma molecular est an llena de dificultades. Los mtodos hidrodinmicos que se basan en la relacin entre la asimetra molecular y la fuerza de friccin necesaria para mover las molculas a travs del solvente, son rpidos, precisos y se llevan a cabo fcilmente. Desgraciadamente, a causa de algunas suposiciones, estos mtodos proporcionan resultados equivocados. El microscopio electrnico y los mtodos de difraccin de los rayos X nos han dado, en los ltimos aos "imgenes" espectaculares de la forma de las molculas de protena, pero el primero, hasta ahora, permite la resolucin clara de la forma de las ms grandes molculas solamente y los ltimos, slo se han aplicado en muy pocos casos hasta ahora. La Fig. 8-1 muestra algunas molculas de protenas tales como aparecen en el microscopio electrnico. La aplicacin de los mtodos anteriormente mencionados y de otros mtodos fsicos ha resultado en la siguiente representacin de una estructura aproximada (tamao y forma) de la molcula de protena. (1) El peso molecular de las protenas varia en una gran escala (insulina, 6000, hemocianina del caracol, 6700000). Sin embargo, las grandes protenas estn generalmente compuestas de subunidades ms pequeas. (2) Las formas varan considerablemente desde casi esfricas hasta las altamente asimtricas. (3) A diferencia de muchos polmeros sintticos, las protenas son partculas rgidas, de forma definida. Al final de este captulo discutiremos los resultados recientes de la aplicacin de la difraccin de los rayos X a las estructuras detalladas o "finas" de dos molculas de protenas, la mioglobina y la hemoglobina. Estos estudios muestran que las protenas, a pesar de su enorme tamao y complejidad, son molculas altamente uniformes con una arquitectura precisa y definida.

Fig. 8-1. Micrografias electrnicas en aspecto oscuro, de varias molculas de protenas A: molculas de fibringeno (X 150000). (Cortesa de C. E. Hall y H. S. Slayter, Massachusetts Institute of Technology). B: molculas de fosfatasa alcalina (X 163000). (Cortesa de Hall). C: molculas de colgeno (X 166000). (Cortesa de Hall y P. Doty)

ESTRUCTURA PRIMARIA -- LA SECUENCIA DE LOS AMINOACIDOS Cuando se calienta una protena con un cido fuerte a 100C por varias horas, se descompone o hidroliza en los bloques componentes de su estructura, llamados aminocidos. Existen alrededor de 20 aminocidos diferentes en las protenas de todos los organismos, aunque ciertas protenas pueden tener menos y algunos organismos pueden contener aminocidos especiales que representan ligeras modificaciones de los 20 aminocidos principales. La Fig. 8-2 muestra la estructura bsica de todos de los 20 aminocidos. Muestra que a pH neutro, el aminocido es un "zwitterion que contiene simultneamente H +H - N \ C / R \ H / OH C=O H O +H - N C= O + \ / +H C / \ R H H H-N \ C / R \ H O C=O /

-H

pKcoo = 2 - 3
Fig. 8-2. Formas Zwitterion de aminocidos

pKNH3 = 9 - 10

un grupo negativo y otro positivo. Tambin muestra que el tomo de carbono es asimtrico, puesto que tiene unidos a l, cuatro grupos diferentes. Todos los aminocidos derivados de las protenas son l-aminocidos (excepto la glicina, que no es pticamente activa), un hecho que sugiere firmemente el origen comn de toda la materia viviente sobre la tierra. El smbolo R de la Fig. 8-2 representa la porcin variable de la molcula que diferencia un aminocido de otro. La Fig. 8-3 es una lista de los diferentes grupos R de los 20 aminocidos ms comunes. Obsrvese que el ltimo, la prolina, es el nico miembro atpico de la serie, en el sentido de que el grupo -amino no se encuentra libre sino que forma parte de una estructura en anillo. Los aminocidos constituyen el alfabeto de la estructura protenica y son, finalmente, responsables de la especificidad y variabilidad de la materia viviente. Se aconseja al estudiante de biologa, familiarizarse con estos importantes compuestos, porque las prximas dcadas sern testigos de la explicacin del papel preciso desempeado por los grupos R de los aminocidos, en las interreacciones moleculares especificas de la clula.

NO POLARES (ALIFATICOS) - H - CH3 CH3 / -C - H \ CH3 CH3 / - CH2 - C - H Isoleucina (Ileu) \ CH3 ALCOHOLES (ALIF. Y AROM) -CH2 - OH -CH - CH3 \ OH
Serina Treonina (Ser) (Treo) Valina (Val) Glicina (Gli) Alanina (Ala)

ACIDOS CARBOXILICOS -CH2 - COO -CH2-CH2-COOAcido asprtico (Asp) Acido glutmico (Glu)

AMIDAS

-CH2 - CONH2 -CH2 - CH2 - CONH2

Asparagina (Asp-NH2) Glutamina (Glu-NH2)

BASES AMINA -CH2-CH2-CH2-CH2-NH3+ NH2 / -CH2-CH2-CH2-NH - C

Arginina (Arg) Lisina (Lis)

\ -CH2-C6H4-OH
Tirosina (Tir)

NH2+ -CH2---------N -H+ \ / N

Histidina (His)

OTROS AROMATICOS -CH2-C6H5

Fenilalanina (Fen)

CONTENIENDO AZUFRE -CH2-SH -CH2-CH2-S-CH3

Cisteina (CiSH) Metionina (Met)

- CH2 ____ /\ O Triptofano (Trip) CONTENIENDO EL GRUPO IMINO \ / \/ ___ Prolina (Pro) N -OOCH / \+/ N Fig. 8-3. Los "Grupos R" de los encuentran. 20 ms comunes aminocidos que se

La separacin de los 20 aminocidos entre si fue una tarea formidable, a la cual, el famoso qumico Emil Fisher (1852-1919) dedic muchos aos de su vida. En 1941,

Martin y Synge propusieron un nuevo enfoque al problema de la purificacin y estimacin de los compuestos que se asemejan entre s. Este enfoque implicaba la disolucin de la mezcla de aminocidos en un par de solventes y luego la "percolacin" de esta mezcla a travs de tiras de papel filtro o a travs de columnas. Usando un segundo par de solventes y haciendo girar el papel 90, es posible separar los aminocidos bidimensionalmente sobre una gran hoja de papel filtro (Fig. 8-4). A causa de que estos mtodos tenan algunas semejanzas con la tcnica empleada muchos aos antes por Tswett para la separacin de los pigmentos de la hoja, Martn y Synge le dieron al procedimiento el nombre de cromatografa.

Fig. 8-4. Cromatografa bidimensional en papel de aminocidos

En los ltimos 20 aos, los mtodos cromatogrficos han sido extendidos y perfeccionados a tal grado, que en la actualidad son los ms ampliamente empleados en tcnicas para anlisis y purificacin. Lo "ltimo" en anlisis de aminocidos se ha

obtenido en el laboratorio de Moore y Stein, quienes han perfeccionado una columna cromatogrfica de aminocidos y construido una mquina automtica para su determinacin. Este dispositivo es capaz de tomar el hidrolizado de 1 mg de protena y estimar la concentracin de cada uno de sus aminocidos componentes con una exactitud de unos cuantos centsimos. Moore y Stein utilizaron una columna de resinas intercambiadoras de iones fabricadas de poliestireno sulfonado. El preparado del aminocido se coloca en la columna, en un buffer, a. baja concentracin de pH y baja resistencia inica, que son las condiciones para el enlace mximo de los aminocidos cargados positivamente con los grupos -SO4- sobre la resina. Se deja correr el buffer a travs de la columna elevndose tanto el pH como la resistencia jnica. Este proceso, llamado elucin provoca que los diferentes aminocidos se percolen en la columna a diferentes velocidades, separndose as en bandas diferentes. El "eluato" que emana en el fondo de la columna es recogido, ya sea en fracciones separadas por medio de un colector de fracciones automtico o procesado con una mquina tambin automtica. En el primer caso, las fracciones separadas se hacen reaccionar con un reactivo llamado ninhidrina. el cual da un color prpura en presencia de aminocidos y la intensidad del color se estima en un colormetro; comparando este resultado con una curva estndar, permite calcular la concentracin del aminocido. La mquina automtica ejecuta la reaccin de la ninhidrina automtica y continuamente, en tanto que un registrador marca, en una grfica, la intensidad del color, a medida que pasa por el colormetro. Aunque a primera vista tal procedimiento pudiera aparecer como un dispositivo muy sofisticado, en los ltimos aos ha sido posible, de hecho, verificar varios experimentos muy importantes que requieren tanto la rapidez como la precisin de estos nuevos mtodos automticos. La Fig. 8-5 representa un cromatograma de una mezcla de aminocidos obtenido por el mtodo de Moore y Stein. La concentracin de cada aminocido es proporcional al rea debajo de la curva.

Una vez que la protena se hidroliza en sus bloques componentes, es lgico examinar cmo stos se ajustan en la molcula de la misma. Fisher fue capaz de demostrar que, en la hidrlisis de la protena, se pone en libertad igual nmero de grupos amino y carboxilos. Para explicar este resultado, sugiri que los aminocidos estaban ligados unos con otros por medio de un enlace peptdico (Fig. 8-6). El equilibrio de esta reaccin est netamente del lado de la hidrlisis, y, como veremos ms adelante, la clula sintetiza el enlace peptdico durante la sntesis de la protena por medio de un mecanismo completamente diferente. La teora del enlace peptdico de Fisher, en la estructura de la protena, ha sido desde entonces corroborada por muchas pruebas evidentes. Las enzimas proteolticas, por ejemplo, que se sabe rompen el enlace peptdico de los pptidos sintticos, son tambin capaces de hidrolizar protenas.

Fig.8-5. Columna cromatogrfica de aminocidos, empleando el analizador automtico de aminocidos de Moore y Stein. Ntese que el anlisis se efectu en 3 niveles de sensibilidad. El anlisis es de una muestra hidrolizada de la protena ribonucleasa. (Reimpreso con permiso Copyright 1961 por Scientific American,lnc. Todos los derechos reservados)

H H - N \

O C - OH / +

H H - N \ C / H

O C - OH / \ CH3

C / \ H H

H O H - N C \ / \ C / \ H H

CH3

\ / C / \ N C - OH H O

Enlace peptdico

Fig. 8-6. El en lace p eptdi co.

La Fig. 8-7 es un diagrama de una cadena hipottica de aminocidos, denominados polipptidos. Obsrvese que, excepto los grupos del carboxilo terminal (C terminal) y del amino terminal (N terminal), todos los carboxilos restantes y los grupos amino estn involucrados en el enlace amido. Este enlace no es capaz de poner en libertad o aceptar protones y por consiguiente, no contribuye a las propiedades

cido-base del polipptido. Las propiedades electroquimicas en un pH fisiolgico del polipptido (y, por lo tanto, de la protena) estn determinadas por los grupos R

4 -5

COO4-5 CH2 COO O CH2 H O CH2 H O H3N H C C N H C C N H C \ / \ / \ / \ / \ / \ / \ / \ / C N H C C N H C C N H H O CH2 H O CH2 H CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 NH NH3 C 10-11 / \\ + H2N NH2 12-13

6 -7 + HN = \ N =/ CH2 H C N COO \ / \ / H C C O CH3

Glicil -aspartil-lisil-glutamil-arginil-histidil-alanina
Fig.8-7. Un polipptido hipottico conteniendo todos los grupos que normalmente contribuyen a las cargas de las protenas. El nmero representa el rango del pK de cada grupo disociado.

de los aminocidos cidos, cido asprtico y cido glutmico, y los aminocidos bsicos, lisina y arginina, y por la histidina. La ltima es importante porque es el nico aminocido, con excepcin del N terminal del grupo amino, con un pK en la regin del pH fisiolgico y, debido a esto, es el nico aminocido que podra contribuir a un cambio en la carga de la protena originado por pequeos cambios del pH bajo condiciones fisiolgicas. El papel de este aminocido en un mecanismo para la regulacin celular, an no se ha descubierto.

El polipptido hipottico de la Fig. 8-7 muestra todos los grupos R que contribuyen a la carga de una protena en un pH fisiolgico. Muestra por extrapolacin, que una protena es un ion polivalente que contiene varias cargas positivas y negativas. De las propiedades de disociacin de los grupos, uno puede predecir qu podra suceder si se aaden un cido o una base a una protena. As, cuando se aade un cido COO-, cambiar a -COOH y, por lo tanto, dejar a la protena con una carga positiva neta: cuando se aade una base, -NH3+, cambiar a -NH2, dejando a la protena con una carga negativa neta. En cierto pH intermediario, llamado punto isoelctrico, el nmero de cargas positivas iguala al nmero de cargas negativas. Puesto que la mayora de las protenas tienen puntos isoelctricos del lado del cido, llevarn una carga negativa neta en un pH fisiolgico. Sin embargo, las protaminas y las histonas, que son protenas que se encuentran en los cromosomas, contienen grandes cantidades de lisina y arginina, llevando, por lo tanto, carga positiva neta bajo condiciones normales. Sin lugar a duda, esta propiedad desempea un importante papel en la estructura molecular de los cromosomas, los cuales, en parte, estn compuestos de protenas cargadas positivamente interactuando con el ADN cargado negativamente. Hemos sealado que es posible determinar la composicin del aminocido de un polipptido. Sin embargo, es posible determinar la secuencia especifica de los aminocidos en el polipptido? Sanger fue el primero en demostrar que esto, en verdad puede hacerse. Como es generalmente el caso al tratarse de una primera contribucin en determinado campo, su descubrimiento es notable, no solamente por la muy importante contribucin tcnica hecha al contestar esta pregunta, ni por los grandes alcances de las conclusiones tericas derivadas de los resultados, sino por la intuicin y fe implicadas en hacerse la pregunta de este asunto en particular. Las primeras tradiciones de la qumica de las protenas se derivaron de la qumica de los coloides, que consideraban a sus materiales como entidades qumicamente indefinidas para ser caracterizadas por parmetros estadsticos ms bien que por parmetros qumicos precisos. Sanger desafi a esta tradicin al hacer una pregunta que hasta recientemente como lo es 1945, fue considerada descabellada por la mayora de los qumicos dedicados a las protenas. El pregunt: "Tienen las protenas una composicin qumica especifica y definida hasta la secuencia de los 20 bloques constructivos? Hacer esta pregunta y estar dispuesto a invertir 10 aos de la vida de uno para contestarla, implica una creencia en la exactitud absoluta por medio de la cual, las macromolculas biolgicas son replicadas y sintetizadas. El grado hasta el cual tomamos esto como correcto en la actualidad, es un tributo a la inmensa contribucin de Sanger. Cuando l comenz su estudio que hizo poca, sobre la protena insulina, el mtodo de la cromatografa de papel para la separacin de los aminocidos, acababa de ser desarrollado por Marfin y Synge. A ste, Sanger aadi una tcnica propia, el "rotulado" del grupo terminal amino (grupo terminal N) de un pptido, combinndolo con el compuesto amarillo dinitrofluorobenceno 24 (DNFB), para dar el dinitrofenil (DNF) pptido.

NO2

NO2 F
H O

/ \\ /
+

H-N

+ HF

/ \ // O2N

\ /\ / C N / \ H R Extremo del teminal N ptido

C / \\ N \ /\ / C / \ // N O2N / \ H R

2,4-dinitrofluoro benceno DNFB

Dinitrofenilpptido (DNF)

Este compuesto amarillo es estable durante la hidrlisis del pptido y es posible, empleando la separacin cromatogrfica despus de la hidrlisis, identificar el aminocido particular al cual est unido el DNF. Determinando el N del aminocido terminal, fue posible para Sanger orientar al pptido, es decir, distinguir un extremo del otro. Sanger tambin desarroll varios mtodos para hidrolizar, parcialmente, la molcula de la insulina en pptidos de diferentes longitudes. Igualmente desarroll procedimientos cromatogrficos para separar estos pptidos unos de otros, lo cual le permiti determinar su composicin aminocida y la identidad del N del aminocido terminal. Algunos de los pptidos ms largos, tuvieron que ser hidrolizados por segunda vez, cromatografiados y otra vez analizados para conocer los grupos terminales. A medida que se acumulaban datos, ms y ms de la secuencia llegaba a ser definida de manera nica. Finalmente, toda la secuencia lleg a estar definida de manera nica, despus de lo cual, todos los datos nuevos, simplemente verificaron la estructura existente sin proporcionar ninguna evidencia en contra de ella. La Fig. 8-8 es un resumen de los resultados que Sanger emple para determinar la secuencia del aminocido de una de las cadenas de polipptidos de la molcula de la insulina. Empleando el enfoque anterior, Sanger fue capaz de demostrar que solamente una secuencia finita satisfacerla los datos que haba obtenido. Se demostr la primera vez, que, a pesar de la complejidad de la molcula de la protena, la clula es capaz de sintetizala en una forma qumicamente precisa y reproducible. Es interesante observar que, aunque la insulina es una de las protenas ms pequeas que conocemos, no es la ms sencilla en su estructura ya que est compuesta de dos polipptidos. La Fig. 8-9 muestra la secuencia o lo que se denomina, la estructura primaria, de una protena mucho ms grande (18 000 de peso molecular), que est compuesta de una sola cadena. La determinacin de la secuencia de este polipptido ms largo result ser un problema mucho ms difcil, que requera la precisin del mtodo de la columna cromatogrfica automtica de Moore y Stein. Se ha determinado actualmente la estructura primaria de varias otras protenas, y, aunque la ms larga cadena polipptida, posiblemente de peso molecular de 60 000,

no se ha observado, es justo decir que estamos por buen camino para obtener una solucin general de este problema.

ESTRUCTURA SECUNDARIA LA RELACION DE LOS VECINOS MAS CERCANOS

Estudios fsicos de molculas de protenas han demostrado que son compactas, rgidas, alargadas y no sobrepuestas. La conclusin debe ser que el polipptido se encuentra plegado en alguna forma para poder adquirir esta estructura compacta, pero la geometra precisa del doblamiento, ha sido un tema de especulacin por muchos aos. En 1951, Pauling y Corey proporcionaron la primera clave. Haban comenzado su trabajo con un meticuloso anlisis con rayos X de la estructura de varios pptidos sencillos, que les proporcionaron una descripcin precisa de la ligadura amida de la cadena del polipptido (Fig. 8-10). Descubrieron que los seis tomos del grupo amido (CCONHC) son "coplanares", quedando dentro de unos cuantos cientos de unidades Angstrom, en un plano comn.

1.53A 1.32A

H N

1.47A

\ 114 / 119 \ 112 / 1.53 C 125 1.24 A O A C / \

\ / .. / C- N C= N // \ / \ :O: :O:

C \

B
Fig. 8-10. La ligadura amida del polipptido. A: Estructura exacta del grupo amido en el polipptido. B: Resonancia del doble enlace en una ligadura amida entre dos estructuras de enlace de valencia.

La propiedad de ser plano del grupo amida, as como la corta distancia de la ligadura del pptido (C-N) las explic Pauling mediante una resonancia del doble enlace C=O como se muestra en la Fig. 8-10, siendo la estructura verdadera, un hbrido de los dos estados. Adems, encontraron que el grupo amido estaba ordenado con la configuracin trans; es decir, los dos tomos de carbono asimtricos quedaban en las esquinas opuestas del grupo. Finalmente, Pauling y sus colaboradores sealaron

que los enlaces con los carbonos de las esquinas del grupo amido eran enlaces qumicos simples y, por consiguiente, capaces de rotacin. Arguyeron que sera la rotacin alrededor de este enlace la que determinara la configuracin del polipptido. Construyendo modelos a escala, pronto descubrieron que se poda construir un gran nmero de configuraciones diferentes, si uno aceptaba las restricciones anteriores. Fue precisamente aqu, al decidir cul de tantas configuraciones era la que ms probabilidades tena de ocurrir, donde Pauling dio el salto crucial intuitivo. Habiendo tenido gran cantidad de experiencia acerca de la importancia de los enlaces de hidrgeno en la estructura cristalina de compuestos de modelo, Pauling predijo que la configuracin preferida del polipptido sera aquella que favoreciera el enlace mximo de hidrgeno entre los grupos -C-O y -NH del enlace amido. Muy sabiamente, como una primera aproximacin, decidi ignorar los efectos posibles de los grupos R. Descubri entonces que, sometiendo cada grupo amido a lo largo del polipptido, a una pequea rotacin, se generaba una espiral que tena la propiedad de formar enlaces de hidrgeno a travs de las vueltas de la misma. La llamada espiral (Fig. 8-11) es capaz de formar enlaces de hidrgeno entre todos sus grupos amido, un hecho que, sobre fundamentos a priori, le daran el mayor grado de estabilidad. Las caractersticas de la espiral a pueden describirse, conociendo el nmero de residuos de aminocidos por vuelta (3.6 A), el paso de la espiral (5.4A), el dimetro, incluyendo las cadenas laterales (10.5 A), y el nmero de residuos de aminocidos en una vuelta con enlaces de hidrgeno. Estas dimensiones y otras ms, se buscaron en varias protenas y polipptidos sintticos por el mtodo de anlisis con rayos X y pronto se acumul gran cantidad de evidencia para sostener el brillante anlisis de Pauling. Como veremos ms adelante, hay en la actualidad ms evidencia directa de la existencia de la espiral en las protenas.

ESTRUCTURA TERCIARIA LA CONFORMACION DEL POLIPEPTIDO

Como ya hemos dicho, las protenas son molculas compactas, rgidas (Fig. 8-1). Aunque la formacin de una espiral acortara la cadena polipeptdica extendida, esto dara lugar, sin duda alguna, a una molcula compacta, casi esfrica. As, las dimensiones de una espiral a de la protena del virus del mosaico del tabaco sera de 6 X 240 A, cuando en realidad es de 75 X 25 A. Por lo tanto, debemos imaginarnos que la espiral se dobla y se enrosca de tal manera, que hace a la estructura ms compacta an. Adems, debemos tomar en consideracin que el grupo terminal amino de las protenas completas, marcadas con DNF muestra que algunas de ellas contienen ms de una cadena polipeptdica. Pensamos en una estructura terciaria como un plegado y torsin de la cadena polipeptdica, principalmente en la configuracin de la espiral, para formar una estructura compacta.

Fig. 8-11. Modelo de una espiral , una configuracin de la cadena polipeptdica, que se cree se encuentra en las protenas. El eje de la cadena consiste de secuencias de C, C, N. R representa cadenas laterales de los diversos aminocidos. Las lneas punteadas representan enlaces de hidrgeno que estabilizan a la espiral. ( Reimpreso con permiso. Copyright (g) 1961 por Scientific American Inc. Todos los derechos reservados )

La asociacin de dos o ms unidades polipeptdicas compactas para formar la figura completa de la molcula proteica (en el caso en que halla ms de un polipptido en la molcula), se ha denominado, recientemente, estructura cuaternaria. Las preguntas provocadas por las estructuras terciaria y cuaternaria de la protena, no se han contestado por completo, Qu propiedades de la cadena polipeptdica podran explicar la estructura terciaria y cules la cuaternaria? Hasta ahora, hemos ignorado a los grupos R y hemos dicho que no son de importancia para la formacin de la espiral . Actualmente parece, sin embargo, que son en extremo importantes en la "conformacin" o enrollamiento de la espiral . Ciertos grupos R son capaces de interactuar unos con otros y, cuando esto sucede, se puede esperar que ayuden a estabilizar a una vuelta de la espiral a formando puntos de unin en ciertos lugares. La lista de interacciones especficas entre grupos R, no es todava digna de confianza y completa, necesitndose, en fin, muchas adiciones y revisiones. La siguiente es una lista de cienos tipos de interacciones que se cree tienen lugar y que existen evidencias de ello en algunos casos. (1) Enlaces disulfuro. El disulfuro es el nico otro enlace covalente que con frecuencia se encuentra en las protenas. Se forma cuando dos grupos -SH de cistena reaccionan entre si de la siguiente manera: 2SH + 1/2 O2 --- S --- S--- + H2O

Es interesante hacer notar que Sanger descubri tres de tales enlaces en la molcula de la insulina, uno conectando dos porciones del mismo pptido y los otros dos, manteniendo juntos los dos pptidos de la molcula de insulina (Fig. 8-12). En la molcula de la ribonucleasa, por otra parte, solamente hay una cadena polipeptdica y cuatro grupos disulfuro formados dentro de ella .
H2N S S NH2 Gli iLeu Val Glu Glu Ci Ci Ala Ser Val Ci Ser Leu Tir Glu Leu Gli Asp Tir Cy Asp / S S / H2N NH2 S S / Fen Va| Asp Glu Hk Leu Ci Gli Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tir Leu Val Ci Gli Glu Arg Gli

)
Ala Lis Pro Trto Tir Fen Fen Fig. 8-12. Estructura de la insulina mostrando disulfuro de intracadena y de intercadena (Sanger) los enlaces

(2) Enlaces de hidrgeno. Hasta dnde los enlaces de hidrgeno entre los grupos R son responsables de la estructura terciaria y cuaternaria, es un tema debatido vigorosamente al presente. Hechos sustanciales sealan la formacin de enlaces de hidrgeno entre los residuos tirosil e histidil y entre el seril y el aspartil. (3) Enlaces hidrofbicos. Una proporcin sustancial (35 a 45% ) de los grupos R de las protenas, son de la variedad hidrofbica no polares ( valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, prolina, triptfano, alanina). Kauzmann ha sugerido que estas cadenas laterales no polares, tienen tendencia a eliminarse por si mismas del medio acuoso y luego se buscan para formar una o ms "regiones hidrofbicas" en la molcula. La fuerza que estabiliza esta interaccin, no es solamente la llamada atraccin de Van der Waal entre las cadenas laterales no polares, sino tambin es debida a la capacidad aumentada del agua alrededor de la molcula de la protena para formar enlaces de hidrgeno a causa del retiro de grupos no polares de la fase acuosa. (4) Ligaduras salinas. Puesto que en un pH fisiolgico, los grupos R de la lisina y de la arginina estn cargados positivamente y los de los cidos asprtico y glutmico, negativamente, se ha sugerido que las ligaduras salinas pueden formarse entre ellos para estabilizar las estructuras terciara y cuaternaria. La titulacin de las protenas y otros medios de evidencia sugieren, que de existir solamente una pequea porcin de los grupos cargados contribuyen para los enlaces estables no ocultos por la sal encontrada en las soluciones de protenas. Se ha sugerido que unas cuantos ligaduras salinas pueden ser de importancia y estabilizarse por regiones hidrofbicas cercanas, que las protegen de los efectos tamizadores de los iones en solucin. La investigacin de Kendrew, Perutz y sus colaboradores, sobre la cristalografia por medio de los rayos X, de la mioglobina y de la hemoglobina, constituye el desarrollo ms reciente y espectacular por lo que se refiere a la qumica estructural de la molcula proteica. De su trabajo, se est obteniendo gradualmente un conocimiento detallado y preciso de la estructura tridimensional de estas molculas. No es posible aqu discutir con todo detalle el mtodo de la cristalografa por medio de los rayos X empleado para la resolucin de este problema, por lo que se recomienda al estudiante leer cuidadosamente el artculo de Kendrew sobre este asunto (vase la Lista de Lecturas que se Sugieren). Baste decir que estos investigadores tuvieron xito al aplicar el llamado mtodo de reemplazamiento isomorfo", el cual implica la comparacin de cristales de protenas con cristales similares a los cuales se les haba introducido metales pesados dispersores de electrones, en regiones especficas de la molcula de protena. Esta comparacin permite al cristalgrafo eliminar incertidumbres especificas y deducir la estructura directamente, sin suposiciones o tanteos, ni errores. Kendrew fue capaz de construir un modelo completo de la molcula de la mioglobina a una resolucin de 6 A. A este nivel de resolucin, uno puede ver una masa compleja en forma de intestino, compuesta de ocho trayectos de "salchichas" rectas, interrumpidas por curvaturas de diversos grados de profundidad (Fig. 8-13). La mioglobina es una protena coloreada que contiene un grupo llamado hem,

Fig. 8-13, Modelo de la mioglobina a una resolucin de 6 A. El grupo hem es la seccin plana sombreada de la parte superior derecha. (Fotografa de George Rodger. 1963 Magnum Photos.

Fig. 8-14. Modelo tridimensional de la mioglobina basado en el anlisis con rayos X a 1,5 A de resolucin. Pueden reconoserse diversas estructuras de espirales (en negro).

similar al que se halla en la hemoglobina, el cual es responsable del color y es el asiento de la propiedad de la protena de combinarse con el oxigeno. La localizacin del grupo graso hem puede verse claramente en el modelo. Las "salchichas" resultan ser huecas y tener los mismos dimetros que la espiral de Pauling. En la actualidad est progresando el trabajo a una resolucin de 1.5 A. Esto implica hacer aproximadamente 600 veces ms mediciones que con una resolucin de 6 A, Los clculos son tan complejos y numerosos (se deben calcular las densidades de 100 000 electrones) que se necesitan las computadoras ms rpidas. No obstante, se ha aprendido bastante a un nivel de resolucin de 1.5 A. Los trayectos rectos de las salchichas pueden definitivamente reconocerse como espirales , una confirmacin de la prediccin de Pauling. Ha sido tambin posible reconocer una buena proporcin de los restos de aminocidos y por lo tanto obtener la estructura primaria. Han salido varias interacciones entre grupos R. As, Kendrew fue capaz de determinar la proximidad de algunos grupos que previamente se haban hecho sospechosos de estar implicados en tales interacciones. Estos incluan a grupos capaces de formar enlaces de hidrgenos, salnos e hidrofbicos. Suponiendo que es posible la extrapolacin de molculas de protena en cristales a molculas de protena en solucin, es posible que se pruebe que estos datos son cada vez ms importantes para el entendimiento de cmo las estructuras terciaria y cuaternaria estn estabilizadas. Estamos solamente en los principios de este avance asombroso para la comprensin de la estructura de la protena y podemos esperar bastante de este acontecimiento. La biologa molecular de la clula se comprender algn da en trminos de las interacciones precisas entre las diversas molculas que la componen. Siendo las protenas el material estructural as como los reguladores catalticos de la clula, juegan un papel crucial en todas las interacciones de ellas, sean stas, interacciones entre proteina-proteina, protena-cido nucleico, protena-lipido, o enzima-substrato. A fin de comprender a stas en detalle, necesitaremos una visin muy exacta de la molcula de la protena. El progreso en este campo es una revolucin cientfica de primera magnitud que tenemos el privilegio de observar de muy cerca. ___________________________________________________________________

LISTA DE LECTURAS QUE SE SUGIEREN

Edsall, J. T., and Wx, MAN, J., BiophysicaI chemistry. New York: Academic Press. Haurowitz, F., 1950. Chemistry and biology of laroteins. New York: Academic Press. Kendrew. w, J. C., "Three-dimensional study of a protein," Scientific American, December 1961. Neurath, H., and BAxLr. v, K., 1953-1954. The laroteins. New York: Academic Press. Pauling, L., CoRv. v, R. B., and HAvworm, R., "The structure of protein molecules," Scientific American, July 1954. Stein, W. H., and Moore, S., "The chemical structure of proteins," Scientific American, 1961.

Thompson, E. O. P., "The insulin molecule," Scientific American, May 1955.

CAPITULO NUEVE

LA CATALISIS DE ENZIMAS, MECANISMO DE CONTROL BIOLOGICO

Dijimos en el Cap. 6, que la mayora de los compuestos orgnicos de la clula son notablemente estables a temperaturas, presiones y concentraciones de iones hidrgeno fisiolgicas. Si se disuelve urea en agua, por ejemplo, no reaccionar con su solvente en proporcin apreciable aun que si lo hiciera se pondra en libertad una considerable cantidad de energa. H2N \ C= O / H 2N La explicacin de Eyring es que la urea y el agua no reacciona en proporcin apreciable debido a que la reaccin tiene que pasar a travs de un "complejo activado", cuya formacin toma una gran cantidad de energa (Fig. 9-1). As, para que se forme el complejo activado, las molculas de agua y de urea deben chocar con cierta cantidad mnima de energa. Como se muestra en la Fig. 9-2, solamente un nmero infinitesimal de molculas de urea y de agua tienen esta cantidad mnima de energa a la temperatura ambiente. Aumentando la temperatura, una mayor proporcin de molculas obtendrn esta energa mnima y la velocidad de la reaccin aumentar proporcionalmente. Esto es lo que hace el qumico laboratorista de orgnica aunque l tambin, algunas veces, varia la presin y utiliza extremos de acidez y alcalinidad con el fin de activar la velocidad de las reacciones orgnicas. Pero la clula efecta sus reacciones a temperaturas moderadas, bajas presiones y baja acidez y alcalinidad, a menudo, en proporciones a considerables velocidades. Adems, la clula es capaz de controlar estas reacciones y de sincronizarlas unas con respecto a otras. Estos misteriosos poderes de la clula se deben a la catlisis biolgica especifica efectuada por las enzimas. + H2O CO2 + 2 NH3 + 13800 caloras

Fig. 9-1. Representacin esquemtica de las energas de la hidrlisis de la urea. A fin de que reaccione una molcula de urea con el agua, debe tener suficiente energa para formar un complejo agua-urea activado

Fig. 9-2. Distribucin de la energa de la urea en agua a dos temperaturas, en relacin con la energa de activacin necesaria para la hidrlisis de la misma. A 100 C, una proporcin mayor de molculas tienen energas iguales, o mayores que la energa de activacin

La catlisis fue definida por los qumicos van't Hoff y 0stwald como el aumento de la velocidad de una reaccin sin afectar los resultados totales de la misma. Trabajos posteriores han puesto en claro que la sustancia cataltica si reacciona con el "substrato" y que es regenerada al final de la reaccin en su forma original. Esto capacita a la sustancia cataltica a efectuar muchos ciclos de reaccin y explica por qu es efectiva en concentraciones sumamente bajas. El complejo substratosustancia cataltica tiene una energa de formacin ms baja que la de los

intermediarios "activados" de la reaccin no catalizada, permitiendo as que mayor nmero de molculas reaccionen a determinada temperatura (Fig. 9-3 ). Se debe hacer notar que puesto que la formacin del intermediario sustancia cataliticasubstrato es temporal, no teniendo nada que ver con los estados inicial y final, no tiene absolutamente ningn efecto sobre el equilibrio de la reaccin. Las sustancias catalizadoras no son genios termodinmicos capaces de aumentar las reacciones. Ellas no hacen cambiar los equilibrios, sino solamente aumentan la velocidad con la cual se alcanza ese equilibrio.

Fig. 9-3. A: Representacin esquemtica mostrando que una reaccin catalizada por enzima tiene una energa ms baja de formacin del complejo activado que las reacciones catalizadas por H+ o las sin catalizar. B: Representacin esquemtica mostrando el efecto de la menor energa de activacin sobre el nmero de molculas con suficiente energa para formar el complejo activado

La catlisis biolgica efectuada por enzimas obedece a las mismas reglas generales observadas en las catlisis no enzimticas. Difiere de otras formas de catlisis, principalmente, en la mayor efectividad para hacer descender la barrera de energa de activacin (vase Fig. 9-3) y en el extraordinario grado de especificidad exhibido. Aqu reside una clave del delicado control de los procesos celulares que ejercen las enzimas. Este control es posible debido a que las enzimas pueden actuar a concentraciones muy bajas y con un elevado grado de especificidad. Regulando el abastecimiento de pequeas cantidades de enzima activa, la clula puede controlar el flujo metablico de los compuestos dentro de ella. As, la funcin de la catlisis biolgica no es slo el incremento de la velocidad de las reacciones qumicas, sino que tambin las regula, lo cual es, quizs ms importante. Para comprender su capacidad reguladora debemos primeramente estudiar las propiedades generales de las enzimas.

ANALISIS ENZIMATICO
La bioqumica moderna debe sus xitos a la especificidad de la accin enzimtica. Esta, en la prctica, nos permite mezclar un substrato purificado con preparaciones de enzimas que podran contener 1000 veces ms impurezas, y obtener un anlisis cuantitativo de la cantidad de enzima presente. La razn para esto, como lo hemos indicado, es que la enzima puede ignorar todos los compuestos extraos y catalizar especficamente las reacciones de su substrato. Es posible, por ejemplo, moler algunas semillas de Canavalia ensiformis* y aadir esta preparacin impura a urea purificada. La hidrlisis de la urea se puede observar, midiendo la produccin de amoniaco con un anlisis qumico apropiado (Fig. 9-4). La prctica, generalmente empleada, es dibujar una tangente a la curva con su origen en tiempo cero. La pendiente de esta lnea se llama la velocidad inicial de la reaccin y est en relacin con la concentracin enzimtica. Para estimar la pureza de una preparacin enzimtica, se divide la velocidad inicial per la cantidad total de protena presente. Esta medida se llama la actividad especifica y aumenta a medida que las etapas siguientes de purificacin, proporcionan una preparacin enzimtica ms pura. Cuando la actividad especfica ya no puede aumentar ms all de cierto lmite, aunque se haya empleado un amplio rango de procedimientos de purificacin, se supone, generalmente, que la enzima se encuentra pura. Este puede o no ser el caso, dependiendo del criterio para juzgar la pureza.

NATURALEZA PROTEICA DE LAS ENZIMAS

El procedimiento general que acabamos de delinear, fue empleado por Sumner, el cual, en 1926, fue el primero en cristalizar una enzima, la ureasa. Este resultado fue especialmente notable porque se verific en una poca en la cual todo fenmeno de catlisis biolgica se encontraba rodeada de una atmsfera de temor. Los cristales de ureasa que obtuvo Sumner, resultaron estar constituidos por protena, pero debido al prestigio del gran qumico Willsttter, quien se opona a la nocin de que las enzimas fueran "meras" protenas, hubo necesidad de ms experimentos para que se aceptara la naturaleza proteica de las enzimas. Por el ao de 1956, se haban cristalizado alrededor de 75 enzimas y muchas ms se haban purificado, encontrndose que todas contienen protenas. Quizs la prueba ms convincente de la naturaleza proteica de las enzimas es el experimento, frecuentemente repetido, que se hace tratando una enzima determinada con una enzima digeridora de protenas (proteinasa).
---------*Canavalia ensiformis es el nombre cientfico que se le da a la planta denominada ersimo, que es una planta de la Amrica tropical, herbcea, anual, semirrecta, que posee grandes vainas conteniendo semillas, se emplean como forraje. (N. del T.)

Fig. 9-4. Velocidad de produccin de amoniaco por la accin de la ureasa sobre la urea y agua. La pendiente de la lnea recta representa la velocidad inicial la enzima se encuentra pura. Este puede o no, ser el caso, de pendiendo del criterio para juzgar la pureza.

Se puede demostrar que la prdida de la actividad de la enzima va paralela con la desaparicin de protena. Es posible tambin demostrar un paralelismo entre la desnaturalizacin de la protena, ocasionada por diversos agentes, y la prdida de la actividad de la enzima. En los ltimos aos, se han hecho reportes de ensayos ocasionales acerca de la actividad enzimtica de preparaciones que no contienen protena. Sin embargo, ninguno de estos ensayos se ha repetido completamente o se ha comprobado y por lo tanto, se debe sacar por conclusin que la naturaleza proteica de las enzimas est completamente establecida. El hecho de que las enzimas sean protenas tiene varias consecuencias relacionadas con sus propiedades. Una de stas es el efecto de la temperatura sobre la accin de la enzima. La Fig. 9-5 muestra que este efecto tiene dos componentes: una curva con una pendiente positiva que es causada por el efecto de la temperatura sobre una reaccin qumica (vase Fig. 9-2) y otra curva con una pendiente negativa muy pronunciada que es debida al efecto de la temperatura sobre la desnaturalizacin de la enzima.

Fig. 9-5. El efecto de la temperatura sobre la actividad de las enzimas. La curva est compuesta de dos procesos. A es el efecto de la temperatura sobre la reaccin catalizada por enzimas. B es el efecto de la temperatura sobre la velocidad de la desnaturalizacin de la enzima.

Fig. 9-6. Efecto del pH sobre la actividad de varias enzimas (Copiado de J.S.Fruton y S.Simmonds, General Biocheraistry,Wiley,1953. Con autori-zacin)

Este efecto notable de la temperatura sobre la desnaturalizacin es una propiedad nica y caracterstica de las protenas y de los cidos nucleicos. Puesto que las protenas son iones polivalentes, cargados positiva y negativamente, son muy sensibles a los cambios del pH, el cual no solamente cambia la disociacin de ciertos grupos R que se supone estn implicados en el proceso cataltico, sino que se ha demostrado que tambin ocasiona cambios estructurales de mayor alcance en la molcula de la protena. A causa de este doble efecto, las enzimas exhiben un pH ptimo muy definido, el cual se presenta en un rango de valores de pH relativamente amplio (Fig. 9-6). Por diversas razones, las enzimas no siempre se encuentran en un estado activo. Algunas enzimas, entre ellas las proteolticas, o variedad de enzimas digeridoras de protenas, se hallan, a menudo, en la clula como precursoras inactivas. El tripsingeno, por ejemplo, es inactivo, pero se puede activar a tripsina con diversas enzimas, incluyendo a la tripsina misma. Parece que la activacin implica la supresin de un corto pptido, seguida de algunos cambios estructurales en la molcula de la protena, que finalmente conducen a la enzima tripsina activa. Otras enzimas, como ya dijimos en el Cap. 4, requieren para su actividad, ciertos cationes divalentes como el Ca2+, Zn2+, Mn2+, Mg2+ o Co2+. Otra categora de enzimas

requieren como "coenzima", un compuesto orgnico complicado. Tanto el catin divalente como la coenzima, se pueden separar generalmente de la enzima, por medio de la dilisis. Este procedimiento consiste en poner a la protena dentro de una bolsa de celofn con poros demasiado pequeos para permitir el paso de la enzima a travs de ella y sumergindola en grandes volmenes de agua o de solucin salina. La coenzima es capaz de pasar a travs de los poros de la bolsa de dilisis y diluirse en el gran volumen exterior de la solucin. Por regla general, la coenzima es estable en agua hirviendo, en tanto que la apoenzima, o sea parte protena de la enzima activa, es inactivada por el calor. Por lo tanto, la dializabilidad y la estabilidad al calor son las pruebas usuales para la coenzima. Algunas enzimas, sin embargo, contienen una porcin no proteica que est lo suficientemente bien unida, de manera que no se puede quitar por medio de la dilisis. Esta porcin no proteica, denominada grupo prosttico, juega un importante papel en la interaccin entre la enzima y el substrato.

EL COMPLEJO SUBSTRATO-ENZIMA
Si la actividad de una enzima se mide a diferentes concentraciones del substrato (Fig. 9-7A) y si la velocidad de la reaccin se grfica contra la concentracin del substrato, se obtiene una curva como la dibujada en la Fig. 9-7B. A medida que la concentracin del substrato aumenta, el valor de v se aproxima a una velocidad limite v. A esta velocidad, la actividad de la enzima es proporcional a la concentracin de la misma.

Fig. 9-7. A: Velocidades iniciales de las reacciones (v1 v2, v3) en tres concentraciones substratos (S1 S2, S3). B: Curva obtenida cuando las velocidades iniciales de las reacciones catalizadas por enzimas, a diferentes concentraciones de substrato se grafican contra las concentraciones del substrato. La velocidad lmite (V) es la velocidad inicial a una concentracin "infinita" del substrato.

Para explicar estas relaciones, Henri (1920) sugiri primero que la enzima y el substrato se combinan la una con el otro. As se puede ver en el terreno cualitativo, que solamente cuando la concentracin del substrato es lo bastante elevada para mantener a la enzima completamente ocupada en el proceso cataltico, tiene lugar la proporcionalidad entre la actividad de la enzima y la concentracin de la misma. Michaelis y Menten (1913) lograron validar el adelanto de Henri en trminos cuantitativos. Comenzaron su formulacin suponiendo que la ley de la accin de las masas era aplicable a la formacin de un complejo substrato-enzima y obtuvieron la siguiente relacin: V [S] = _________________ Km + [ S ]

en donde V= velocidad de la reaccin enzimtica V = el lmite o velocidad mxima a una concentracin "infinita" del substrato [S] = la concentracin del substrato en moles por litro de solucin Km = la constante de Michaelis en moles por litro de solucin Si se grafica la ecuacin de Michaelis-Menten (Fig. 9-8) se obtiene una hiprbola rectangular con una forma muy similar a la curva experimental mostrada en la Fig. 9-7B. Esta, en si misma, es una validacin experimental precisa del complejo substrato-enzima supuesto de la derivacin. En la actualidad existe mucho ms evidencia espectroscpica directa de la existencia del complejo substrato-enzima. La curva de la Fig. 9-8 muestra, como puede comprobarse por medio de una simple sustitucin algebraica, que a una velocidad de la mitad del valor lmite, [S] es igual a Km. Aunque Km no es una medida estricta de la afinidad entre la enzima y el substrato, es, no obstante, una aproximacin burda de ella. De la Fig. 9-8 se puede ver que cuanto ms bajo es el valor de Km - esto es, cuanto ms empinada es la pendiente de la curva - mayor es la afinidad aproximada entre la enzima y el substrato.

ESPECIFICIDAD DE LA ACCION DE LA ENZIMA

La especificidad es, quizs , la propiedad ms caracterstica de la mquina viviente.

Fig. 9-8. Curva obtenida graficando la ecuacin de Michaelis-Menten. Obsrvese que la forma de la curva es muy similar a la de la curva experimental mostrada en la Fig. 9-7B.

La relacin entre el substrato-enzima es un importante ejemplo de este fenmeno. El grado de especificidad de la enzima varia hasta cierto lmite. La especificidad absoluta, como lo indica su nombre, significa que la enzima puede catalizar la descomposicin de solamente una sustancia. La hidrlisis de la urea por medio de la ureasa es un ejemplo de esto. Cualquier dbil modificacin qumica de la molcula de urea, le impide completamente ser un substrato. La especificidad de grupo absoluta implica que la enzima puede obrar sobre determinado grupo orgnico solamente. As, las deshidrogenasas alcohlicas actuarn solamente sobre los alcoholes. deshidrogenasa del alcohol

coenzima CH3CH2OH + oxidada

CH3CHO

coenzima reducida

En tales casos, la intensidad de la actividad de la enzima depender de la naturaleza de las porciones restantes de la molcula. En el caso de la deshidrogenasa del alcohol, la enzima "prefiere" al etanol, pero puede actuar con intensidades decrecientes sobre alcoholes de cadena recta de longitudes crecientes. La especificidad de grupo relativa se refiere a la propiedad de las enzimas que les permite actuar sobre ms de un grupo orgnico. As, la tripsina que es capaz de romper ciertos enlaces peptdicos comprendiendo a los residuos de lisina o arginina, es tambin capaz de romper sus enlaces ster.

NH2

NH2

C = NH NH

C = NH

NH (CH2)3 O

(CH2)3 H

C C N / \ / \ / \ N H C

/ + O \

H H

C C OH / \ / \ / N H C

H \ + H N /

residuo de arginina

actividad peptdica de la tripsina

NH2

NH2

C = NH

C = NH

NH

NH

(CH2)3
TRIPSINA

(CH2)3

---// \__ C -- N -- C -- C O CH3

\---//

H2O

---// \__ C -- N -- C -- C OH \---// O H H O

ster metlico de la benzol-L-arginna

+ CH3OH benzol-L-arginina + metanol

actividad esterasa de la tripsina La especificidad ptica es, quiz , el ejemplo ms dramtico de la capacidad de una enzima para discriminar entre substratos relacionados. Aunque en otros aspectos pueda clasificarse en una de las tres clases anteriores, una enzima es capaz tambin de discriminar entre un substrato dado y su ismero ptico. Una oxidasa de un aminocido levgiro, por ejemplo, no reaccionar sobre aminocidos dextrgiros y viceversa.

H3N \ C / H /

COO-

aminocido

levgiro

COO+ NH3 + H2O2 R

oxidasa

+ O2 + H2O \ R

/ O= C \

aminocido levgiro

cido -cetnico

Estos y otros numerosos estudios sobre la especificidad de la enzima nos han proporcionado cierta compresin sobre el mecanismo de la accin de la enzima. Antes de que estemos preparados para discutir este importante tpico, debemos repasar otra propiedad de las enzimas que es crucial para la comprensin de la accin de la enzima. INHIBICION DE LA ENZIMA Como sealamos en el Cap. 4, podemos esperar que los venenos ejerzan su efecto biolgico sobre las enzimas; ya que solamente a travs de una inhibicin de la catlisis, podemos explicarnos por qu los venenos tienen tales efectos drsticos a concentraciones pequesimas. Grafiquemos la ecuacin de Michaelis Menten en una forma un poco diferente (Fig. 9-9).

Fig. 9-9. La graficacin reciproca ( 1/v contra 1/[S]] da lneas rectas, las cuales por extrapolacin revelan diferencias entre la inhibicin competitiva y la no competitiva. Obsrvese que al graficar 1/v contra 1/[S], se obtiene una lnea recta que intercepta al eje 1/v en 1/V. Esto nos proporciona un medio conveniente y exacto para calcular V.

La pendiente resulta ser Km/V y, por lo tanto, Km puede calcularse, tambin, muy convenientemente. La Fig. 9-9 muestra que dos tipos de inhibicin de enzimas se

pueden distinguir. Uno de ellos, llamado no competitivo, est caracterizado por el hecho de que la accin del inhibidor sobre la enzima, no se modifica por algn cambio en la concentracin del substrato. As, a una concentracin infinita de substrato, uno es todava capaz de medir alguna inhibicin de la enzima, es decir, las curvas inhibidas y las no inhibidas, no se interceptan en 1/[S] = 0. La inhibicin no competitiva incluye muchos efectos qumicos sobre la enzima que tienen un efecto directo o indirecto sobre su actividad. Un ejemplo de esto podra ser el cubrimiento sobre la enzima de uno o ms grupos sulfidrilos que son necesarios para su accin. Enzima --- SH /\ + Cl --- Hg /

Enzima --- S --- Hg //\

\ \/ \ COO
cloromercuribenzoato-p

\ \ /\ COO
enzima inhibida
---

En la inhibicin competitiva, el efecto del inhibidor se reduce, aumentando la concentracin del substrato. Aqu el efecto inhibidor casi desaparece cuando la concentracin del substrato llega a ser infinita. As, las dos lneas se interceptarn en l/[S] = 0. Esa conducta se puede explicar, suponiendo que el inhibidor compite reversiblemente con el substrato por una porcin de la enzima que est directamente implicada en el proceso cataltico. El efecto del cido malnico como un inhibidor competitivo de la reduccin del cido succnico, es un ejemplo clsico de la inhibicin competitiva (vase Cap. 11). COOH CH2 CH2 COOH
cido succnico

catalizado por la des hidrogenasa succnica

COOH CH CH COOH
cido fumrico

inhibido competitivamente por el COOH CH2 COOH

cido malnico

El inhibidor competitivo es suficientemente similar al substrato real, como para formar un complejo enzima-inhibidor, aunque se diferencia del substrato en que impide a la enzima de actuar catalticamente sobre l. En presencia de un inhibidor,

una parte de la enzima est "atada" y no puede actuar catalticamente, un efecto que puede disminuirse, aumentando la concentracin del substrato. Otro ejemplo bien conocido de esto, es el efecto de la sulfanilamida (una droga sulfa), que "engaa" a la enzima que acta normalmente sobre el cido paminobenzoico, un importante factor de crecimiento para muchas bacterias. HO O \ // C / /\

H2N O \ // O=S //\

\ \/ NH2
cido aminobenzoico-p

\ \/ NH2
sulfanilamida

Obsrvense otra vez, las similitudes estructurales generales entre los dos compuestos.

MECANISMO DE LA ACCION ENZIMATICA La discusin hasta ahora nos conduce a la conclusin general de que la catlisis enzimtica implica la interaccin ntima de sta y del substrato. El hecho de que los cambios estructurales de la molcula de la enzima (desnaturalizacin) ocasionan descensos notables en la actividad de la enzima, sugiere que esta requiere unas estructuras secundaria, terciaria y posiblemente hasta cuaternaria especficas para su propiedad cataltica. El fenmeno de la especificidad ptica sugiere que, a lo menos en algunos casos, tres o cuatro sustitutos del tomo de carbono pticamente activo, deben estar en contacto con la superficie de la enzima (Fig. 9-10). Una relacin ntima entre la enzima y el substrato, tambin se ha sugerido, aunque en una forma un tanto indirecta, por el fenmeno de la inhibicin competitiva. Esta nocin de una relacin ntima entre una regin determinada de la enzima y ciertos grupos de la molcula del substrato, ha conducido al concepto del sitio activo. De acuerdo con este concepto, existen una o ms regiones en la enzima, en las cuales se verifican las transformaciones catalticas. Cul es la naturaleza del sitio activo? Aunque el estudio del sitio activo de las enzimas apenas ha comenzado a hacerse, existen varias observaciones interesantes que sealan la direccin en la cual podemos esperar hacer algn progreso. Existen las llamadas enzimas conjugadas, en las cuales, los "grupos prostticos" son necesarios para la actividad de la enzima. Puesto que nosotros podemos esperar que el grupo prosttico sea, al menos parte del sitio activo de la enzima, tenemos la oportunidad de estudiar la qumica estructural de esta regin.

F ig . 9 -1 0 . D emo s t r ac i n d e q u e l a es pec if ic id ad pt ic a pu ed e s er d ebid a al c o n t ac t o d e t r es pu n t o s c o mo mn imo . El c o n t ac t o d e d o s pu n t o s n o pu ed e d is t in g u ir en t r e l o s is mer o s pt ic o s A y B

Wang llev a cabo un estudio interesante sobre la catalasa, la enzima que cataliza la descomposicin del perxido de hidrgeno en oxigeno y agua. La catalasa tiene un grupo prosttico compuesto por un tomo de hierro y un grupo hem (hematina). Es posible medir los efectos catalticos del hierro solo (dbil) y de la hematina (menos dbil); la conclusin, como poda esperarse, es que la porcin protenica de la enzima si desempea un papel crucial en la catlisis (Fig. 9-11 ). Es muy probable que el grupo hematina est colocado sobre la enzima de tal manera que el substrato interaccionar con porciones de la molcula de la protena como tambin con el grupo prosttico. Una hiptesis alternativa supone que la interaccin de la protena y de la hematina modifica las propiedades de la ltima, de tal manera, que aumenta su actividad cataltica. Wang fue capaz de sintetizar un compuesto (la trietilentetramina frrica) que es un catalizador mucho ms efectivo que la hematina, pero mucho menos que la enzima (Fig. 9-11). Colocando los grupos NH2 junto al hierro, este compuesto posiblemente simula la situacin del hierro en el complejo proteina-hematina de la catalasa. Tales estudios de la actividad cataltica de anlogos de la enzima sern probablemente, de una importancia cada vez mayor, en un futuro prximo. Otro enfoque que han proporcionado recientemente algunos resultados interesantes es el haber quitado porciones de la molcula de la enzima, por medio de un rompimiento selectivo de enlaces especficos peptdicos con ciertas enzimas proteolticas (desdobladoras de protenas). Emil Smith, y sus colegas, han tenido xito en suprimir ms de 100 residuos de aminocidos de los 185 encontrados en la enzima papaina, sin suprimir la actividad. F. M. Richards, usando la accin de la enzima sutilsina sobre la enzima ribonucleasa, fue capaz de romper un pptido en

20 partes. Fue posible eliminar la actividad de la ribonucleasa, suprimiendo este pptido, y regenerar la actividad de la enzima, aadindoselo. Estudios como stos proporcionar una imagen, cada vez ms precisa, de la porcin de la enzima que se necesita para la actividad cataltica.

Fig. 9-11. Actividad cataltica ejercida por varios compuestos sobre la descomposicin del perxido de hidrgeno. (Cortesa de J. H. Wang)

Un enfoque que ha vuelto a emplearse en los ltimos aos, es el bloqueo especifico de los grupos R en la molcula de la enzima. Se ha sabido, desde hace mucho tiempo, que ciertas enzimas necesitan para su actividad, la presencia de uno o ms grupos sulfidrilos especficos. Cuando tales grupos llegan a unirse con un reactivo mercurial como el p-cloromercuribenzoato o con un reactivo alquilante como la yodoacetamida, entonces la actividad enzimtica se pierde.

H NH2

H NH2
enzima inhibida -- S -- C -- C + H2O \\ H O

enzima--SH +

I-- C-- C \\ H O

+ HI

yodoacetamida

Un trabajo reciente sobre varias enzimas ha implicado algunos grupos adicionales como la histidina, el cido asprtico, la tirosina y la serina; y podemos esperar que esta lista aumente rpidamente en un futuro inmediato. Quizs el ejemplo ms excitante de este trabajo haya sido en conexin con ciertos grupos R que resultaron ser extraordinariamente reactivos. En el caso de la ribonucleasa, Barnard y Stein descubrieron que un grupo R de histidina localizado en la posicin 119 (Fig. 8-13) es extremadamente reactivo para el cido bromoactico. Este reactivo no reacciona tan rpidamente con las otras tres histidinas de la molcula ni tampoco lo hace con la histidina en solucin. Adems -- y esto es de mayor significacin -- la reactividad especial de la histidina 119 se pierde si se desnaturaliza a la ribonucleasa, puesto que es dependiente de la configuracin especfica de la enzima natural. El panorama de la biocatlisis que se presenta, implica una relacin estructural ntima entre la enzima y el substrato. La superficie especfica o sitio de la enzima donde tiene lugar la unin temporal, se supone que est formada de grupos R trados a una yuxtaposicin rgida por medio del enrollamiento, plegamiento y asociacin de las estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria de la enzima, respectivamente. Se espera que la yuxtaposicin de estos grupos, modifique su reactividad en cierta forma como para hacer del sitio activo, no solamente especifico en su configuracin espacial, sino tambin muy especial en su reactividad qumica. Un substrato que se une aunque sea temporalmente al sitio activo, queda sometido a esfuerzos violentos y, por lo tanto, es activado. Sea como fuere, tal es en la actualidad, nuestra manera de pensar, un tanto vaga si se quiere. El mecanismo preciso por medio del cual una enzima baja su energa de activacin, necesaria para una reaccin determinada, est an por descubrirse. No obstante, la direccin general de la investigacin se ha vuelto precisa. Debemos tratar de conocer la qumica de la estructura tridimensional del sitio activo y posiblemente de toda la enzima. Con los nuevos desarrollos en la cristalografa por medio de rayos X y la precisin cada vez mayor de otras tcnicas de anlisis estructural, podemos decir, con seguridad, que esta meta est a nuestra vista.

LISTA DE LECTURAS QUE SE SUGIEREN BALDWIN, E., 1957. Dynamic aspects of biochemistry, 3d ed. Cambridge: Cambridge University Press. BOYER, P. D., LARDY, H., and MYRBACK, K., 1959. The enzymes. New York: Academic Press. COLOWICK S. P., and KAPLAN, N. O., 1955. Methods in enzymology. New York: Academic Press. FRUTON, J. S., and SIMMONDS, S., 1958. General biochemistry, 2d ed. New York: Wiley. MEHLER, A. H., 1957. Introduction to enzymology. New York: Academic Press. NEILANDS, J. B., and STUMPF, P. K., 1958. Outlines of enzyme chemistry, 2d ed. New York: Wiley.

CAPITULO DIEZ

CAMINOS METABOLICOS
Hasta hora hemos tratado con enzimas y de la forma como actan sobre los substratos, ya sea oxidndolos o reducindolos, separndolos con agua o con fosfato; o bien, combinando dos molculas pequeas para hacer una molcula ms grande. Pero, qu son estos substratos? estos compuestos sobre los cuales actan las enzimas? Principalmente, son el material alimenticio que toman las clulas, o los productos de la transformacin de estas sustancias nutritivas. Por ejemplo, ya sea que lo que penetra a nuestro organismo sea un carbohidrato, grasa, protena, cidos nucleicos o algunos otros componentes, son descompuestos en molculas ms pequeas por medio de las enzimas de la saliva y las del tracto gastrointestinal. Entonces, los productos de la descomposicin entran a las diversas clulas del cuerpo, a travs de la corriente sangunea, y por medio de mecanismos que se detallarn en el Cap. 15. En algunas clulas, la transformacin va ms lejos; en otras tiene lugar la sntesis de molculas ms grandes a partir de las ms pequeas; an ms, en otras, la forma predominante de ataque puede dar lugar a diversas transformaciones de estos compuestos. En la mayora de los casos, las diversas clulas del cuerpo pueden verificar todas estas funciones. De todas maneras, la forma preponderante para la utilizacin o metabolismo de estos compuestos en las diversas clulas de los diferentes rganos, varia de acuerdo con la naturaleza de las mismas. Algunas, como las clulas del hgado, son muy activas en proporcionar una buena cantidad de protenas circulantes de la sangre y en movilizar glucosa para uso del resto de las clulas del cuerpo, principalmente las de los msculos. Otras, como las diversas clulas secretoras de las diferentes glndulas, son activas en sintetizar y secretar hormonas, las cuales, a travs de la sangre, son despus depositadas en sus respectivos sitios en los rganos de destino, y posteriormente son activas, en algunos aspectos, para regular el completo metabolismo del cuerpo. En estas tareas y en muchas otras que se bosquejarn en captulos posteriores, la clula hace trabajo, y al hacerlo necesita gastar energa. En general, la obtiene por medio del metabolismo de una parte de los mismos productos de descomposicin que se emplean en la sntesis de los compuestos ms grandes de la clula. As, parte de los productos resultantes de la descomposicin, se emplean para sintetizar glucosa o glicgeno, en el hgado y en las clulas de los msculos, en tanto que otra parte del resto es metabolizado para proveer la energa para estas sntesis.

En el metabolismo de los carbohidratos

De este escueto bosquejo, est claro que muchos de los substratos, o metabolitos, son atacados no precisamente de una sola manera por una sola enzima. En muchos casos, existe ms de una enzima atacando al mismo metabolito -una oxidndolo, otra reducindolo, y una para agregarle algn otro compuesto. As, nosotros podemos hablar de caminos metablicos, es decir, las diferentes direcciones que puede llevar un metabolito. Por ejemplo, la misma sustancia puede ser atacada por una enzima para producir energa qumica y puede tambin ser puesta, por otra enzima, en el camino para la sntesis de alguna de las molculas ms grandes de la clula, como protenas y cidos nucleicos. Un buen ejemplo de esto es el destino del fosfato-6-glucosa en la clula del hgado (Fig. 10-1).

Fig. 10-1. Camino general para la glucosa en la clula del hgado

Esta sustancia se puede formar por diversos medios enzimticos, ya sea partiendo del glucgeno; o por intermediarios menores de fermentacin; o de la glucosa libre (vase

Cap. 14). Una vez que se ha formado, pueden actuar sobre l cuatro enzimas diferentes; es decir, existen cuatro vectores para su metabolismo: (1) aportar abastecimiento de glucosa en la sangre, (2) fabricar glucgeno heptico para servir de almacn, para la glucosa de las clulas de la sangre y de los msculos, (3) proveer de intermediarios para las sntesis de grasas, protenas y cidos nucleicos, y (4) proveer de energa. Exactamente como todo esto es regulado por las clulas del hgado, no lo sabemos, pero es casi seguro que las velocidades relativas de las reacciones enzimticas y de las diversas hormonas, tienen que ver en parte en esta regulacin, al determinar qu proporcin de molculas de glucosa viaja a lo largo de cada ruta. La naturaleza es conservativa en el sentido de que cada compuesto acta como un punto de partida para muchos pasos metablicos diferentes. Hemos sugerido que la razn es debida a que la regulacin completa del metabolismo -la fisiologa- de la clula, es mucho ms fcil, si existen menos puntos clave que deben ser acomodados. En este caso, a la clula le resulta ms fcil cambiar de camino. En el ejemplo mencionado anteriormente, el compuesto clave podra ser el fosfato-6-glucosa. Tambin, aunque el ejemplo es la clula del hgado, otras clulas tan distantes biolgicamente como la clula de la levadura, tienen la mayor parte de las mismas enzimas, los mismos caminos y son, probablemente, propensas al mismo tipo de regulacin. Sin embargo, aun el diagrama simplificado de la Fig. 10-1, no proporciona todos los otros caminos alternativos conocidos en este gran subcampo del metabolismo. Por ejemplo, la sntesis de los cidos nucleicos es un requisito necesario para el crecimiento de la clula, como veremos en captulos posteriores. Uno de los componentes de estos compuestos complicados es el azcar de 5 carbonos, la ribosa. El precursor inmediato de sta, el fosfato-5-ribosa, se sintetiza por muchos caminos. Del precursor de los carbohidratos, el fosfato-6-glucosa, existen actualmente tres caminos que conducen a la formacin de este compuesto (Fig. 10-2). Uno de estos caminos, el del fosfato-pentosa, se ha conocido desde hace mucho tiempo. En realidad, se reconocen ahora dos caminos de fosfato-pentosa, el oxidativo y el no oxidativo. El primero, conduciendo la fosfato-5ribosa en cuatro etapas enzimticas, es una fuente primordial de potencial reductor bajo la forma de FDNAH: (vase ms adelante ); potencial reductor a causa de que esta coenzima, el FDNAH2, es un reactante concomitante necesario para la sntesis de los cidos grasos y de los esteroides. El camino no oxidativo de fosfato-pentosa comienza con la conversin del fosfato-6-glucosa a fosfato-6-fructosa. Pero en lugar de continuar en el camino glicoltico (vase la Fig. 14-2), los tomos de carbono del fosfato-6fructosa van a travs de una serie de reacciones de condensacin y transferencia, conduciendo por medio de las importantes enzimas, transaldosas y transcetosas, al fosfato-5-xilulosa y al fosfato-5-ribosa. El primer compuesto, tambin se forma por el camino oxidativo y por otro, llamado camino del cido urnico, pasando por el difosfato de uridinglucosa y 11 reacciones enzimticas. Puesto que el fosfato-5-xilulosa puede

convertirse en fosfato-5-ribosa, a travs del intermediario fosfato-5-ribulosa, el camino cido urnico es, tambin, una fuente de la mitad de ribosa de los cidos nucleicos.

Fig. 10-2. Caminos fosfato-pentosa

Los marcadores de radiactividad indican que todos estos caminos parecen operar en la clula al mismo tiempo, aunque el trfico en el camino, conduciendo a la ribosa a travs de cidos urnicos, parece ser insignificante comparado con los otros dos. En las clulas del hgado y de los msculos, al menos, el difosfato de uridin-glucosa formado de esta manera, es llevado para la sntesis del glucgeno. Pero, por qu deben existir estas mltiples fuentes de ribosa? No estamos seguros, pero pensamos que, puesto que la sntesis del cido nucleico es necesaria para el crecimiento de la clula y aun para su

existencia, la clula se ha provedo, por s misma, de ms de un camino para su sntesis en caso de que los otros sean bloqueados. Esto se puede ilustrar experimentalmente, empleando la observacin de que la vitamina tiamina, bajo la forma de pirofosfato de tiamina, es un cofactor necesario en el funcionamiento de las enzimas del camino no oxidativo, transaldolasas y transcetolasas. Se ha demostrado que en los animales normales, de todos los tomos de carbono de glucosa que se convierten en ribosa, aproximadamente el 40% de los tomos radiactivos de carbono de la glucosa administrada, se convierten en tomos de carbono de ribosa por el camino oxidativo y el 60% por el no oxidativo. Sin embargo, en animales que son deficientes en tiamina, aproximadamente el 80% de los carbonos de la ribosa fueron formados por el camino oxidativo. As, la clula parece tener implicados mltiples caminos para asegurar que un compuesto necesario sea formado, no importa en qu condiciones ambientales se pueda encontrar la clula. En el caso anterior, este compuesto es el fosfato-5-ribosa. Otro ejemplo, implicando los mismos caminos alternativos, podra ser la necesidad de la clula para formar suficiente FDNAH: para la sntesis de esteroides y grasas.

El Ciclo de Krebs
Esta disposicin de la naturaleza de ser conservadora, se muestra tambin en el hecho de que casi los mismos caminos existen para la sntesis de grandes molculas que para la produccin de energa. Esto no es completamente cierto durante todo el trayecto del camino, puesto que se sabe actualmente, que existen diferentes porciones del camino para el desdoblamiento y la sntesis de las protenas, para el desdoblamiento y sntesis de los carbohidratos (vase el Cap. 14) y para el desdoblamiento y sntesis de las grasas. Pero bajando en la escala metablica, en donde est n los intermediarios para todos estos procesos, los caminos metablicos est n dispuestos de tal manera que un cambio en la direccin, por decirlo as, puede conducir, ya sea a la combustin de un intermediario para producir energa o al acoplamiento de un intermediario con otro compuesto para formar molculas mayores. En este sentido, el bioqumico habla de ciclos, de verdaderas ruedas. Quizs sea ms fcil explicar esto, penetrando en los detalles del ms famoso y viejo de estos ciclos, el ciclo del cido tricarboxlico (ATC), o ciclo de Krebs, nombrado as por su formulador. Al hacerlo as, aprenderemos tambin un poco de cmo un bioqumico trabaja y de cmo estos caminos llegan a ser formulados. Es una historia fascinante. En la Fig. 10-3 se muestra el ciclo. Esencialmente, es un esquema, en el cual, los dos tomos de carbono del cido actico son oxidados para dar dixido de carbono y agua, y, al mismo tiempo, se produce una gran cantidad de energa biolgica. Este compuesto de 2 carbonos es, en realidad, la acetil-coenzima A y su produccin es un resultado del desdoblamiento previo de los alimentos grasos y de los carbohidratos. El carbohidrato, cuando se introduce al cuerpo de un organismo pluricelular, est bajo la forma de

Fig. 10-3. Ciclo del cido tricarboxlico (Krebs).

grandes polmeros de unidades de glucosa que deben ser primeramente desdoblados en unidades ms pequeas. El desdoblamiento en molculas de glucosa simples se hace, principalmente, por medio de enzimas extracelulares, que son secretadas por clulas. Entonces la glucosa penetra dentro de las clulas del cuerpo por medios que se describirn posteriormente. En el caso de organismos unicelulares, como las bacterias y algunos hongos, el carbohidrato en el medio ambiente es desdoblado ya sea por medio de enzimas secretadas en el medio por las clulas, o por enzimas situadas en la superficie de las clulas. La glucosa, ahora dentro de las clulas, es desdoblada por una serie de enzimas conocidas colectivamente como enzimas glicolticas (vase el Cap. 14). El producto final de todo esto es, generalmente, el cido pirvico. Este compuesto, a su vez, es oxidado para dar la acetil-coenzima A en una reaccin enzimtica sumamente complicada. El ltimo compuesto puede oxidarse an ms, a travs del ciclo ATC, o puede ir, a travs de una serie de reacciones, en las cuales se condensa sucesivamente con s mismo o con un derivado de si mismo, para formar los cidos grasos superiores. Estos cidos grasos son compuestos de cadena recta, de 14 a 20 carbonos de longitud. As es como los carbohidratos se convierten en grasa y cmo el azcar ingerido termina como cuerpo graso. El porqu en algunos casos la acetil-coenzima A consigue oxidarse para proporcionar energa, y en otras circunstancias se condensa para construir cidos grasos ms largos que proveen de grasas, no lo sabemos, pero existen algunas explicaciones posibles basadas en las circunstancias del ciclo del ATC. Por ejemplo, obsrvese en la Fig. 10-3 que el primer paso en la oxidacin de la acetilcoenzima A es la condensacin, con el auxilio de una enzima llamada simplemente "enzima condensadora", de este compuesto, con el oxalacetato para formar el citrato. Ahora, supngase que hay muy poco oxalacetato disponible para este paso. La condensacin se reducir mucho en cantidad, y la acetil-coenzima A no podr oxidarse ms en grandes cantidades; en su lugar, una buena cantidad de ella ir en un camino alterno. Este es el que capacitar a la acetil-coenzima a formar cido graso de cadena larga. La desviacin en este punto es uno de los posibles medios para que un comn precursor sea transformado ya sea en carbohidrato o en grasa. Para regresarse al ciclo, el citrato formado en la reaccin anterior es atacado por una enzima, la aconitasa, que origina un equilibrio que debe establecerse entre los tres compuestos, el citrato, el cis-aconitato y el isocitrato. La direccin de la reaccin est constantemente desviada hacia la formacin del isocitrato, debido a que existe una enzima que ataca a esta sustancia; eliminando al isocitrato de la reaccin por medio de la aconitasa, el equilibrio total resulta en la formacin de ms isocitrato a partir del cisaconitato y del citrato. Esta clase de hechos, la desviacin de un equilibrio enzimtico por medio de otro ataque enzimtico sobre uno de los compuestos implicados, no es un incidente singular en la clula, sino que prosigue constantemente. De esta manera, muchas reacciones que son termodinmicamente reversibles, en las cuales est implicado muy poco cambio en la energa libre, estn constantemente siendo vueltas

irreversibles "enzimticamente" es decir, encauzadas para ir la mayor parte del camino en una sola direccin. Si se aumenta la concentracin del isocitrato, como se puede hacer experimentalmente, resultar la formacin de citrato a partir del isocitrato. La enzima que ataca al isocitrato, llamada deshidrogenasa del isocitrato, emplea al dinucletido de nicotinamida-adenina (DNA) como una coenzima mientras que una enzima similar, utiliza el fosfato del dinucletido de nicotinamida-adenina (FDNA). Estas dos coenzimas fueron conocidas anteriormente como el nucletido de la difosfopiridina (NDF) y como el nucletido de la trifosfopiridina (NTP). En el proceso, el isocitrato es oxidado a oxalsuccinato, con la prdida de dos tomos de hidrgeno, dando DNAH2 o DNA reducido (y en el otro caso FDNAH2). La misma enzima, probablemente al mismo tiempo origina una descarboxilacin del oxalsuccinato, para dar el -cetoglutarato y bixido de carbono. Este proviene de la oxidacin de uno de los tomos de carbono del oxalacetato original. La formacin del DNAH2 es notable por el hecho de que su oxidacin subsecuente conduce a la produccin de energa biolgica. Como se lleva a cabo el ltimo proceso, se discutir en el prximo captulo. Baste sealar aqu esta funcin posterior del ciclo, el originar la produccin de la mayor parte de la energa que es empleada por la clula. El siguiente paso, la descarboxilacin oxidativa del -cetoglutarato para formar el succinato y dixido de carbono, por medio de la enzima deshidrogenasa del cetoglutarato, es tambin una reaccin muy complicada. La coenzima A toma parte otra vez, y lo que en realidad se obtiene no es el succinato, sino la succinilcoenzima A. Esta deshidrogenacin tiene lugar de nuevo con la ayuda del DNA para dar lugar al DNAH2 y otra vez este DNAH2 es ms oxidado para proporcionar energa. Sin embargo, hay otro paso en esta reaccin completa que suministra energa. Esta es la supresin enzimtica de la coenzima A de la succinilcoenzma A con ayuda del difosfato de guanosina (DFG) y fosfato inorgnico para formar trifosfato de guanosina (TFG). Este TFG es un compuesto de elevada energa, cuyas propiedades ya se mencionaron. De esta manera, la secuencia completa de las reacciones a partir del -cetoglutarato para dar succinato, proporciona produccin de energa para la formacin del DNAH2, y del TFG. Este ltimo puede reaccionar enzimticamente con el difosfato de adenosina (DFA) para formar DFG y trifosfato de adenosina (TFA). Es este ltimo nucletido, el TFA, el que ha recibido el nombre de moneda energtica del reino biolgico. Obsrvese, accidentalmente, que durante la oxidacin del -cetoglutarato, otra molcula de bixido de carbono se elimina del oxalacetato original. La siguiente reaccin, la deshidrogenacin succinica, es una muy poderosa, en la cual dos tomos de hidrgeno son eliminados del succinato para formar el fumarato. En el proceso, los dos tomos de hidrgeno, dejados suspendidos en el esquema, son transferidos al citocromo b, para formar el citocromo reducido b. Este citocromo b es una protena portadora de electrones que contiene un hem de hierro como grupo prosttico: tendremos ms que decir acerca de este tipo de compuesto en el siguiente captulo.

El fumarato que resulta de la reaccin anterior, toma entonces una molcula de agua con la ayuda de la enzima fumarasa, para formar el malato. Este es oxidado por la deshidrogenas mlica y por el DNA para formar el DNAH2 y otra vez el oxalacetato. Siguiendo los dos tomos de carbono (letra ms negra) del acetato a travs del ciclo, se observar que terminarn en la nueva molcula de oxalacetato. As, aunque el oxalacetato est de nuevo de regreso, no es precisamente la misma molcula, puesto que ha perdido tomos de carbono bajo la forma de dixido de carbono y los ha recuperado de nuevo de la acetil-coenzima A. Esta molcula de oxalacetato puede ahora aceptar otra molcula de acetil-coenzima A y el ciclo se repetir . Podemos decir, por lo tanto, que los dos carbonos de las molculas del bixido de carbono resultan de la oxidacin del acetato. El ciclo es la clave de la oxidacin de las grasas y de los carbohidratos, porque ahora sabemos que la mayor parte de las grasas y una buena parte de los carbohidratos son oxidados por medio del ciclo. Ya que los cidos, -cetoglutrico, oxalactico y pirvico pueden formarse muy fcilmente de los aminocidos (glutmico, asprtico y alanina), el ciclo es tambin responsable de la oxidacin de algunas de las protenas intermediarias de la clula. Este punto de vista est robustecido por el hecho de que otros muchos aminocidos se pueden desdoblar en intermediarios, tales como la acetil-coenzima A, el -cetoglutarato, el oxalacetato, el succinato o el fumarato. Se puede estimar que la oxidacin de los tomos de carbono de la mayor parte de los substratos tomados por la clula, se produce a lo largo de este ciclo. Esto sucede en toda clase de clulas, desde la mayora de las diferentes clases de clulas de nuestro organismo hasta las clulas de plantas, levaduras y bacterias. Y el reverso de la medalla? El ciclo tambin est implicado en la sntesis de los intermediarios que conducen a la formacin de molculas mayores. Por ejemplo, por aminacin, la colocacin de amoniaco en diversas formas, da origen a la formacin de aminocidos a partir de intermediarios del ciclo. A su vez, algunos de los aminocidos son precursores de las purinas y de las pirimidinas y por lo tanto, de los cidos nucleicos; tambin son precursores de las porfirinas. El oxalacetato, condensador inicial en el ciclo, se encuentra tambin en el camino de la sntesis de la hexosa y de la pentosa, esta ltima estando implicada como la mitad del azcar de los cidos nucleicos. En las reacciones subordinadas del ciclo, como se muestra en el esquema, el bixido de carbono puede fijarse en forma orgnica, combinndose con el piruvato para formar el oxalacetato; con el fosfopiruvato para dar el malato y con el propionato para originar el succinato. Estas reacciones hacen entrar al bixido de carbono, dentro del esquema, para formar sustancia celular. Este empleo del bixido de carbono se encuentra, no solamente en la fotosntesis a travs de diferentes reacciones, sino tambin hasta cierto punto, por medio de las mismas reacciones anteriores, en nuestros propios cuerpos que se "asemejan a plantas". Aun con esta breve descripcin, uno se puede dar cuenta de que el ciclo tiene un papel central en el metabolismo de los materiales alimenticios por medio de las clulas. A travs de l pasan la mayora de los intermediarios qumicos -la mayor parte de los tomos de carbono, para ser ms exactos- de los componentes qumicos de la clula. Es

el centro de un gran nmero de caminos implicados en el desdoblamiento y sntesis con los componentes celulares. La razn de esto es que los intermediarios del ciclo, particularmente los de 4 carbonos estn muy implicados como intermediarios en otros caminos del metabolismo qumico de la clula. Tarde o temprano, los compuestos implicados en los ltimos caminos alcanzan alguna parte del ciclo. Cuando esto sucede, sus tomos de carbono pueden ya sea oxidarse para proporcionar energa, o desviarse hacia otro camino. Aunque la estructura del ciclo se ha establecido muy bien, bastante poco se conoce de la forma como los carbonos son desviados, de cmo el ciclo "sabe" qu camino hacer funcionar, es decir, ya sea como una fuente de energa biolgica, como un mecanismo para la sntesis de los componentes que necesita la clula o como un medio por el cual, el metabolismo es cambiado de un camino importante a otro, digamos de los carbohidratos a las grasas. De los estudios fisiolgicos, nosotros sabemos que estas desviaciones pueden ocurrir, y que de hecho, ocurren. Los carbonos de los carbohidratos terminan en grasa; los carbohidratos estn formados de molculas ms pequeas y se encuentran almacenados; los carbohidratos se desdoblan para proporcionar energa. La grasa es sintetizada o desdoblada; las protenas son formadas o desdobladas. Los carbonos de los carbohidratos, grasas y protenas son todos intercambiables. Todos estos hechos ocurren en algn momento y como conocemos ahora la mayor parte de los caminos metablicos a lo largo de los cuales circulan estos intermediarios, comprendemos que el lugar clave donde ocurre la regulacin de estos pasos se encuentra en el ciclo de Krebs. Cules son los caminos alternativos posibles? Una mirada al ciclo sugiere varias posibilidades casi inmediatamente y pueden hacerse experimentos con tejidos desmenuzados (homogeneizados) para probar varios de ellos. Por ejemplo, el piruvato se puede oxidar a dixido de carbono y agua por medio de estos homogeneizados, por medio del ciclo de Krebs; sin embargo, para que esto tenga lugar es necesario aadir una cantidad adecuada de cidos de 4 carbonos, como el oxalactico, el mlico o el fumrico, ya que todos stos son interconvertibles. Si alguno de estos cidos se omite de la mezcla reaccionante, el piruvato no se oxida sino que, en su lugar, es convertido por medio de la acetilcoenzima-A en acetoacetato, uno de los productos intermedios del metabolismo de las grasas. Este resultado muestra que la acetilcoezima-A no se condensa con el oxalacetato para formar el citrato, sino que se condensa consigo misma para formar el acetoacetato. Se puede aadir tambin cloruro de amonio, el cual, asimismo, evita bastante la oxidacin del piruvato y ocasiona su conversin a acetoacetato. La razn de esto, probablemente, es que el cloruro de amonio aadido, elimina a los intermediarios del ciclo de Krebs, como el -acetoglutarato y el oxalacetato, originando que se conviertan en los aminocidos glutmico y asprtico. Puesto que todos los intermediarios estn en equilibrio entre si, una disminucin de algunos de ellos se reflejar en una disminucin de todos, y as los niveles de los intermediarios sern demasiado bajos para efectuar una condensacin efectiva con la acetilcoenzima-A

derivada del pirvico. As, de nuevo, dos de los tomos de carbono del pirvico terminarn como carbonos de grasa.

Verificacin del ciclo

Pero, cmo sabremos que algo como esto est realmente sucediendo dentro de la clula o dentro del animal? No lo sabemos exactamente, pero podemos hacer algunas conjeturas bastante acertadas. Los marcadores radiactivos, como el carbono 14, se pueden incorporar dentro de ciertos compuestos qumicos, como el cido pirvico, y este cido, as marcado, darlo entonces a un organismo, ya sea ste una clula de levadura o una rata. Varios compuestos qumicos -glucosa, grasas, aminocidos- se aslan entonces. Conociendo qu tomo de carbono del cido pirvico se marc y determinando qu tomos de carbono de los compuestos aislados estn marcados, se puede inferir bastante bien, conociendo las reacciones bioqumicas individuales implicadas, lo que sucedi en el organismo con los tomos de carbono individuales del cido pirvico ingerido. Sobre las bases de muchos experimentos como ste; diversos investigadores han llegado a las conclusiones ineludibles de que el ciclo de Krebs es operativo en la clula como tambin en los tubos de ensayo; que existen caminos metablicos alternativos para muchos de los intermediarios del metabolismo de las grasas, de los carbohidratos y de los aminocidos; y que estos intermediarios se cruzan entre si al nivel del ciclo de Krebs. Las reacciones del ciclo de Krebs pueden explicar completamente las formas por medio de las cuales los tomos de carbono del piruvato terminan en varios otros compuestos. En la ciencia, la verificacin de esta prediccin se considera como la prueba de la "veracidad" de la teora. Esto nos conduce a la evidencia original del ciclo y a los cimientos sobre los cuales Krebs formul el esquema. En tejidos desmenuzados, como msculos del pecho o hgado, se observ hace mucho tiempo, que la adicin de cantidades muy pequeas de citrato catalizaban una intensa respiracin. Se encontr tambin que el citrato poda sintetizarse cuando se aada oxalacetato y que el citrato, el isocitrato, el cis-aconitato y el -cetoglutarato eran todos rpidamente oxidados por estos tejidos desmenuzados. Pero el hallazgo de los primeros trabajos de laboratorio implicaba el empleo de un inhibidor enzimtico particular, el cido malnico, que especficamente inhibe la enzima deshidrogenasa y evita el intercambio de hidrgenos entre el succinato y el fumarato. Sin embargo, se ha visto que aun en presencia de malonato, el succinato poda, en realidad sintetizarse, cuando se aada fumarato u oxalacetato. Observando el ciclo, podemos ver que el succinato no se pudo formar por la reduccin directa del fumarato porque esta enzima estaba bloqueada por el malonato. Krebs dedujo que deba haber una reaccin "regresiva" por medio de la cual, el succinato poda formarse va el desdoblamiento del -cetoglutarato. As, se postul un ciclo empleando los cidos tricarboxlico, el citrato, el isocitrato y el cis-aconitato y los cidos dicarboxlicos, succinato, fumarato, malato y oxalacetato. Adems, en las clulas del hgado, en las cuales puede tener lugar la fijacin del bixido de carbono (por medio de la reaccin del

piruvato ms bixido de carbono para dar oxalacetato), el citrato y el -cetoglutarato se pueden formar a partir del piruvato. La siguiente evidencia, involucraba el uso de bixido de carbono radiactivo. Cuando este compuesto se incub con hgado desmenuzado en presencia de piruvato y malonato, se encontr que el succinato aislado no contena radiactividad y que sta en el cetoglutarato aislado estaba en el carbono del carboxilo prximo al grupo carbonilo. En la Fig. 10-3, el bixido de carbono radiactivo est marcado con un asterisco; obsrvese que la marca radiactiva se encuentra en el oxalacetato. A causa del bloqueo formado por el malonato, el ciclo tiene que ir en la direccin de las "manecillas de un reloj" y as, la marca se encuentra en el citrato, cis-aconitato, isocitrato, oxalsuccinato y cetoglutarato; sin embargo, no se encuentra en el succinato debido a que el grupo carboxilo marcado del -cetoglutarato se elimin por la deshidrogenasa del cetoglutarato. Si usted observa detenidamente el ciclo, podr preguntarse si la radiactividad que se encontr en el fumarato y en el malato, proviene del oxalacetato radiactivo. Puesto que no haba radiactividad presente en el succinato, es evidente que el succinato no proviene del fumarato, pero debe haberse formado va una reaccin regresiva. Cuando se omite al malonato, todos los cidos dicarboxlicos, incluyendo al succinato, contienen radiactividad, mostrando la interconvertibilidad de los compuestos en cuestin. Tambin debido a que el malonato especficamente bloquea a la oxidacin del succinato, se puede emplear como un sistema de prueba para cualquier compuesto que forme succinato en presencia del inhibidor, puesto que el succinato realmente se acumula bajo estas condiciones y puede ser extrado y calculada su cantidad. Se encontr que todos los intermediarios del ciclo de Krebs, como se postul, pueden formar succinato bajo estas condiciones. Estas piezas de evidencia pueden explicarse solamente por medio de las reacciones del ciclo. Podemos proseguir; por ejemplo, se encontr que el citrato puede formarse a partir del acetoacetato y del oxalacetato. Otra vez, cuando el acetato radiactivo o el acetoacetato se aade a riones desmenuzados se forma -cetoglutarato radiactivo, y cuando se inyecta al animal con acetato radiactivo, se forman cidos asprtico y glutmico radiactivos. Puesto que los dos ltimos aminocidos estn en equilibrio con el -cetoglutarato y con el oxalacetato, estamos seguros de que el ciclo funciona en todo el animal. Gran parte de esta evidencia se ha acumulado, tanto de los experimentos en tubo de ensayo como los efectuados en el animal entero. La conclusin ineludible es que existe, en verdad, una cosa como el ciclo de Krebs en las mltiples clulas del cuerpo de los mamferos, como tambin en la mayora de las clulas de los organismos de los reinos vegetal y animal. Quizs la evidencia ms significativa haya sido el aislamiento y la purificacin de todas las enzimas involucradas en el ciclo, indicando que existen enzimas especficas que catalizan estas reacciones igualmente especificas. Que el ciclo es importante para la economa de la clula, queda ilustrado por el hallazgo de que la ingestin de fluoroacetato puede matar a un animal; este veneno detiene el ciclo debido a la inhibicin de la enzima aconitasa, acumulando concomitantemente fluorocitrato en la clula.

El ciclo de Krebs, por lo tanto, es una relacin metablica compleja entre muchos de los intermediarios de las grandes clases de material alimenticio ingerido por los organismos. Es un medio, por el cual, todos estos intermediarios pueden ser, de alguna manera, intercambiados; por ejemplo, la energa en los carbohidratos puede almacenarse, para un futuro uso, bajo la forma de grasa y las protenas almacenadas en el cuerpo, principalmente en los msculos, pueden transformarse en grasas y carbohidratos y convertirse en energa. El ciclo tiene otra funcin igualmente importante, a saber, la transformacin de la energa qumica en la energa que necesita la clula para efectuar sus diversas funciones; este es el tema del Cap. 11.

El Ciclo del Glioxalato

El ciclo de Krebs es solamente uno de lo que llamamos caminos intersectores del metabolismo. Es el compuesto qumico raro que se metaboliza solamente a lo largo de una secuencia metablica sencilla. Aun el ciclo de Krebs mismo, es slo un eje central de caminos entrelazados.

Fig. 10-4. Interaccin entre el ciclo de Krebs y el desvo del glioxalato

Por ejemplo, se ha observado desde hace mucho tiempo, que el crecimiento de muchas bacterias y hongos se puede sostener por medio de la adicin al medio de compuestos simples de dos carbonos, como el acetato. Este compuesto en estos organismos, a diferencia del caso en los mamferos, puede dar lugar a un aumento neto en carbohidratos y protenas va el ciclo del glioxalato (Fig. 10-4 ). Se puede ver que el ciclo intersecta al ciclo de Krebs en los niveles del cido mlico y del cido isoctrico. Las bacterias y los hongos tienen, en este punto, dos enzimas que no se encuentran en los animales: la isocitrasa, que desdobla al isocitrato en glioxalato y succinato; y la sintetasa de malato, que condensa al glioxalato con otra molcula de acetato para formar malato. As, dos moles de acetato se convierten en un mol de succinato. Este puede entrar, por supuesto, en el ciclo de Krebs y, por lo tanto, llegar a ser una fuente de tomos de carbono, de carbohidratos y protenas. De manera que la diferencia entre el ciclo de Krebs y lo que pudiramos llamar, su ciclo de paso de glioxalato es que los carbonos del acetato son oxidados por el primero mientras que se convierten en oxalacetato y, per lo tanto, a carbohidratos y protenas por el ltimo. Es interesante especular acerca de los mecanismos de control que determinan si acta la isocitrasa o la deshidrogenasa iso-ctrica; este es el punto clave, la interseccin entre estos dos ciclos. En la actualidad, solamente estamos especulando; no tenemos respuestas.

Estudio de un caso
Finalmente, el caso del metabolismo de la metionina (Fig. 10-5) ilustrar , una vez ms, los papeles mltiples que una molcula puede representar. La metionina es un aminocido componente de protenas. A causa de su grupo metilo lbil (CH3), acta como un agente de metilacin; puede metlar o transferir sus grupos metilo a aceptores de metilo para formar compuestos tales como la colina y la creatina. El primero es importante porque es un componente de los fosfolpidos que forman las membranas interna y externa de la clula (vase Cap. 15), y es tambin un factor clave en el metabolismo de los lpidos. La creatina, en la forma de fosfocreatina, es una fuente de energa en los msculos (Cap. 14). Estas propiedades de la metionina pueden demostrarse inyectando etionina a un animal. Se verifican diversos desrdenes fisiolgicos, particulamente en el hgado y en el pncreas; tienen lugar desarreglos en el metabolismo de las protenas, cidos nucleicos y fosfolpidos. La etionina es un antagonista metablico de la metionina; difiere de sta solamente en que tiene un grupo -S-CH2CH3 en lugar de un grupo -S-CH3 y as puede reemplazar a la metionina en muchas reacciones metablicas. Reacciona como metionina en cuanto a que llega a unirse a otros aminocidos por medio de enlaces pptidos y se incorpora a las protenas; algunas de estas protenas, debido a este reemplazo, se convierten en poco satisfactorias para desempear sus papeles metablicos. La etionina tambin compite con la metionina en varias reacciones enzimticas que requieren metionina. Esta es "activada" para transferir el grupo metilo, reaccionando con el TFA, el compuesto de elevada energa,

para formar el compuesto de metionina "activo", el S-adenosil-metionina. Asimismo, la etionina es atacada por la misma enzima para convertirse en el S-adenosil-etionina. Sin embargo, este ltimo compuesto no es, como el S-adenosil-metionina, un substrato para las diversas enzimas transferidoras de grupos metilo y es, por lo tanto, una terminal muerta. Si suficiente etionina penetra a una clula que contenga la enzima activadora de metionina puede sacar al TFA de la clula para llevarlo a su cul-de-sac; en consecuencia, tanto el metabolismo del cido nucleico como el metabolismo de la energa, se interfieren. S - CH2CH3

S - CH3

CH2

CH2 CH2

CH2 CHNH2

Proteinas

CHNH2

COOH
Etionina

COOH
Metionina

+ ATP

+ ATP
S-Adenosil-metionina

S-Adenosil-etionina

Colina

Creatina

Transmetilacin

Fosfolpidos

Fosfocreatina

Fig. 10-5. Etionina, un antagonista metablico

Todos estos hechos mltiples tienen lugar cuando una clula ingiere este sencillo y nico antagonista metablico. Esta observacin es un final adecuado para descripcin de los esquemas metablicos de una clula, en los cuales un compuesto desempea no una, sino muchas funciones. La clula es conservativa, guarda su sustancia y acumula su energa. Conocemos ahora la existencia de muchas enzimas, de muchos caminos enzimticos, que involucran a las pequeas molculas de la clula. Se han publicado hasta "mapas metablicos" en forma de libros, enumerando las acciones y las interacciones entre los substratos y las enzimas a lo largo de estos caminos, implicando no solamente a los carbohidratos, sino tambin a las protenas, a las grasas y a los precursores de los cidos

nucleicos. Aunque estos mapas no han sido una tarea fcil, sino que han necesitado aos de trabajo de parte de cientos de individuos, son an mucho ms sencillos que la formidable tarea que queda todava por delante: la comprensin de las regulaciones a travs de estos caminos, de los medios por los cuales una clula determina qu caminos se deben escoger, con el fin de que los destinos finales tengan algn beneficio para la economa de la clula como un todo. No debemos olvidar que la clula es una entidad metablica integrada, no meramente un conjunto de reacciones enzimticas separadas espacial y temporalmente. En el Cap. 16, se bosquejar n algunas ideas que se poseen acerca de la naturaleza de los mecanismos del control metablico.
___________________________________________________________________________________________________

LISTA DE LECTURAS QUE SE SUGIEREN

AXELROD, BERNARD, "Glycolysis." In Greenberg, D. M. (ed.), 1960. Metabolic pathways. New York: Acadcmic Press. Vol. 1, p. 97. GREEN, DAVID E., "The synthesis of fat" Scientific American, February 1960. ----, "The metabolism of fats," Scientific American, January 1954. ----, "Enzymes in teams," Scientific American, September 1949. GREENBERG, D. M. (ed.), 1960. Metabolic pathways. New York: Academic Press. Vols. 1 and 2, chapters on fat and amino acid metabolism. KREBS, HANS, A., and LOWENSTEIN, JOHN M., "The tricarboxylic acid cycle." In Greenberg, D. M. (ed.), 1960. Metabolic pathways. New York:Academic Press. Vol. 1, p. 129. MCELROY, W. D., 1961. Cellular physiology and biochemistry. Englewood Cliffs, N.J.: Prentice-Hall. POTTER, VAN R., and HEIDELBERGER, CHARLES, "Alternative metabolic pathways,' Physiological Reviews, Vol. 30 (1950), p. 505. WOOD, HARLAN. G., "Significance of alternate pathways in metabolism of glucose," Physiological R eviews, Vol. 35 ( 1955 ), p. 841.

CAPITULO ONCE

EL MITOCONDRIO Y LA FIJACION DE LA ENERGA Las clulas son convertidores de energa; tiene que serlo as necesariamente,
debido a que necesitan energa para llevar a cabo sus numerosas tareas. Para sobrevivir y dividirse, para atraer a su interior substratos del medio ambiente, para moverse, contraerse y expandirse -todas las actividades de diversas clulas, sea trabajo mecnico, trabajo osmtico o la concentracin de diversos solutos, requieren energa. Finalmente, la sntesis de compuestos con el fin de fabricar nuevas clulas, requiere trabajo. La importancia de los mitocondrios reside precisamente en el hecho de que ellos abastecen, prcticamente, toda la energa biolgica necesaria, y lo hacen, principalmente, oxidando los substratos del ciclo de Krebs. Una clula obtiene su energa de la oxidacin enzimtica de compuestos qumicos; en este captulo describiremos lo que se sabe acerca de este proceso.

LOS MITOCONDRIOS: HISTORIA Y DESCRIPCION

En la dcada de los veintes, Warburg, un innovador en la bioqumica, encontr que las reacciones oxidativas que tienen lugar en la mayor parte de los tejidos estaban concentradas en una pequea porcin de las clulas. Moliendo el tejido, hizo lo que llamamos ahora, un homogeneizado del tejido; lo hacemos en la actualidad con un triturador que encaja ajustadamente dentro de un tubo de vidrio en el cual se ha colocado el tejido y un medio adecuado. El homogeneizado se puede centrifugar, y si se hace esto a diferentes velocidades, se obtendr una separacin fraccionada de los componentes de la clula. Cuando Warburg hizo esto, encontr que la mayor parte de las enzimas responsables de la oxidacin de los cidos, que sabemos ahora son intermediarios en el ciclo de Krebs, estaban contenidas en una fraccin de grnulo grande, llamada as porque se podra centrifugar a bajas velocidades. Como muchas otras observaciones, sta qued perdida en la mente bioqumica colectiva por muchos aos, aunque muchos bioqumicos hicieron uso de la tcnica de Warburg para determinar algunas propiedades de estas enzimas. Pero nadie le dio mucha importancia a lo que estaba en esta fraccin de grnulo grande ni a qu parte de la clula contena todas estas enzimas. Hace aproximadamente 15 aos, sin embargo, varios bioqumicos se interesaron precisamente en este problema y guiados por hombres como Claude, Schneider y Hogeboom, Lehninger y Green, repitieron en esencia los experimentos de Warburg, pero con tcnicas, mucho ms refinadas,

debido a la acumulacin de experiencia bioqumica. Ya que ellos estaban interesados tambin en citologa, descubrieron la importancia bioqumica de los mitocondrios. Los citlogos haban conocido algo de la existencia de los mitocondrios desde haca mucho tiempo. Haban visto estos pequeos cuerpos microscpicos en la mayora de las clulas del cuerpo; haban podido teirlos con ciertos colorantes vitales; y saban que los mitocondrios contenan enzimas que podan reaccionar con estos colorantes. Despus de doce aos de trabajo con estos mitocondrios, los bioqumicos, actualmente, conocen bastante acerca de ellos; son los componentes importantes de las fracciones de grnulo grande de Warburg, todas las enzimas del ciclo de Krebs se encuentran en estos cuerpos y son, por lo tanto, los responsables de casi toda la transformacin de la energa de la clula. Qu es el mitocondrio? Es una estructura rodeada por una membrana limitante, que se encuentra en todas las clulas excepto en las bacterias y en los glbulos rojos maduros de la sangre de los organismos pluricelulares; se halla, tambin, en clulas vegetales, en las algas y en los protozoos. En todas estas clulas su apariencia es muy similar: una membrana exterior limita a la estructura, en tanto que en el interior, existe otra membrana con pliegues o invaginaciones, llamadas crestas, que llegan muy dentro del mitocondrio, algunas veces tan lejos que alcanzan el otro lado. Esta tpica estructura se encuentra siempre en las clulas, de manera que es fcil reconocer a un mitocondrio sencillo por su morfologa. La Fig. 11-1 muestra mitocondrios procedentes de hgado de rata, de un rin de rata y de un alga, la Chlamydomonas, tal como se observan en un microscopio electrnico. La Fig. 11-2 es un diagrama derivado de estas micrografas electrnicas. Enzimas en los mitocondrios An aislados, los mitocondrios conservan su tpica apariencia, aunque el proceso de su aislamiento, modifica su textura, daa sus membranas y hace su contorno menos preciso. Estas partculas, en la actualidad, se separan por el mismo mtodo empleado por Warburg; es decir, primero, homogeneizando el tejido en algn medio; las soluciones de sacarosa isotnicas o hipertnicas son las ms comnmente empleadas. Por medio de un proceso llamado centrfugacin diferencial, el ncleo y las clulas que no han sufrido ruptura van al fondo durante la centrifugacin, y lo que sobrenada se hace sedimentar por medio de una fuerza centrfuga mayor. Los mitocondrios van al fondo bajo la forma de una pldora de color canela. Lavando esta pldora varias veces, se puede obtener una fraccin mitocondrial casi pura; y se han obtenido de muchas clases de clulas animales y vegetales, y hasta de algunos protozoos. La investigacin ha demostrado que los mitocondrios procedentes de todas estas fuentes, tienen casi las mismas actividades enzimticas. En algunos casos, parece ser que son las nicas depositarias de ciertas enzimas en las clulas. La Tabla 11-1 muestra los resultados de un experimento tpico, en el cual, un homogeneizado de hgado fue separado en varias fracciones subcelulares por medio de la centrifugacin diferencial. Del total de las actividades succinoxidasa y citocromoxidasa en la clula del hgado, un 60% en un caso y un 80% en el otro parece que reside en los mitocondrios. Se cree que la presencia de estas enzimas en las otras fracciones celulares, se debe a la contaminacin con mitocondrios rotos o

Fig. 11-1 A: Mitocondrios en una clula de hgado de rata (x 50000) B: Cuerpos intramitocndrios C: mitocondrios en un alga Chlamydomonas (x 25000). Cortesa de G. Palade, Rockefeller Institute).

Fig. 11-2 Diagrama de un mitocondrio tpico, como se observa en una micrografa electrnica.

TABLA 11-1 DISTRIBUCION DE LAS ACTIVIDADES SUCCINOXIDASA Y CITOCROMOXIDASA EN EL HIGADO DE RATA (SEGN HOGEBOOM Y SCHNEIDER)
Succinoxidasa Fraccin
Actividad
Homogeneizado Ncleos, desechos de clulas Mitocondrios sobrenadante de los mitocondrios Partculas pequeas Sobrenadante final Mitocondrios ms sobrenadante Mitocondrios, ms ncleos, ms desechos de ncleo, ms sobrenadante de los mitocondrios. 4.25 0.84 2.40 0.18 3.15 4.18

Citocromoxidasa
Act./mg Protena
2.06 2.44 6.46 0.35 0.00

Act./mg Protena
1.34 1.65 3.18 0.09

Actividad
6.86 1.36 5.39 0.29 0.00

enteros. El hecho de que ambas enzimas se hallen concentradas en los mitocondrios, se demuestra por medio de la observacin de que, no solamente veces existe un cofactor para la actividad enzimtica en alguna otra fraccin de la clula, como en la fraccin que sobrenada; as, aunque en sta se halla poca o ninguna actividad enzimtica, existe algo all que, cuando se aade a los mitocondrios, aumenta su actividad succinoxidasa. Experimentos como stos, en los cuales se han observado efectos de recuperacin, activacin y recombinacin, nos han permitido determinar el sitio de muchas enzimas y de muchos cofactores en la clula. Precisamente de esta manera, se encontr que muchas de las enzimas del ciclo de Krebs estaban localizadas en los mitocondrios. Este descubrimiento, por supuesto, peda haberse deducido de la primera observacin que se hizo de que los mitocondrios eran capaces de oxidar completamente al piruvato, dando dixido de carbono y agua. Puesto que sabemos que esto slo puede suceder a travs del ciclo de Krebs, podemos decir que todas las enzimas del ciclo deben residir en los mitocondrios. En el caso de algunas de estas enzimas individuales, existe tambin una gran parte de la actividad celular total que es extra

mitocondrial. Qu estn haciendo estas enzimas -por ejemplo, la deshidrogenasa mlica- fuera de los mitocondrios? No se sabe con precisin. Como todos los cientficos, los bioqumicos se sienten complacidos al permitir que casos difciles se queden a un lado por algn tiempo, hasta que alguna teora les llegue a las manos. Por el momento, podemos decir que el ciclo de Krebs es mitocondrial, y a causa de que es un ciclo de trasmutacin de energa, podemos llamar a los mitocondrios, los transformadores de energa de la clula -los agentes por medio de los cuales la energa innata en los compuestos qumicos es modulada en energa biolgica que es til al organismo.

LOS MITOCONDRIOS COMO CONVERTIDORES DE ENERGA

El problema de la energa biolgica est ntimamente relacionado con el metabolismo de los fosfatos inorgnicos. Por el ao de 1907, el bioqumico Harden encontr que los fosfatos inorgnicos desaparecan durante la fermentacin efectuada con jugo de levaduras libre de clulas, ms tarde encontr que las enzimas en las levaduras esterifican estos fosfatos a formas orgnicas, tales como mono y difosfatos de hexosa, a los cuales aisl posteriormente de las clulas de levaduras. Durante el periodo de 1930 a 1938, se vio que los fosfatos inorgnicos tambin desaparecan durante la oxidacin aerbia de los carbohidratos, para convertirse tambin en la forma ster, la cual, en este caso, era el cido 1,3-difosfoglicrico (vase Fig. 14-2). Sabemos ahora que estos pasos enzimticos son etapas del esquema glucoltico, en el cual, el glucgeno se desdobla anaerbicamente en lactato y durante el mismo, tambin, se pone en libertad algo de energa. Pero no se observ la dependencia de la respiracin con la fosforilacin, hasta que lo hicieron Engelhardt en 1930 y Kalckar en 1937. Fue en 1939 cuando se hizo el verdadero intento para determinar el papel de los fosfatos en la oxidacin de lo que nosotros llamamos ahora substratos del ciclo de Krebs. Muchos laboratorios, casi simultneamente, observaron que los fosfatos inorgnicos eran necesarios para la oxidacin celular del citrato, glutamato, fumarato, malonato y piruvato; que sin adicin de fosfatos al tubo de ensayo, tena lugar muy poca oxidacin. Por lo tanto, la desaparicin del fosfato y la oxidacin del substrato, se acoplaban mutuamente. Se encontr que, en el tejido muscular, el fosfato que desapareca era esterificado en creatina; y en el rin, hgado y los msculos otra vez, era esterificado de nuevo en glucosa, fructosa o cido adenlico. Poda medirse la cantidad de fosfato que desapareca, y se encontr que mucho ms se eliminaba que el que era capaz de obtenerse por la bien conocida etapa, de entonces, de la fosforilacin glucoltica es decir, la oxidacin del fosfato-3-gliceraldehdo en cido 1,3-difosfoglicrico (vase Cap. 14). Por consiguiente, se propuso que el resto de las fosforilaciones tenan lugar durante la transferencia de los electrones del substrato al oxgeno, siendo los substratos, los familiares del ciclo de Krebs. El objeto de la investigacin, en aquellos das, era encontrar cmo muchas moles de fosfato inorgnico eran tomadas, bajo la forma orgnica, por el tomo de oxgeno consumido durante la oxidacin del substrato. Esta relacin es una medida de la eficiencia en la produccin de energa, o cunto substrato se debe oxidar para dar tal energa. Esta relacin tambin proporciona una idea del nmero de etapas enzimticas individuales

implicadas. Posteriormente, cuando el ciclo de Krebs fue estudiado completamente, lleg a ser muy claro el hecho de que la mayora de las fosforilaciones asociadas con la oxidacin del substrato, no tenan lugar directamente con ste sino durante el flujo subsecuente de electrones hasta el ltimo de ellos, o aceptor de hidrgeno, o sea el oxgeno. Por ejemplo, de la Fig. 10-3 se puede concluir que durante la oxidacin del -cetoglutarato a succinato, un fosfato inorgnico se esterifica para formar el trifosfato de guanosina. Pero, cuando el -cetoglutarato es oxidado completamente por una preparacin de tejido, no es una sino hasta cuatro moles de fosfato que son los esterificados por cada tomo de oxgeno consumido, o para cada mol de cetoglutarato oxidado. As, ms de tres esterificaciones de fosfato se deben llevar a cabo. La cadena transportadora de electrones La cadena transportadora de electrones es el camino biolgico ms corto para describir una reaccin, en la cual, un donador transfiere, con la ayuda de una enzima, un par de electrones a un aceptor. Por ejemplo, el piruvato es oxidado por una enzima que transfiere un par de electrones del piruvato a un aceptor de electrones, siendo ste la coenzima DNA, para formar el DNA reducido, o sea el DNAH2. Los electrones son entonces transferidos a travs de una serie de oxidaciones y reducciones acopladas, al aceptor de hidrgeno final o de electrones, el oxgeno, para formar agua. Estos pares que transfieren electrones se han conocido desde hace mucho tiempo. El ms conocido, el citocromo c, es un pigmento demostrado en bioqumica. Pero ahora sabemos que el citocromo c es solamente uno de una serie de pigmentos respiratorios. La Fig. 11-3 ilustra el concepto comn de la naturaleza del transporte del electrn, de los substratos oxidables al oxgeno reducible. Muchos substratos son oxidados por enzimas conocidas como deshidrogenasas, as llamadas a causa de que sustraen dos iones hidrgeno y electrones del substrato. Como la mayora de las enzimas, las deshidrogenasas son especficas para su substrato particular. En el ciclo de Krebs hablamos de una -cetoglutarato deshidrogenasa, de una malato deshidrogenasa, de una succinato deshidrogenasa y as por el estilo. En algunos casos, la deshidrogenasa es una flavoproteina, porque consiste de una protena ms un grupo prosttico, en este caso una flavina, constituyendo ambos la enzima activa. El aceptor de hidrgeno para algunas deshidrogenasas es el DNA, otras emplean especficamente el DNAF y an otras, pueden usar ya sea el DNA o el DNAF. Estas se conocen como coenzimas por que participa en la reaccin directamente, aceptando electrones y, por lo tanto, reducindose. El siguiente paso en el esquema del transporte del electrones la oxidacin del DNAH2 por medio de una reductasa del mismo; esta enzima es una flavoproteina, en la cual, el grupo prosttico, flavina adenina dinucletido, o FAD, se reduce y se oxida, participando as en la reaccin. Parece que existen dos flavoprotenas en este punto, en la cadena del transporte del electrn, una que acopla, o trabaja, con la deshidrogenasa sucinta, y la otra que lo hace en conjuncin con el resto de las deshidrogenasas del ciclo de Krebs. En el primer caso, los electrones del succinato son transportados directamente a la flavoproteina, en tanto que en el segundo caso,

los electrones van primero al DNA y despus, del DNAH2 al grupo FAD de la flavoproteina. Estas dos flavoproteinas reducidas, donan luego sus electrones a un aceptor comn, el citocromo b, el cual, entonces, se reduce. A su vez, el citocromo c1, el citocromo a y el citocromo a3. Se reducen y se oxidan alternativamente por el paso de electrones. En alguna parte, a lo largo de esta cadena, est implicado un nuevo portador, ltimamente descubierto, la coenzima Q10 , una quinona qumicamente relacionada con la vitamina K. Finalmente, la enzima citocromoxidasa, que parece ser la entidad que ahora denominamos ms sucintamente citocromo a y citocromo a3, cataliza la transferencia de electrones e hidrgeno al oxgeno para formar agua. Todos estos citocromos son hemoproteinas, en las cuales el hierro en el centro del Hem, se oxida y se reduce, alternativamente. Este envo de electrones del substrato al oxgeno tiene lugar, porque el potencial de energa de cada uno de los portadores intermedios es tal, que el hidrgeno o los electrones van de un compuesto con un potencial reductor elevado a otro con un potencial reductor bajo. Es como si la cadena transportadora de electrones estuviera formada por una serie de cascadas: el agua parte de un nivel de energa elevado, el substrato, y termina en un nivel de energa bajo, el oxgeno; esto es, un flujo de una sola direccin. Sin embargo, el flujo de electrones puede invertir, bajo ciertas condiciones como, por ejemplo, poniendo energa dentro del sistema, justamente como el agua se la puede hacer subir, si se aplica energa (vase ms adelante).

Fosforilacin oxidativa
Es lgico preguntarse por qu la clula emplea este complicado medio de capturar la energa en el substrato. La razn parece ser que, qumicamente, es ms eficiente romper la gran diferencia en potencial de energa entre el substrato y el oxgeno en muchas etapas pequeas; y esto es precisamente lo que hace la cadena transportadora de electrones. En cada cascada, la energa latente en la configuracin qumica del substrato, no es solamente capturada, sino transformada en una forma qumica que pueda utilizar la clula. Nosotros sabemos actualmente, casi con precisin, dnde estn localizadas estas "cascadas" transformadoras de energa en la cadena transportadora de electrones, son los sitios donde tiene lugar la produccin del TFA, y de esa manera estn designadas en la Fig. 11-3. De manera que podemos decir que la fosforilacin transportadora del electrn es el acoplamiento de la fosforilacin de un fosfato inorgnico con difosfato de adenosina (DFA) para dar el trifosfato de adenosina (TFA), con la transferencia concomitante de electrones de un donador a un aceptor. Tenemos una idea de cmo ocurre esto (vase ms adelante). Sabemos con ms precisin, que tiene lugar durante la oxidacin del DNAH2, durante la oxidacin del citocromo b reducido y, probablemente, durante la oxidacin del citocromo c reducido. As, para cada sustrato oxidado a travs del DNA -es decir, oxidado por un DNAH2 acoplado con una deshidrogenasa- existen tres molculas de TFA formadas por cada tomo de oxgeno

que es reducido, para dar una molcula de agua. En el caso de la oxidacin del succinato, la etapa del DNA es desviada y se forman dos molculas de TFA por cada tomo de oxgeno que es reducido. En algunos casos como en la oxidacin del cetoglutarato, durante su oxidacin por el DNA, hay igualmente un paso de fosforilacin, la formacin de TFG o de TFA; este es un ejemplo de la llamada fosforilacin de substrato, la produccin de energa bajo forma de TFA por la oxidacin directa del substrato. Otro ejemplo de esto es la oxidacin del fosfato-3gliceraldehido a cido 1,3-difosfoglicrico y la conversin de este ltimo en cido fosfoglicrico y TFA (Fig. 14-2). En el caso del -cetoglutarato, su oxidacin dar por lo tanto, cuatro molculas de TFA por cada tomo de oxgeno reducido. Esta relacin de moles de fosfato inorgnico esterificado para formar TFA por tomo de oxgeno consumido durante la oxidacin, se denomina relacin P/O. Es unamedida de la energa producida por la oxidacin de un substrato; en el caso del cetoglutarato son cuatro, con el succinato son dos, con el malato son tres y con el DNAH2 son tres tambin. Este proceso completo, de la fosforilacin oxidativa, se mide sencillamente, aadiendo substrato a los mitocondrios y observando el consumo de oxgeno y la desaparicin del fosfato inorgnico . Las relaciones de P/O que se observaron durante la oxidacin del substrato, mostraron que por cada par de electrones transferidos al oxgeno, tuvo lugar ms de un paso de fosforilacin. Datos como stos, produjeron la teora de la fosforilacin por medio del transporte del electrn.

Control de la respiracin
El trmino, fosforilacin acoplada, necesita una explicacin. En los mitocondrios trabajando, no tiene lugar la oxidacin de muchos de los substratos en el ciclo de Krebs sin la fosforilacin concomitante. Esto se puede demostrar muy fcilmente por estudios efectuados con mitocondrios aislados. Se ha observado muchas veces que los mitocondrios no oxidan al -cetoglutarato o al piruvato en ausencia de fosfato inorgnico y DFA. En presencia de fosfato inorgnico, pero sin DFA, no hay oxidacin; tan pronto como se aade DFA, el substrato se oxida, desaparece el fosfato inorgnico, y se forma el TFA. Este acoplamiento de la fosforilacin para la oxidacin es obligatorio; es decir, normalmente los electrones no son transportados a menos que tenga lugar una sntesis de TFA. El DFA es un componente necesario con el fin de que el fosfato inorgnico sea aceptado para formar el TFA; la adicin de ste nicamente, tiene muy poco efecto sobre la oxidacin. Sin embargo, si el TFA se descompone para formar DFA, la oxidacin se asegura y el DFA es entonces refosforilado a TFA. Esto ltimo se puede hacer muy fcilmente, aadiendo la enzima hexoquinasa, la cual cataliza la transferencia del fosfato del TFA a la glucosa para formar el fosfato-6-glucosa y el DFA, este ltimo necesario para que se verifique la oxidacin.

2e

Succinato

Deshidrogenacin Succinica

FADH2 FAD

Sustratos del ciclo de Krebs excepto el succinato DNAH2 2e

FADH2 2Fe+2 2Fe+2 2Fe+2 2Fe+2

H2O
1/2 O2

DNA

2e

FAD

2e

[ Q10 ]
Ubiquinona

2e

2Fe+3

2e

2Fe+3

2e

2Fe+3

2e 2e
2Fe+3

Deshidrogenasas Fosforilaciones

Pi Reluctasas
TFA

Cit.b

Pi Cit.c
TFA

Pi Cit.a
TFA

Cit.a3

Inhibidores Transportador de electrones transportadores reducidos inhibidores por amital transportadores oxidados transportadores reducidos

inhibidores por antimicina A transportadores oxidados

Fig. 11-3 Cadena transportadora de electrones, mostrando los sitios de Fosforilacin y los de inhibicin de transportadores.

La Tabla 11-2 muestra un experimento tpico, en el cual, la adicin de hexoquinasa, en presencia de TFA y glucosa, origina un aumento en la oxidacin del piruvato y del fumarato. Este efecto del DFA se llama efecto del "aceptor fosfato" en el aumento de la oxidacin. De igual manera, experimentos similares han mostrado la necesidad de que fosfato inorgnico

TABLA 11-2. EFECTO DE LOS ACEPTORES FOSFATO SOBRE LA VELOCIDAD OXIDATIVA

Velocidad oxidativa Adiciones piruvato y fumarato como substratos
TFA, fsforo inorgnico Fsforo inorgnico DFA, fsforo inorgnico, TFA,fosforo inorgnico, hexoquinasa, glucosa

glutamato como substrato 8 12 101 116

12 18 75 80

est presente, para que tenga lugar la oxidacin; la razn es precisamente la misma que para el caso del DFA. Experimentos como stos han establecido firmemente las bases de la fosforilacin oxidativa acoplada del substrato en los mitocondrios. En el siguiente captulo se discutir el posible significado de esto para la regulacin de ciertos aspectos del metabolismo celular.

CINETICA DEL TRANSPORTE DEL ELECTRON Y FORMACION DEL TFA

En aos recientes, el trabajo brillante de Chance y sus colaboradores comprobaron la existencia de la cadena transportadora del electrn en los mitocondrios de clulas completas aisladas, y an ms recientemente, en varios tejidos animales in situ. Adems, este grupo ha dilucidado la cintica del transporte del electrn. A travs del empleo de micro-mtodos de electrodos de oxgeno para medir el consumo de oxgeno, de la espectrofotometra de flujo rpido de doble destello y de mediciones simultneas de los estados reducidos y oxidados de los transportadores del electrn, se ha podido verificar la secuencia de stos a lo largo de la cadena. En lugar de medir

la respiracin por su producto final, el consumo del oxgeno, se ha medido por la reduccin, no del oxgeno, sino de los transportadores de electrones intermediarios. Puesto que cada uno de los transportadores de electrones tiene un espectro de absorcin caracterstico en los estados oxidados y reducidos, la medicin de la concentracin en los picos de absorcin proporciona una estimacin del porcentaje del compuesto que se ha reducido o se ha oxidado. Adems, como resultado de estas tcnicas, sabemos ahora exactamente dnde se forma el TFA a lo largo de la cadena. Previamente, partes separadas de la cadena pueden ensayarse para conocer sus relaciones P/O; la oxidacin de una mol de citocromo c reducido da un mol de TFA, la formacin del cual debe tener lugar entre el citocromo c y el oxgeno; la oxidacin del succinato da 2 moles de TFA, la otra teniendo lugar entre la ligadura del succinato con la flavoproteina y el citocromo c; la oxidacin del DNA da tres moles de TFA, la tercera tiene lugar entre el DNA y el citocromo b. El resultado muy interesante del trabajo de Chance es que lleg exactamente a la misma conclusin empleando mtodos radicalmente diferentes. Simplemente su mtodo consisti en mediciones de estados de oxidacin y de reduccin de los diferentes componentes de la cadena bajo condiciones en donde (1) no se aadi substrato, (2) se aadi substrato adecuado, pero no DFA, y (3) fueron aadidos substratos y DFA adecuados. Por ejemplo, si los mitocondrios estn urgidos de substrato todos los transportes de electrn son oxidados; durante la oxidacin del substrato y la fosforilacin subsecuente, ellos son reducidos. Sin embargo, si se aaden a los mitocondrios substratos y pequeas cantidades de DFA, la respiracin rpidamente aumenta hasta que todo el DFA se ha fosforilado a TFA, en cuyo momento, la velocidad de la respiracin comienza a decaer estrepitosamente. Observando los cambios de los estados de oxidacin-reduccin de varios componentes, durante el ltimo estado inhibido de la respiracin, se pueden identificar puntos a lo largo de la cadena -los llamados puntos de "entrecruzamiento"- como sitios de conversin de energa a una forma que pueda ser utilizable para la fosforilacin del DFA. Bajo estas condiciones, tienen lugar reducciones del DNA, de la flavoproteina y de los citocromos b y c; y una oxidacin del citocromo a. El punto de "entrecruzamiento" se encuentra as entre el citocromo a y el c, implicando este sitio como uno de aquellos, en los cuales, puede tener lugar la formacin del TFA. Estos resultados fueron comparados con los experimentos que involucran a los inhibidores del transporte de electrones conocidos, como la antimicina A y el amital. Estos reaccionan con los componentes de la cadena, como se muestra en la Fig. 11-3, y originan una reduccin de alguno de ellos y una oxidacin de otros, identificando de esta manera sus puntos de inhibicin. As, las conclusiones estn ahora firmemente deducidas de los sitios de formacin del TFA, y aun, la forma posible de cmo se efecta. Adems, podemos calcular ahora, por este mtodo, la cantidad de cada uno de los transportadores en la cadena. Parece que stos existen en distintas relaciones estequiomtricas entre entre s; todos los citocromos y las flavoproteinas se encuentran casi en igualdad de concentraciones con, aproximadamente, diez veces ms de nucletidos de piridina. De estos valores y de los datos conocidos del volumen mitocondrial y del contenido de protenas, se puede calcular el nmero de

conjuntos respiratorios para cada mitocondrio; estas cantidades, en nmeros, se encuentran entre 5000 y 10000 conjuntos de cadenas transportadoras de energa. Conceptos de la fosforilacin acoplada Otro conocimiento satisfactorio de este mtodo fue el establecer firmemente el papel de los aceptores de fosfato como el fosfato inorgnico (P1) y el DFA, en los ciclos de oxidacin y de reduccin de los transportadores. Los cambios inmediatos en la reduccin de estos transportadores de electrones que se verifican en segundos, despus de la adicin del DFA, sugieren firmemente que tiene lugar verdadera unin qumica entre el transporte del electrn y la fosforilacin. Del esquema representado en la Fig. 11-4, se puede inferir que no solamente el transporte de electrones es reversible, sino que el flujo de energa a lo largo de la fosforilacin tambin puede ser reversible. Recientemente se ha mostrado que al aadirse juntos succinato y TFA, la coenzima DFN es reducida a DFNH2. Esto se puede explicar mediante el concepto que despus de la oxidacin del succinato por su flavoproteina, los electrones fluyen primero 1. AH2 + B + X 2. BH2 ~X + Y 3. X~Y 4. Y~Pi** + Pi** + A*DP A X~Y Y~Pi** Y + BH2 ~X

+ BH2 + + X A*DP-P** (ATP)

Fig. 11-4. Esquema hipottico aceptado actualmente para la unin del transporte de electrones con la fosforilacin. A y B son transportadores de electrones; X y Y son los compuestos de unin hipotticos; Pi es el fosfato inorgnico; Pi** es el fosfato inorgnico radiactivo y el DFA* es el difosfato de adenosina radiactivo

al citocromo b; luego, en lugar de que los electrones fluyan al citocromo c, la elevada energa del TFA aadido causa una regresin, y los electrones van hacia la reductasa del DFN, originando la reduccin de ste. As parece que el TFA es la fuente de energa necesaria para dirigir esta reaccin hacia adelante, en contra del potencial electroqumico. La fuerza de unin entre el transportador de electrones y la fosforilacin est ampliamente ilustrada por la facilidad con que se verifica esta reaccin reversible. No sabemos cmo tiene lugar esta unin, pero tenemos una ligera idea de los pasos enzimticos individuales que deben estar implicados. El esquema dado en la Fig. 11-4, se ha desarrollado de los trabajos e ideas de bioqumicos tales como Lipmann, Slater, Lardy, Lehninger y Hunter, y est aceptado en la actualidad. La idea central es que la unin entre el transporte de electrones y la fosforilacin asociada tiene lugar a travs de un intermedio comn a ambos tipos de estas reacciones. No es necesario que as sea, pero es la hiptesis ms sencilla que se debe tomar en consideracin en la actualidad y que parece se ajusta a las observaciones conocidas.

La evidencia experimental de que los fosfatos inorgnicos no son necesarios para el transporte de electrones per se, indica que este intermediario comn no involucra ni al Pi ni al DFA. Por lo tanto, se ha postulado que un transportador reducido (AH2) reacciona con el siguiente transportador en lnea (B) en presencia de otra sustancia (X), reduciendo a B para dar BH2. Al mismo tiempo, un enlace de elevada energa (smbolo ~) aproximadamente del mismo contenido de energa como es el del TFA, se forma entre BH2, y X dando (BH2~X). El ltimo compuesto reacciona entonces con otra sustancia hipottica (Y) para formar un intermediario de elevada energa (X~Y). En el siguiente paso entra, finalmente, Pi formando (Y~Pi) y otra vez se pone en libertad a X. Y~Pi entonces se une con el DFA para formar, al fin, TFA y poniendo, otra vez, en libertad a Y. As, X~Y es el intermediario comn a ambos, tanto de los transportadores de electrones como de las enzimas de fosforilacin. La evidencia para este esquema se ha obtenido de diversas maneras. Uno puede predecir que las reacciones (3) y (4) deben ser reversibles, involucrando, como lo hacen, a compuestos de aproximadamente igual contenido de energa. Un medio para demostrar esto, implica el uso del compuesto 2,4-dinitrofenol; este compuesto se ha conocido desde hace algn tiempo que es un desligante de la fosforilacin oxidativa, puesto que en presencia de pequeas cantidades del compuesto, substrato y DFA, la oxidacin prosigue a un ritmo rpido, pero no se verifica la fosforilacin. Este compuesto es tambin un activador de una adenintrifosfatasa mitocondrial, separando al Pi del TFA. Todos estos hechos se pueden explicar, postulando que el dinitrofenol acta descomponiendo a X~Y para poner en libertad a X y a Y y as X~Y no puede actuar como aceptor de Pi para formar TFA. Las otras dos reacciones parciales de la secuencia de la fosforilacin se han descrito ya; ambas son inhibidas por el dinitrofenol, por lo cual estn implicadas en la unin del transporte de electrones con la fosforilacin. Una es la reaccin de intercambio entre Pi y el fosfato terminal del TFA, medida por medio de la mezcla de mitocondrios con Pi radiactivo y TFA no radiactivo y midiendo la radiactividad en el TFA aislado. La otra es una reaccin de intercambio similar entre el DFA y el TFA, medida por medio de la incubacin de mitocondrios con DFA marcado en slo mitad de adenosina y de Pi y despus contando el TFA marcado. Estas son reacciones de verdadero intercambio en las que no existe una sntesis neta de cualquiera de estos compuestos; no sale ms TFA del que se puso. La reaccin (3) ms la (4) pueden explicar la reaccin de intercambio Pi-TFA, y la reaccin (4) puede explicar el intercambio de DFA-TFA. Las identidades de los acopladores hipotticos, X y Y se desconoce. Ambos, o ninguno, puede ser una enzima fosforilada. Recientemente, compuestos tales como un DNA "activado", ligado a una enzima, o un citocromo c "activado" ligado a una enzima o una histidina fosforilada ligada a una enzima, todos han sido implicados como que funcionan en algn punto de este esquema. Tambin ciertas quinonas, como la vitamina K o ubiquinona, otra transportadora de electrones mitocondrial recientemente identificada se ha credo que est involucrada, tal vez siendo el compuesto X. Finalmente, no sabemos si estos propuestos Y y X son los mismos en los tres lugares de fosforilacin a lo largo de la cadena, o si existen diferentes acopladores en cada lugar. Puesto que estas reacciones parciales de fosforilacin estn ntimamente ligadas a la cadena transportadora de

electrones, se puede esperar que el estado de reduccin de los transportadores de electrones, tiene algn efecto sobre las proporciones de estas reacciones parciales; y, ciertamente, ste es el caso.

Partculas submitocondriales
El motivo de tanta dificultad, que se ha encontrado en la solucin de este problema del mecanismo, reside en el hecho de que los conjuntos respiratorios con sus fosforilaciones asociadas, son una parte de las membranas de los mitocondrios con lipoproteinas insolubles. Los laboratorios de Lehninger y Green han efectuado grandes adelantos al intentar fragmentar estas unidades plurienzimticas complejas en piezas laborables. Estos fragmentos de membrana, que pueden aislarse rompiendo los mitocondrios por medio de detergentes tales como la digitonina o el colato, se convierte en mitocondrios minimizados, pues parece que los conjuntos respiratorios, se expanden de una manera uniforme sobre todas las membranas mitocondriales intactas. Quizs ellos sean los pequeos grnulos, de aproximadamente 70 Angstroms de dimetro, que se han visto recientemente en micrografias electrnicas especialmente preparadas y que se muestran figurativamente en la Fig. 11-2. Una idea tentativa de que son las membranas crestadas y no las membranas exteriores de los mitocondrios, los lugares de estos conjuntos, se deduce del hecho observado de que los mitocondrios del corazn, que tienen ms crestas por mitocondrio que los mitocondrios del hgado, tienen tambin un contenido ms elevado de pigmentos respiratorios y una proporcin oxidativa ms alta. Estas crestas son, al igual que otras estructuras membranosas lipoproteinas (vase Cap. 15); por lo tanto, se cree que los conjuntos respiratorios sean realmente complejos de lpido protena (enzima). Se vislumbra que el lpido acta como una sustancia cementante especfica, uniendo rgidamente determinado portador con su vecino ms prximo. As se cree que el transporte de electrones tiene lugar, no por colisiones moleculares entre los componentes de la cadena, durante las cuales los electrones son transferidos, sino por medio de un verdadero flujo de electrones, posiblemente a travs de la matriz proteica del transportador, de un transportador colocado rgidamente al siguiente. Estas partculas diminutas, de naturaleza lipoproteica, se han denominado. PTE, partculas transportadoras de electrones. Junto a estas partculas, pero todava siendo parte de las membranas, se encuentra la mayor parte de las deshidrogenasas del ciclo de Krebs y las enzimas protenicas que estn implicadas en las reacciones de fosforilacin mencionadas anteriormente. Recientemente se han hecho intentos de fraccionar an ms este complejo diminuto de plurienzimas. Se han obtenido partculas ms pequeas que contienen algunos de los componentes y carecen de otros. En esta forma, trabajando con esta mezcla de partculas y deseando conocer algunas de sus propiedades, esperamos colocarlas, juntas en un panorama qumico significativo, lo que es actualmente un rompecabezas. Algunos de estos fragmentos de membrana mitocondrial son en si mismos, conjuntos completos de transporte de electrones y de cadenas de fosforilacin. Similarmente, el sistema de la secuencia de la fosforilacin puede ser transformado en fragmentos, como, por ejemplo, aquellos que contienen solamente la

adenintrifosfatasa del dinitrofenol activado. Se puede apreciar ahora la estructura del mitocondrio; podemos compararlo con una mquina eficiente, organizada estructuralmente para una rpida transduccin de energa oxidativa qumica utilizable.

Eficiencia de la fosforilacin como una transductora de energa

Vamos ahora a reflexionar acerca de lo que realmente sucede con la energa almacenada dentro de una molcula de glucosa en la clula. Si esta glucosa es completamente quemada en un tubo de ensayo proporcionar alrededor de 690000 caloras de energa por mol, todas ellas como calor. Sin embargo, en la clula, parte de esta energa no se pierde como calor sino que es retenida bajo la forma de TFA. La primera reaccin que la glucosa sufre en la clula es la serie de reacciones llamada esquema de Embden-Meyerhof de la gliclisis anaerbica (vase Fig. 14-2). El primer paso en este proceso es la fosforilacin de la glucosa por el TFA por medio de la enzima hexoquinasa para formar el fosfato-6-glucosa. Este ltimo compuesto es luego convertido enzimticamente a fosfato-6-fructosa, el cual reacciona entonces con otra molcula de TFA para formar el difosfato de hexosa, o sea el difosfato-1, 6fructosa. Este compuesto va entonces a travs de una serie de reacciones hasta que finalmente termina como dos molculas de 3-fosfogliceraldehdo. Este compuesto, a su vez es oxidado por el DNA para dar el cido 3-fosfoglicrico y DNAH. Esta reaccin es realmente un paso de fosforilacin acoplada ya que ocurre en presencia del DFA y fsforo inorgnico, con lo cual se forma TFA. Todos los pasos enzimticos mencionados anteriormente, se verifican por medio de enzimas solubles, que no se encuentran en los mitocondrios. Se necesitan dos molculas de TFA para que empiece la gliclisis de la glucosa y durante la reaccin oxidativa de la gliclisis, se recuperan estas dos molculas de TFA. Los siguientes pasos tienen lugar en los mitocondrios. El DNAH2 que se form como resultado de la oxidacin del 3- fosfogliceraldehdo es oxidado va la cadena transportadora de electrones para formar tres molculas ms de TFA. El resultado final de las reacciones glicolticas es la produccin del cido pirvico: en ellas, dos moles de cido pirvico se forman a partir de cada mol de glucosa. Este cido pirvico penetra en los mitocondrios y es oxidado por el DNA, dando al final, cuatro moles de TFA. El compuesto de dos carbonos que se forma, la acetil-coenzima A, se condensa para formar el citrato, como se explic en el captulo anterior. El siguiente paso productor de energa es la oxidacin del isocitrato a oxalsuccinato por medio del DNA, formndose DNAH2, cuya oxidacin da entonces tres molculas ms de TFA. El siguiente paso es la fosforilacin a un nivel del substrato del -cetoglutarato a succinil-coenzima A para dar un TFA ms, va el TFG. El DNAH2 que se forma como resultado de esta oxidacin, es oxidado a lo largo de la cadena transportadora de electrones para dar tres molculas de TFA. Sumando todas estas fosforilaciones dan 19 moles de TFA, formadas desde la oxidacin del piruvato hasta la formacin de CO2, y agua; pero como hay dos molculas de piruvato procedentes de una mol de

glucosa, esta sola mol de glucosa, en la gliclisis y en la oxidacin, da 38 molculas de TFA. El TFA es el compuesto llamado de "elevada energa". Con esto queremos decir que si es rota una ligadura ordinaria del ster fosfato como la del fosfato-6-glucosa, se obtienen aproximadamente 3000 caloras de energa por mol, pero si es hidrolizado el TFA, la energa desprendida del grupo fosfato terminal del TFA es aproximadamente de 10000 caloras por mol. Multiplicando todos los TFA formados durante el metabolismo de la glucosa nos da 38 10 000 = 380 000 caloras. Esto es, aproximadamente, el 55% de la energa total de la glucosa; en otras palabras, el proceso es 55% de eficiente un gran porcentaje. Probablemente cerca del 90% de la energa liberada en el desdoblamiento de los alimentos, tiene lugar durante el proceso del transporte de electrones. As, podemos observar que la mayor parte de la conversin de energa -conversin de esa energa inherente en una estructura qumica del substrato a energa inherente en la configuracin del TFA tiene lugar en los mitocondrios.

Membranas mitocondriales
Las membranas mitocondriales son similares a las otras en cuanto a ser semipermeables; es decir, algunos substratos, principalmente el citrato, tienen dificultad en atravesar las membranas, en tanto que los iones como el K+, son aparentemente tomados en contra el gradiente de una concentracin. Nuevamente, al estar rodeados de tales estructuras, los mitocondrios se comportan como osmmetros, en cuanto a que incorporan agua y se hinchan cuando se los coloca en soluciones hipotnicas. Bajo ciertas condiciones de hinchamiento, pierden algo de sus componentes solubles de peso molecular ms bajo, como los nucletidos de la adenina y las coenzimas DNA y FDNA y, por lo tanto, pierden su poder oxidante. Lehninger ha encontrado que ciertas clases de hinchamientos -por ejemplo, los originados por la adicin de iones fosfato- son reversibles; un buen agente reversible es el TFA. Los mitocondrios hinchados bajo estas condiciones se contraern por medio de adiciones de TFA, extrayendo agua. Ciertamente tomando en consideracin medidas muy exactas, se ha concluido que durante el paso de electrones que se verifica cuando es oxidado el substrato y, por lo tanto, cuando tiene lugar la fosforilacin, se efectan diversos cambios en el volumen -y, por ende, en la formadel mitocondrio. Es posible que los mitocondrios contengan una protena contrctil que responda a la adicin del TFA, porque sta es casi la misma situacin que se encuentra en la contraccin de las fibrillas musculares (vase Cap. 14). Lo que tiene que ver la contraccin y el hinchamiento alternados de los mitocondrios, con el funcionamiento de este orgnulo, es incierto. Pero la principal funcin de los mitocondrios no es precisamente fabricar TFA, sino su secrecin a otras partes de la clula. Por consiguiente, se cree que estos cambios en las propiedades de permeabilidad de la membrana mitocondrial, como lo indican los cambios de volumen efectuados por los mitocondrios, tienen algo que ver con la necesidad de secretar TFA. Adems del efecto aceptor de fosfato observado anteriormente, cualquier influencia intra o extramitocondrial sobre las propiedades de permeabilidad

de la membrana mitocondrial, puede ser un dispositivo regulador para la funcin mitocondrial. La membrana es una estructura netamente funcional. Los mitocondrios, y particularmente sus membranas, son un ejemplo sutil de la unin de la naturaleza para proyectar y hacer funcionar una estructura que provea de la ms grande eficiencia de flujo. Por alguna razn se han llamado a los mitocondrios "la usina de la clula". ____________________________________________________________________ LISTA DE LECTURAS QUE SE SUGIEREN CHANCE,B., and WILLIAMS, G.R., "Respiratory chain and oxidative phosphorylation," Advances in Enzymology, vol. 17 (1956), p. 65. DE DUVE,C., and BERTHET,J., "Use of differential centrifugation in the study of tissue enzymes," International Review of Cytology, Vol. 3 (1954), p. 225. ERNSTER,L., and LINDBERG, O., "Animal mitochondria," Annual Review of Physiology, Vol. 20 (1958), p. 13. GREEN, D.E., "Electron transport and oxidative phosphorylation," Advances in Enzymology, Vol. 21 (1959), p. 73. ---- and FLEISCHER, SIDNEY, "Mitochondrial system of enzymes." In Greenberg, D. M. (ed.), 1960. Metabolic pathways. New York: AcademicPress. Vol. 1, p. 41. ---- and HATEFI, Y., "Mitochondrion and biochemical machines," Science,Vol. 133 (1961), p. 13. HOGEBOOM, G. H., and SCHNEIDER, W. C., "The cytoplasm." In Chargaff, E., and Davidson, J. N. (eds.), 1955. Nucleic acids. New York: Academic Press. Vol. 2, p. 199. HOWATSON, A. F., and HAM., A. W., "Fine structure of cells," Canadian Journal of Biochemistry and Physiology, Vol. 35 (1957), p. 549. LEHNINGER, ALBERT L., "How cells transform energy," Scientific American, September 1961. ---- "Energy transformation in the cell," Scientific American, May 1960.

CAPITULO DOCE

EL NUCLEO Y EL ALMACENAMIENTO Y TRANSMISION DE INFORMACION Hasta

ahora hemos hablado de los hechos que tienen lugar en el citoplasma; enseguida volcamos nuestra atencin hacia el ncleo. Todas las clulas vegetales y animales contienen ncleos bien definidos, con una membrana que los rodea. Algunas clula tienen dos ncleos, otras tienen muchos. Las bacterias, sin embargo, contienen una regin "nuclear", sin estar rodeada por ninguna membrana. A diferencia del citoplasma, que parece tener muchas funciones, todas las actividades del ncleo estn enlazadas en la eterna conservacin y en la exacta reproduccin de informacin. En la actualidad, es un hecho bien establecido que el ncleo es el depositario de los factores mendelianos, o genes; que stos estn localizados en los cromosomas; que la sustancia qumica principal de los genes es el cido desoxirribonucleico (ADN), y que ste es una molcula muy grande, con un peso molecular de millones, que lleva la informacin que capacita a la clula para expresar su individualidad. no sabemos cmo se verifica esto, pero estamos en el camino para su conocimiento. Este capitulo describir lo que podramos llamar el viaje inicial a lo largo de la carretera. Existe un colorante particular, el colorante de Feulgen, que reacciona especficamente con los desoxirribonueletidos polimerizados, es decir, con el ADN. Por medio de este colorante se ha demostrado, incontables veces, que el ADN reside solamente en el ncleo. En realidad, el ADN es un complejo unido a una protena bsica, la histona, para formar la nucleohistona que se encuentra naturalmente. En muy pocos casos, sin embargo, en ciertos tipos de clulas parece que se encuentra tambin una pequea cantidad de ADN en el citoplasma. La cantidad de ADN es constante; en todas las clulas de un tejido procedente de un animal de determinada especie, la cantidad de ADN por clula en la misma. Ms exactamente, la cantidad de ADN por ncleo es la misma para todas las clulas somticas de un animal en particular, y esta cantidad es el doble de la encontrada en las clulas germen de esa especie en particular. Podemos ir ms adelante y decir que la cantidad de ADN por determinado cromosoma es una cantidad fija y caracterstica de esa especie. Esta concentracin de ADN permanece la misma, no importa bajo qu esfuerzo metablico o nutricional se puedan colocar a las clulas o al animal. Otra constante del ADN del ncleo es su estabilidad metablica. Si se inyecta a un animal, fosfato inorgnico radiactivo, la marca radiactiva se encontrar en grandes cantidades en toda clase de compuestos que contengan fsforo, pero no habr radiactividad en los fosfatos del ADN. Parece

ahora que una vez que se ha sintetizado el ADN de los cromosomas, ya no se desdobla. Es una molcula estable, y esto es precisamente lo que uno puede esperar de una molcula que lleva la informacin acerca de las propiedades de la clula. Esto no quiere decir que el ADN sea inerte, de hecho, pensamos que no lo es; como si dijramos mejor, una vez formado el ADN, su modelo molecular est instalado y no sufre ms transformaciones metablicas. Siendo parte de los cromosomas, el ADN participa de los actos celulares (de hecho, podemos "ver" que hace esto) cuando los cromosomas se replican y se dividen durante la divisin celular.

DIVISION CELULAR
Esto trae a colacin el asunto de la divisin celular; porqu una clula debe dividirse? nosotros no lo sabemos con certidumbre, pero podemos hacer buenas conjeturas. Puede ser que el crecimiento de la clula, su aumento de masa, tenga cierto lmite, y que, al dividirse, una clula pueda obtener ms superficie por masa de sustancia celular. Con el fin de sobre vivir la clula debe tener un intercambio constante con su medio ambiente ya sea ste pequesimo como lo es una gota de agua, o un intermediario como lo es el torrente sanguneo. Probablemente exista una relacin lmite entre la superficie de la clula y su masa, diferente para las diversas clases de clulas, y cuando este lmite se alcanza, se divide la clula. Otra razn para la divisin podra ser debida a una especie de "envejecimiento" del citoplasma; la divisin de la clula permitira as al ncleo celular, o material nuclear, recoger de su alrededor citoplasma fresco y no excederse todava de la relacin lmite de volumen a masa. Sobre todo, por supuesto, la principal razn para la divisin de la clula durante el crecimiento, es formar clulas nuevas y similares, hasta que se alcance el tamao adulto del rgano. Qu origina que una clula de un tejido joven se divida? y, qu es lo que hace que una clula de un tejido adulto se detenga virtualmente en sus divisiones? Ambos son enigmas.

Mitosis
Sabemos de cierto, que la causa visible de la divisin celular es la duplicacin de la sustancia nuclear. En el ncleo de una clula en "reposo" y que, por lo tanto, no se est dividiendo e1 llamado ncleo de interfase" (vase la Fig. 3-7) - todo lo que aparece es una rea densa, definida pero sin limitar, que es el nucleolo; otras reas menos densas, no muy bien definidas, se encuentran en el nucleoplasma, o sea el rea del ncleo fuera del nuclolo. Sin embargo, aunque nosotros no podemos "ver" estructuras en el nucleoplasma, sabemos con certeza que hay algn tipo de organizacin molecular. Durante la divisin de la clula mencionada en el Cap. 3, esta organizacin se pone de manifiesto. Aparecen las regiones del centrosorna, una en cada extremo de la clula en divisin, que parece que actan como puntos de enfoque para las fibras del huso. Estas fibras son partes de una organizacin, el aparato mittico, el cual puede separarse intacto de las clulas en divisin. En el nucleoplasma se encuentran las protenas que posteriormente, durante la divisin de la clula, se condensarn y as

estructuradas, formarn las fibras del huso visible a lo largo de las cuales, los cromosomas se movern hacia cada extremo de la clula en divisin (vase la Fig. 37) Verdaderamente, hay mucho ms trabajo por hacer para determinar la superestructura del ncleo y cmo esta estructura cambia dramticamente y con mucha rigidez durante varias etapas del ciclo nuclear. La divisin de la clula somtica en dos clulas hijas se efecta por un proceso llamado mitosis (vase la Fig. 3-7). Esencialmente lo que sucede en la mitosis es que se hace una exacta distribucin del ADN en el ncleo del ADN que previamente se haba exactamente duplicado. La mitosis comienza con la condensacin del ADN, protenas y, posiblemente, del ARN para formar hilos visibles de cromatina, los cuales se convierten en cromosomas entrelazados y enrollados que pueden observarse por primera vez. Despus de la divisin, todo lo que puede verse del material de cromatina en el ncleo de interfase es una rea densa, vaga, pero que, sin embargo, se tie con el colorante de Feulgen, indicando la presencia continua de contenido de ADN en los hilos. As, podemos decir que si una clula se ha dividido, lo ha realizado de tal manera que las clulas hijas tienen exactamente las mismas caractersticas de la clula madre. El significado de la mitosis es de que provee de un mecanismo preciso para que esto se lleve a cabo. En trminos morfolgicos, esto significa una duplicacin exacta del nmero, tamao y arquitectura de los cromosomas, para que stos lleven los genes mendelianos. En trminos bioqumicos, esto debe significar, como hemos visto, una duplicacin exacta de la estructura qumica del ADN.

Duplicacin del ADN

El hecho inicial en la divisin de la clula parece ser la duplicacin del contenido de ADN en el nucleolo, tenemos idea de cmo esto se inicia, pero tiene lugar antes de que la condensacin visible de la cromatina forme a los cromosomas. Estamos precisamente empezando a encontrar cmo el ADN se duplica, ya que bioqumicos dirigidos por Kornberg han aislado de la clula, enzimas que realmente sintetizarn el ADN (Fig. 12-lA). Lo que la enzima necesita para que tenga lugar la reaccin son los cuatro trifosfatos desoxirribonuclesidos (trifosfatos de desoxiadenosina, de desoxicitidina, de desoxi-guanosina y el de timidina), ms pequeas cantidades de ADN como iniciador. Durante la reaccin, el pirofosfato inorgnico es descompuesto de los trifosfatos, con la formacin concomitante de los enlaces fosfodister entre los nucletidos adyacentes. La sustancia clave parece ser el iniciador. La enzima es especfica para la clase de enlace que se forme entre los nucletidos y tambin es capaz de trabajar solamente con los desoxirribonuclesidos; los ribonucletidos no participan en la reaccin. Sin embargo, la enzima no especificar qu clase de ADN se formar ; sta es la funcin del ADN iniciador. Por ejemplo, sabemos que si el ADN es extrado de varias fuentes y luego hidrolizado en sus componentes desoxirribonucletidos, las cantidades de estos desoxirribonucletidos entre si, son diferentes para cada "especie" de ADN; estas proporciones parecen ser caractersticas del ADN de determinada especie. As, en la sntesis enzimtica del ADN, la clase que de ste se forma, depende de la clase de ADN que se aade como

iniciador; es decir, las proporciones entre los diversos nucletidos en el ADN sintetizado son las mismas que aqullas del ADN iniciador. n dFFFT n dFFFG n dFFFA n dFFFC

ADN

polimerasa del ADN

[-dFT-dFG-dFA-dFC-]n + 4(n)FF A

n dFFFU n dFFFG n dFFFA n dFFFC

ADN

polimerasa del ARN

[- FU-FG-FA-FC]n

4(n)FF

Fig. 12-1. A: Ecuacin para la sntesis del ADN. (Segn Kornberg.) B: Ecuacin para la sntesis del ARN segn el modelo del ADN. (Segn Weiss y Hurwitz)

Adems, pensamos que un rasgo caracterstico de cada "especie" de ADN individual es que sus nucletidos componentes estn dispuestos linealmente en cierto orden a lo largo de la cadena del ADN. Y existe alguna razn para creer que el ADN que se forma durante la reaccin enzimtica tiene el mismo arreglo de nucletidos a lo largo de su longitud como el que tiene el ADN que sinti de iniciador. En otras palabras, parece que el ADN iniciador, es realmente una especie de molde sobre el cual se asientan los desoxirribonucletidos individuales, y todo lo que hace la enzima es llegar y formar el enlace fosfodister y cerrar la molcula. La naturaleza de la estructura macromolecular del ADN hace a todos estos hechos extremadamente complicados. Como se discuti en el Cap. 7, el ADN nativo existe en una estructura de doble cordn, cada uno arrollado al otro en una configuracin helicoidal. Estas espirales se conservan unidas por medio de enlaces de hidrgeno entre los nucletidos, de tal manera que el cido desoxiguanlico de una cadena est unido por medio de un hidrgeno al cido desoxicitidlico de la otra y el cido desoxiadenilico de una al cido timidilico de la otra. Por lo tanto, parecera que en una reaccin enzimtica, en la cual el ADN de dos cordones fue aadido como iniciador y cada cordn se duplic de tal manera que, donde el ADN iniciador tenia cido desoxicitidlico, el ADN sintetizado contena cido desoxiguanlico en la posicin opuesta. De manera que el ADN sintetizado era tambin de doble cordn; cada cordn del ADN fue copiado en una especie de espejo, resultando dos cordones cuya composicin de nucletidos combinados y cuyo arreglo de nucletidos individuales fueron los mismos que los del ADN iniciador de doble cordn. Se ha pensado que el ADN en el material cromtico del ncleo, se encuentra en la misma configuracin de doble espiral, y que la duplicacin del ADN en el ncleo tiene lugar

casi de la misma manera como se verifica en el tubo de ensayo. Sin embargo, la duplicacin del ADN no es un requisito para la divisin de la clula ya que, en ciertos casos, la duplicacin tiene lugar sin que ocurra la divisin celular. Pero lo inverso no es verdad; la divisin de la clula no se efecta si no hay una previa duplicacin del contenido de ADN.

Duplicacin de los cromosomas

El siguiente acto general en la divisin de la clula es la etapa de profase; esta etapa marca el camino conveniente para reconocer a las clulas que estn efectuando la divisin. En esta etapa, por primera vez, se puede observar la condensacin de la cromatina en los filamentos enrollados en forma de espiral, los cromosomas. Se est generalmente de acuerdo en que los cromosomas, que se pueden observar en un microscopio de luz, son en si mismos, por lo menos una estructura duplicada en el sentido de que contienen dos, o quizs ms, cordones equivalentes, llamadas cromtidas. Estas cromtidas son las estructuras que se separarn una de la otra en una etapa posterior. Es una de estas cromtidas el nuevo ADN que fue sintetizado a partir del viejo ADN tomado como patrn? Parece que en algunos casos cada una de estas cromtidas es, en si misma, un dplice, habindose formado de "mitades de cromtidas", y que cada una de estas mitades son replicadas, de manera que en cierto momento, una espira de la cromtida contiene un cordn nuevo de ADN y uno viejo de ADN. El siguiente experimento realizado primeramente por Taylor (Fig. 12-2), nos permite observar lo que puede suceder en la clula. A clulas que se estaban dividiendo activamente, se les proporcion timidina radiactiva marcada con trtio y despus se las fij para su examen microscpico. En las clulas que tomaron la timidina -las que estaban produciendo una nueva generacin de cromosomas antes de la divisin- se encontraron que todos los cromosomas estaban marcados, y la radiactividad estaba igualmente distribuida entre las dos cromtidas de cada cromosoma. Despus las clulas fueron colocadas en un medio con timidina no radiactiva y se permiti que tuviera lugar una segunda generacin de duplicacin de los cromosomas. Taylor encontr, por medio de la radioautografa, que un cromosoma estaba marcado y el otro no. La forma ms sencilla para explicar esto, particularmente a la luz del conocimiento bioqumico actual de la duplicacin del ADN, se ilustra en el diagrama de la Fig. 12-2. Un cromosoma consiste de dos partes o cordones, cada uno de los cuales acta como un patrn o modelo para la produccin de otra parte. En un medio radiactivo, cada uno de los cromosomas, despus de partirse en dos, acta como un molde para la produccin de un compaero radiactivo. Por consiguiente, todos los nuevos cromosomas estn marcados. Sin embargo, cuando estos cromosomas marcados se duplican en un medio no radiactivo, los cromosomas se separarn para originar un compaero radiactivo y otro no radiactivo. Cada uno de stos luego acta como un patrn para la formacin de una nueva cromtida, produciendo una mitad de cromosomas marcados y otra mitad que no lo est .

Esto parece bastante claro; pero cuando penetramos dentro de las pequeas dimensiones, encontramos las dificultades.

Fig. 12-2. Diagrama de los resultados de los estudios radioautogrficos efectuados sobre la duplicacin de los cromosomas. (Segn H. Taylor)

No tenemos an idea de la organizacin molecular de la cromtida, o cuntos cordones de ADN contiene, o cmo est colocado este ADN dentro de la cromtida.

Parece, sin embargo, que la configuracin de doble hlice de las molculas de ADN individuales, se refleja en el enrollamiento de los cromosomas miles de veces ms grandes. As, en tanto que a un nivel bioqumico podemos reconocer que son molculas de ADN individuales las que se pueden duplicar, en un nivel morfolgico no estamos seguros cul estructura correspondiente se pueda duplicar, si el cromosoma completo, una cromtida, la mitad de una cromtida, o aun una subdivisin ms fina del complejo visible. Este tipo de experimento se puede hacer de otra forma como lo demostraron Meselson y Stahl, empleando clulas de la bacteria Escherichia coli; se evitan las complicaciones de la estructura cromosomal, ya que las bacterias carecen de cromosomas visibles. Las clulas de E. Coli pueden desarrollarse en un medio que contenga nitrgeno "pesado" (N15); de esta manera todo el ADN de las clulas en multiplicacin se marca con N15. Si el cultivo en crecimiento se desva entonces a un medio normal de N14, el ADN producido ahora, contendr N14 en sus bases. El ADN de todas estas clulas se puede entonces extraer y con una centrifugacin por largo tiempo, en un sistema de gradiente de densidad que contenga cloruro de cesio, se puede separar el ADN-N15 del ADN-N14. Durante la centrifugacin, las molculas de cloruro de cesio ms pesadas, comienzan a sedimentarse a travs de la solucin acuosa, estableciendo el gradiente de densidad. Las molculas del ADN-N15 mucho ms pesadas que las molculas del ADN-N14, se separarn en tal sistema. Si esta separacin se hace en tiempos diferentes durante el experimento bosquejado anteriormente, se obtendrn los siguientes resultados. Al principio, solamente es visible una banda de ADN, que es la del ADN-N15. Despus de una duplicacin del nmero de clulas, en presencia de timidina N14, se encuentra otra vez solamente una banda, aunque en una nueva posicin intermedia entre las posiciones que el ADNN15 y el ADN-N14 haban ocupado. Despus de una segunda duplicacin se forman dos bandas de ADN, una en la misma posicin que la banda intermedia anterior y la otra donde haba aparecido la del ADN-N14. La banda intermedia puede entonces ser aislada y separada, esencialmente de la misma manera, en dos bandas, una constituida por ADN-N15 y la otra por ADN-N14. La explicacin de estos resultados parece obvia. La banda intermedia se produce debido a que el ADN-N15 sintetizado en un medio de N15 sirvi luego como patrn para la sntesis de una nueva molcula de ADN-N14. En la segunda divisin, tanto las cadenas del ADN-N15 como las del ADN-N14 sirvieron de patrn para la sntesis de nuevas molculas de ADN. El ADNN15 se une a un ADN14 para formar otra banda intermedia, en tanto que el ADN-N14 sirve como patrn para dar otro ADN-N14, con el fin de formar una nueva banda de ADN14. As parece, por lo menos en las bacterias y, probablemente en todas las clulas, en que cada cadena de ADN pueda servir como patrn o iniciador, para la sntesis de otra cadena de ADN. En el nivel bioqumico, parece que hemos descubierto el mecanismo de la exacta duplicacin de una molcula existente de ADN para formar una nueva molcula de ADN destinada a la nueva clula hija. En el nivel morfolgico, el mecanismo es un tanto oscuro, pero el resultado final es el mismo: la formacin de un nuevo cromosoma que es parecido al de la clula madre. Se cree que la inexactitud de la duplicacin da por resultado lo que observamos como una mutacin; la nueva cadena de ADN no es exactamente la misma que la

vieja. Pero, qu presagia exactamente esta duplicacin de una estructura dentro del ncleo con respecto al metabolismo del citoplasma? Hemos dicho que tanto las caractersticas nucleares como citoplasmticas de una clula estn determinadas por el material gentico del ncleo, los cromosomas. En otras palabras, la sntesis de la protena celular especifica, de las enzimas y de las estructuras celulares estn determinadas por la informacin en los genes. La pregunta es: Cmo son transmitidas las instrucciones en los cromosomas al mecanismo receptor que sintetiza las protenas en el citoplasma? El ncleo mismo tiene, por supuesto, algunos de los mismos tipos de reacciones que el citoplasma. Puede, aparentemente, hacer su propia energa bajo la forma de TFA, puesto que contiene muchas de las enzimas glicolticas descritas en el Cap. 14. Puede sintetizar varias molculas pequeas y posee diversas enzimas para verificar trabajos cuya aplicacin al metabolismo general de la clula no est an claro. El ncleo tiene, por lo tanto, su propio complemento de enzimas; en algunos casos, se han encontrado los mismos tipos que en el citoplasma; en otros casos, son diferentes; pero, no obstante, estas enzimas deben estar presentes en el ncleo de la clula hija. El ADN de los cromosomas, sin duda tiene la especificacin para la sntesis de estas enzimas. Pero la mayor parte del material enzimtico y mucha de la maquinaria sintetizadora celular, se encuentra en el citoplasma, y la informacin para la duplicacin de este material se halla tambin en los cromosomas.

PAPEL DEL ARN

La forma por medio de la cual tiene lugar la transferencia de informacin entre el ADN del ncleo y la maquinaria sintetizadora del mismo y del citoplasma, est ligada con el metabolismo de otro cido nucleico, el cido ribonucleico (ARN). En las clulas de los tejidos de los mamferos, aproximadamente el 10% del ARN de la clula, se encuentra en el ncleo. De ste cerca del 20% se halla en el material denso nucleolar (el nuclolo no posee ADN, aunque tiene algo de material ADN concentrado en sus bordes). El resto del ARN est en el nucleoplasma, parte de l ntimamente unido con el material de la cromatna, y el restante, posiblemente en forma de pequeas partculas, los ribosomas, que tambin se encuentran en el citoplasma (vase el Cap. 13). Se saba, desde hace algunos aos, que el ARN nuclear, tomado en conjunto, tiene un elevado ciclo. Lo que esto significa, puede ilustrarse por medio de los siguientes tipos de experimentos. Los fosfatos inorgnicos radiactivos pueden ser inyectados a un animal y luego extraer el hgado y fraccionarlo en sus diversas entidades morfolgicas, tales como el ncleo, los mitocondrios, los microsomas (vase Cap. 13), y el jugo celular. En seguida se extrae el ARN de todas estas fracciones y se ensaya su radiactividad. invariablemente se ha encontrado que el ARN nuclear total es el ms radiactivo cuando se prueba a intervalos, inmediatamente despus de la inyeccin. En efecto, en la mayora de los casos, el ARN del nuclolo es el ms radiactivo, como lo indican los experimentos radiautogrficos. En algunos casos, en periodos ms largos despus de las inyecciones, se ha encontrado que la radiactividad del ARN nuclear total ha disminuido, en tanto que ha aumentado la del ARN citoplasmtico. La misma clase

de experimento se ha efectuado con la tcnica de la radiautografa, empleando especmenes favorables como las clulas grandes del oocito; es fcil determinar en estas clulas si los granos de plata quedan sobre el ncleo o en las reas citoplasmticas. En estos casos, se ha encontrado, tambin, que el ARN nuclear se conviene en radiactivo ms rpidamente que el ARN citoplasmtico. Los resultados de estas dos clases de experimentos conducen a la hiptesis de que el ARN es sintetizado en el ncleo, y que estas molculas de ARN completas se dirigen entonces hacia el interior del citoplasma, no hay duda de que algo como esto sucede, pero an permanece la pregunta de si todo el ARN de la clula es sintetizado en el ncleo o si existan dos sitios independientes para la sntesis del ARN celular, estando el otro en el citoplasma. Ciertos experimentos han sugerido la ltima posibilidad. Por ejemplo, empleando tipos favorables de clulas en las cuales se puedan verificar tales microoperaciones, ha sido posible extraer el ncleo de la clula y an conservar un poco de clula viva, al menos por un corto tiempo. En la mayora de los casos, se ha encontrado que no existe un aumento neto en el ARN citoplasmtico despus de extraer el ncleo, en tanto que en algunos casos, parece ser que la sntesis del ARN citoplasmtico prosigue, aun en ausencia del ncleo. Sin embargo, como veremos en el prximo captulo, existen diferentes clase de molcula, de ARN, verificando diversas funciones, y la pregunta de si el ncleo sintetiza todo el ARN de la clula no podr ser contestada completamente hasta que no se desarrollen tcnicas ms finas para poder trabajar con fracciones de ARN separadas. Todava ms parece ser, que dentro del ncleo existen diferentes clases de molculas de ARN, as como tambin en el nuclolo y en los ribosomas nucleares.

El ARN "Mensajero" o "Informativo"

Como se discutir en el Cap. 13, se sabe que el ARN est ntimamente conectado con la sntesis de las protenas; ste parece ser el nico papel de las molculas del ARN en la clula. La mayor parte de esta sntesis de protenas se efecta en el citoplasma. De otras fuentes de informacin, implicando a los virus que contienen ARN y no ADN, est claro que el material gentico en estos virus es el ARN. En estos casos, el ARN de estos virus en particular, efecta la misma funcin que hace el ADN en la mayor parte de otros organismos y clulas; es decir, contiene la informacin para la sntesis de nueva protena vrica. De esta manera, no solamente el ARN es muy similar en estructura al ADN, sino que, en determinados casos, verifica la misma funcin. De estas fuentes de evidencia se ha postulado que el intermediario entre la informacin del ADN en el ncleo y la sntesis de la protena en el citoplasma es el ARN que es sintetizado en el ncleo. Realmente no haba habido una prueba definitiva de esto, sino hasta muy recientemente, Como fue demostrado primeramente por Astrachan y Volkin, cuando un bacterifago que contenga ADN como material gentico, infecta a una bacterial las clulas infectadas sintetizan una nueva clase de molcula de ARN. Este ARN parece tener las caractersticas del ADN fago en el sentido de que las proporciones de bases del nuevo ARN sintetizado, son como un espejo de las

proporciones de bases del ADN. En otras palabras, parece haber informacin en el ADN para la sntesis de las molculas de ARN semejantes a ADN. Fue descubierto tambin por Weiss y Hurwitz, que podan hacerse extractos de bacterias, o de ncleos de clulas de mamferos, que contienen una enzima que formar ARN, ms an, la sntesis de este ARN dependa de la presencia del ADN (Fig. 12-1B). La reaccin enzimtica utiliza los trifosfatos de nucletidos, TFA, TFC, TFG y TFU; el pirofosfato inorgnico es desdoblado por cada uno de stos, concomitantemente con la formacin del enlace fosfodister para unir a los monofosfatos de nuclesidos resultantes con el fin de formar la cadena del ARN. La enzima es especifica para los trifosfatos del ribonuclesido; no siendo convenientes los trifosfatos del desoxirribonuclesido, ms todava, como en el caso de la sntesis del ADN, la naturaleza del producto formado de ARN, depende del ADN que se aade. Se encontr que las proporciones de bases del ARN sintetizado (las proporciones relativas de los nucletidos entre si) eran las mismas que las proporciones de bases del ADN aadido, como en el caso de la bacteria infectada de fago. Cuando se aade un ADN diferente, que tenga distintas proporciones de sus nucletidos, el ARN sintetizado resultante, contiene esta proporcin de bases. Por consiguiente, la enzima fabric una molcula de ARN que es una imagen de la molcula del ADN. Se puede representar que si se aade un ADN de doble cordn, cada cordn actuar como un patrn para la sntesis de una molcula de ARN. Cuando hay cido desoxiguanlico en el ADN, habr cido citidlico en el ARN; cuando se encuentre cido tiroidlico en uno, habr cido adenlico en el otro. De esta manera, las dos cadenas de ARN tomadas juntas, tendrn idntica composicin de bases que las dos cadenas de ADN tomadas tambin juntas. Este hallazgo concretamente se ajustara a un esquema, el cual representara la transferencia de informacin del ADN al nuevo ARN sintetizado y de ste, al mecanismo que sintetiza a la protena, tanto en el ncleo como en el citoplasma, particularmente en este ltimo. De las evidencias tanto histoqumicas como radiautogrficas est claro que la duplicacin del ADN y la sntesis del ARN en el ncleo, tiene lugar en momentos diferentes durante el ciclo de la divisin nuclear. En un momento, el ADN acta como un patrn para la sntesis enzimtica de una molcula duplicada de ADN; en otro instante, acta como un patrn para la sntesis enzimtica de una molcula de ARN similar a ella. Los medios para la regulacin de esta doble funcin del ADN, no se conocen, pero se cree que estn ntimamente ligados con la estructura macromolecular del ADN y, posiblemente, con la presencia de la histona que est en combinacin con l. Funciona la polimerasa del ARN sobre el intermediario del ADN en la clula, como lo hace en el tubo de ensayo? En los dos ltimos aos muchos laboratorios, principalmente los de Roberts, Spielgeman y Gres, han estado observando el comportamiento in vivo del ARN que es probablemente sintetizado por esta enzima en la clula. Se le ha denominado ARN "mensajero" o "informativo", un nombre acuado para destacar la idea de que puede cumplir la funcin de transportar un mensaje del ADN nuclear a los ribosomas citoplasmticos sintetizadores de protenas (vase Cap. 13); as como tambin, de la especificidad de las protenas que fabricarn estos ribosomas.

2 minutos de incubacin

10 minutos de incubacin

Gradiente de densidad (sacarosa)

Gradiente de densidad (sacarosa)

Fig. 12-3. A: Sntesis del ARN "mensajero"(ARN-P32). B: Adhesin subsecuente a los ribosomas. (Datos tomados de McCarthy, Britton y Roberts )

Cuando a un cultivo bacteriano se le da un solo toque de un precursor del ARN, marcado con P32 o C14, por un corto tiempo, se puede fcilmente observar la existencia de una fraccin de ARN con un alto poder trasformativo. El sistema preferido para la separacin de las macromolculas es el de un gradiente de densidad, empleando ya sea sacarosa o cloruro de cesio, mencionados anteriormente. El ARN ribosomtico ya sea en forma de ribosomas intactos o de ARN extractado, se separa fcilmente del ARN no ribosomtico en tal sistema. Ambos tipos de ARN se pueden reconocer por su caracterstico espectro de absorcin en el ultravioleta, con un mximo en 260 nm. la Fig. 12-3 muestra esta separacin. Los ribosomas, bajo las condiciones particulares de este experimento, se separaron en dos fracciones, denominadas partculas 30 S y 50 S (S = unidades Svedgerg, una medida en especial de tamao). Lo que est claro es que el ARN marcado rpidamente, en este caso P32, no parece ser ARN ribosomtico. Pero despus de 10 minutos de incubacin de las clulas en P32, la mayor parte del ARN marcado, se dirige hacia la regin ribosomtica. La interpretacin primeramente preferida y an sostenida por muchos investigadores en este campo de la ciencia, fue que el ARN marcado rpidamente, era todo ARN "mensajero"; despus de que es sintetizado, se dirige hacia el interior de los ribosomas, y ah, adherido, acta como un modelo especfico para la sntesis de la protena. En lugar de la clula normal, se puede utilizar la clula infectada con fago, como lo hicieron Astrachan y Volkin; el resultado es la misma clase de esquema que se ilustra en la Fig. 12-3. Ms an, como se mencion anteriormente, este nuevo ARN sintetizado, pareci tener la misma proporcin de bases que el ADN del fago; varia marcadamente en este respecto del

ARN ribosomtico en conjunto. En otras palabras, este nuevo ARN sintetizado cumple uno de los requisitos para calificarlo de "mensajero". Sin embargo, el criterio de muchos investigadores de hoy en da quizs no del maana- es que el nuevo ARN sintetizado es, en parte, del tipo "mensajero" y, en parte, precursor del ARN ribosomtico, que la diferencia entre estos dos tipos de ARN, no es simplemente que uno contenga un mensaje clave del ADN y que el otro acte como un componente estructural de los ribosomas. no sabemos qu relaciones hay entre estos dos; quizs lo que estamos presenciando sea una imagen, pero en una escala increblemente pequea, de una especie de mquina registradora, con estas dos clases de macromolculas de ARN actuando como cintas. Sin embargo, al mismo tiempo, los investigadores estn firmemente convencidos de la nocin de que tal "mensajero" existe. Otra de las propiedades de este mensajero propuesto -aparte de su rpida formacin dentro de la clula en ciertas circunstancias, de tener la misma composicin de bases que el ADN, y de contener enzimas que pueden hacer una molcula ARN tomando como modelo a una ADN- es que este ARN mensajero tiene arreglos de bases a lo largo de su longitud, que forman una cadena complementaria a la del ADN (vase la Fig. 7-8). Si esto es as, se puede esperar que los enlaces de hidrgeno se forman entre estas dos cadenas complementarias, de la misma manera como interactuan las dos cadenas en la sntesis del ADN para formar la doble espiral unida ntimamente. Spielgeman y Hall han demostrado recientemente que esto tiene lugar. Ellos emplearon una tcnica diseada por Doty y Marrnur, que verificaba la unin de los enlaces de hidrgeno, de una cadena de un polinucletido con otra, calentando una solucin, aproximadamente a 40 C, que contuviera estas macromolculas y luego enfriando lentamente la solucin. Doty y Marmur encontraron que, durante el enfriamiento, los cordones individuales del ADN comenzaban a atraerse entre si para formar la doble espiral; sin embargo, esto suceda, solamente si existan grandes trechos a lo largo de estas cadenas, en donde las bases de la una se complementaban con las bases de la otra -el requisito principal para la formacin de los enlaces de hidrgeno entre ellas. Este experimento puede verificarse asimismo, con una mezcla de macromolculas de ADN y de ARN. Si bacterias E. Coli se infectan con fago en un medio que contenga timidina marcada con trtio, que es un precursor del ADN, se puede obtener el ADN del fago marcado con trtio (H ). Si se incluye tambin en el medio P32, se puede obtener un ARN "mensajero" altamente marcado. El ADN marcado con H y el ARN marcado con P32 se pueden aislar y luego separar uno del otro por medio de un gradiente de cloruro de cesio como se muestra en la Fig. 12-4 A. Sin embargo, si a la solucin que contenga el ADN y al ARN marcados, se le da el tratamiento Doty, y se centrifugan stos, junto con el gradiente, se obtiene un resultado diferente como se muestra en la Fig. l2-4B. Un poco del nuevo ARN marcado, caracterizado por su marca P32, se dirige hacia el interior de la regin del ADN marcado con H . Se forma, por lo tanto, un complejo que se comporta como una unidad sedimentadora individual en el sistema del gradiente de densidad. Esta formacin del complejo es especifica; si otro ADN -procedente de otra bacteria, del mismo E. Coli, o de otro fago se trata bajo las mismas condiciones de experimentacin con ARN marcado con P32, el resultado es el que se muestra en la Fig. 12-4A y no el de la Fig. 12-4B.
3 3 3

desoxicitidlico

-------

timidlico

---- desexiguanlico ----

desoxiadenlico

ADN

guanilico

adenlico ----

citidlico ----

uradlico

ARN

control sin calientamiento

calentando a 40 C, despus enfriado lentamente

gradiente de densidad (CsCl2)

gradiente de densidad (CsCl2)

Fig. 12-4. Formacin de las espirales complementarlas entre el ADN y el ARN "mensajero" ( ARN-P32 ). ( Datos de Hall y Spiegelman )

A la luz de todo lo que se ha dicho acerca de las estructuras del ADN y del ARN, la nica interpretacin que se puede hacer al presente, del porqu se obtiene un ADNARN hbrido en el experimento anterior, es que a lo largo de una porcin grande de las cadenas del ADN y del ARN, debe haber regiones donde las bases estn colocadas en tal secuencia, que las bases del ADN se complementen con las del ARN. En otras palabras, se ha sintetizado una verdadera copia complementaria del ARN en la clula de E. Coli infectada con fago, que refleja, como en un espejo, una gran parte del ADN. Finalmente, en el laboratorio de Spiegelman se ha demostrado, con tcnicas similares que se puede extraer el complejo del ADN y del ARN de la clula infectada con fago, conteniendo este complejo el ARN marcado y, por lo tanto, el ARN "mensajero" que se ha supuesto. Con el fin de formar el complejo, el ADN tiene que ser de un solo cordn, puesto que intervendr slo el ADN desnaturalizado (de un solo cordn) y no el ADN nativo (de doble cordn). Sospechamos como resultado de otras evidencias, que solamente el ADN de un solo cordn acta como un patrn para el ARN "mensajero". De esta manera est claro que el ADN de doble cordn, se debe desarrollar antes de que tenga lugar la sntesis de este ARN. Sin embargo, no est claro si uno o ambos cordones actan en la sntesis del ARN. Algunos resultados experimentales apoyan esto ltimo. Tampoco est claro si toda la secuencia del nucletido en el ADN acta

como un modelo para la sntesis del ARN "mensajero". Se cree actualmente, que toda la sntesis del ARN verificada en la clula, ya sea un ARN informativo como el anterior, un ARN ribosomtico, o un ARN transporte, se efecta mediante el ADN (vase el Cap. 13). no estamos seguros, por lo tanto, de que todas las secuencias de los nucletidos a lo largo de la cadena del ADN estn implicadas en actuar como modelo para la sntesis del ARN informativo. De nuevo no se sabe si la sntesis del ARN "mensajero" tiene lugar en el ncleo, ya sea en los limites del nucleolo, donde existe material de cromatina o en el material de cromatina del resto del nucleoplasma. En el siguiente captulo se tratar de cmo el ARN acta en la sntesis de las protenas. Resumiendo, la principal funcin bioqumica del ncleo es doble. Acta como un depsito de la clula para la informacin gentica, la que, en la divisin de la clula se duplica exactamente para las clulas hijas. Tambin se comporta como un depsito para la informacin que, durante toda la vida de la clula, est dando cuenta de los mecanismos enzimticos del citoplasma exactamente cules y cuntas enzimas protenicas de la clula deben sintetizarse. Todo el metabolismo del ncleo parece estar encauzado a estas funciones, no sabemos dnde tienen lugar. Tampoco estamos seguros del "significado" biolgico del nuclelo, del aparato de cromatina nucleolar. Todo lo que podemos conjeturar es que, a tono con la exactitud rgida de la duplicacin del ADN y la sntesis del ARN, debe haber una armazn estructural igualmente exacta sobre la cual deben apoyarse los mecanismos bioqumicos.

LISTA DE LECTURAS QUE SE SUGIEREN ALLFREY, V., "Isolation of subcellular components." In Brachet, J., and Mirsky, A. E. The cell, newYork: Academic Press. Vol. 1, p. 193. BRIGS, R., and KING, T. J., "Nucleocytoplasmic interactions in eggs andembryos." In. Brachet, J., and Mirsky, A. E. (eds.), 1960. The cell, newYork: Academic Press. Vol. 1, p. 537. HOROWITZ, N. H., "The gene," Scientific American, October 1956. HURWITZ, J., and FURTH, J. J., "Messenger RNA," Scientific American,February 1962. KORNBERG, A., 1962. Enzymatic synthesis of DNA. new York: Wiley. MCELROY, W. D., and GLASS, B. (eds.), 1957. Chemical basis of heredity. Baltimore: Johns Hopkins Press. MAZIA, D., "How cells divide," Scientific American, September 1961., ----- "Mitosis and the physiology of cell division.' In Brachet, J., and Mirsky, A. E. (eds.), 1961. The cell. New York: Academic Press. Vol. 3,p. 77. MIRSKY, A. E., and OSAWA, S., "The interphase nucleus." In Mirsky, A. E.,and Brachet, J. (eds.), 1961. The cell. New York: Academic Press.Vol. 2, p. 677.

PRESCOTT, D. M., "Nuclear function and nuclear-cytoplasmic interaction", Annual Review of Physiology, Vol. 22 (1960), p. 17. STERN, H., "Function and reproduction of chromosomcs," Physiological Reviews, Vol. 42, no. 2 (April 1962). SWANN, M. M., "Control of cell division," Cancer Research, Vol. 17 (1957), p. 727. TAYLOR, J. H., "The duplication of chromosomes," Scientific American, June 1958.

CAPITULO TRECE

EL RISOMA Y EL USO DE LA INFORMACION

Aproximadamente hace 15 aos, los bioqumicos comenzaron a utilizar los aminocidos radiactivos en el estudio de los procesos implicados en la sntesis de la protena. Hasta entonces se crea que muy poca protena se sintetizaba y se desdoblaba En las clulas de un organismo adulto, incapaz de crecer ms. Se supona que, una vez que eran formadas las protenas celulares, ellas duraban por todo el resto de la vida de la clula. Hay, sin embargo, una excrecin constante de amonaco y de urea en la orina, y puesto que estos compuestos que contienen nitrgeno solamente pueden provenir del catabolismo de las protenas, se supone que esta excrecin continua representa la porcin pequea de las clulas que se est descomponiendo, siendo sus proteinas hidrolizadas y los aminocidos resultantes desaminados para formar la urea y el amoniaco. Esta hiptesis de la estabilidad metablica relativa de las protenas fue conocida como la teora del "desgaste natural"; es decir, las nicas protenas que se metabolizaban eran aquellas resultantes de la descomposicin de las clulas muertas o a punto de estarlo. Fue as una sorpresa encontrar que si se inyectan suficientes aminocidos radiactivos a un animal y luego se aislan las protenas de los diferentes tejidos, se encuentra que estas protenas son radioactivas. Los aminocidos radiactivos haban llegado a incorporarse a las molculas de las protenas de la clula, demostrando que hay una sntesis de protenas en las clulas del organismo adulto. Este hallazgo concuerda con el concepto del "estado dinmico de los componentes del cuerpo", introducido por el bioqumico Schoenheimer, para explicar los primeros descubrimientos sobre el metabolismo de las grasas. De acuerdo con este punto de vista, todos los grandes compuestos de las clulas no solamente las protenas, sino tambin los carbohidratos, las grasas y los cidos nucleicos estn siendo constantemente desdoblados y resintetizados en las clulas de un organismo que no est en crecimiento. El actual punto de vista est entre estos dos extremos: ciertamente existen algunas sintesis de proteinas que se verifican en todas las clulas, pero la mayor parte de las sntesis de protenas es con el fin de formar nuevas clulas, o para ser transportadas fuera de ellas. Por ejemplo,

cuando se inyectan aminocidos radiactivos al animal y se aislan las protenas de los diferentes tejidos, se encuentra que los tejidos ms activos en la sntesis de protenas son aquellos cuyas clulas forman protenas para fines de exportacin. Las clulas del hgado fabrican la mayor parte de las protenas de la sangre; las clulas del pncreas forman la mayor parte de las enzimas proteolticas destinadas al intestino; las clulas de la mucosa intestinal forman las enzimas digestivas y algunas hormonas proteicas; algunas glndulas endocrinas producen hormonas proteicas para segregarlas dentro de la sangre. Todos estos tejidos son los que se encontraron que contenan las proteinas ms radioactivas. Por otra parte se encontr que los tejidos como la piel y los msculos, contenan muy poca radiactividad en sus protenas. De hecho, estaba bastante claro que las protenas de los msculos por su cantidad ocupan el segundo lugar en el cuerpo, presentan muy poca descomposicin y sintesis o, como se ha llamado, poco reemplazo proteinico. Sin embargo, existe algn reemplazo, no para segregar ni para formar protenas para clulas hijas, sino simplemente una descomposicin y resntesis de una pequea parte de las protenas propias de la clula. Lo que esto significa no se sabe con exactitud hasta el presente.

Bases citolgicas de la sntesis de la protena

Podemos ir ms adelante y delinear aquellas estructuras celulares que estn funcionando en la sntesis de la protena, de la siguiente manera. El homogeneizado de hgado puede fraccionarse por medio de la centrifugacin diferencial en los componentes morfolgicos de la clula del hgado. De esta manera se obtienen la fraccin nuclear y la total de la clula, as como la fraccin mitocondrial. Despus de que se ha centrifugado el homogeneizado del hgado y separado la porcin de los ncleos pesados y de los mitocondrios, la parte restante se centrfuga a gran velocidad; en esta forma se obtiene otro pequeo grnulo en el fondo del tubo. Este grnulo se denomina "microsoma" o fraccin de partculas pequeas. Cuando este grnulo se analiza morfolgica y qumicamente, se encuentra que contiene la mayor parte del ARN y de los fosfolpidos de la clula y que esta compuesto de fragmentos del reticulo endoplasmtico. Su importancia para la economa de la clula fue comprendida a travs del descubrimiento de que la mayor parte de la sntesis de las protenas de la clula tiene lugar en esta fraccin. Despus de que se inyecta el higado con aminocidos radiactivos, se extirpa y se fracciona en las porciones nuclear y completa de la clula, la mitocondrial, la microsmica y la sobrante. Se obtienen as las protenas de estas diferentes fracciones y se mide su radiactividad. La Fig. 13-1 muestra que la fraccin del microsoma es la que tiene radiactividad especfica ms elevada, es decir, el conteo radiactivo por minuto por miligramo de protena.

Fig. 13-1. Incorpotacin in vivo de aminocidos radiactivos dentro de las protenas de varias fracciones morfolgicas de tejido panacreatico del conejillo de Indias (Datos segn Siekevitz y Palade )

Pero qu es este reticulo endoplsmico? Por aos, los citlogos haban observado en el citoplasma de la mayora de las clulas, una fina red o malla, demasiado difusa y pequea como para ser vista claramente con el microscopio de luz. Cuando comenz a emplearse el microscopio electrnico para especmenes biolgicos, se encontr rpidamente que esa red estaba formada de diversas membranas que encerraban espacios vesiculares, tubulares o planos dentro de la clula, y que estos espacios estaban probablemente interconectados unos con otros. En algunas clulas, como en las secretoras y en las glandulares, existe una inmensa profusin de estos espacios limitados por membranas; en otras clulas, como en las musculares, estos espacios han disminudo en nmero; y an en otras, como en las bacterias, no existen espacios. Adems, en algunos casos, las membranas estn cubiertas con pequeas partculas; en tanto que en otras, estn desnudas. Por lo general, podemos describir la parte extramitocondrial del citoplasma tomando en consideracin estas estructuras, como sigue: (1) clulas con membranas libres de partculas; (2) clulas con membranas, todas las cuales tienen partculas en su superficie; (3) clulas con membranas con o sin partculas; (4) clulas sin membranas, solamente partculas y

(5) en unos cuantos casos, clulas con muy pocas membranas y tambin con muy pocas partculas. En otras palabras, se puede encontrar toda la gama de posibles combinaciones. Realmente "microsoma" no es un trmino muy descriptivo, puesto que solamente da idea de los resultados de un mtodo, el de centrifugar a altas velocidades el residuo de la fraccin mitocondrial. De esta manera, si una clula tiene membranas con partculas en su citoplasma, entonces, la fraccin del microsoma se halla formada de los fragmentos de estas membranas, todava con partculas sobre ellas. Si la clula tiene solamente partculas, entonces las fracciones del microsoma consisten slo de partculas; si nicamente de membranas, entonces la fraccin del microsoma es una fraccin membranosa; y as sucesivamente. Por ejemplo, en las clulas vesiculosas del pncreas, el citoplasma consiste de vesculas rodeadas de membranas y de espacios, la mayora de estas membranas cubiertas de partculas en su superficie, aunque algunas estn desnudas, como se muestra en la Fig. 13-2. La fraccin del microsoma del pncreas est, por lo tanto, compuesta de fragmentos de estas vesculas rodeadas de membrana, algunas con partculas en su superficie. Esto se muestra en la Fig. 13-2. En el hgado, la mitad de estas membranas poseen partculas; de manera que la fraccin del microsoma del hgado es notoriamente heterogneo en su morfologa, consistiendo de membranas, de espacios entre estas membranas y de partculas sobre esas membranas. Tambin lo es qumicamente, ya que la mayora, si no todo el fosfolpido se encuentra en las membranas, mientras que la mayor parte del ARN se halla en las partculas. Es heterogneo bioqumicamente debido a que las membranas tienen varias funciones (vase Cap. 14), mientras que las partculas estn ntimamente implicadas en la sntesis de las protenas. Estas particulas compuestas de ARN y protenas, se han denominado "ribosomas"; su significado para nuestra historia es que parecen ser las estructuras intracelulares que estn involucradas en la sntesis de las protenas celulares. Parece extrao que hace quince aos ningn bioqumico tena una idea correcta del funcionamiento del ARN. Desde hacia mucho tiempo se haba conocido la existencia de estas macromolculas y aun se saba que el ARN estaba presente tanto en el ncleo como en el citoplasma, pero principalmente en el ltimo. Por mucho tiempo se haba observado que ciertas clulas, y solamente determinadas partes de ellas, respondan a la tincin con colorantes basfilos; se deca que estas clulas eran basfilas debido a que contenan grandes cantidades de compuestos cidos macromoleculares que se combinaban con los colorantes bsicos. Ahora sabemos que es el ARN de estas clulas es el que se combina con estos colorantes. Se observ posteriormente que las clulas que eran basfilas eran precisamente las activas en la sntesis de las protenas. Esta observacin hecha por Brachet fue el primer vislumbre de que el ARN estaba implicado en la sntesis de las protenas.

Todava ms, son las partculas de la clula las responsables de la basotia, puesto que es el ARN de los ribosomas, es el que se combina con los colorantes bsicos. Por lo tanto, aquellas clulas basfilas que son muy activas en la sntesis de las protenas, son precisamente las clulas que contienen un gran nmero de partculas, algunas fijas en las membranas y otras flotando libremente en el citoplasma.
Fig. 13-2. El reticulo endoplsmico y los microsomas. A; El reticulo endoplasmtico en la clula acinar pancretica (x 46000)

B: Microsornas aislados de la clula acinar pancretica (x 39000).

C: Ribosomas aislados de las clulas acinares pancreticas (x 52000).

D: Ribosomas aislados de la E. Coli. Las particulas de 70S estn indicadas por medio de flechas y estn formadas por una particula de 50S y una de 30S (x 102000). ER, perfiles del reticulo endoplasmtico; R, ribosornas: PM, membrana del plasma. (A, B, y C, cortesa de G. Palade, Rockefeller lnstitute. D, Cortesa de C. E. Hall y H. S. Slayter, Massachusetts Institute of Technology)

Sntesis de las protenas in vitro

Posteriormente se encontr que esta incorporacin de los aminocidos radiactivos dentro de las proteinas podria tener lugar in vitro dentro del tubo de ensayo. Se puede hacer un homogeneizado de un tejido activo, por ejemplo hgado, y si los factores apropiados se incuban junto con l, los aminocidos radiactivos que se aaden se encuentran incorporados en las protenas del higado. Existe en realidad, un desdoblamiento neto de las proteinas durante la incubacin, pero la presencia de aminocidos radiactivos hace posible descubrir que se verifica la sntesis de una pequea cantidad de protena; es tan pequea que solamente por el mtodo muy sensible de la radiactividad se pudo descubrir en medio de desdoblamientos mucho ms grandes. Se encontr que los agregados ms necesarios eran un substrato oxidable y cofactores para la oxidacin. En otras palabras, las condiciones que se encontraron necesarias para la incorporacin de aminocidos radioactivos dentro de las protenas, fueron precisamente aquellas que se necesitaban para la fosforilacin oxidativa para la sintesis del TFA (vase la Tabla 13-1). Este hallazgo fue importante debido a que, por aos, se haba pensado que el mecanismo para la sntesis de la protena y para su degradacin era el mismo, que la sntesis de ella era justamente lo contrario de su degradacin. La principal razn por la cual se crea que ste era el caso, est relacionada con la necesidad de la clula de sintetizar, no precisamente cualquier protena, sino protenas especficas.

TABLA 13-1
Capacidad de Varias Fracciones Modolgicas Aisladas de Clula de Higado Para Oxidar Substrato, Formar TFA, e Incorporar Aminocidos Radiactivos Dentro de sus Proteinas. (Datos Segn Siekevitz )

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Fraccin Consumo de oxgeno 37,4 8,2 0,4 0,8 14,0 9,7 18,8 9,7 TFA formado de protena 4,0 4,2 0,0 0,0 4,1 4,1 3,8 4,4 Conteos/min/mg

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Homogeneizado Mitocondrios Microsornas Sobrante Mitocondrios ms microsornas Mitocondrios ms sobrante Mitocondrios ms microsornas ms sobrante Mitocondrios ms microsornas hervdos 10,8 1,3 1,1 0,4 10,2 1,5 4,3 1,2

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Tambin sabemos de la existencia de muchas enzimas proteoliticas que son muy especficas en la hidrolizacin de enlaces peptdicos solamente entre ciertos aminocidos. Estas enzimas proteolticas, como todas las enzimas, podran, tericamente, catalizar una reaccin reversible; as, hipotticamente, no slo podran degradar protenas especficas para convertirlas en aminocidos, sino sintetizarlas a partir de ellos. Pero sabemos actualmente que la sntesis de las protenas, no es precisamente lo contrario de su desdoblamiento; que mientras no se requiere energa para hidrolizar una protena, se necesita para construirla. El homogeneizado que ha sido incubado con el substrato, los cofactores y el aminocido radiactivo, puede ser fraccionado despus de varias incubaciones, en sus diferentes fracciones subcelulares. Nuevamente, se encuentra que las protenas de la fraccin del microsoma son las ms radioactivas de todas las fracciones celulares (Fig. 13-3); puesto que el aspecto de este experimento in vitro es el mismo que el del experimento in vivo (Fig. 13-1 ) parece ser verdad que los experimentos in vitro con la fraccin de microsoma son algo semejante a un espejo, de lo que sucede dentro de la clula. Profundizando ms se puede obtener la incorporacin de los aminocidos radiactivos dentro de la protena si existe substrato oxidante mitocondrial en presencia de los factores necesarios de fosforilacin y si se encuentran microsomas que contengan ribosomas, ms algunos otros factores en el sobrante. Esto se muestra en la Tabla 13-1, donde se puede observar que tanto los mitocondrios, que abastecen de energa bajo la forma de TFA, como los

microsomas que proporcionan la maquinaria para sintetizar proteinas, son necesarios para que tenga lugar la incorporacin: no podrian trabajar independientemente. hicieron posteriormente varias modificaciones sobre este sistema bsico.

Fig. 13-3. Incorporacin in vitro de aminocidos radiactivos dentro de las protenas de varias fracciones modolgicas de homogeneizado de hgado de rata. (Datos segn Siekevitz )

En lugar de los mitocondrios, pueden agregarse DFA, fosfoenolpiruvato y la apropiada enzima quinasa purificada, con el fin de hacer el TFA. En lugar de los microsomas completos, se poda usar una preparacin pura de partculas ribosomticas obtenida de la fragmentacin de los mismos. En algunos casos, como en las bacterias o en las clulas reticulocitos, se puede obtener un preparado razonablemente puro de ribosomas, por medio de la homogeneizacin de las clulas y la centrifugacin diferencial de la suspensin. En lugar de obtener radioactividad de aminocidos en una mezcla de protenas degradadas, podemos aislar, como en el caso de la clula reticulocito, solamente una protena, la hemoglobina, ya que estas clulas sintetizan solamente esta protena heme, transportadora de oxgeno. Por lo tanto, como se puede observar en la Tabla 13-2, podemos fabricar protenas a partir de ribosomas aislados, una fuente de energa como el fosfoenolpiruvato y la quinasa pirvica, aminocidos y varios otros cofactores, como los contenidos en la fraccin de "pH 5" en algunos casos, una protena especfica.

Naturaleza de los ribosomas

Debido a la reciente importancia encontrada de los ribosomas, mucho trabajo de investigacin se ha efectuado con ellos ltimamente.
TABLA 13-2. REQUERIMIENTOS DE LOS RIBOSOMAS AISLADOS PARA LA INCORPORACION DE AMINOACIDOS RADIACTIVOS DENTRO DE LA PROTEINA El sistema completo consiste de ribosomas de hgado, TFA, TFG, MgCl2. la fraccin de "pH 5" (que contiene la enzima activadora, la enzima transportadora, probablemente otros factores de protenas y el ARN transmisor) y un sistema generador de TFA (fosfoenolpiruvato, DFA y quinasa pirvica) y leucina radiactiva. (Datos de Kirsch, Siekevitz y Palade ).

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Sistema CPM/mg de proteina Completo 66 Menos fosfoenolpiruvato y la quinasa pirvica 7 Menos TFG 3 Menos TFA 3 Menos la fraccin "pH 5" 6 -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Estas partculas son elementos ubicuos que se encuentran en todas las clulas que sintetizan proteinas, desde las bacterias hasta las clulas de los rganos de los mamferos (vase Fig. 13-2). Como ya se mencion, estn algunas veces ligados a elementos membranosos de la clula y en otros casos, quedan libres en el citoplasma. Su disposicin en la clula parece no influir en su funcin; los ribosomas bacterianos, que existen libres en la clula, fabrican protenas tan bien, o an mejor, que los ribosomas de las clulas de los mamferos. Su tamao es siempre aproximadamente el mismo de 150 a 200 amgstroms de dimetro. Su constitucin es tambin la misma, puesto que contienen de 40% a 60% de ARN, siendo el resto protenas. El ARN es de un peso molecular muy elevado, estimndose ser aproximadamente de 2000000 en varias clases de partculas. No se sabe qu une el ARN a la protena pero se cree que sea por medio de fuerzas electrostticas, formando enlaces salinos entre los grupos fosfato del ARN y los grupos amino de los aminocidos bsicos de la protena, o complejos de magnesio entre la misma clase de grupos, o quizs una combinacin de ambos. El ARN se puede extraer de la protena por medio de agentes que rompan precisamente tales enlaces, como soluciones salinas concentradas, o reactivos complejos de magnesio.

La estructura ribosomtica y su apariencia dependen estrechamente de la presencia y de la cantidad de magnesio. En ausencia de este elemento en el medio, las partculas ms grandes se separan para presentar una nueva familia de partculas ms pequeas, cada una de las cuales tiene la misma proporcin entre ARN y protena que en las partculas originales. Los ribosomas bacterianos probablemente existen en la clula como partculas de 100 S o de 70 S (S = unidad Svedberg), pero se pueden romper para originar partculas ms pequeas de 50 S a 30 S. Los ribosomas de las levaduras y los de las clulas de los mamferos, existen probablemente como partculas de 120 S y de 80 S y se pueden romper en partculas de 60 y de 40 S. No se sabe cmo estas partculas ms pequeas se unen para formar a las ms grandes pero se cree que en ello estn implicados los complejos del Mg+2. No se sabe, definitivamente, cules de estas partculas o subpartculas son las activas en la sntesis de la protena; las investigaciones indican que de alguna manera las ms pequeas se acoplan para formar a las ms grandes y que son estas ltimas las ms activas para sintetizar a las protenas. Hay tambin algunos indicios de que solamente una pequea porcin de estas partculas dentro de la clula, sintetiza protenas en cualquier momento; no se sabe lo que le impide al resto de ellas hacerlo. Las protenas de los ribosomas parecen ser bsicas en su naturaleza, ms o menos de la misma clase que las que unen al ADN en los ncleos de las clulas de los mamferos. Se desconoce la naturaleza del ARN, pero se cree que acta, junto con el ARN "mensajero" que se mencionar posteriormente, como un patrn para la sntesis de las protena especficas. No sabemos dnde es sintetizado, aunque se supone que el lugar est en el ncleo (vase Cap. 12); todo lo que conocemos es que el ARN ribosomtico no presenta ninguna transformacin. En otras palabras, parece que, una vez que se ha formado, es estable y no se desdobla durante toda la vida de la clula. De esta manera, el ARN ribosomtico se comporta como el ADN gentico, en ser estable metablicamente.

Mecanismo de la sntesis de la protena

Cules son los otros factores necesarios para que tenga lugar la sintesis de la protena? Para contestar esta pregunta debemos penetrar con algn detalle, en lo que se sabe acerca del mecanismo de la sntesis de la protena. Hace algunos aos, Lipmann present la idea de que, en la preparacin para su papel en la sntesis de la protena, los diferentes aminocidos deben ser llevados a un estado de "elevada energa". Se formul adems la hiptesis de que esto poda verificarse solamente con la intervencin del TFA. En bsqueda de una reaccin tal, M. Hoagland descubri las enzimas activadoras de aminocidos. El TFA reacciona con un aminocido individual, en presencia de esta enzima, para separar al pirofosfato inorgnico y formar un compuesto aminoaciladenilato (Fig. 13-4). Este compuesto

permanece ntimamente ligado a la enzima. Existen enzimas especficas que catalizan la reaccin para cada aminocido individual. El carcter de elevada energa del compuesto aminoaciladenilato est indicado por la observacin de que al incubar una enzima con el aminocido, el TFA y el pirofosfato inorgnico radiactivo, hay una radiactividad en el TFA que se puede aislar. As, la reaccin es fcilmente reversible mostrando que el contenido de energa del enlace acetilo en el aminoacetiladenilato es aproximadamente la misma que la del enlace del penltimo pirofosfato del TFA. El minocido ha sido "activado". La hiptesis del siguiente paso en la sntesis de protena fue en realidad presentada por Crick antes de que fuera descubierta. El razonamiento era de que si los ribosomas estaban implicados en la sntesis de la protena, por contener ARN informativo o molde, debera haber un transportador del aminocido activado a los ribosomas; este transportador debera obrar de tal manera, como para ser capaz de "reconocer" al ARN de los ribosomas. En ese entonces se postul, que este ARN de los ribosornas tena la informacin para hacer una protena especfica y qu otra molcula excepto otra molcula de ARN, era ms conveniente para desempear este papel? El siguiente paso (Fig.13-4) consiste en el transporte del aminocido, de su enlace acilo en la mitad del adenilato al extremo de cierto tipo de molcula de ARN, la llamada soluble, o ARN transporte. Este paso est catalizado por la misma enzima especfica activadora de aminocidos y en el proceso se libera FAM del aminoaciladenilato. Existen molculas especficas de ARN para cada uno de los aminocidos, tal como hay enzimas activadoras especficas. De manera que podemos decir que, para cada aminocido se encuentra una enzima activadora especfica y una molcula transportadora de ARN tambin especfica. Cada una de estas molculas de ARN transporte es mucho ms pequea que el ARN de los ribosomas, pero an es una molcula relativamente grande, siendo aproximadamente de 23000 su peso molecular, y poseyendo de 70 a 80 nucletidos en su cadena. Los tres ltimos nucletidos (citidlicocitidilicoadenilico) son los mismos en cada uno de los ARN transporte de aminocidos especficos. En el transporte desde el aminoaciladenilato, el aminocido se une en la mitad de la rubosa del cido adenilico terminal, para formar un enlace ster. Otra vez la reaccin parece ser reversible, por lo cual debemos suponer que este enlace ster es de una naturaleza de elevada energa. Este es el nico caso conocido, en donde un enlace ester est en equilibrio con un enlace pirofosfato del TFA; no se sabe al presente, la razn por la cual se verifica esto. Sin embargo, si los tres nucletidos terminales de los diferentes ARN transportes son los mismos, entonces para explicar la especificidad del ARN, debemos suponer que en el resto de la cadena del ARN hay ciertos arreglos de los nucletidos para que se verifique la

especificidad del aminocido. Y por cierto, los experimentos que se han verificado recientemente en el laboratorio de Lipmann, han demostrado exactamente este punto. El experimento nos dice algo. Primero, el ARN transporte de la alanina fue aislado con alanina radiactiva todava unida a l; se le puede designar como (alanil-ARNala -Tr.). Al mismo tiempo, el ARN transporte especifico para Ia cisteina fue aislado an con cisteina radiacva unida a l (cisteinil-ARNcis -Tr. ). El grupo sulfhidrilo de la cistena fue entonces suprimido qumicamente, convirtindolo en alanina, sin efecto aparente sobre la estructura del ARN transporte. El resultado fue un residuo de alanina unido al ARN transporte especifico de la cisteina, es decir, alanilARNcis -Tr. Este fue entonces aadido a un sistema que incorpora aminocidos in vitro. Como cofactor, se aadi un polinucletido, un cido poliuridlicoguanlico, que provoca la incorporacin de la cisteina y varios otros aminocidos en la protena, pero no de la alanina. Se encontr que, en presencia de este cofactor, la alanina del alanil-ARNcis -Tr, era incorporada a la protena, pero la alanina del alanil-ARNala -Tr, no lo era. Este resultado indica claramente que la especificidad del aminocido para su incorporacin dentro de la protena reside no en el aminocido unido al ARN sino en alguna porcin especfica de cada molcula

individual del ARN transporte. De esta manera, el ARN transporte acta, no solamente como un portador, sino como un portador especifico "segurisimo". El siguiente paso o pasos en la sntesis de la protena (Fig. 13-4) son los ms desconcertantes. Podemos efectuar experimentos in vitro en tubos de ensayo en los cuales el aminocido radiactivo se encuentra unido a su ARN transporte especfico; si se aaden ribosomas y ciertos factores, el resultado es una protena radioactiva ligada a la superficie de los ribosomas. Necesitamos como cofactores a otro compuesto de elevada energa, el TFG, y dos protenas solubles. Una de las ltimas probablemente es la enzima formadora de enlaces peptdicos; lo que es la otra y lo que hace el TFG, es un misterio. Adems, parece haber un paso preciso para sacar la proteina terminada de los ribosomas y llevarla al medio, o quizs dentro de la parte soluble de la matriz celular; de nuevo se desconoce la naturaleza exacta de este paso. Segn las investigaciones de Dintzis y Schweet, sabemos que en el sistema de ribosomas del reticulocito que sintetiza a la hemoglobina y probablemente en la sntesis de todas las protenas la cadena proteica de la molcula de la hemoglobina es sintetizada en una forma lineal, partiendo del grupo amino no libre del extremo de la molcula; la reaccin probablemente se efecta como sigue: R2 O R1 O I II I II 1 1. NH2 -- CH -- C -- O -- transporte ARN + NH2 -- CH -- C -- transporte ARN2 R2 O R1 O I II I II NH2 -- HC -- C -- NH -- CH -- C -- transporte ARN2 + transporte ARN1 R1 O R2 O I II I II 2. NH2 -- CH -- C -- NH -- CH -- C -- transporte ARN2 R3 O I II NH2 -- CH -- C -- transporte ARN3

R1 O R2 O R3 O I II I II I II NH2 -- CH -- C -- NH -- HC -- C -- NH -- CH -- C -- transporte ARN3 + transporte ARN2 3. n veces

Es interesante que estos resultados sobre la linealidad de la sntesis de la protena estn de acuerdo con los resultados del trabajo sobre el cdigo gentico. Desearamos conocer ms acerca de esta reaccin, incluyendo lo que se refiere al destino de las molculas del ARN transporte, as como tambin a las fuerzas que sostienen a los primeros aminocidos dentro del patrn y tambin por qu el grupo amino es el grupo reactivo en la formacin del enlace peptdico, puesto que el aminocido est "activado" en su carboxilo terminal. El ltimo aspecto del mecanismo de la reaccin es similar a la que tiene lugar en la activacin del cido graso en la sntesis de cidos grasos de cadena larga, porque aqu tambin el carboxilo terminal est activado, pero la reaccin se verifica en el otro extremo de la molcula, el metileno.

Sntesis de la protena especfica

La estabilidad del ARN ribosomtico, desde el punto de vista gentico, muestra una nueva paradoja. Si el ADN es la clave gentica en el ncleo y los ribosomas constituyen la maquinaria sintetizadora de protenas en el citoplasma, entonces debe ser el ARN ribosomtico el que posea la informacin gentica provertiente del ADN que traduzca la copia en algo ms concreto. El hallazgo de las enzimas que sintetizan el ARN en presencia del ADN y cuyo ARN tiene las mismas proporciones de bases que el ADN, sirven para sostener este argumento (vase el Cap. 12). En las bacterias, la sntesis de algunas nuevas protenas en este caso, nuevas enzimas puede ser inducida por la adicin de substrato al medio de cultivo; los detalles de la sntesis de enzimas inducida se proporcionan en Vida Bacteriana, de esta serie. La sntesis de una nueva protena comienza inmediatamente despus de la adicin de substrato, como se puede medir muy fcilmente ya que la nueva protena es una enzima, y esta sntesis cesa inmediatamente despus de que las clulas bacterianas son lavadas para liberarlas del substrato. Asimismo, cuando las bacterias estn infectadas de virus bacterianos, o bacterifagos, las clulas bacterianas comienzan rpidamente a fabricar nuevas enzimas necesarias para la nueva sntesis de constituyentes vricos especficos. En el primer caso, la adicin de substrato origina que, de alguna forma, la clula fabrique nueva protena; en el ltimo caso, el ADN del fago es el agente predeterminante. Sin embargo, en ninguno de los dos casos, parece ser que haya algn cambio del ARN ribosomtico bacteriano; ste es estable. An ms, si hemos postulado que el ARN ribosomtico es el que tiene la informacin necesaria para fabricar protena especfica, cmo es posible que, cuando la clula es inducida a hacer nueva proteina, no hay todava ningn cambio perceptible en el ARN ribosomtico?

Enfrentndose con este problema, varios investigadores, dirigidos por Jacob y Monod, han llegado a la conclusin de que existe un ARN "mensajero" (vase el Cap. 12). De acuerdo con esta hiptesis, hay una molcula de ARN que es sintetizada en el ncleo, o en la regin nuclear en el caso de las bacterias, quizs por las mismas enzimas que utilizan los trifosfatos y el ADN; este "mensajero" se dirige al citoplasma, se enlaza con los ribosomas y dirige a stos ya dentro de la clula, a fabricar la protena especfica. De acuerdo con este punto de vista, los ribosomas constituyen una maquinaria sintetizadora de proteinas no especficas. En el segundo caso citado anteriormente, es el ADN de la particula fago infectante, el que se pens era la fuerza directriz en la sntesis del "mensajero". Se ha encontrado que, cuando una clula bacteriana se infecta con un fago que contiene ADN, un pequeisimo porcentaje del ARN propio de la clula bacteriana, sufre un rpido cambio, se sintetiza y se desdobla muy rpidamente. Adems, si se determinan las proporciones de las bases de este ARN en cierta forma se llega a la conclusin de que tiene la misma composicin que el ADN del virus infectante. Este tipo de ARN es probablemente un compuesto de molculas de ARN de diversos tamaos; aparentemente terminando todas ellas unidas a los ribosomas preexistentes de la bacteria. Por consiguiente, como ya se mencion en el Cap. 12, parece que hay cierta evidencia experimental de la existencia de una molcula de ARN, o una serie de ellas, que poseen las propiedades que se le han asignado al ARN "mensajero". Sin embargo, como en todos los subcampos de la ciencia de rpida expansin, existe tambin alguna evidencia contra esta idea, o al menos contra la ms bien ingenua idea propuesta anteriormente. Por ejemplo, los ribosomas procedentes de las clulas reticulocitos - clulas que son las precursoras de los glbulos rojos y que carecen de ADN- tienen la capacidad de sintetizar hemoglobina: por lo tanto que el ADN fabrique ARN mensajero para que acte como patrn para la sntesis de una protena especfica. Esta discrepancia puede obviarse, hipotticamente, por la asercin de que las clulas bacterianas, al duplicar su nmero cada 20 o 30 minutos y siendo muy sensibles a los cambios en el medio ambiente, tienen la necesidad de un mensajero inestable. Las clulas de un organismo pluricelular por el contrario, tienen mucho ms tiempo para duplicarse y no necesitan ser sensibles a los cambios del medio ambiente, puesto que el suyo es un abastecimiento de sangre bastante estable; por lo tanto, ellas realmente no tienen necesidad de un mensajero inestable y este "mensajero" permanece unido a los ribosomas todo el tiempo que viva la clula. Algunos investigadores, particularmente Roberts, han sostenido que en realidad, lo que sucede cuando las bacterias son infectadas por virus, no es la sntesis de nuevas molculas "mensajeras" que posteriormente se enlacen a los ribosomas peexistentes, sino la sntesis de un pequeo nmero de nuevos ribosomas con el llamado mensajero, que es en realidad el ARN de estos

nuevos ribosomas. Ciertamente, en el momento actual el panorama no est muy claro. Sin duda alguna existe una fraccin de ARN celular que cambia mucho bajo ciertas condiciones y, al parecer, tiene las proporciones de bases del ADN pertinente; recientemente se ha descubierto una fraccin como sta en los ncleos de las clulas del timo y en los ncleos de las clulas regeneradoras del higado. Sus relaciones con el ARN ribosomtico no estn claras; sin embargo, algunos investigadores la consideran ser, en parte, una precursora del ARN ribosomtico; otros la ven como el mismo ARN ribosomtico, no siendo un portador codificado genticamente, sino solamente como poseyendo un papel estructural capaz de enlazar al ARN "mensajero" a si misma. An ms, existe un dogma en biologia hasta el momento actual, incapaz de probarse, y es que el ADN de todas las clulas somticas de los organismos pluricelulares es el mismo. Si esto es as y si la informacin gentica reside solamente en la secuencia de bases del ADN, entonces la informacin gentica es la misma en todas las clulas somticas. Pero sabemos de hecho, que las clulas de un rgano o de un tejido son diferentes entre s; por algn motivo, poseen diferentes enzimas, y, por lo tanto, transmiten informacin diferente en cada caso para indicar que una clula es por ejemplo del hgado y no una clula muscular del corazn. Si la informacin gentica del ADN es la misma, tiene que haber un intermediario en la cadena entre el ADN nuclear y la maquinaria citoplasmtica sintetizadora, que no es el ARN "mensajero" y que no es una mera rplica del ADN. Este intermediario hipottico podra ser una substraccin diferencial o un enmascaramiento tambin diferencial del ADN de una clula a otra. Se ha postulado que la histona, que se encuentra formando un complejo con el ADN en el ncleo, acta como un agente enmascarador, en donde el ADN "desnudo" reacciona como un patrn para la sntesis del ARN. Estas razones son las que originan duda sobre la hiptesis de que existe una relacin lineal sencilla entre la informacin gentica del ADN y el receptor de esta informacin en los ribosomas citoplasmticos. Debera hacerse mencin de que el ncleo parece tener tambin partculas semejantes a ribosomas y por la cantidad limitada de trabajo efectuado por estas partulas, parece que stas tambin son capaces de sintetizar protenas.

"Cdigo" del cido nucleico

Hemos estado hablando de la informacin gentica del ADN, siendo precisamente esta informacin la necesaria para la sntesis de las protenas especficas. Podemos decir que en el ADN se encuentra una serie de nucleticos, lo que significa que cierto aminocido puede ser colocado en determinado lugar en

una protena durante la sntesis de la misma; en otras palabras, la colocacin de los nucletidos en el ADN puede ser un cdigo para el arreglo de los aminocidos en una protena. Hasta 1962, los bilogos en general tenan pocas esperanzas aun en "descifrar" este "cdigo". Sin embargo, fisicos como Gamow y fisicoquimicos como Crick comenzaron a emitir postulados matemticos para determinar a qu clase de cdigos tericos posibles podan relacionarse los cuatro nucletidos diferentes del ADN, o del ARN, con los 20 aminocidos diferentes de las protenas. Hasta ahora el cdigo ms aceptado es el obtenido por Crick y Brenner, en el cual una "palabra" de tres "letras", o nucletidos, arreglada en cierta secuencia significa determinado aminocido. Existe cierta base experimental y terica para dicho cdigo. Se cree que este cdigo no es sobrepuesto, es decir, que el cdigo lee linealmente a lo largo del ADN, o a lo largo del ARN "mensajero" y, por lo tanto, cualquier nucletido a lo largo de la cadena del cido nucleico puede ser parte solamente de una "palabra de tres letras". Se piensa ahora que este cdigo puede romperse del signiente modo. Ha sido posible aislar enzimas bacterianas que sintetizan ARN a partir de los difosfatos de nucletido aadidos. La enzima no es especfica, puesto que puede sintetizar cualquier clase de molcula de polinucletido, dependiendo esta molcula de la clase de nucletido que se aada a la mezcla en incubacin. Por ejemplo, si se aaden difosfatos de uridina, las enzimas fabricarn un cido poliuridilico; es decir, molculas de cido uridilico unidas unas con otras por medio de enlaces 3'5'fosfodister. No sabemos qu funcin desempea esta enzima en la bacteria, ni qu funcin verifica el ARN en la economa de la clula. No obstante, se ha encontrado que los productos de las reacciones enzimticas son muy tiles, porque en la actualidad, podemos fabricar muchas clases de molculas especficas parecidas al ARN, prticamente de la composicin especfica que se quiera, simplemente variando los difosfatos de nucletido que se aaden como precursores al medio en incubacin que contiene la enzima til. De esta manera, adems del cido poliuridilico, se pueden fabricar otros polinucletidos conteniendo cidos adenilico, guanilico y citidlico, en diversas y conocidas proporciones Uno de estos polmeros, el cido poliuridlico, fue primeramente empleado por Nirenberg en un sistema de incorporacin in vitro de aminocido radiactivo conteniendo ribosomas de E. Coli y los cofactores apropiados para que se efecte la incorporacin del aminocido. Cuando se emplearon varios aminocidos radiactivos, se encontr que solamente en el caso de la fenilalanina haba un gran aumento en la incorporacin del aminocido dentro de la protena en presencia del cido poliuridlico. En esta forma, este cido actuaba como un ARN "mensajero". Igualmente, cuando se aaden al sistema otros polirribonucletidos fabricados sintticamente, se encuentra que otros aminocidos son incorporados especficamente dentro de la protena. Este fue por primera vez, un instrumento con

el cual los nucletidos podan relacionarse experimentalmente a los aminocidos. Los resultados de emplear polmeros diferentes conteniendo proporciones diversas de los cuatro nucletidos diferentes y utilizando todos los 20 aminocidos como precursores radiactivos en experimentos individuales pueden expresarse en una tabla; de ella se puede sacar la conclusin que ciertas combinaciones de nucletidos parecen ser los ingredientes necesarios para la incorporacin de los aminocidos radiactivos particulares dentro de las protenas de los ribosomas de la E. Coli. Si tres nucletidos en fila "pretenden ser" o "significan un determinado aminocido, podemos decir, por lo tanto, que tres cidos uridilicos en fila "significan" fenilalanina. La Tabla 13-3, que es una compilacin de los resultados obtenidos en los laboratorios de Ochoa y Nirenberg, nos muestra que cierta combinacin de nucletidos significa los varios aminocidos. El orden de los nucletidos individuales en cada terceto es de importancia, pero hasta la fecha no se conoce. Algunos aminocidos tienen ms de una palabra cdigo, como puede verse en la tabla, pero lo que esto significa, todava no se sabe. La presente suposicin, basada tambin en otras formas de evidencia, es que el cdigo completo puede degenerar; es decir, que un solo aminocido puede ser especficado por ms de un conjunto de nucletidos. Esta redundancia reducida la oportunidad de error en la traduccin del cdigo de cido nucleico a protena. No se conoce el orden de las letras individuales en las palabras cdigo, pero los investigadores han hecho algunas suposiciones. La evidencia independiente ha verificado algunas de estas palabras cdigo para ciertos aminocidos. Por ejemplo, se pueden producir, por medios qumicos, mutantes del virus del mosaico del tabaco por medio de la desaminacin del ARN del virus con cido nitroso, cambiando de esta forma la citidina del ARN en uridina, y la adenina en guanina. En la capa de protena resultante en estos virus mutantes, se puede observar que se han alterado algunos de los aminocidos de la protena; algunos aminocidos han sido reemplazados por otros en ciertos lugares de la cadena proteica tal vez como resultado de la mutacin causada por el tratamiento del ARN con el cido nitroso. Conociendo qu clase de cambios se producen en el ARN por el cido nitroso e igualmente qu aminocidos son reemplazados por otros, podemos hacer una correlacin entre ambos hechos. La Tabla 13-4 nos indica esta correlacin. Compare las Tablas 13-3 y 13-4 y observe la marcada similitud entre los cdigos obtenidos por los dos mtodos diferentes. Armados de este cdigo, los investigadores pueden hacer predicciones acerca de qu nucletidos en una combinacin codificada para determinado aminocido puede ser cambiado por otro nucletido codificado para otro aminocido. Por ejemplo, pueden aislarse diferentes clases de molculas de hemoglobina de los organismos humanos que padecen enfermedades caracterizadas por cambios especficos en las protenas de la hemoglobina de las clulas de los glbulos rojos.

Se puede determinar qu aminocidos de estas protenas difieren de sus congneros en molculas de hemoglobina normal; de esta manera, en algunos casos, un cido glutmico, que est en cierta posicin en la hemoglobina normal, se ha cambiado a una molcula de glicina en esa misma posicin. TABLA 13-3 RELACIONES DE LAS COMBINACIONES DE NUCLEOTIDOS EN LA INCORPORACION DE AMINOACIDOS DENTRO DE LA PROTEINA (Datos de Nixenberg y Ochoa) -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Nucletidos en los tercetos Aminocidos incorporados postulados -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------3 cidos uridlicos fenilalanina 2 cidos uridlicos, 1 adenlico isoleucina, leucina, tirosina 2 cidos uridlicos, 1 citidlico isoleucina, leucina, tirosina 2 cidos uridlicos, 1 guanlico leucina, serina 1 uridlico, 2 adenlicos valina, cistena, leucina 1 uridlico, 2 citidlicos asparagina, lisina 1 uridilico, 2 guanlicos prolina 1 uridlico, 1 adenlico, 1 citidlico triptofano, glicina 1 uridlico, 1 adenlico, 1 guanidlico treonina, histidina, asparagina metionina, cido glutmico, cido asprtico 1 uridlico, 1 citidlico, 1 guanidlico glutamina, alanina, arginina -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Se predijo entonces que esos reemplazamientos de aminocidos podrian deberse a cambios en los nucletidos individuales en la palabra cdigo de tres letras para determinados aminocidos (vase la Tabla 13-5). En otras palabras, pueden predecirse los ms comunes reemplazatalentos de aminocidos, simplemente sobre la base de la frecuencia probable de los cambios de un nucletido en un cdigo cambiante de tres nucletidos individuales, en la palabra cdigo de tres letras para determinados aminocidos (vase la Tabla 13-5). En otras palabras, pueden predecirse los ms comunes reemplazamientos de aminocidos, simplemente sobre la base de la frecuencia probable de los cambios de un nucletido en un cdigo cambiante de tres nucletidos, por ejemplo, cidos uridilicoadenilicoguanilico a cidos uridilico citidilico guanilico. Parece que ha sido descubierto un cdigo en

que las secuencias simples de la molcula del ADN pueden, probablemente a travs de un ARN intermediario, codificarse para la ubicacin de los aminocidos especficos en lugares determinados de una protena. Sin embargo, una vez ms, todava no se sabe si ste es en realidad un verdadero cdigo, un espejo de algo mucho ms complicado y misterioso; o si existe ms de un cdigo en que las combinaciones de nucletidos diferentes se codifiquen para el mismo aminocido. TABLA 13-4
EJEMPLOS DE CONCORDANCIA ENTRE LAS SUSTITUCIONES DE AMINOACIDOS EN LAS PROTEINAS DE MUTANTES DEL VIRUS DEL MOSAICO DEL TABACO Y LAS PALABRAS CODIGO DE LOS NUCLEOTIDOS, DETERMINADAS EXPERIMENTALMENTE

Las mutantes del virus del mosaico del tabaco fueron obtenidas tratando el virus con cido nitroso, que cambia la base citosina del ARN a uracilo y la base adenina a guanina, -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Asparagina Acido Leucina Prolina Cdigo postulado { asprtico HAC UAG CUU CCU Cambios producidos por el cido nitroso Cdigo postulado

UGC LIGG UUU CUU Alanina Glicina Fenilalanina Leucina -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Los investigadores que trabajan en este campo en particular han alcanzado el punto experimental al tomar los ribosomas de la E. coli, aadir los cofactores necesarios para la incorporacin de los aminocidos radiactivos dentro de las protenas, adicionar determinada clase de ARN y obtener la sntesis de una protena especfica. Si al virus del mosaico del tabaco se le agrega ARN, parece que se forma la protena del virus del mosaico del tabaco; si a determinado fago se le aade ARN, parece que se sintetiza determinada protena del fago. No se sabe hasta ahora, qu hacen los ribosomas de la E. Coli; especficamente, qu papel representa el ARN ribosomatico en estas sntesis. Quizs simplemente acte como una forma estructural de los ribosomas, sobre la cual se construyen las grandes molculas de las protenas; o que pueda modificar al ARN "mensajero" en determinada forma

que los ribosomas del hgado, por ejemplo, no hagan junto con el "mensajero" universal del ADN universal de todas las clulas del organismouna protena universal, sino especficamente proteinas de la clula del hgado. TABLA 13-5 EJEMPLOS DE CONCORDANCIA ENTRE LAS SUSTITUCIONES DE AMINOACIDOS DE VARIAS MOLECULAS DE HEMOGLOBINA ESPE CIFICA DE DIVERSAS FUENTES Y LAS PALABRAS CODIGO DE LOS NUCLEOTIDOS, DETERMINADAS EXPERIMENTALMENTE -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Lisina Histidina Acido Acido Histidina Sustituciones de glutmico glutmico Aminocido Acido UAA
Cambio postulado en las palabras del cdigo

Arginina UAC

Glicina UAG

Lisina UAG

Tirosina UAC

UAG UGC UGG UAA UAU --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Sntesis de protenas de estructura especfica

Hasta aqu nuestra discusin se ha concretado a la secuencia de aminocidos en las proteinas como determinante de la estructura de las mismas; en realidad, una proteina es una estructura tridimensional con configuraciones especficas. Esta configuracin es muy importante debido a que algunas de las propiedades de las proteinas que actan como enzimas se deben, no solamente a la secuencia de aminocidos, sino tambin, a la forma como est plegada la protena, plegamiento que sirve para acomodar el substrato de la accin enzimtica. Actualmente se cree que, una vez que una protena tiene una secuencia de aminocido especfica, se plegar naturalmente en una configuracin particular y que esto depender , ms o

menos especficamente, de la distribucin y conjuncin de los residuos de cisteina en la proteina para proporcionar enlaces bisulfuro. Son estos enlaces, juntos con los enlaces hidrofbicos los que se consideran como ms importantes para conservar la protena en una forma tridimensional continua. Se piensa que una vez que se ha sintetizado una protena especfica, se plegar entonces naturalmente en su forma correcta, ms an, no solamente la clula debe sintetizar una protena especfica que tenga propiedades particulares, sino que sta tiene un lugar predestinado dentro de la clula. La oxidasa citocromo, por ejemplo, es una protena mitocndrica. Se desconoce completamente cmo esta enzima est colocada finalmente en su poscin correcta en la clula.

___________________RESUMEN__________________
Para recapitular, la Fig. 13-5 muestra nuestras ideas actuales sobre la sntesis de las protenas especficas, como se han descrito en ste y en el captulo anterior. Una o ambas espirales del ADN acta como un modelo para la sntesis de posiblemente todo el ARN de la clula, probablemente en el ncleo. Una parte de este ARN es "mensajero", otra es ribosomtica y, probablemente, otra parte es ARN transporte. Existen indicaciones de que el ARN ribosomtico es sintetizado junto con el ADN asociado al nuclolo. Todas estas especies de ARN probablemente se mueven entonces en el citoplasma, quedando posiblemerte una parte atrs para actuar en la sntesis de la protena nuclear. El ARN informativo forma parte ya sea de los ribosomas o queda unido a un ribosoma ya formado; los investigadores, hasta el presente, no han podido distinguir entre estas dos alternativas. Tampoco se sabe si el ARN ribosomtico toma su protena en el ncleo o si el ribosoma completo se forma en el citoplasma. Sin embargo, el ribosoma, con su ARN mensajero componente o agregado, se ha convertido en un modelo para la sintescis de las protenas especficas. Entre tanto, los aminocidos se han activado y enseguida se han unido a su propio ARN transporte especfico. El ejemplo dado en la figura es la fenilalanina; puesto que la palabra clave para la fenilalanina se considera que es tres cidos uridlicos (UUU), se supone que el ARN transporte tiene una regin que "dice" fenilalanina, y que esta regin es tres cidos adenfiicos (AAA), regin complementaria a la regin UUU en el ARN mensajero. El aminocido est ahora as alineado en su posicin correcta, de acuerdo con la clave para la protena especfica que est contenida en el ARN mensajero.

Asentado esto, la enzima que forma el enlace peptidico engancha a este aminocido con sus aminocidos adyacentes. Parece que ms de una enzima est implicada en este paso final; la que hace que el TFG sea tambin un enigma. La configuracin final tridimensional de la proteina sintetizada est probablemente determinada por la secuencia de aminocidos; podemos decir que la estructura primaria de la protena, su secuencia de aminocidos, es directamente responsable de su estructura secundaria. En este momento, funciona algn mecanismo libertador desconocido que extrae a la proteina de su modelo. No se sabe con certeza, qu ocurre con el ARN mensajero, y con el ARN transporte. En las bacterias, parece ser que la vida del ARN mensajero es muy corta, durando solamente el tiempo necesario para la sntesis de unas cuantas protenas; en las clulas de los mamferos, parece ser que es un poco mayor, posiblemente dura toda la vida de la clula. Igualmente no sabemos nada acerca del ARN transporte, aunque aqu parece que los tres nucletidos finales (CCA) deben ser cambiados cada vez que el ARN acta como un transportador de aminocido. Asimismo, no se conoce la duracin de los ribosomas aunque se cree que permanecen durante toda la vida de la clula, deduccin que se ha obtenido de los datos proporcionados por el ARN ribosomtico. Aunque est claro que existen muchas fallas en este esquema, creemos que lo que tenemos aqu es al menos una imagen de la verdad. Para terminar el cuadro, tenemos las herramientas de la gentica para complementar nuestro conocimiento bioqumico. Por supuesto, aunque resolviramos los misterios de cmo la clula puede continuar infaliblemente la sntesis de sus propias protenas especficas, nos quedaramos todava con el problema tan importante de cmo se forma la estructura celular (vase el Cap. 16). Estos problemas incluyen la formacin de las estructuras subcelulares, la formacin de la estructura celular que es caracterstica para determinado tejido u rgano y los factores que determinan la forma y el tamao de los rganos individuales y aun del organismo completo.

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------LISTA DE LECTURAS QUE SE SUGIEREN Allfrey, V. G., and Mirsky, A. E., "How cells make molecules," Scientifc American, September 1961. Brachet, J., 1960. The biological role of ribonucleic acids. New York: Elsevier. Campbell, P. N., "Synthesis of proteins by cytoplasmic components of animal cells," Biological Reviews, Vol. 35 (1960), p. 413. Chantrenne, H., 1961. Biosynthesis of proteins. New York: Pergamon Press. Gros, F., "Biosynthesis of proteins in intact bacterial cells." In Chargaff, E., and Davidson, J. N. (eds.), 1960. Nucleic acids. New York: Academic Press. Vol. 3, p. 409. Hoagland, M. B., "Relationships of nucleic acid and protein synthesis as revealed by studies in cell-free systems." In Chargaff, E., and Davidson, J. N. (eds.), 1960. Nucleic acids. New York: Academic Press. Vol. 3, p. 349., --- "Nucleic acids and proteins," Scientific American, December 1959. Hultin, T., "On the function of the endoplasmic reticulum," Biochemical Pharmacology, Vol. 5 (1961), p. 359. Ingram, V. M., "How do genes act?" Scientitic American, January 1958. McQuillen, K., "Ribosomes and synthesis of proteins," Progress in Biophysics and Biochemistry, Vol. 12 (1962), p. 69. Palade, G.E., "A small particulate component of the cytoplasm, Journal of Biophysical and Biochemical Cytology, Vol. 1 (1955), p. 59. Porter, K. R., "The ground substance: observations from electron microscopy.' In Brachet, J., and Mirsky, A. E. (eds.), 1961. The cell. NewYork: Academic Press. Vol. 2, p. 621. Roberts, R. R. (ed.), 1958. Microsomal particles and protein synthesis. NewYork: Pergamon Press. Siekevitz, Philip, "The cytological basis of protein synthesis," Experimental Cell Research, Supplement 7, (1959), p. 90. Zamecnik, P. C., "The microsome," Scientific American, March 1958.

CAPITULO CATORCE

LA SUSTANCIA FUNDAMENTAL Y LA CONVERSION DE LA ENERGIA QUIMICA EN TRABAJO La

conversin de la energa qumica en trabajo mecnico es una propiedad universal de todas las clulas. En el organismo animal pluricelular y quizs tambin en los animales unicelulares, los protozoarios, gran cantidad de energa producida bajo la forma de TFA, es consumida por el movimiento propio del animal. En el primer caso, esto significa que el TFA es utilizado, principalmente, para el movimiento del msculo. Excluyendo el agua, la sustancia que en mayor cantidad se encuentra en nuestro organismo, es la protena muscular. Aproximadamente la quinta parte en peso de nuestro cuerpo es materia slida; el 80% o ms de esta materia es protena; la mayor parte de sta se encuentra en las clulas musculares de nuestro cuerpo. La importancia de la produccin de TFA para el movimiento muscular es as aparente. Existen tres grandes problemas concernientes a la fisiologa de la clula muscular: uno, es el conocer los componentes celulares que realmente ejecutan el trabajo; otro, es el continuo abastecimiento de energa que se necesita; y el tercero, determinar cmo la energa qumica es convertida en energa mecnica. COMPONENTES MACROMOLECULARES El primer trabajo llevado a cabo experimentalmente fue encontrar qu elementos mecnicos se encuentran en la clula. Las clulas musculares se caracterizan en que, adems de un ncleo y de numerosos mitocondrios, contienen muchas fibras alargadas de protena que forman la mayor parte de la clula; estas fibras parecen

constituir la clave para la solucin de este problema en particular. El bioqumico nunca se siente ms feliz que cuando logra desarmar algo y observa qu es lo que hace que esas partes trabajen acompasadamente; si es sagaz y afortunado, puede efectuar una reconstruccin en un tubo de ensayo y en su mente de cmo estas partes separadas se acoplan en un conjunto biolgico. Afortunadamente, el tejido muscular se puede desarmar fcilmente. Hace aos, Szent, Gyrgyi, Bailey, Edsall y Engelhardt comenzaron a fraccionar clulas musculares, y los bioqumicos han seguido su ejemplo desde entonces. Szent, Gyrgyi encontr en aquel tiempo, que una protena muscular particular a la que llam miosina, poda ser extrada del tejido muscular por medio de soluciones salinas fuertes; la miosina constituye aproximadamente el 55% de las protenas de la clula muscular. La solucin viscosa resultante tena una elevada doble refraccin de flujo, indicando que las molculas de la protena en la solucin, existan como molculas muy alargadas. Cuando se aada TFA a esta solucin, la refraccin doble de flujo prcticamente desapareca y, adems, el mismo TFA se desfosforilaba. Pero el hallazgo realmente excitante fue que en presencia de una gran cantidad de sal, las soluciones de miosina podan escurrir a travs de un pequeo orificio, formando largos hilos y que stos se acortaban cuando se aada TFA. Posteriormente se encontr que otra clase de extraccin del tejido muscular, produca las llamadas fibras glicerinadas, las cuales podan hacer se contraer ms fcilmente y con mayor frecuencia cuando se aada TFA. Se saba, debido principalmente a los trabajos del fisilogo Hill, que hay un requerimiento de energa para que se verifique la contraccin del msculo y que este requerimiento de energa se puede expresar en equivalentes trmicos o elctricos. Cuando tambin se encontr que durante la contraccin apareca fosfato inorgnico y desaparecan los steres Ca2+ en presencia del TFA; inhibir la actividad de la trifosfatasa de adenosina pero permitir al TFA reaccionar con la acto miosina y as conservar al fillamento en un estado de reposo y relajamiento.

ENERGETICA
No se tiene la seguridad de que el desdoblamiento del TFA est implicado en el hecho fundamental de la contraccin muscular; en un tipo de experimentos de un solo paso, no se observ ningn cambio en las concentraciones celulares del TFA y del DFA. Sin embargo, en las clulas musculares existe otro compuesto de elevada energa, el fosfato de creatina o fosfocreatina. Este compuesto se forma cuando la enzima quinasa de la fosfocreatina acta sobre la creatina y el TFA; tambin se forma en el proceso DFA. Esta reaccin es completamente reversible de la fosfocreatina se forma TFA y DFA indicando esto que los enlaces fosfato de "elevada energa" del TFA y de la fosfocreatina se encuentran en el mismo nivel de

energa. Por lo tanto, hay grandes cantidades de fosfocreatina en las clulas musculares de los vertebrados (un compuesto similar, la fosfoarginina existe en los msculos de los invertebrados ), se cree que es una clase de compuesto que sirve como depsito de energa al msculo, ms an, un trabajo reciente da a conocer que de hecho es el TFA el que disminuye en cantidad durante una sola contraccin. Pero, no importando cul sea el mecanismo ntimo que se verifica, no hay duda que en las clulas musculares existen grandes cantidades de compuestos de fosfato de elevada energa, TFA y fosfocreatina; que hay una disminucin de fosfato de elevada energa durante la contraccin muscular; y que, en el relajamiento, tiene lugar una resntesis del fosfato de elevada energa. La cantidad de trabajo muscular depende de las concentraciones iniciales de estos compuestos y de las velocidades de su reconstruccin. La eficiencia del trabajo muscular depende, como se bosquej en un captulo anterior, de la cantidad de energa libre que se puede obtener de una reaccin qumica, siendo el resto de la energa transformado en calor. En este caso, la reaccin qumica total es el desprendimiento de fosfato inorgnico del TFA. Puesto que no podemos hacer mucho para cambiar la eficiencia de esta reaccin qumica, debemos pensar acerca de las otras posibilidades que gobiernen la cantidad y la velocidad del movimiento muscular: esto est relacionado con la forma de cmo la clula muscular genera continuamente energa. Mecanismo qumico postulado Debemos examinar el diagrama de la Fig. 14-1. A la izquierda se encuentra el aspecto de las clulas musculares tal como se observa en la realidad aunque, por supuesto, este concepto deber ser revisado a la luz de los nuevos descubrimientos. La miosina reacciona con el TFA para formar un complejo de TFA-miosina. En presencia de K+ y actina F, se forma TFA-actomiosina. Cuando se aaden Ca2+ y Mg2+, este complejo desdobla al TFA dando fosfato inorgnico y formando, probablemente, un complejo de DFA-actomiosina, el cual luego se descompone para poner en libertad actina, miosina y DFA. No se sabe con exactitud, dnde tiene lugar la contraccin en este esquema, pero se cree que ocurre cuando el complejo TFA-actomiosina acta como una trifosfatasa de adenosina. Es ms que un enigma saber cundo acta el factor de relajamiento aunque se supone en la actualidad que lo hace enlazando al Ca2+ y de esta manera inhibiendo el desdoblamiento del complejo TFA-actomiosina. Si esto fuera todo, resultara una sola contraccin, puesto que la fibrilla permanecera falta de movimiento a menos que el DFA pudiera refosforilarse a TFA. Esta molcula de TFA sale de las fibrillas musculares y puede ser influenciada de varias formas. Dos molculas de TFA pueden ser atacadas por la enzima muscular miocluinasa, la que cataliza una

reaccin de transfosforilacin, tomando un fosfato de uno de los del DFA y colocndolo en el otro DFA para formar FMA y TFA. Por otro camino el DFA puede reaccionar con la fosfocreatina, por medio de una quinasa fosfocreatina muscular, para formar TFA y creatina. En ambos casos se forma otra vez TFA para poder reaccionar con la miosina. Pero estas reacciones no son la respuesta del problema.

Fig. 14-1. Flujo de energa en el msculo. (Copia de P. Siekevitz, Ann N. Y. Acad Sci., 72, 1959)

En la reaccin de la mioquinasa debe haber dos molculas de DFA para formar una de TFA, en tanto que en el segundo caso, debe haber TFA para reconstruir la fosfocreatina; es as por qu la mayor parte de los bioqumicos juzgan a la fosfocreatina como un depsito de energa, que dura poco tiempo, hasta que el TFA pueda ser abastecido en exceso por algn otro medio. Este otro medio puede ser la produccin de energa glicoltica.

En los primeros trabajos con fibras musculares se encontr que si stas eran estimuladas por electricidad en ausencia de oxigeno se verificaba la contraccin, pero haba una acumulacin de cido lctico. Cuando la estimulacin se continuaba por algn tiempo, se provocaba un estado conocido como "fatiga muscular". Si este msculo fatigado se expona a la accin del oxigeno, desapareca el cido lctico y el msculo recobraba su capacidad para contraerse. Si el msculo se contrae en presencia del aire, no se acumula ninguna cantidad de cido lctico. Cuando el msculo fue estimulado en presencia de yodoacetato sustancia venenosa que inhibe la gliclisis as como la acumulacin de cido lctico an se contrajo, pero al mismo tiempo, se observ que la fosfocreatina se descompona en creatina y fosfato inorgnico. Cuando esta descomposicin lleg a su trmino, no se verificaron ms contracciones musculares. Bajo todas estas condiciones de contradicciones y relajamientos anaerobias, la concentracin del TFA permaneca inalterada. De manera que puede decirse que, bajo condiciones anaerobias, en todos aquellos casos en que el abastecimiento de oxigeno (sangre) no es adecuado, el msculo se puede contraer empleando su fosfocreatina almacenada. Esto es lo que sucede durante un ejercicio sostenido; este depsito se vuelve a llenar durante el ejercicio por medio de la gliclisis de la glucosa.

Abastecimiento de energa: Gliclisis

La Fig. 14-2 es un esquema del camino glicoltico en el ncleo basado en el trabajo de C. Cori y G. Cori y de Meyerhof y Embden. El glucgeno muscular se desdobla en el fosfato de azcar de 6 carbonos, el difosfato1,6-fructosa, a travs de diversos pasos enzimticos intermedios, incluyendo uno que requiere TFA. Luego el difosfato de fructosa es desdoblado en dos compuestos de 3 carbonos, los cuales se encuentran en equilibrio entre si. Uno de stos, el fosfato 3-gliceraldehido, es oxidado a cido 3-fosfoglicrido, generando TFA. Este paso, catalizado por la importante enzima deshidrogenasa del fosfato 3-gliceraldehido, es el nico paso oxidativo en el camino glicoltico completo. El oxigeno no es necesario para esta oxidacin, nicamente la presencia del ADN, el cual es reducido en el proceso a ADNH2. A travs de varios otros pasos enzimticos, se forma cido pirvico y, al mismo tiempo, se produce otra molcula de TFA. En condiciones anaerobias, este cido pirvico es reducido a cido lctico por el ADNH2 generado en el paso oxidativo de la gliclisis, volvindose a formar ADN para su uso posterior en el paso oxidativo. En condiciones aerbicas, el cido pirvico es oxidado, segn el ciclo de Krebs, en los mitocondrios, siendo as desviada la formacin de cido lctico.

Puesto que se necesita un TFA para formar el difosfato de fructosa y puesto que se producen cuatro molculas de l durante la gliclisis (generndose dos molculas de fosfato 3-gliceraldehido de 3 carbonos, del fosfato de azcar de 6 carbonos), se obtiene una produccin neta de tres molculas de TFA por cada mol de glucosa que se desdobla del glucgeno. Cuando se acumula el cido lctico bajo condiciones anaerobias, se traslada entonces al hgado a travs de la sangre, y ah es transformado en glucgeno del hgado. El glucgeno muscular es reconstruido por medio de un proceso que comienza con la degradacin del glucgeno del hgado, y llegando a la sangre la glucosa libre producida. De la sangre, atraviesa las membranas de las clulas musculares, es fosforilada a fosfato- 6-glucosa y luego transformada a fosfato Lglucosa. La glucosa de este compuesto es luego transferida, a un compuesto de glucosa "activo", el fosfato de uridinglucosa, con ayuda del TFA. Este compuesto de glucosa "activo" pone en libertad a su glucosa enzimticamente cuando an se encuentra presente una pequea cantidad de molculas de glucgeno muscular; de esta manera, el glucgeno es formado por gran nmero de unidades de glucosa. Puesto que por este camino, se necesita una molcula ms de TFA (por la enzima hexoquinasa para formar el fosfato-6-glucosa), el resultado neto de la gliclisis que parte de la glucosa libre es solamente de dos molculas de TFA. De esta manera, si se obtienen 20000 a 30000 caloras de energa, biolgicamente utilizables en forma de TFA (aproximadamente 10000 caloras por TFA) proceden de un rendimiento total de energa calorfica de aproximadamente 58000 caloras, para ir de la glucosa al cido lctico, sta es una eficiencia del 30 al 50%. El TFA que es producido en esta forma, puede fosforilar a la creatina, regenerando otra vez a la fosfocreatina. Esta produccin de fosfocreatina se har hasta que exista glucgeno muscular disponible. Pero, puesto que el glucgeno muscular est siendo constantemente reconstruido del glucgeno del hgado, podemos decir que ste es el ltimo depsito de energa para el movimiento muscular. Sin embargo, el paso anaerobio completo, conduciendo a la produccin de cido lctico, probablemente se efecta slo bajo condiciones de emergencia ya sea un movimiento muscular sostenido o un largo o repentino ejercicio muscular. Bajo condiciones aerbicas, el cido lctico nunca se acumula, y el cido pirvico es oxidado por los mitocondrios; de esta forma se obtiene ms energa procedente de la esencial oxidacin completa de la glucosa, a travs del piruvato, dando bixido de carbono y agua. Cuando el piruvato es oxidado completamente por los mitocondrios, se obtienen 15 moles de TFA por mol de piruvato oxidado, o 30 moles por mol de glucosa. Esto es, aproximadamente, 10 veces ms de energa de TFA obtenida de la gliclisis anaerobia de la glucosa.

Fig. 14-2. Gliclisis en la clula muscular

Abastecimiento de energa: Mitocondrios del Msculo

Por esta razn no es sorprendente encontrar muchos mitocondrios en las clulas musculares y ms an, en las clulas del msculo del corazn, cuyas fibras estn continuamente relajndose y contrayndose, que en las clulas de los msculos estrados que actan intermitentemente. La Fig. 14-3A muestra un aspecto tpico de los mitocondrios del corazn entre las fibrillas, en tanto que las Fig. 13-3B y C muestran lo mismo pero en un msculo estriado. En ambos casos, los mitocondrios estn ntimamente unidos a las fibrillas musculares, para facilitar el intercambio de los materiales solubles entre las dos estructuras. En el primer caso, los mitocondrios quedan entre las fibrillas, en tanto que en el segundo caso, los mitocondrios ms numerosos estn cerca de las bandas I. El DFA, producido como resultado de la contraccin fibrilar, puede salir de las fibrillas y penetrar en los mitocondrios; si existe suficiente substrato oxidable til, se oxida y, concomitantemente, el DFA es fosforilado a TFA. Este sistema completo es probablemente un sistema de finas mallas. Los experimentos efectuados en mitocondrios aislados, indican que stas duran ms, desde un punto de vista metablico, cuando estn produciendo un trabajo que cuando no lo hacen. Si los mitocondrios son aislados y se les deja simplemente a la temperatura del cuarto, pronto pierden su capacidad para oxidar la mayor parte de los substratos. Sin embargo, si se les hace oxidar substrato mientras se les deja, pueden continuar oxidndolo por largo tiempo. El tejido muscular parece tener la misma naturaleza: si las conexiones nerviosas del msculo estn rgidas, hacindolo incapaz para funcionar, en un tiempo relativamente corto el tejido muscular comienza a degenerar. Tambin sabemos que el tejido muscular puede hacerse "desarrollar" hacindolo trabajar. Lo que esto significa bioqumicamente es que al contraerse el msculo y desdoblar al TFA en DFA, ste penetra en los mitocondrios y ah acta como un aceptor de fosfato, como se explic en un captulo anterior. Si hay substrato disponible, el paso del DFA de las fibrillas a los mitocondrios, acta como un estimulante de stos; el substrato es oxidado: y se produce TFA, y otra vez vuelve al ciclo a travs del sistema de las fibras musculares. En otras palabras, los mitocondrios parecen ser capaces de responder al DFA, para formar TFA, durante tanto tiempo como ste se necesite. Si el msculo se contrae continuamente, un abastecimiento sin interrupcin de DFA alimentar a los mitocondrios, los cuales respondern, fabricando TFA. Si no hay necesidad de que la contraccin contine; si no hay necesidad de TFA, no se formar DFA y, por lo tanto, no se generar TFA. Debido a que la energa es preciosa, la naturaleza parece que ha construido un sistema, en el cual, no se produce ms energa que la que se utiliza. Se debe sealar, sin embargo, que esta idea de la relacin simbitica entre las fibrillas musculares y los mitocondrios del

Fig. 14-3 A: Miocardio de ratn, corte longitudinal (x 20000) B: Msculo estriado, corte lingitudinal (x 15000) C: Msculo estriado corte oblcuo (x 15000). M, mitocondrios; Sr, retculo sarcoplasmtico; P, miofilamentos; Z, lnea Z; H, regin H; I, banda I. (Cortesa de G. Palade, Rockefeller Institute).

msculo est basada en resultados obtenidos de experimentos hechos con mitocondrios aislados, y tienen poco que hacer con la realidad celular. No obstante, para muchos bioqumicos esto semejara ser una verdadera imagen significativa de lo que sucede in situ en la clula muscular.

MECANICA MACROSCPICA
Sabemos algo acerca de los requerimientos de energa para la contraccin del msculo y bastante, tambin, concerniente a los elementos moleculares implicados, pero an tenemos mucho que descubrir en lo que se refiere al mecanismo macroscpico. Sabemos que el hecho inicial es la despolarizacin de la membrana de la clula muscular que es afectada por un impulso elctrico procedente de los nervios. Tambin sabemos un poco de lo referente a la estructura macroscpica del msculo y lo que le sucede a esta estructura durante la contraccin. Los tejidos musculares estn divididos en tres clases principales: el liso, el estriado y los msculos del corazn. El ms conocido de los tres, es el msculo estriado. Es lo que se llama musculatura roja, los msculos con que movernos a voluntad nuestros huesos y que constituye la mayor parte del tejido muscular. Los otros tipos de msculos son involuntarios, es decir, no estn bajo nuestro control nervioso consciente. Los haces musculares estriados, llamados as debido a que si se les observa al microscopio, se pueden ver claramente las bandas oscuras transversales de las fibras. Estos haces musculares estn compuestos de clulas, cada una de las cuales tiene cierto nmero de fibras longitudinales. Estas clulas tienen muchos ncleos y numerosos mitocondrios, estos ltimos colocados entre las fibras. Estas terminan en los tendones o directamente en los huesos, por lo que la contraccin se verifica por medio del acortamiento de estas fibras. Las fibras celulares estn formadas, a su vez, de fibrillas individuales y son las estriaciones repetidas de estas fibrillas las que dan el nombre a este tipo de msculo. La unidad repetida, de la cual debe haber miles en cada fibrilla, se denomina sarcmera. La Fig. 14-3 muestra una micrografa, en tanto que la Fig. 144 da un esquema de una sarcmera, con los sitabolos universalmente empleados para designar las diferentes regiones de luz y oscuridad alternadas o bandas isotrpicas (L) y anisotrpicas (A). Las lneas Z sirven como inserciones para un nmero (100 a 1500) de filamentos de actina, en tanto que la regin A tiene de 50 a 750 filamentos de miosina. Cuando un msculo se contrae, parece que la regin clara I menos densa, prcticamente desaparece. No hay cambio en la regin oscura A ms densa; verdaderamente se tiene la impresin de que esta regin, en especial el segmento de la regin I, se vuelve en realidad ms ancha. En la actualidad se

Fig. 14-4. Estructura de un msculo estriado (esquemtica).

cree que las fibrillas compuestas exclusivamente de miosina, forman una buena parte de la regin A, ya que se extienden desde el borde de una regin I hasta los linderos de la regin I adyacente. La actina parece que se encuentra principalmente en los filamentos que se extienden desde el borde de la regin H, a travs de la lnea Z, hasta el borde de la regin H de la sarcmera adyacente. As, parece que la fibrilla que realmente se contrae, la actomiosina, se encuentra solamente en la regin A, en cualquier lado de la regin H. Efectivamente, H. Huxley observ en algunas fibras musculares, que existen verdaderos puentes entre el delgado filamento de actina y el grueso de miosina precisamente en la regin A, fuera de la banda de H. Han sido propuestos dos mecanismos para explicar la contraccin, aunque ambos estn de acuerdo en la existencia de dos clases de protenas musculares, una activa y mvil, y la otra, fija. En el primero de los casos, que es el del mecanismo plegadizo, se ha postulado que el TFA se desdobla originando que ciertas molculas de protenas largas se contraigan de una manera semejante a un acorden; las protenas musculares fijas y que se encuentran unidas a estas protenas contrctiles, son removidas de esta manera, a medida que los puntos de anclaje se van juntando cada vez ms. En la hiptesis del mecanismo deslizante, se cree que el desdoblamiento del TFA tiene lugar en serie a lo largo de la fibrilla; cuando esto sucede, los enlaces que sostienen a las protenas mviles unidas a las estacionarias, se van rompiendo paulatinamente, permitiendo, en alguna forma quizs debido a las cargas opuestas de las dos protenas deslizarse una protena sobre la otra. En otras palabras, se ha propuesto que la actomisina se contrae debido a que los filamentos de actina se deslizan sobre los de miosina cuando se hidroliza el TFA; esto da por resultado el efecto observado de traer a las lneas Z ms juntas unas de las otras. Al presente, la seleccin entre estas dos hiptesis se inclina hacia el mecanismo del deslizamiento, aunque realmente no existe ninguna evidencia definitiva para ninguna de las dos. La fisiologa de la clula muscular es un campo excitante y maravilloso. Cuando consideramos lo intrincado del msculo del corazn, por ejemplo, en el cual los principios de la mecnica, de la qumica y de la electricidad estn finamente combinados dentro de un todo que puede funcionar continuamente por muchos aos, no nos queda ms que maravillarnos. Para el bioqumico y para el citlogo, la clula muscular es ese raro recurso que permite estudiar los medios eficientes, con los cuales la naturaleza transforma la energa qumica en energa mecnica. En un futuro no muy lejano, esperamos conocer el verdadero mecanismo.

______________________________________________________________________________ LISTA DE LECTURAS QUE SE SUGIEREN Axelrod, B., "Glycolysis." In Greenberg, D. M. (ed.), 1960. Metabolic pathways. New York: Academic Press. Vol. 1, p. 97. Finean, J. B., 1962. Chemical uhrastructure in living tissues. Springfield, Ill.: Charles C Thomas. Huxley, H. E., "Muscle cells." In Brachet, J., and Mirsky, A. E. (eds.), 1960. The cell. New York: Academic Press. Vol. 4, p. 365. -- -- -- , "The contraction of muscle," Scientific American, November 1958. "Metabolic factors in cardiac contractility," Annals of New York Academy of Science, Vol. 72 (1959), Art. 12.

CAPITULO QUINCE

EL SISTEMA DE LA MEMBRANA Y EL INTERCAMBIO DE MATERIALES Todas las clulas estn constantemente intercambiando compuestos con su medio
ambiente. Los organismos unicelulares como los protozoos, las bacterias o las levaduras toman de su medio ambiente el alimento y dejan en l los productos excretorios y en algunos casos los secretorios. La clula de un organismo pluricelular debe obtener su alimento del que circula en la sangre y tambin secreta sus productos de desecho y algunas veces sus productos especficos, como protenas de la sangre, azcares u hormonas, dentro del torrente sanguneo. Todos estos intercambios son especficos porque solamente determinados compuestos penetran dentro de la clula, y slo otros salen de ella. El mecanismo de esta especificidad reside, casi por completo, en las membranas del plasma que rodean a las clulas.

ESTRUCTURA DE LA MEMBRANA
Las membranas se pueden aislar. El mtodo ms fcil es convertir a los glbulos rojos en "fantasmas"; todo lo que queda despus de cierta clase de extraccin es la membrana del plasma. Tomando como base el anlisis qumico de stas y otras fracciones de membrana, se tiene actualmente la seguridad de que las membranas son primordialmente estructuras lipoproteicas, posiblemente con pequeas cantidades de otros compuestos unidos a ellas. Las lipoproteinas son complejos entre molculas de protena y fosfolpidos o esteroides, en las cuales, los grupos ionizados de las protenas, como los amino grupos cargados, estn electrosttica-

Fig.15-1 Diagrama qumico de la membrana unidad y de la membrana tal como se observa con el microscopio electrnico. (Segn Danielli, Robertson; microfotografa cortesa de W. Stoeckenius, Rockefeller Institute)

mente unidos a grupos cargados de los lpidos, los grupos fosfato e hidroxilo. La Fig. 15-1 es un esquema similar al originalmente propuesto por Danielli, de la apariencia qumica de una membrana; con la protena cubriendo la capa de lpido. La unidad de 75 Angstroms de ancho, ha sido denominada por D. Robertson "membrana unidad" para significar su universalidad celular. Sus relaciones con lo que se puede observar en el microscopio electrnico, tambin se indican en la figura. La estructura resultante tiene propiedades tanto hidroflicas como lipoflicas y es, al mismo tiempo, fuerte, resistente al corte y a la ruptura, pero flexible. Pero su mayor ventaja como membrana parece ser su propiedad de semiexclusividad, o semipermeabilidad, que probablemente proviene de la naturaleza lipoflica de la estructura, conservando las molculas ionizadas excepto bajo ciertas circunstancias. (La ionizacin de un compuesto disminuye notoriamente su permeabilidad a travs de las membranas biolgicas).

Son estas condiciones determinadas las que constituyen la especificidad. A causa de su naturaleza hidroflica, se pens, durante mucho tiempo, que la membrana posea poros; stos podan ser los causantes de su permeabilidad a los pequeos compuestos solubles en agua, pero, cmo poda pasar tambin un pequeo nmero de iones cargados? No existen, sin embargo, pruebas de la existencia de poros, excepto para aquellos tan pequeos que permiten el paso de las molculas de agua. Debe suponerse, por lo tanto, que existe otro mecanismo para la penetracin.

Propiedades de permeabilidad
La membrana del plasma de la clula no es una estructura esttica. Trabaja, no solamente como una barrera semipermeable, sino tambin como una vectorial, en la cual, la direccin del flujo del compuesto es tan importante como la propia naturaleza del compuesto. A causa de esta propiedad, la membrana tiene la capacidad de permitir que ciertos compuestos atraviesen la clula de una solucin exterior menos concentrada a la solucin interior ms concentrada; es decir, moverse contra un gradiente de concentracin. Por ejemplo, la mayora de las clulas conservan la concentracin de su ion potasio ms alta que la de su medio ambiente, y si esta concentracin interior disminuyera, la clula tomara su potasio contra el gradiente de concentracin. Muchos otros compuestos se comportan de una manera similar, por lo que toda clase de clulas debe tener un mecanismo para conservar su ambiente intracelular constante frente a un ambiente exterior variable. De este solo hecho, debemos suponer que se necesita energa para el transporte de materiales a travs de la membrana, puesto que muchos de estos materiales, por decirlo as, tienen que subir una colina. Efectivamente, parece ser que la mayor parte de la energa de la clula se utiliza justamente en el transporte de materiales dentro y fuera de la clula. Esto no quiere decir que todos los materiales estn conducidos activamente contra gradientes de concentracin; algunos pasan a travs de las membranas por simple difusin de la solucin ms concentrada a la menos concentrada. No obstante, gran cantidad de membranas procedentes de toda clase de clulas bacterias, levaduras, glbulos rojos, clulas del rin, epiteliales, musculares son extraordinariamente impermeables a gran nmero de sustancias a menos que algn proceso facilite el paso de estos compuestos. Entre estas sustancias se encuentran muchos iones inorgnicos, tanto cationes como el sodio y el potasio, aniones, como el fosfato y el sulfato, y azcares, aminocidos, cidos grasos y aun hasta el agua misma. Es sorprendente que estas diferentes clases de clulas se comporten casi de la misma manera bajo idnticas condiciones de experimentacin; en otras palabras, parece que las membranas del reino biolgico tienen propiedades similares.

As, se han efectuado experimentos con varias clases de clulas convenientes, como clulas de levaduras, glbulos rojos, o bacterias. Estas clulas se han incubado en un medio que contenga, con varias adiciones, los compuestos cuya permeabilidad se desea probar y luego son centrifugadas de este medio. Las concentraciones de estos compuestos se miden al principio y al final del experimento tanto las del medio como las del interior de las clulas. De esta manera se puede determinar si las clulas toman los compuestos, y tambin algo relacionado con los mecanismos por medio de los cuales lo efectan. Se pueden hacer a veces, ciertas preparaciones de rganos completos, como cortes de vejiga o rin, tiras de diafragma o de mucosa intestinal, o preparaciones de epidermis de rana, a causa de que en estos especmenes, las clulas que estn recubriendo los rganos o los tejidos, se encuentran polarizadas; es decir, presentan una cara distinta en el exterior y otra en el interior unida a las otras clulas del rgano. La estructura de estas dos caras es completamente diferente una de otra; por ejemplo, muchas de estas clulas tienen en su parte exterior, los llamados bordes cerdosos, que son en realidad, finas vellosidades que aumentan el rea de la superficie membranosa. En muchos casos, hasta el interior de la clula se encuentra polarizado, como en las en que los mitocondrios se hallan en un extremo de la clula. Pero cualquier cosa que pruebe la clula, parece que siempre los mismos compuestos se mantienen fuera de las clulas a menos que un mecanismo particular los haga penetrar. De lo que nosotros sabemos hasta ahora, el mismo mecanismo para el transporte del potasio se verifica en todas las clases de clulas, el mismo mecanismo para el movimiento de los azcares se opera en todas las clulas, y as por el estilo. La mayora de estos mecanismos requieren un enlace energtico para el transporte y este abastecimiento de energa se obtiene en ltimo trmino y parece ser que en algunos casos especficamente, del TFA. A tal sistema de enlace energtico se le ha dado el nombre de "transporte activo". En el interior de casi todas las clulas, la concentracin de potasio total es mucho ms alta que en su medio ambiente inmediato y an ms, el elemento se encuentra, en su mayor parte, bajo la forma de iones K+ libres. El magnesio parece comportarse en una forma similar. La concentracin alta tiene lugar debido a que la clula puede tomar K+ a una velocidad mayor de la que puede dejarlo salir, y no porque la membrana sea impermeable al K+; en esta forma parece existir un coeficiente vectorial a la permeabilidad de la membrana (Fig. 15-2). La conservacin de esta concentracin intracelular requiere energa para que los glbulos rojos y las clulas nerviosas -- no as las clulas musculares -- pongan en libertad dentro del medio, apreciables cantidades de K+ si se encuentran bajo condiciones anaerobias, y esta prdida puede evitarse por adicin de glucosa al medio. La glucosa es metabolizada por las clulas, indicando esto que el gradiente para el K+ se conserva gracias a un abastecimiento constante de energa metablica. En realidad se cree que la energa

est implicada en el bombeo de Na+ hacia el exterior, actuando el K+ pasivamente para conservar la concentracin inica. Poco ms o menos el mismo mecanismo se ha mostrado que tiene lugar en las clulas de las bacterias y de las levaduras.

Fig. 15-2. Esquema postulado para el transporte del Na+ y del K+ a travs de las membranas

Adems, en las clulas nerviosas, el flujo de Na+ y de K+ hacia adentro y hacia afuera de la clula est conectado en alguna forma con una polarizacin de la membrana; la corriente que fluye a lo largo de la membrana de la clula nerviosa parece que est correlacionada con un movimiento del K+ desde el interior hacia el exterior de la clula, haciendo el Na+ lo contrario. La fase de recuperacin --la despolarizacin de la membrana, vindola por medio de la siguiente ortda de potencial elctrico-- corresponder , por lo tanto, a un movimiento del Na+ hacia el exterior, y del K+ hacia el interior. Puesto que en ambos casos el flujo del catin est en contra del gradiente de concentracin, tiene que verificarse un trabajo y necesitarse energa. De esta manera, en el caso de la clula nerviosa, se verifican dos mecanismos de transporte de iones, uno conectado con un gradiente electroqumico y dependiente de un estimulo exterior, y el otro sujeto al abastecimiento de energa generada clula por la fcula misma. La membrana que rodea a las fibras musculares, llamada sarcolema, tambin se cree que sea la responsable de su medio inico en la misma forma. De alguna

manera el impulso procedente de las terminaciones nerviosas en el sarcolema debe ser transmitido al interior de las fibrillas nerviosas y se piensa que en determinados lugares, a lo largo del sarcolema, existe un contraflujo de Na+ y de K+. La separacin resultante del flujo de iones origina un gradiente electroqumico en ese lugar. Es un misterio de cmo este gradiente o polarizacin se transmite al interior de los haces fibrosos, pero se ha representado como si se trasladara a lo largo de las membranas llamadas colectivamente retculo sarcoplasmtico, para penetrar dentro de las fibras (vase la Fig. 14-3 ). Este movimiento puede ser de la misma clase que el que se representa a lo largo de la membrana de la clula nerviosa, en la que existen una onda de K+ que sale y una de Na+ que entra a la clula, seguidas por otra onda de K+ que entra y una de Na+ que sale.

HIPOTESIS
Transporte de iones
Se desconoce el mecanismo ntimo por el cual estos iones atraviesan las membranas y la forma como se abastecen de energa. En los ltimos aos se han sugerido varias hiptesis para dar una explicacin de estos hechos pero hasta el presente, no hay certidumbre acerca de la veracidad de ningn esquema. No obstante, se presentarn aqu algunas de las ideas ms aceptadas debido a que creemos que los actos celulares se efectan realmente en una forma generalizada y que estas ideas encierran el meollo de la verdad. Recientemente ha habido indicaciones de que el TFA mismo est implicado tanto en el abastecimiento de energa como en el mecanismo de transporte. Actualmente se ha descubierto que en toda clase de clulas se encuentra una trifosfatasa de adenosina que est localizada en las membranas microsomticas y probablemente, en la membrana del plasma. Se hizo el interesante descubrimiento de que la trifosfatasa de adenosina, que se activaba por Mg+ poda ser adems estimulada por la adicin de Na+ y de K+ y que esta activacin era inhibida por compuestos que anteriormente se haban encontrado ser inhibidores del transporte activo. Podramos hacer un esquema que represente el transporte activo de acuerdo con estos descubrimientos? (Vase la Fig. 15-2). La idea que prevalece actualmente acerca del transporte de las sustancias -- no solamente cationes sino tambin azcares y otros compuestos -- a travs de las membranas es que obra un sistema de transporte, donde un transportador especfico para la sustancia en cuestin fija al compuesto por un lado, de la membrana lo lleva al otro lado, deja al compuesto y entonces regresa para estar listo otra vez para recoger otra molcula de la sustancia. De esta manera, las sustancias ionizadas

pueden ser neutralizadas combinndose con otro compuesto, el transportador hipottico. Se desconoce lo que este transportador X puede ser, pero en el caso del transporte del Na+ y del K+ se cree actualmente que es posiblemente el mismo TFA o el compuesto X-TFA. El mecanismo completo podra actuar como se muestra en la Fig. 15-2. El K+ se combina con X para formar K+-X, el. cual, entonces, se traslada a travs de la membrana y descarga el K+ al interior de la clula, quedando todava X en la membrana. Luego se combina con el TFA para formar X-TFA. Esta sustancia hipottica es atacada entonces por una trifosfatasa de adenosina dando DFA y fosfato inorgnico, y se pone en libertad nuevamente X. Este X libre puede entonces tomar otro K+ y el DFA debe fosforilarse nuevamente dentro de la membrana por algn mecanismo para dar otra vez TFA. Se ha propuesto un enfoque diferente, basado en los ltimos hallazgos de que los conjuntos de transporte electrnicos de los mitocondrios que son partes de estructuras osmticamente activas, pueden actuar en la permeabilidad selectiva y acumular iones. El ltimo proceso es esencialmente vectorial para un ion, es decir, que solamente un ion es transportado activamente, el otro ion en equilibrio elctrico entra por el gradiente de potencial electroqumico as establecido. Si el Na+ es transportado activamente, el C1- se difundir para equilibrar las cargas elctricas de ese lado de la membrana. De esta manera se establece inicialmente una separacin entre las cargas positivas y las negativas1. Los iones hidrgeno y los electrones viajan por diferentes caminos, los primeros por la fase acuosa soluble y los ltimos movindose en alguna forma directamente de un transportador a otro. Recientemente, Davies y Ogston, Conway, Robertson, y particularmente Mitchell, han postulado que los dos procesos, el transporte de electrones y el transporte de iones: son, en realidad, el mismo mecanismo, pero visto desde diferentes puntos experimentales. Esta hiptesis consiste en que la energa empleada para el transporte de ciertos iones, reside no en la informacin del TFA directamente, aunque esto ciertamente sucede al mismo tiempo, sino en la energa ganada por los electrones que pasan de un transportador reducido a uno oxidado, de un potencial ms alto a uno ms bajo. La Fig. 15-3 ilustra esta hiptesis en relacin a la secrecin "cida" por varios tipos de clulas. El proceso del transporte electrnico de los mitocondrios por si mismo proporciona la energa. Asimismo, la cantidad vectorial aumenta en alguna forma debido al hecho de que el transporte electrnico es un proceso isotrpico, yendo por un lado los iones H+ y por el otro los electrones. --------1 Se sabe desde hace tiempo que en las cuplas de oxidacin reduccin del sistema de transporte de

electrones hay tambin una separacin de cargas.

Puesto que la posicin correcta de los transportadores de electrones es muy importante para que se verifique este proceso, una vez ms --suponiendo que este esquema refleje efectivamente la realidad-- se seala la necesidad de una estructura supra-molecular en la cadena transportadora de electrones del mitocondrio. Esto no quiere decir que todo el transporte de los iones tenga lugar a travs de las crestas mitocondriales; lo interesante es que las membranas del retculo endoplsmico, o microsomtico, contienen tambin una porcin de una cadena transportadora de electrones, especficamente una enzima o enzimas que pueden transferir electrones del DNAH2 a un citocromo microsomtico distintivo, el citocromo b5. Que este fragmento transportador de electrones puede tambin actuar como una mquina transportadora de aniones es una posibilidad; como mencionaremos ms adelante, existe una evidencia citolgica para sugerir que estas membranas del retculo endoplasmtico estn en continuidad con la membrana del plasma de la clula, de aqu que sus componentes pueden tener acceso al medio ambiente exterior de la clula. Este no es slo el nico esquema que se ha postulado. De las observaciones efectuadas en diversas clases de tejidos, particularmente en el extico de la glndula secretora de sal del albatros, los Hokins han formulado el concepto que se ilustra en la Fig. 15-4. Este esquema est basado en el descubrimiento de las enzimas activas en las clulas glandulares, como la quinasa diglicrida y la fosfatasa del cido fosfatdico, las que actan sobre sustancias que son solubles en la parte lipodica de la membrana. Adems, (1) si la glndula de sal es estimulada para la secrecin de NaCl por medio del secretagogo fisiolgico, la acetilcolina, hay un marcado aumento en el desdoblamiento del fosfato del cido fosfatdico, medido por el P32; (2) el aumento del ciclo del P32 depende de la presencia de Na+; (3) este ciclo puede ser catalizado por las dos enzimas mencionadas anteriormente, como se muestra en la Fig. 15-4; (4) el ciclo tiene lugar en la fraccin microsomtica obtenida de las membranas de las clulas; y (5) el bastante rpido equilibrio del P32 no solamente con el cido fosfatdico, sino tambin con los fosfatos del TFA, suministra la cintica de este esquema aceptable para su papel fisiolgico postulado. Las caractersticas sobresalientes de este esquema son: el cido fosfatidico acta como un portador de sodio; la enzima quinasa diglicrida reacciona con el diglicrido y con el TFA en una interfase; y los iones del fosfato inorgnico son impedidos de atravesar la superficie exterior de la membrana plasmtica y deben regresar a la clula para ser finalmente incorporados al TFA, completando as el ciclo.

Fig. 15-3. Esquema postulado del transporte de "cido" a travs de la membrana. La "secrecin" de H+ est acoplada al transporte de electrones.(Modificado segn P. Mitchell, J. Gen. Microbiol.)

La energa impulsora para el esquema es, por lo tanto, el TFA, proporcionando su fosfato terminal la fuerza necesaria para la circulacin de los portadores mviles de uno al otro lado de la membrana. El comportamiento de las clulas nerviosas y musculares con respecto al intercambio de cationes a travs de la membrana no es peculiar de este tipo de clulas. Las clulas de las levaduras y de las bacterias tambin realizan un activo transporte de K+, requiriendo un gasto de energa. Las clulas tubulares del rin acumulan K+, lo mismo que los leucocitos.

Fig. 15-4. Esquema referente a la asociacin del transporte del Na+ con el metabolismo del cido fosfatdico. (Segn Hokin y Hokin, J. Gen. Physiol., 44, 1960 )

En contraste con las dificultades que las clulas encuentran para acumular estos cationes un proceso que requiere energa los aniones como el Cl-, parece que atraviesan las membranas sin ninguna asistencia metablica. Una excepcin es el fosfato inorgnico, ya que se necesita energa para transportar fosfatos a travs de las membranas de los glbulos rojos, dentro de las clulas musculares, en los huevos marinos, en las clulas de levadura y dentro de las clulas tubulares del rin. Todos

los experimentos efectuados con fosfato inorgnico llegan a la conclusin de que esta molcula logra atravesar bajo la forma de anin PO42-. Se cree que, en algunos casos, atraviesa como formando parte de la molcula del TFA, que el requerimiento de energa reside en la fabricacin del TFA y que esto tiene lugar en la membrana de la clula. Si existe una trifosfatasa de adenosina en la membrana de la clula, separa el fosfato, y entonces la mitad del adenilato puede considerarse como un portador de fosfato. La evidencia no llega a la conclusin de que existe una trifosfatasa de adenosina en la membrana de la clula de levadura como tambin en la de las bacterias y en la superficie de las clulas de glbulos rojos. En algunos casos, el transporte de K+ hacia el interior se ha unido con el transporte del fosfato, en el mismo sentido como se puede ver en la Fig. 15-2. De esta manera, el portador comn en el esquema, el "TF-X", es un portador comn, tanto para el K+ como para el fosfato. La energa que se necesita en este caso seria para la resintesis del TFA. En el Cap. 11 se hizo la observacin de que los mitocondrios aislados pueden duplicar su formacin de TFA para acumular iones como K+. Los mitocondrios de rin aislados tambin tienen un mecanismo activo para concentrar SO42-, Ca2+,y Mg2+ contra un gradiente de concentracin; este proceso depende de la fosforilacin oxidativa. El punto interesante es que la acumulacin de SO42- por los mitocondrios del rines muy similar, en muchos aspectos, a la toma del mismo ion por los cortes de rin. Uno se pregunta entonces, si no son las membranas mitocondriales ms bien que la membrana del plasma las responsables del transporte activo del SO42-, y quizs, de otros iones, en stas y posiblemente, en otras clases de clulas.

Transporte del azcar

De un modo semejante, en el caso del transporte del azcar a travs de las membranas, la idea de un portador mvil se ajusta muy bien con la evidencia metablica y cintica observada. El paso de los azcares hacia adentro o hacia fuera de las clulas parece que tiene lugar por medio de dos mecanismos diferentes. Uno est ejemplificado en lo que sucede en las clulas epiteliales del intestino pequeo y en los tbulos replegados prximos del rin. Ambas clases de clulas poseen un proceso dependiente de energa que las capacita para transferir glucosa y algunos otros azcares ntimamente relacionados, del lumen del intestino o del tbulo del rin, al torrente sanguneo en contra de un gradiente de concentracin. El otro mecanismo que se ha observado en clulas tales como los glbulos rojos de la sangre, las de tumores ascticos, las musculares, o las del hgado, en las cuales la glucosa puede atravesar las membranas celulares pero no en contra de un gradiente de concentracin, no necesita el gasto inmediato de energa. De hecho, este proceso del transporte pasivo, probablemente tambin tiene lugar en los casos de las clulas

epiteliales del rin y del intestino, puesto que la cintica del transporte del azcar en estos dos casos y en el de los glbulos rojos de la sangre, se asemejan entre s. Esta cintica es muy similar a la que se puede aplicar al proceso enzimtico, de manera que podemos suponer que en el transporte pasivo est actuando un proceso ms complejo que en el de una mera difusin. Se ha observado que tanto el transporte pasivo como el activo, tienen un paso comn, que el azcar penetra a la clula por medio de la combinacin con un portador. Este no necesitara energa e in toto debiera ser el proceso de transporte pasivo. Para explicar la "ascensin" del azcar contra un gradiente de concentracin se ha propuesto el concepto de un portador mvil; se cree que este portador recoge el azcar de un lado de la membrana, lo lleva consigo al otro lado y luego lo abandona en este lado de la clula. (Fig. 15-5). Este concepto es ms real que terico porque (1) existe una gran especificidad en la clase de azcar que puede atravesar la membrana; (2) hay una competencia. entre los diversos azcares para su transporte y por lo tanto, para este portador y (3) la forma como estos azcares entran en las clulas, la llamada cintica de la penetracin, se acopla bien con la forma como se cumplira el proceso, si el portador estuviera implicado.

Fig. 15-5. Transporte de azcar a travs de las membranas

Por ejemplo, podemos comparar dos azcares, el S1 y el S2 (Fig. 15-5) que se combinan con el portador mvil X, siendo trasladados a travs de la membrana, como se muestra en la figura. Si uno de los azcares ya est equilibrado con el portador, formando S1X, y se aade entonces el otro azcar, S2, el primer azcar se eliminar dentro del medio contra su propio gradiente de concentracin. Este resultado se puede explicar suponiendo que como S2 compite con xito con S1 por el X y se combina con ste, al mismo tiempo se pone en libertad S1 del X. Conocemos algo acerca de este portador, por las propiedades de los azcares que logran pasar, por ejemplo, su configuracin (D o L) y la forma en que estn plegados en estructura tridimensional. Lo que se necesita ahora es encontrar un compuesto o algunos compuestos que tengan las configuraciones estructurales que los hagan acoplarse a las estructuras de los azcares especficos y tambin que sean solubles en la estructura lipoltica de la membrana. Este portador mvil, de alguna forma necesita energa a fin de trabajar, pero no sabemos exactamente el lugar del esquema donde entra esa energa.

TRANSPORTE EN MASA
En la mayor parte de las clulas, excluyendo las bacterias y algunos hongos, existen membranas intracelulares. En algunos casos estas membranas forman una extensa red intracelular, como se puede observar en las micrografas electrnicas (vase el Cap. 3), en tanto que en otros, las membranas estn ms bien esparcidas. En algunas clulas y en algunos casos, cuando el corte del material es favorable, se puede observar claramente la continuidad entre estas membranas intracelulares y la membrana del plasma que rodea a la clula (Fig. 15-6A). En otros cortes se puede ver que estas membranas estn tambin en continuidad con una de las membranas que rodean el ncleo (Fig. 15-6B). Haciendo cortes en serie de tejidos fijados y luego examinando las micrografas electrnicas de estos cortes, los investigadores han encontrado varios puntos clave concernientes a la estructura interna de la clula. Uno es que el sistema de membranas, en las clulas en que es extenso, divide a la clula en dos compartimientos, uno que queda dentro de las membranas y est rodeado por ellas, y el otro que est afuera. Existe bastante continuidad entre los espacios rodeados por estas membranas. En algunos casos, estos espacios tienen la forma de largos tbulos, en forma de dedos; en otros, tienen la forma de grandes glbulos; y an ms, en otros, parecen grandes vesculas, aplanadas, llamadas cisternas; pero no importa cul sea su forma, todos estos espacios parecen estar en continuidad unos con otros. Este sistema de espacios interconectados ha recibido el nombre de retculo endoplasmtico (vase el Cap. 13). Los mitocondrios y varias inclusiones celulares, tales como los cuerpos secretorios en algunas clulas, quedan

Fig. 15-6. A: Macrfago del bazo, mostrando las penetraciones de la membrana del plasma, en continuidad con las membranas intracelulares (x 37500) B: Clula muscular lisa del intestino, mostrando la continuidad de la membrana nuclear nuclear exterior con las membranas del retculo endoplasmtico (x 52000). PM, membrana del plasma; M, mitocondrios; N, ncleo; Ic, uniones entre los espacios citoplasmtico y perinuclear; P, poro nuclear; Nm, membrana nuclear interior; ER, perfiles del retculo endoplasmtico; R, ribosomas; S.E.R. perfiles y cortes longitudinales de las membranas del retculo endoplasmtico, que se encuentra en continuidad con la membrana del plasma. (Cortesa de G. Palade, Rockefeller Institute).

fuera de estos espacios. Algunas veces, dentro de ellos se pueden observar cuerpos densos, de funcin desconocida. Pero lo ms interesante es que el ncleo, con su nica membrana que lo rodea, parece estar colocado en un gran espacio ensanchado dentro de estas membranas. Aunque se debe hacer una salvedad, y es que estos elementos membranosos del retculo endoplasmtico no encierran completamente al ncleo, de manera que quedan numerosas aberturas o poros sobre la superficie nuclear. Sin embargo, parece ser que estos poros estn tapados y por esto debemos suponer que no son aberturas a travs de las cuales puedan pasar los materiales entre el ncleo y el citoplasma sino que representan la envoltura incompleta del ncleo por las membranas endoplasmticas. Como se ilustra en el diagrama compuesto, estilizado de la Fig. 3-3, la clula no es una entidad autoencerrada en una membrana que la separa del exterior sino una estructura con canales que la comunican con el exterior (quizs slo intermitentemente), los cuales penetran lo bastante profundo de manera que pueden alcanzar, y algunas veces lo hacen, la regin nuclear hasta el espacio perinuclear que rodea al ncleo. As, la proporcin de membrana accesible al medio ambiente est grandemente aumentada y la mayor parte de la clula est en ntimo contacto con el medio ambiente, bloqueada solamente por la cortina activa de una sola membrana. Penetran los materiales del exterior de esta manera? En algunas clulas tiene lugar un proceso que se ha denominado pinocitosis. La membrana celular forma una invaginacin, la que se agranda y finalmente se estrecha encerrando dentro de ella un poco del medio ambiente exterior. Esta vescula se dirige hacia el interior donde se rompe y tal vez deja su contenido en el interior de la clula. El proceso de la pinocitosis se puede observar claramente en la ameba, donde con claridad se verifica en gran escala; este es, probablemente, el medio de que se vale la ameba para tomar su alimento. Las amebas cuando se desarrollan en un medio que contiene glucosa, toman este azcar dentro de las vesculas pinociticas; empleando glucosa radiactiva, como lo hizo Holter, podemos determinar por medio de la radioautografa, lo que sucede. Este proceso parece ser inducido por la presencia de alguna protena en el medio, porque sin ella, no se verifica la pinocitosis. Una vez dentro de las vesculas de la clula, la glucosa radiactiva aparece en el medio citoplasmtico general; seguramente el recubrimiento de las membranas de las vesculas se rompe de alguna forma y pone en libertad la glucosa dentro de la clula. Sin embargo, no todos los compuestos del medio exterior son tomados, y as debe ser, ya que aun aqu existe una selectividad. Se cree que esto sucede porque hay sitios especficos en la membrana celular donde se fijan algunos compuestos y no otros, y cuando la membrana se invagina, estos compuestos extra-celulares fijados, penetran junto con ella. Un ejemplo interesante es el de la clula endotelial muy delgada que cubre a los capilares sanguneos (Fig. 3-5B); parece ser que los

materiales son transferidos de la sangre al interior de los espacios intersticiales, literalmente acarreados a travs de la clula en pequeas vesculas; stas se forman en un lado de las clulas, viajan a travs de la estrecha clula, se fusionan con la membrana del otro lado, y as descargan su contenido fuera de la clula --pero del otro lado. Otro ejemplo es la fabricacin y secrecin de las enzimas digestivas: quimotripsingeno, tripsingeno, amilasa, procarboxipeptidasa y la ribonucleasa, por las clulas acinares del pncreas. Estas enzimas se sintetizan sobre los ribosomas que se encuentran adheridos a las membranas del retculo endoplasmtico. Luego son puestas en libertad de alguna forma de estas partculas, atraviesan las membranas del retculo, y entran a los espacios vesculares. En estos canales viajan hacia la regin de Golgi, en la parte basal de la clula. Aqu, al parecer, son reunidas para formar grandes y densos cuerpos, los que son envueltos por las membranas de la regin de Golgi. Las ltimas membranas lisas estn en continuidad con las membranas que tienen ribosomas unidos a ellas y por lo tanto, hay un paso continuo de una parte de la clula a la otra. Estos cuerpos recubiertos son ahora los grnulos de zimgeno maduros peculiares de las clulas acinares pancreticas. Cuando el pncreas es estimulado para la secrecin, los grnulos de zimgeno se dirigen a la parte basal de la clula, la que rodea a uno de los ductos del pncreas. La membrana del grnulo de zimgeno se fusiona entonces con la membrana celular; se hace una fisura en esta ltima y el contenido enzimtico de los grnulos se vierte dentro del lumen glandular, y por medio de los ductos pancreticos es finalmente descargado en el duodeno. La Fig. 15-5 muestra algunas etapas de este proceso. Todos estos casos indican que las membranas intracelulares no son estticas, que la propia estructura celular, aun de las clulas fuertemente restringidas de un organismo pluricelular, se encuentra en un estado fluido. Ciertamente, las observaciones efectuadas en las clulas de cultivos de tejidos muestran muy claramente los movimientos constantes de materiales hasta de cuerpos como los mitocondrios dentro de estas clulas. En algunas de las clulas polares, que toman los materiales por un extremo o que los descargan por un lado, se cree que tambin hay un flujo de membrana, en una sola direccin, de un lado de la clula al otro. La estructura celular no es la de un cuerpo rgido sino la de un flujo que constantemente est cambiando. As, adems de los procesos de transporte que utilizan sistemas transportadores para acarrear materiales hacia el interior de las clulas, existe otro mecanismo, el del flujo de la membrana y la formacin de vesculas. Probablemente el ltimo proceso necesita energa para contraer y expandir las membranas. Ciertamente puede ser que muchas clulas utilicen ambas formas para proporcionarse materiales. El estudiante habr comprendido, por el anterior razonamiento, que nuestros conocimientos, en lo que se refiere a la mecnica del transporte de materiales, estn lejos de ser completos. El problema es el mismo que est implicado para dilucidar la

contraccin de los msculos la conversin de la energa qumica en trabajo mecnico. Hasta que el sistema morfolgico completo pueda romperse en sus partes componentes, las preguntas concernientes al movimiento de materiales quedaron sin contestacin. ___________________________________________________________________

LISTA DE LECTURAS QUE SE SUGIEREN

Crane, R. K., "Intestinal absorption of sugars", Physiological Reviews, Vol. 40 (1960), p. 789. Finean, J. B., 1961. Chemical uhrastructure in living tissues. Springfield, Ill.: Charles C Thomas. Holter, H., "How things gel into cells", Scientific American, September 1961. -- -- -- , "Pinocytosis", Annals of New York Academy of Science, Vol. 78 (1959), p. 524. Katz, B., "How cells communicate", Scientific American, September 1961. -- -- -- , "The nerve impulse", Scientific American, November 1952. Keynes, R. D., "The nerve impulse and the squid", Scientific American, December 1958. Lefevre, P. G., "Molecular structure factors in competitive inhibition of sugar transport", Science, Vol. 130 (1959), p. 104. -- -- -"Active transport through cell membranes", Protoplasmatologia, Vol. 8 (1955), No. 7a. (Springer-Verlag, Vienna.) Palade. E., "Endoplasmic reticulum", Journal of Biophysical and Biochemical Cytology Supplement 2 (1956), p. 85. Porter, E., "Cell membrane and its properties". In Brachet, J., and Mirsky A. E. (eds.), 1961. The cell. New York: Academic Press. Vol. 2, p. 1. Porter, K. R., "The ground substance: observations from elcctron microscopy". In Brachet, J., and Mirsky A. E. (eds.), 1961. The cell. New York: Academic Press. Vol. 2, p. 621. -- -- -- , "Submicroscopic morphology of protoplasm", Harvey lectures, 1955-1956. New York: Academic Press. Page 175. Robertson, J. D., "Membranes of living cells", Scientific American, April, 1962. Robertson, R. N., "Ion transport and respiration", Biological Reviews, Vol. 35 (1960), p. 231. Solomon A. K., "Pores in the cell membrane", Scientific American, December 1960. Wilmer, E. N., "Steroids and cell surfaces", Biological Reviews, Vol. 36 (1961), p. 368.

CAPITULO DIECISEIS DESARROLLO Y CONTROL DE LA ESTRUCTURA Y FUNCION CELULAR En los ltimos captulos hemos puesto nuestra atencin en el funcionamiento de
las unidades individuales que constituyen la maquinaria viviente. Lo maravilloso de la clula es que todos sus procesos estn ntimamente correlacionados dentro de un proceso rtmico de crecimiento y divisin de la clula. Cmo estn ligados los millares de procesos tanto en tiempo como en espacio para producir los fenmenos unificados de la vida? Hasta la fecha conocemos muy pocas respuestas para esta tan importante pregunta, de manera que nos contentaremos en este captulo, a dirigir nuestra atencin a algunas posibles entradas de acercamiento y sugerir la direccin en la cual el trabajo futuro probablemente deba encauzarse. Discutiremos el problema de la regulacin desde dos puntos de vista: el enzimtico y el estructural.

EL NIVEL ENZIMATICO
El hecho de la coordinacin enzimtica de la actividad celular se demuestra por la observacin de que la clula rara vez sintetiza o descompone ms de lo que le es necesario para su metabolismo normal y su crecimento; se demuestra tambin por el hallazgo de que la clula es un organismo homeosttico; si se le hace algn dao reparable, la clula misma puede arreglarlo. Aun es posible que al ocurrir determinadas mutaciones en el ADN y que, por lo tanto, no se formen ciertas enzimas, los metabolitos esenciales puedan todava

producirse, pero en alguna otra forma que no sea la "normal"; ste puede ser el significado de los caminos metablicos alternos tratados anteriormente.

Fig. 16-1. Mecanismos de control de la actividad enzimtica.

El control del metabolismo celular se centra alrededor de la regulacin del tipo, cantidad y actividad de ]a enzima; esta ltima est determinada, en gran parte, por la naturaleza de la misma reaccin enzimtica. Estas reas de regulacin se pueden trazar, como se muestra en la Fig. 16-1, numerando las de acuerdo: (1) control del tipo y cantidad de enzima por los mecanismos que actan por el gen o ADN y mediante el sistema formador de enzimas; (2) control de la actividad enzimtica mediante factores que son especficos para una enzima en particular, como el pH, etc. y (3) control de la actividad de la enzima por la naturaleza y cantidad del producto que se forma. Trataremos cada uno de estos casos posteriormente. La velocidad de la reaccin est limitada por la cantidad de las molculas de enzima activas y la cintica de la reaccin. La primera, a su vez, est influida directamente por el mecanismo sintetizador de enzimas de la clula, por el ADN, por el ARN y por los tres ribosomas mencionados anteriormente; como tambin, indirectamente, por las concentraciones de los substratos y los productos de la reaccin enzimtica especial. La cintica est influida por las condiciones que prevalecen en el medio de la reaccin, por la concentracin de los substratos y por la presencia o ausencia de cofactores, activadores, inhibidores, pH y otros. Trataremos primero el ltimo caso, marcado con los nmeros (2) y (3) en la Fig. 16-1.

Variaciones de la actividad enzimtica

Los substratos y los productos de la actividad enzimtica tienen gran influencia en la velocidad de la reaccin. Cuando se aumenta la concentracin del substrato, aumenta la actividad enzimtica. Si la reaccin es reversible, tanto en la prctica como en teora, el efecto de la accin de masa entra en juego, puesto que el aumento en la concentracin del producto tender a disminuir la reaccin, ocasionando el equilibrio. En muchos casos, el producto de la reaccin inhibe la reaccin compitiendo con el substrato por la superficie activa de la enzima; el grado de esta inhibicin depender de la relativa concentracin del substrato y del producto, y de las afinidades relativas de cada uno de stos por la enzima. De esta manera, a medida que el producto se acumula, la velocidad de su formacin disminuye. La mayor parte de las enzimas parecen ser una parte de un conjunto de reacciones lineales, o en secuencia; es decir, el producto de una reaccin es el substrato para la enzima prxima en la serie. En algunos pocos casos, se ha encontrado que en una secuencia de reacciones, A B C D, el producto de la reaccin C D inhibe la reaccin enzimtica A B. Esto se ha llamado

mecanismo de "reutilizacin"; cuando D aumenta a cierta concentracin, cierra la serie completa de reacciones que conducen a su formacin futura. El problema interesante aqu, es que en la mayora de los casos, el producto C D no tiene semejanza espacial con el substrato o con el producto implicado en la reaccin A B; no tenemos idea de cmo compite con un substrato al que no se asemeja, por un sitio comn en una superficie enzimtica. Una respuesta posible sera que pueden haber dos sitios en la enzima que afectan su actividad --uno para la combinacin con su substrato y el otro para la combinacin con su inhibidor de "reutilizacin"-- y que la enzima, en el ltimo estado, est inhibida. La Fig. 16-2 muestra un ejemplo, basado principalmente en las investigaciones de Magasanik, de un ciclo sinttico en el metabolismo de los nucletidos, en el que se encontraron varios casos de inhibicin enzimtica algunos por reutilizacin de la actividad enzimtica y otros por la represin en la formacin de la enzima. En este ciclo, el fosfato-5-guanosina puede dar lugar al fosfato-5-adenosina, a travs de los intermediarios fosfato-5-inosina y el succinato de adenilo. El fosfato-5adenosina puede, por supuesto, ser fosforilado a TFA. Este ltimo compuesto acta entonces para reprimir su propia formacin por medio de una inhibicin de reutilizacin sobre la enzima formadora del fosfato-5-inosina a partir del fosfato-5guanosina. Reciprocamente, el fosfato-5-guanosina puede provenir del fosfato-5inosina a travs del fosfato-5-xantosina. Aqu el FMG inhibe la actividad de la reaccin enzimtica inicial, la oxidacin del fosfato-5-inosina a fosfato-5xantosina. Asimismo, como se ilustra en la figura, la histidina se sintetiza a travs de un paso que implica al fosfato-5-adenosina; aqu de nuevo la histidina inhibe la actividad de la segunda enzima en la serie, retardando efectivamente su propia sntesis. En todos estos casos, parece que cuando el producto final de una serie de reacciones enzimticas llega a cierta concentracin, impide que se contine su propia formacin, inhibiendo la actividad de una de las enzimas, generalmente una de las primeras, en su paso sinttico. Otro punto de control se deriva del hecho de que el mismo compuesto puede servir como substrato para ms de una enzima. Por ejemplo, dos secuencias de reacciones pueden cruzarse en un punto; en este caso, la direccin se puede regular entonces por las velocidades relativas de las reacciones ms lentas, las reacciones de "apertura de paso" en cada serie. Cualquier mtodo que pueda acelerar a estas reacciones de apertura de paso, acelerar el paso completo. Si el substrato tiene una mayor afinidad para unirse a una enzima ms que a la otra, esto influir tambin en la direccin del metabolismo. Porque, si la concentracin del substrato es muy baja, reaccionar solamente con la enzima para la cual tiene una gran afinidad; es decir, la Km de la reaccin es mayor1. ----------1Si se aumenta la concentracin el substrato comenzar a reaccionar con la segunda enzima, donde el Km es ms alto.

Fig. 16-2 Inhibicin de reutilizacin y represin de la enzima. (Segn B. Magasanik, J. Biol. Chem. , 235, 1960)

Otra forma de regulacin en tal situacin fue discutida anteriormente: si el substrato en cuestin est unido enzimticamente a un segundo compuesto. y si este compuesto se encuentra en altas concentraciones, el substrato tender a entrar en ese camino de la sntesis. De esta manera la concentracin de esta segunda molcula acoplada puede actuar como un medio regulador. Hay muchas otras formas, demasiado numerosas para mencionarlas aqui, en las que los compuestos solubles de una clula, sean substratos, coenzimas o iones pueden influir en una reaccin enzimtica; la mayor parte de estos medios tericos de regulacin han sido observados en los experimentos in vitro. Por ejemplo, hemos visto en los Caps. 11 y 14 que el nivel de un cofactor, en ese caso el DFA, puede regular la actividad enzimtica. Hay suficientes ejemplos de la misma naturaleza que nos permiten generalizar que la respiracin y la fosforilacin doble, responden a la necesidad de TFA de clula para la maquinaria sintetizadora. Se ha observado que las coenzimas como el DNA y el DNAF existen en pequeas cantidades en la clula en relacin con el nmero de reacciones enzimticas en que participan; estos hallazgos dan lugar a la especulacin de que las concentraciones y las condiciones de estos compuestos, ya sean oxidadados o reducidos, pueden determinar la direccin de un paso metablico en el caso de estos pasos alternativos. Por ejemplo, en la sntesis de los cidos grasos y esteroides, hay necesidad de un DNA y de un DNAF reducidos; el estado de reduccin de estas coenzimas puede muy bien influir el destino de la grasa en la clula, si ser oxidada para producir energa o si seguir su transformacin para dar lugar a cidos grasos superiores. Por supuesto, el estado de reduccin de estas coenzimas depender de las velocidades relativas de reduccin y oxidacin por las deshidrogenasas de la clula. De esta manera creemos que la condicin del medio en el cual acta la enzima, determina, en gran parte, la velocidad de su actividad y no cabe duda que la clula emplea muchos de los medios bosquejados anteriormente para regular la actividad enzimtica. Debe tambin tenerse en cuenta, sin embargo, que muchas enzimas no son solubles en las clulas; estn rodeadas por estructuras y sus actividades estn influidas por stas. Por ejemplo, cualquier aflojamiento, cualquier cambio en la forma en que la enzima est unida a una membrana, influir en su actividad. Inversamente, el hecho de que algunas enzimas estn en ciertas estructuras dentro de la clula significa que sus substratos no pueden tener libre acceso a ellas. Un substrato puede ser atacado por una enzima de preferencia que por otra, no debido a ciertas propiedades intrinsecas de los complejos respectivos enzima-substrato sino simplemente a causa de que tiene ms fcil el acceso a la primera enzima. Ciertamente, esta propiedad ha sido postulada por algunos autores tomando en

consideracin el efecto Pasteur; este efecto es que, en condiciones aerobias se inhibe la gliclisis de la glucosa a cido lctico. Al presente, la clave de lo que es sin duda un importante mecanismo regulador celular, este efecto Pasteur, es buscada generalmente pero hasta ahora, sin xito entre los procesos fosforilativos gliclicos y oxidativos. Se ha pensado, durante mucho tiempo, que puesto que la glucosa debe ser fosforilada por el TFA y la hexoquinasa con el fin de colocarla en el camino glicoltico, el punto de regulacin del efecto Pasteur debe estar en esta reaccin de la hexoquinasa. Puede ser que durante las oxidaciones aerobias, los mitocondrios utilicen todo el fosfato inorgnico disponible de la clula, dejando muy poco para la fabricacin glicoltica del TFA para ser utilizado por la hexoquinasa. Si, al mismo tiempo, el TFA fabricado en los mitocondrios tiene dificultad de ser liberado por ellas, la gliclisis se reducir debido a la escasez de estos cofactores. Sin embargo, la fosforilacin de la glucosa es solamente el paso inicial en la gliclisis y no puede ser el limitado. De esta manera, mientras se ha visto que la carencia de fosfato o de DFA, no inhibe la fosforilacin de la glucosa o la absorcin de sta por la clula, en cambio produce un bloqueo en la formacin del cido lctico a partir de la glucosa. Ciertamente, parece tambin inverosmil que los mitocondrios al utilizar fosfato inorgnico o DFA en la fosforilacin oxidativa, puedan conservar un nivel intracelular tan bajo como para perjudicar la utilizacin de la glucosa o la fosforilacin y formacin de cido lctico. En la actualidad, a pesar de la gran cantidad de investigaciones, el efecto Pasteur, todava se encuentra sin explicacin. Parece dudoso que los niveles de fosfato inorgnico o de DFA, aun si stos estn compartidos entre los mitocondrios y el resto de la clula, puedan explicar por si solos el efecto. Igual duda puede expresarse acerca de la competencia entre las enzimas glicolticas y las oxidativas por aquellas coenzimas comunes a ambas, como el DNA o el DNAF.

Variaciones de la cantidad enzimtica

Adems de los mecanismos asociados con la regulacin de la actividad enzimtica, existe otra forma de coordinacin del metabolismo en la clula que est relacionado con la regulacin de la cantidad enzimtica (marcada con el (1) en la Fig. 16-1 ). Se ha descubierto en los microorganismos, habiendo muy pocos casos reportados para clulas de organismos pluricelulares, un fenmeno llamado de induccin y represin enzimtica; ambos tienen que ver con el control de la sntesis de las enzimas. Por ejemplo, en las bacterias, las concentraciones de algunas enzimas dependen, extraordinariamente, de las condiciones de crecimiento, de la composicin del medio. Se ha encontrado, en muchos casos, que la adicin de un substrato puede inducir a la maquinaria sintetizadora de protenas de las

bacterias, a sintetizar muchas molculas de la enzima que ataca este substrato en particular. Cuando el substrato es metabolizado y desaparece, cesa la sntesis de esta enzima. Se ha postulado sobre esta base, que en una serie lineal de reacciones enzimticas, el producto de la enzima1, que es el substrato de la enzima2, puede inducir la sntesis de sta, y as sucesivamente. Aun se ha supuesto que este mecanismo puede explicar la formacin de nuevas enzimas en las primeras etapas del desarrollo embriolgico. En la situacin inversa, algunos compuestos pueden provocar una represin en la formacin de enzimas. Este efecto represivo puede ser inducido por el producto de la enzima en cuestin. En algunos casos de una serie lineal de reacciones enzimticas, el producto de la enzimas puede causar la represin en la formacin de la enzimas. La Fig. 16-2 muestra dos ejemplos de este efecto represor. La guanina puede actuar en dos sitios para suprimir la formacin del fosfato-5-guanosina: uno, para eliminar la formacin de la enzima inosinicasa, enzima que est implicada en la sntesis del fosfato-5-adenosina; y dos, para inhibir la sntesis de la enzima deshidrogenasa del fosfato-5-inosina, la que se encuentra en el camino de la formacin del fosfato-5-guanosina. Tanto en el caso de la induccin como en el de la represin enzimtica, las molculas de poco peso molecular no reaccionan para aumentar o inhibir la actividad enzimtica, pero actan en el sitio gentico que tiene injerencia en la sntesis de esa determinada protena. Existen algunas pruebas procedentes de estudios genticos bioqumicos de que, en las clulas bacterianas que pueden producir enzimas inducibles, el gen que controla la formacin de esta enzima est compuesto de material gentico que codifica la sntesis de esa protena, como tambin de un gen represor, y que este ltimo inhibe la expresin del primero. Se supone que al aadir un inductor, ste se combina con el gen represor, permitiendo de esta manera el funcionamiento del otro gen. Se considera que la represin de la enzima funciona en una forma similar.

Las enzimas y la estructura celular

En resumen, estamos empezando a comprender cmo la concentracin de molculas pequeas dentro de la clula puede controlar sus actividades enzimticas. La formacin de intermediarios tiene lugar en una serie de reacciones metablicas. En esta serie, la velocidad de la reaccin completa depende de la velocidad de la ms lenta, y esta velocidad a su vez, depende de la cintica de la interaccin enzima-substrato. Si este substrato es tambin comn a otro camino metablico, debe haber algn medio para controlar la direccin del trayecto metablico.

Este control puede verificarse si el producto del camino metablico acta como un inhibidor del camino alternativo o por inhibicin de reutilizacin, o reprimiendo la formacin de la enzima, que ataca primero al substrato en cuestin a lo largo de ese camino. Por lo tanto, est claro que el producto de las reacciones enzimticas tiene mucho que ver con la velocidad de su propia formacin y con la velocidad de las reacciones. Por supuesto, la forma cmo estos productos estn divididos dentro de la clula tiene un efecto restrictivo sobre estas interacciones. Si un producto se mueve dentro de una parte diferente de la clula, significa que ha salido de la esfera de la enzima que se supone est influida por l. En el caso de la clula bacteriana, en la que no existe evidencia de membranas internas, esto no representa una complicacin. En otras clulas, sin embargo, es casi una verdad que lo que se ha observado en las bacterias, referente a inhibiciones en la formacin y en la actividad de las enzimas, tiene variaciones por el hecho de que existen diferencias de concentracin del mismo compuesto en las diferentes partes de la clula. Esta concentracin de los compuestos libres est regida, no solamente por las barreras de las membranas intracelulares, sino por la probabilidad de que muchos de estos compuestos estn ligados a otras molculas no covalentemente, aun a las membranas. Lo que nosotros consideramos como compuestos libremente accesibles a las enzimas puede ser que no lo sean realmente dentro del marco estructural de la clula. Sabemos, por ejemplo, que el DNAH se forma durante la gliclisis. Tambin sabemos que este DNAH puede ser empleado por la clula para producir energa en la produccin del TFA. No se conoce precisamente cmo el DNAH se utiliza, pero nuestra observacin frecuente es que de alguna manera penetra dentro de los mitocondrios, all es oxidado por medio de la cadena transportadora de electrones y as produce los equivalentes de energia bajo la forma de fosfatos de elevada energa. Pero no tenemos ninguna indicacin de cmo, ni de si el DNA. consigue penetrar dentro de los mitocondrios. Parece ser que de alguna manera la membrana mitocondrial tiene una influencia reguladora sobre el metabolismo de la coenzima y concomitantemente, sobre el metabolismo de la energa. El verdadero hecho de que las enzimas individuales y aun los ciclos metablicos completos estn en compartimientos dentro de la clula indica fuertemente que la estructura interna de ella est condicionada para una regulacin sencilla por su misma configuracin. En una solucin podemos medir las diferencias de afinidad entre el propio substrato y las diversas enzimas que actan sobre l, y entre la misma enzima reaccionando sobre substratos que varan ligeramente. Estas afinidades, sin embargo, pueden no tener significacin dentro de la clula dividida. Los bioqumicos han trazado los lugares dentro de la clula donde tienen lugar la mayor parte de los pasos enzimticos individuales, pero no se sabe cmo estos pasos se unen en una clula que funciona fcilmente. An el ms fundamental de estos pasos ha escapado a nuestros experimentos interpretativos especialmente, cmo el piruvato procedente de la gliclisis en la matriz soluble de la clula,

penetra en los mitocondrios para ser oxidado. Por lo tanto, el descubrimiento de los citlogos de la maravillosa arquitectura interior de la clula, ha abierto para los fisilogos y para los bioqumicos, nuevos campos para futuras investigaciones.

EL NIVEL ARQUITECTONICO
Hemos sugerido que la diversidad arquitectnica de la clula debe desempear un papel en el control y regulacin de las muchas y diversas reacciones bioqumicas que tienen lugar simultneamente en la clula. Ahora la pregunta lgica es la siguiente: Cmo es elaborado el complejo arquitectnico de la clula? O ms especficamente, "Cmo es fabricada la membrana? Cmo se organiza un cilio? Cmo se dispone el huso? ". Aunque no podemos contestar a estas preguntas, comenzamos a hacer algunos progresos mediante los sistemas "modelos" sencillos. En la coagulacin de la sangre, por ejemplo, sabemos que una enzima (trombina) puede actuar sobre una protena soluble (fibringeno) y separar dos pptidos cortos. Esta accin modifica las molculas del fibringeno de tal manera, que origina que reaccionen especficamente entre si para formar una malla de fibras altamente organizada (Fig. 16-3) que constituyen el cogulo de sangre (fibrina). Esta interaccin especifica tiene lugar a pesar de la presencia de muchos otros tipos de molculas de protenas en el plasma de la sangre. La malla de fibrina parece estar sostenida por fuerzas secundarlas dbiles puesto que se puede disolver fcilmente en diversos disolventes suaves ( cido actico al 2% ). Una segunda enzima (fibrinasa)

Fig. 16-3. Microfotografa electrnica de un segmento de fibra de fibrina teida con cido fosfotngstico (x148800). Cortesa de C.E. Hall y H.S. Slayter, Massachusetts Institute of Technology )

puede hacer a la malla de fibrina insoluble en gran variedad de disolventes y podemos sacar en conclusin que entonces est unida por medio de enlaces covalentes. No comprendemos hasta ahora los detalles moleculares de la ltima reaccin. El sistema que hemos descrito es relativamente sencillo. No obstante, es un modelo interesante para el estudio de las series de reacciones controladas enzimticamente que resultan al formarse una estructura fibrilar organizada. Uno puede predecir tambin que la clula es capaz de utilizar enzimas especficas para reaccionar con protenas estructurales especficas, modificndolas de tal manera, como para que interaccionen especficamente y originen estructuras peculiares. Se han estudiado activamente varios otros sistemas de interaccin de protenas. En el campo de la inmunologa, la interaccin altamente selectiva entre los antgenos y los anticuerpos est proporcionando mucha informacin para el conocimiento detallado de la naturaleza de las fuerzas moleculares implicadas en la interaccin protena-protena y protena-carbohidrato. Estas y otras investigaciones han conducido a la hiptesis general de que la interaccin entre las macromolculas se debe a la "complementariedad" de sus superficies respectivas, que encajan entre si como una llave en la cerradura. Quizs la investigacin ms espectacular sobre la morfognesis de la estructura fina es la efectuada con el virus del mosaico del tabaco y se remite al estudiante al excelente libro y artculo de Fraenkel-Conrat (vase la Lista de Lecturas que se sugieren al final de este captulo). Estos estudios muestran que las necesidades para la formacin de un virus de arquitectura compleja estn cimentadas en las propiedades de las sub-unidades individuales, en este caso, en las 2200 subunidades de protena y la larga cadena de ARN (Fig. 16-4). De esta manera creemos que el plegamiento (estructura secundaria y terciara ) de la subunidad de protena es tal que es capaz de interactuar consigo misma y con el ARN para formar una partcula de virus de diseo sumamente regular y preciso. Queda por verse si todas las estructuras de las clulas son igualmente capaces de formarse de novo precisamente a partir de sus macromolculas componentes. Recientes investigaciones de Sonneborn sobre la herencia de la capa externa o crtex del Paramecium, indican que la presencia de ciertas caractersticas estructurales en la capa externa se perpetan de generacin en generacin, independientemente de la naturaleza especifica del material gentico y del resto del citoplasma. Parece ser que la capa cortical es instrumental en la formacin de ms capa cortical. La autorreproduccin de los cromosomas, por supuesto, un fenmeno establecido y tenemos razn al creer que otras estructuras celulares como los centrolos y los cloroplastos y posiblemente hasta los mitocondrios, son taro bin autoduplicativos.

Fig. 16-4. A: Micrografa electrnica del virus del mosaico del tabaco (x 60000). Los bastoncitos (15 x 300A) estn compuestos de 95% de protenas y de 5% de ARN. El peso molecular es aproximadamente de 40 millones. B: Modelo de Caspar-Klug del virus del mosaico del tabaco. La espiral interior (negra) es la cadena del cido nucleico enrollndose en una hlice plana. Alrededor de ella, en ngulos convenientes se encuentran las subunidades de protenas (slidos blancos de forma elipsoidal) que constituyen la "capa" del bastoncito del virus. (Fotografas cortesa de Wendell M. Stanley Virus Laboratory University of California )

Es as cmo para las estructuras ms complejas de la clula, es necesaria alguna estructura para el desarrollo de ms estructura. Sea cual fuere el mecanismo de la autoduplicacin del organulo celular, creemos que se probar que depende de la especificidad de la interaccin entre las macromolculas. Lo que nosotros encaramos es un proceso por el cual determinado organulo celular se desarrolla, seleccionando la macromolcula apropiada en su medio ambiente. No se excluye por supuesto el papel de las enzimas en preparar a estas macromolculas estructurales para su funcin particular. As parece que la clula tiene dos tipos completos diferentes de herencia: primero, a travs del ADN, que es el responsable esencial de la estructura tridimensional de las enzimas o de las protenas estructurales; y segundo, a travs de determinadas estructuras celulares autorreproductivas que se perpetan a si mismas seleccionando de su medio ambiente algunas de las enzimas y protenas estructurales producidas por el ADN.

Si atribuimos a las estructuras tridimensionales de las protenas un papel ms importante en el mecanismo que elabora la arquitectura celular, entonces, cul es el mecanismo que forma las estructuras secundaria y terciara? Nos hemos referido brevemente a este problema en el Cap. 13 y el espacio no nos permite discutirlo en detalle. Baste decir que las investigaciones efectuadas sobre la ribonucleasa y otras protenas dan idea que la secuencia de los aminocidos en el pptido (estructura primaria) determina, por lo menos en parte, la definitiva configuracin tridimensional propia y verdadera de la protena. Existe la posibilidad de que otras condiciones de la clula puedan desempear tambin un papel de gua. Por ejemplo, Dintzis ha demostrado que la hemoglobina es sintetizada ordenadamente partiendo del N terminal de los ribosomas de los reticulocitos del conejo. Esto puede significar que el polipptido tambin es "desmembrado" con determinada secuencia, posiblemente al ser abandonado por un polipptido de reciente formacin. Si esto es as, debe haber un factor "cintico" que gue el plegamiento hacia una determinada configuracin final. La ltima forma puede ser una configuracin estable, pero no es la nica; los llamados estados "desnaturalizados" pueden representar otras configuraciones estables para determinada protena. Todava nos falta saber cmo las protenas fabricadas de dos o ms cadenas diferentes de polipptidos se ensamblan en la clula. Estn hechas en los mismos o en diferentes ribosomas? Y si fuera como en el ltimo caso, cmo se unen las cadenas separadas de polipptidos para formar la molcula completa de protena? Conocemos que la clula almacena su mensaje gentico en forma de ADN, un sistema que emplea un lenguaje lineal, sencillo, basado en cuatro variables. Los mensajes en este lenguaje se traducen en el lenguaje ms rico de las protenas, basado aproximadamente en 20 variables pero todava organizado en forma lineal. Este nuevo lenguaje, con su grandsima variedad qumica es la base para una serie de transformaciones espaciales que dan por resultado la formacin de una estructura tridimensional altamente especifica con nuevas y especiales propiedades qumicas. As naci la molcula de protena "nativa" --ya sea sta una enzima o una protena estructural-- y es capaz de interactuar especficamente con otras protenas, cidos nucleicos, lpidos, carbohidratos y otras molculas orgnicas para formar ambas, la maquinaria estructural y la metablica de la clula. Cmo funciona esta maquinaria en la regulacin y control celulares, ser contestada con ms y ms precisin en un futuro prximo, posiblemente por algunos de los lectores de este libro.

______________________________________________________________________________

LISTA DE LECTURAS QUE SE SUGIEREN

Allen, J. M. (ed.), 1962. Molecular control of cellular activity. New York: McGrawHill. Bonner, D. M. (ed.), 1961. Control mechanisms in cellular processes. New York: Ronald Press. Finean, J. B., 1960. Chemical ultrastructure in living tissues. Springfield, Ill.: Charles C Thomas. Fraenkel-Conrat, H., 1962. Design and function at the threshold of life: the viruses. New York: Academic Press. ---------, "Rebuilding a virus," Scientific American, June 1961. Gross, J., "Collagen," Scientific American, May 1961. Oncley J. L. (ed), 1959. Biophysical science: a study program. New York: Wiley. Pauling, L., and Itano, H. A., 1957. Molecular structure and biological specificity. Institute of Biological Sciences. Potter, V. R., and Heidelberger, C., "Alternative metabolic pathways," Physiological Reviews, Vol. 30 (1950), p. 487. Schmitt, F. O., "Giant molecules in cells and tissues," Scientitc American, May 1961. Wolstenholme, G. E. W., and O'Connor, C. M. (eds.), 1959. Regulation of cell metabolism; Gilda foundation symposium. London: J. and A. Churchill.

RESUMEN

Hemos intentado presentar al principiante, en este pequeo volumen, la descripcin funcional de la clula, su estructura dinmica, sus capacidades sintetizadoras, sus propiedades de autoduplicacin y sus interacciones con el medio ambiente. Hemos omitido muchos detalles ntimos de la estructura celular, de la actividad bioqumica y del comportamiento fisiolgico. Nos hemos refrenado tambin de especular bastante acerca de la periferia de nuestros conocimientos donde los hechos y la fantasa estn en un rpido flujo. Hemos mostrado que, a pesar de los ricos detalles de nuestro conocimiento en lo que se refiere a la maquinaria molecular de la clula, estamos todava virtualmente ignorantes del mecanismo molecular por el cual se regula la gran cantidad de sus reacciones. Estamos ms ignorantes an acerca de un aspecto crucial de la regulacin celular, que es el mecanismo por el cual la clula trata de introducirse en un camino particular de diferenciacin. El misterio de este mecanismo per el cual las clulas con el mismo fondo hereditario se desarrollan en tipos de clulas adultas completamente diferentes, est an sin violarse. An ms, esta cuestin est comenzando a ocuparla atencin de los bilogos citlogos, y se espera un rpido progreso en el futuro. Nuestro optimismo se basa en las increbles hazaas poderosas de los ltimos aos. Estamos en el umbral de la mayor revolucin en la historia de la humanidad, que es la comprensin de la naturaleza de la Vida misma. No existe un objetivo ms grande de admiracin, ninguna cosa de belleza ms inmensa que el orden din mico, la complejidad organizada de la vida. Estamos siendo testigos quizs, del evento ms dramtico en la lenta evolucin de la vida --el cerebro humano se examina a si mismo y a sus orgenes la vida volvindose a la vida! Nosotros, que somos Naturaleza, estamos evolucionando para conocer a la Naturaleza. ---Todo lo que vive es hermoso, La Vida se deleita en la Vida. BLAKE