Microbiologa General Tema 2.- Cultivo de microorganismos. Tema 2.- Cultivo de microorganismos. Crecimiento microbiano. Cultivo de microorganismos.

Medios de cultivo. Mtodos de aislamiento. Concepto de cultivo puro. Crecimiento microbiano en medio lquido. Crecimiento microbiano en medio slido. Concepto de muerte de un microorganismo. Medida del crecimiento y enumeracin de microorganismos. Crecimiento microbiano equilibrado. Cintica de crecimiento de un cultivo estanco. Factores fsicos y qumicos que influyen en el crecimiento. Rendimiento de los cultivos. Cintica de crecimiento en un cultivo continuo. Tipos de fermentadores. Bibliografa recomendada: Cap. 1 de la 8 edicin de Brock: Biologa de los microorganismos CRECIMIENTO MICROBIANO Entendemos por crecimiento microbiano el aumento del nmero de microorganismos a lo largo del tiempo. Por tanto, no nos referimos al crecimiento de un nico microorganismo que denominaremos ciclo celular, sino al demogrfico de una poblacin. En este tema nos centraremos en el crecimiento de bacterias, el estudio que se hace puede servir tambin para entender el crecimiento de levaduras y de otros hongos. El crecimiento de los virus se produce de otra forma diferente y ser tratada al final de este captulo. Denominamos ciclo celular al proceso de desarrollo de una bacteria aislada. A lo largo del ciclo celular tiene lugar la replicacin del material gentico, la sntesis de componentes celulares, la elongacin de la bacteria para alcanzar un tamao doble del inicial y su divisin por biparticin para dar lugar a dos clulas hijas. La duracin del ciclo celular coincide con el tiempo de generacin y depende, en general, de los mismos factores de los que depende este. El crecimiento de una poblacin resulta de la suma de los ciclos celulares de todos los individuos de dicha poblacin. Los cultivos de microorganismos de los que hemos hablado son asincrnicos puesto que en ellos cada microorganismo se encuentra en un punto diferente del ciclo celular. Por consiguiente, en un momento determinado en un cultivo se encuentran clulas que acaban de dividirse, otras que estn replicando su ADN, otras que estn credciendo, otras que estn iniciando la divisin celular, etc. En un cultivo sincrnico todas las clulas se encuentran simultneamente en la misma fase del crecimiento celular. Los cultivos sincrnicos son muy difciles de mantener por lo que su importancia est principalmente ligada a los estudios bsicos de biologa microbiana. Sin embargo, en la naturaleza, las bacterias del suelo se encuentran en condiciones de crecimiento prximas a la fase estacionaria (en la que se produce una cierta sincronizacin del cultivo) y, por consiguiente, durante cierto tiempo las poblaciones naturales probablemente se comporten como relativamente sincrnicas.

Microbiologa General Tema 2.- Cultivo de microorganismos. Las poblaciones de bacterias crecen de forma explosiva acumulando grandes nmeros en un periodo de tiempo muy reducido. Puesto que el efecto de los microorganismos es en la mayora de los casos depende de su nmero, entender cmo se produce el crecimiento microbiano es importante para poder evitar o reducir sus efectos nocivos y potenciar los beneficiosos o aplicados. CULTIVO DE MICROORGANISMOS El cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones fsicas, qumicas y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma controlada. En general, podemos distinguir cultivos lquidos y slidos en funcin de las caractersticas del medio y cultivos discontinuos y continuos en funcin de la disponibilidad de nutrientes en el medio. MEDIOS DE CULTIVO Un microorganismo necesita para crecer nutrientes que le aporten energa y elementos qumicos para la sntesis de sus constituyentes celulares. Dependiendo de la fuente de carbono que utilizan, los microorganismos se pueden clasificar en autotrofos si es el CO2 atmosfrico (microorganismos que fotosintetizan) y heterotrofos si utilizan carbono orgnico. La frmula elemental de un microorganismo es, aproximadamente, C4H7O2N lo que supone que los componentes de las clulas son: carbono que representa alrededor del 50% del peso seco, oxgeno (32%), nitrgeno (14%), fsforo (3%), azufre (en torno al 1%) y otros elementos traza entre los que se encuentran Fe, K, Mg, Mn, Co, Mb, Cu y Zn. La elaboracin de medios de cultivo requiere proporcionar los elementos antes citados en una forma asimilable. As, por ejemplo, el C debe estar en forma de carbono orgnico para los heterotrofos y como CO2 para los autotrofos, el N en forma de NH4, de NO3- o de NO2- o en forma de aminocidos a los que se pueda tomar su grupo amino; el P debe estar en forma de PO43-, el S procede de aminocidos sulfurados o de SO42-, etc. Adems, en ciertos casos, es necesario aadir a los medios de cultivo algunos aminocidos o vitaminas que determinados tipos de microorganismos no pueden sintetizar. En el caso de la levadura del pan (Saccharomyces cerevisiae) la frmula elemental ms concreta es: C3.72H6.11O1.95N0.61S0.017P0.035K0.056 esta composicin puede variar ligeramente en funcin de las condiciones de cultivo o de fase de crecimiento. El conocimiento de la frmula elemental del microorganismo que se cultiva facilita la formulacin del medio de cultivo ms adecuado para el mismo. 2

Microbiologa General Tema 2.- Cultivo de microorganismos. Los medios de cultivo se pueden clasificar en definidos cuando su composicin qumica se conoce totalmente y complejos cuando no es el caso porque estn compuestos por mezclas de extractos de materiales complejos (extracto de levadura, extracto de carne, etc.). Por otra parte, los medios de cultivo pueden ser lquidos o slidos si se aade algn agente solidificante que no sea consumible por los microorganismos (normalmente agar). En funcin de los microorganismos que pueden crecer en ellos, los medios pueden ser generales, selectivos cuando favorecen el crecimiento de ciertos microorganismos mientras suprimen el de otros (por ejemplo, el medio SPS para clostridios), diferenciales cuando alguno de sus componentes permite identificar las colonias de un tipo de microorganismos (por ejemplo medios con hemates para identificar colonias de microorganismos hemolticos), selectivo-diferenciales cuando combinan las dos caractersticas anteriores (por ejemplo, el agar de MacConkey para identificar Escherichia coli), y medios de enriquecimiento que permiten aislar un tipo determinado de microorganismo a partir de una mezcla una poblacin mixta de gran tamao. MTODOS DE AISLAMIENTO El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza, en la mayora de los casos, mediante la produccin de colonias aisladas en cultivos slidos. El crecimiento explosivo de las bacterias permite producir un gran nmero de ellas a partir de una nica clula inicial de forma que, tras un periodo de incubacin en las condiciones ambientales adecuadas, se produce una colonia observable a simple vista y formada por individuos iguales (un clon bacteriano). Sin embargo, no todos los microorganismos presentes en las muestras ambientales son cultivables (microorganismos no cultivables). Esto es debido a dificultades intrnsecas en el cultivo (microorganismos parsitos de otros), al desconocimiento de los requerimientos especficos de cultivo, y a la existencia de grupos de microorganismos que deben mantenerse en equilibrio para poder sobrevivir (casos de sintrofa por ejemplo). Se estima que en slo en torno al 1% de las bacterias del suelo al 0,1 - 0,01 % de las bacterias marinas son cultivables. Existen procedimientos de enriquecimiento del nmero de bacterias de ambientes naturales para facilitar su aislamiento. Uno de ellos es la Columna de Winogradski que crea un microcosmos para enriquecer el nmero de ciertos tipos de microorganismos presentes en ambientes naturales con objeto de facilitar su aislamiento. CONCEPTO DE CULTIVO PURO Se denomina cultivo puro (axnico) al que contiene slo un tipo de microorganismos. Los cultivos puros se inician a partir de colonias aisladas, de manera que todos los individuos del mismo tengan la misma composicin gentica. Los cultivos puros son

Microbiologa General Tema 2.- Cultivo de microorganismos. esenciales para poder estudiar las caractersticas de los microorganismos y para poder identificarlos con seguridad. Sin embargo, cada vez se va conoce ms sobre el funcionamiento de las comunidades bacterianas lo que debe hacernos reflexionar sobre el hecho de que un cultivo puro supone unas condiciones no naturales y que, por consiguiente, la fisiologa de los microorganismos en ambientes naturales puede ser diferente de la que presentan en condiciones de cultivos puros. CRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO LQUIDO Si la bacteria crece en un medio lquido, en la mayora de los casos las clulas que se producen en cada divisin continan su vida independientemente formndose una suspensin de clulas libres. En un cultivo discontinuo de bacterias en medio lquido, se pueden diferenciar cuatro fases en la evolucin de los parmetros que miden el crecimiento microbiano: 1.- Fase lag o de adaptacin durante la que los microorganismos adaptan su metabolismo a las nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y condiciones de cultivo) para iniciar la fase de crecimiento exponencial. 2.- Fase exponencial o logartmica: en ella la velocidad de crecimiento es mxima y el tiempo de generacin es mnimo. Durante esta fase las bacterias consumen a velocidad mxima los nutrientes del medio. La evolucin del nmero de clulas durante esta fase se explica con los modelos matemticos que describiremos a continuacin.

3.- Fase estacionaria: en ella no se incrementa el nmero de bacterias (ni la masa u otros parmetros del cultivo). Las clulas en fase estacionaria desarrollan un metabolismo diferente al de la fase exponencial y durante ella se produce una acumulacin y liberacin de metabolitos secundarios que pueden tener importancia industrial.

Microbiologa General Tema 2.- Cultivo de microorganismos. Los microorganismos entran en fase estacionaria porque se agota algn nutriente esencial del medio o porque los productos de desecho que han liberado durante la fase exponencial hacen que el medio sea inhspito para el crecimiento microbiano. La fase estacionaria tiene gran importancia porque probablemente represente con mayor fidelidad el estado metablico real de los microorganismos en los ambientes naturales. 4.- Fase de muerte: se produce una reduccin del nmero de bacterias viables del cultivo. CRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO SLIDO Las fases, parmetros y cintica de crecimiento discutidas para el caso de los cultivos lquidos se presentan tambin en cultivos slidos. La cintica de crecimiento, en este caso, se puede estudiar siguiendo la evolucin del nmero de clulas viables por unidad de superficie o por unidad de masa. Cuando una clula aislada e inmvil comienza a crecer sobre un substrato slido, el resultado del crecimiento al cabo del tiempo es una colonia. Por consiguiente, se denomina unidad formadora de colonia (UFC) a una clula bacteriana viva y aislada que si se encuentra en condiciones de substrato y ambientales adecuadas da lugar a la produccin de una colonia en un breve lapso de tiempo. Si el nmero inicial de bacterias por unidad de superficie es muy alto, la confluencia de las colonias da lugar a lo que se llama un csped cuando se realizan los cultivos en placas de laboratorio. En el caso de microorganismos mviles (deslizantes) o en el de los hongos filamentosos que tienen un crecimiento trfico no se producen colonias aisladas sino formaciones ms difusas o miceliares. CONCEPTO DE MUERTE DE UN MICROORGANISMO Desde el punto de vista microbiolgico, un microorganismo muere cuando pierde de forma irreversible la capacidad de dividirse. Como consecuencia de esta prdida, no se produce aumento en el nmero de microorganismos y, por tanto, no hay crecimiento. Sin embargo, un microorganismo puede estar muerto desde el punto de vista microbiolgico y continuar desarrollando una actividad metablica que se traduzca, por ejemplo, en liberacin de toxinas. Por otra parte, hay que considerar que la capacidad de multiplicacin (crecimiento) de un microorganismo puede verse transitoriamente afectada por lesiones o por las condiciones fsicas o qumicas del entorno. En estos casos, podramos considerar como muertos microorganismos que pueden reanudar su crecimiento si las condiciones son de nuevo favorables.

Microbiologa General Tema 2.- Cultivo de microorganismos. MEDIDA DEL CRECIMIENTO Y ENUMERACIN DE MICROORGANISMOS Existen diferentes sistemas para detectar y medir el crecimiento de microorganismos. Los principales, se enumeran a continuacin: 1.- Recuento directo: consiste en la observacin al microscopio de volmenes muy pequeos de suspensiones de bacterias. Se usan unos portaobjetos especiales denominados cmaras de Petroff-Hausser. Para que la medida sea correcta es necesario que la densidad de clulas sea del orden de 105 por ml. 2.- Medida de la masa de clulas: el sistema se basa en que las clulas en suspensin dispersan la luz causando la turbidez del cultivo. La turbidez depende de la masa en suspensin y, por tanto, midiendo esta se puede estimar aquella. Este es el parmetro de medida ms fcil de usar en los cultivos de laboratorio. La densidad de clulas debe ser del orden de 105 por ml. 3.- Recuento de viables: consiste en sembrar un volumen determinado de cultivo o muestra sobre el medio de cultivo slido adecuado para estimar el nmero de viables contando el nmero de colonias que se forman puesto que cada una de estas deriva de una clula aislada. Para que la medida sea correcta desde el punto de vista estadstico, es necesario contar ms de 300 UFC. En ciertas ocasiones en las que la densidad de microorganismos es demasiado baja, stos se pueden recolectar por filtracin a travs de una membrana (de 0.2 m de tamao de poro) y posterior colocacin de la membrana en un medio de cultivo adecuado para que se formen las colonias. 4.- Medida del nmero de partculas usando contadores electrnicos de partculas. Estos sistemas no nos indican si las partculas corresponden a clulas vivas o muertas; pero nos pueden dar una idea del tamao de las partculas. 5.- Medida de parmetros bioqumicos tales como la cantidad de ADN, ARN, protenas, peptidoglicano, etc. por unidad de volumen de cultivo. 6.- Medida de actividad metablica de las bacterias como que respiran producen una disminucin del potencial redox del medio en que se encuentran como consecuencia del consumo de oxgeno (utilizacin de colorantes sensibles a oxidacin-reduccin tales como el azul de metileno). CRECIMIENTO MICROBIANO EQUILIBRADO Se denomina crecimiento equilibrado a aqul en el que todos los parmetros del cultivo (biomasa, nmero de clulas, cantidad de protenas, de ADN, etc.) evolucionan en paralelo. El crecimiento equilibrado probablemente ocurra en muy contadas ocasiones en condiciones naturales. Por tanto, es principalmente un concepto de aplicacin en el laboratorio (o en microbiologa industrial). Sin embargo, es til porque permite estudiar el crecimiento microorganismos.

Microbiologa General Tema 2.- Cultivo de microorganismos. CINTICA DE CRECIMIENTO DE UN CULTIVO DISCONTINUO En este apartado vamos a revisar el estudio de la cintica del crecimiento de microorganismos que crecen aislados que no forman ningn tipo de estructura. Esta es la forma de crecimiento de la levadura (hongo unicelular) y de las bacterias. Es importante conocer la cintica de crecimiento de los cultivos microbianos para predecir cmo va a evolucionar un cultivo, cmo va a ir consumindose el substrato y cmo se van a ir acumulando los productos del cultivo. Sin conocer estos factores es muy imprudente iniciar el cultivo en un fermentador de 10.000 litros, por ejemplo, con el coste que ello supone, puesto que no podemos predecir qu va a pasar, cundo va a completarse el crecimiento, cmo se va a acumular el producto, etc. Las clulas aisladas cultivadas en un volumen finito de medio de cultivo apropiado van utilizando los nutrientes que tienen disponibles con la mayor eficiencia y rapidez que pueden, sintetizando sus propios componentes celulares y dividindose en cuanto han podido duplicar su masa y su material gentico. El tiempo que tarda una clula en hacer todo lo anterior es lo que conocemos como tiempo de generacin () y puede variar desde unos 20 minutos en condiciones ptimas hasta varios meses en condiciones del suelo. Cada vez que transcurre un tiempo de generacin, el nmero de clulas se duplica, siguiendo, por tanto, un incremento exponencial. TRATAMIENTO DEL CRECIMIENTO COMO PROGRESIN GEOMTRICA Las bacterias crecen siguiendo una progresin geomtrica en la que el nmero de individuos se duplica al cabo de un tiempo determinado denominado tiempo de generacin (). De esta forma, podemos calcular el nmero de bacterias (N) al cabo de un nmero de generaciones (n) usando la ecuacin siguiente: N = N0 2n (ecuacin 1)

siendo N0 el nmero de clulas en el momento actual. El nmero de generaciones se puede calcular de la siguiente forma: n=t/ donde t es el tiempo transcurrido. Por consiguiente, combinando las ecuaciones 1 y 2: N = N0 2t/ (ecuacin 3) (ecuacin 2)

Los tiempos de generacin de bacterias creciendo en ambientes favorables pueden ser muy cortos (valores de de 20 min). Esto lleva a que una nica clula (N0=1) creciendo con un = 20 min, llegue a poder producir 4.7 x 1021 clulas en 24 horas.

Microbiologa General Tema 2.- Cultivo de microorganismos. Las ecuaciones exponenciales son muy difciles de manejar grficamente, por ello es mejor transformarlas en otras ms simples. Para transformar una ecuacin exponencial en una recta, tomamos logaritmos en los dos trminos y resulta: lnN = lnN0 + (t/) ln2 (ecuacin 4)

Esto es: el logaritmo del nmero de clulas crece linealmente con el tiempo a razn de una constante igual a ln2/. Si el tiempo de generacin es muy grande, el crecimiento tendr poca pendiente (ser lento) y si es pequeo el crecimiento ser rpido. En un crecimiento equilibrado, todos los parmetros de crecimiento (nmero de clulas, biomasa de cultivo, acumulacin de metabolitos primarios, protenas, cidos nucleicos etc.) evolucionan en paralelo. Por tanto, en la ecuacin anterior N puede representar cualquiera de estos factores. TRATAMIENTO DEL CRECIMIENTO EN FUNCIN DE LA TASA DE CRECIMIENTO Otra forma de representar la cintica es considerando el incremento en el nmero de clulas (dN) en un intervalo corto de tiempo (dt). En este caso, la ecuacin que describe la cintica es la siguiente: dN/dt = N (ecuacin 5)

esto es: el incremento del nmero de clulas (dN) por unidad de tiempo (dt) es proporcional al nmero de clulas presentes en el cultivo (N). A la constante de proporcionalidad () se le denomina tasa de crecimiento. Integrando la ecuacin anterior durante el tiempo de cultivo, se transforma en la siguiente funcin exponencial: N = N0 et (ecuacin 6)

la transformacin de esta ecuacin en una recta (tomando logaritmos) rinde lo siguiente: lnN = lnN0 + t (ecuacin 7)

esto es: el incremento del logaritmo del nmero de clulas aumenta linealmente con el tiempo siendo la constante de proporcionalidad . Comparando esta ecuacin (7) con la similar presentada ms arriba (4), podemos concluir que = ln2/ y, por consiguiente, que = ln2/. Es decir, que hay una correlacin inversa entre el valor de la tasa de crecimiento () y el tiempo de generacin (). Estas ecuaciones nos permiten predecir cul ser el nmero de clulas, masa celular, etc. despus de un cierto tiempo de cultivo (t) si conocemos ; o bien, poder calcular la tasa de crecimiento a partir de medidas experimentales del incremento en el nmero de clulas, biomasa, etc.

Microbiologa General Tema 2.- Cultivo de microorganismos. 12.- FACTORES FSICOS Y QUMICOS QUE INFLUYEN EN EL CRECIMIENTO. 1.- Temperatura: Cada microorganismo tiene una temperatura de crecimiento adecuada. Si estudiamos la variacin de la velocidad de crecimiento en funcin de la temperatura de cultivo, podemos observar una temperatura mnima por debajo de la que no hay crecimiento; a temperaturas mayores se produce un incremento lineal de la velocidad de crecimiento con la temperatura de cultivo hasta que se alcanza la temperatura ptima a la que la velocidad es mxima. Por encima de esta temperatura ptima, la velocidad de crecimiento decae bruscamente y se produce la muerte celular. El incremento de la velocidad de crecimiento con la temperatura se debe al incremento generalizado de la velocidad de las reacciones enzimticas con la temperatura. Se denomina coeficiente de temperatura a la relacin entre el incremento de la velocidad de reaccin y el de temperatura. En trminos generales, la velocidad de las reacciones bioqumicas suele aumentar entre 1.5 y 2.5 veces al aumentar 10C la temperatura a la que tienen lugar. La falta de crecimiento a temperaturas muy bajas se debe a la reduccin de la velocidad de crecimiento por la reduccin de la velocidad de reaccin y al cambio de estado de los lpidos de la membrana celular que pasan de ser fluidos a cristalinos impidiendo el funcionamiento de la membrana celular. La muerte a altas temperaturas se debe a la desnaturalizacin de las protenas y a las alteraciones producidas en las membranas lipdicas a esas temperaturas. Es importante tener en cuenta que a temperaturas bajas, el metabolismo celular se enlentece y las clulas paran de crecer; aunque no tienen porqu morir. Sin embargo, cuando la temperatura es superior a la ptima, se produce la muerte celular rpidamente y las clulas no pueden recuperar su capacidad de divisin si baja posteriormente la temperatura. Esto permite esterilizar por calor y no por fro. Hay varios tipos de microorganismos en funcin de sus temperaturas de crecimiento mnima, mxima y ptima. Tipo de Temperatura Temperatura Temperatura microorganismo mnima ptima mxima Psicrfilo -5 +5 12 - 15 15 - 20 Psicrtrofo -5 +5 25 - 30 30 - 35 Mesfilo 5 - 15 30 - 45 35 - 47 Termfilo 40 - 45 55 - 75 60 - 90 Los microorganismos psicrtrofos son mesfilos que pueden crecer a temperaturas bajas. Por tanto, se les puede considerar como psicrfilos facultativos. Esto es importante desde el punto de vista aplicado porque cuando se encuentran contaminando alimentos, son capaces de crecer en condiciones de refrigeracin (4 - 8C) y de producir infecciones en los consumidores del alimento (30 - 35 C).

Microbiologa General Tema 2.- Cultivo de microorganismos. Los microorganismos capaces de producir infecciones son los mesfilos y algunos psicrtrofos ya que sus temperaturas ptimas de crecimiento coinciden con las corporales. sin embargo, tanto mesfilos como psicrfilos, psicrtrofos y termfilos pueden producir toxinas causantes de intoxicaciones alimentarias. 2.- Actividad de agua: Se denomina actividad de agua a la relacin entre la presin de vapor de agua del substrato de cultivo (P) y la presin de vapor de agua del agua pura (P0). El valor de la actividad de agua est relacionado con el de la humedad relativa (HR). El valor de la actividad de agua nos da una idea de la cantidad de agua disponible metablicamente. Por ejemplo: comparemos el agua pura donde todas las molculas de agua estn libremente disponibles para reacciones qumicas con el agua presente en una disolucin saturada de sal comn (NaCl) donde una parte importante de las molculas de agua participa en la solvatacin de los iones de la sal disuelta. En este ltimo caso, la actividad de agua es mucho menor que en el primero. Conforme aumenta la cantidad de solutos en el medio, disminuye su actividad de agua. Cuando un microorganismo se encuentra en un substrato con una actividad de agua demasiado baja, su crecimiento se detiene. Esta detencin del crecimiento no suele llevar asociada la muerte del microorganismo, sino que ste se mantiene en condiciones de resistencia durante un tiempo ms o menos largo. En el caso de las esporas, la fase de resistencia puede ser considerada prcticamente ilimitada. La gran mayora de los microorganismos requiere unos valores de actividad de agua muy altos para poder crecer. De hecho, los valores mnimos de actividad para diferentes tipos de microorganismos son, a ttulo orientativo, los siguientes: bacterias aw >0.90, levaduras aw>0.85, hongos filamentosos aw >0.80. Como puede verse, los hongos filamentosos son capaces de crecer en substratos con una actividad de agua mucho menor (mucho ms secos) de la que permite el crecimiento de bacterias o de levaduras. Por esta razn se puede producir deterioro de alimentos de baja actividad de agua (por ejemplo, el queso o almbares) por mohos (hongos filamentosos) y no por bacterias. En funcin de su tolerancia a ambientes con baja aw, los microorganismos que pueden crecer en estas condiciones se clasifican en halotolerantes, halfilos y xerfilos segn toleren o requieran condiciones salinas o hipersalinas, respectivamente. La reduccin de la actividad de agua para limitar el crecimiento bacteriano tiene importancia aplicada en industria alimentaria. La utilizacin de almbares, salmueras y salazones reduce la actividad de agua del alimento para evitar su deterioro bacteriano. 3.- pH: Es un parmetro crtico en el crecimiento de microorganismos ya que cada tipo de microorganismo slo puede crecer en un rango estrecho de pH fuera del cual mueren rpidamente. El pH intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea las clulas ya que, en muchos casos, la obtencin de energa metablica depende de la existencia de una diferencia en la concentracin de protones a ambos lados de la membrana citoplsmica. El pH interno en la mayora de los microorganismo est en el rango de 6.0 a 7.0.

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Microbiologa General Tema 2.- Cultivo de microorganismos. Los rangos de pH tolerables por diferentes tipos de microorganismos son, tambin, distintos. Hay microorganismos acidfilos que pueden vivir a pH=1.0 y otros alcalfilos que toleran pH=10.0 Hay que considerar que, como consecuencia del metabolismo, el pH del medio de crecimiento suele tender a bajar durante el cultivo. Por otra parte, la bajada del pH del medio que producen ciertos microorganismos les confiere una ventaja selectiva frente a otros microorganismos competidores. As, por ejemplo, las bacterias lcticas que producen grandes cantidades de cido lctico como consecuencia de su metabolismo primario reducen el pH del medio de cultivo a valores inferiores a los soportables por otras bacterias competidoras (llegan a bajar el pH del medio hasta 4.5). De esta forma, las bacterias competidoras mueren y las lcticas se convierten en la poblacin dominante. La bajada del pH se puede deber a varios factores, uno de los cuales es la liberacin de cidos orgnicos de cadena corta (frmico, actico, lctico) por ciertas bacterias. En este sentido, hay que tener en cuenta que la accin bactericida de estos cidos orgnicos de cadena corta es ms potente que la debida nicamente a la bajada del pH que producen. Esto es, los cidos orgnicos de cadena corta son txicos para algunas bacterias por s mismos. El efecto letal del pH cido sobre los microorganismos tiene aplicacin en la conservacin de alimentos acidificndolos. De esta forma, la adicin de cido actico en forma de vinagre permite la conservacin de alimentos perecederos (escabeches, por ejemplo) y la produccin de cidos en el curso de fermentaciones naturales permite alargar la vida de los alimentos (coles fermentadas, por ejemplo). 4.- Potencial redox: nos indica la capacidad del substrato para aceptar o donar electrones, esto es: sus caractersticas oxidantes o reductoras. Uno de los factores que intervienen en el potencial redox, aunque no el nico, es la concentracin de oxgeno [O2]. Hay microorganismos que requieren ambientes oxidantes para crecer, mientras que otros necesitan ambientes reductores. El metabolismo de ambos tipos de microorganismos presenta diferencias notables. El requerimiento de condiciones oxidantes o reductoras no debe confundirse con la necesidad de presencia o ausencia de oxgeno para que se produzca el crecimiento. En general, cuando un microorganismo requiere un ambiente oxidante se dice que desarrolla un metabolismo oxidativo (o respirativo) mientras que los microorganismos que requieren ambientes reductores (o menos oxidantes) realizan un metabolismo fermentativo. Un microorganismo es aerobio cuando necesita oxgeno para vivir y es anaerobio cuando o bien no lo necesita (anaerobios facultativos como las bacterias entricas, o como Saccharomyces cerevisiae; o anaerobios aerotolerantes como las bacterias lcticas) o cuando muere en presencia de oxgeno (anaerobios estrictos como los clostridios). Hay microorganismos que viven en ambientes carentes de oxgeno (anaerobios) que, sin embargo, llevan a cabo un metabolismo oxidativo porque usan otro aceptor final de 11

Microbiologa General Tema 2.- Cultivo de microorganismos. electrones que acta como oxidante ambiental. Por ejemplo, las bacterias que "respiran" nitratos (NO3-), sulfatos (SO42-) u otros compuestos orgnicos oxidados (respiracin anaerobia). Hay microorganismos que, aunque viven en presencia de oxgeno, no son capaces de utilizarlo como aceptor final de electrones y deben desarrollar un metabolismo fermentativo (las bacterias lcticas que son anaerobias aerotolerantes, por ejemplo). Por otra parte, hay microorganismos que pueden desarrollar ambos tipos de metabolismo. Esto es: en presencia de oxgeno desarrollan un metabolismo oxidativo y en su ausencia, fermentativo. El rendimiento de los procesos fermentativos es menor que el de los respirativos: las bacterias y las levaduras producen menos biomasa cuando crecen fermentando que cuando lo hacen respirando. En el curso de ciertas reacciones metablicas redox se forman compuestos altamente reactivos (radicales libres, formas superxido) que pueden daar las protenas, membranas y cidos nucleicos produciendo la muerte de las clulas. Las clulas se defienden de estos compuestos reactivos mediante las enzimas siguientes: Superxido dismutasa (SOD) y catalasa. Los anaerobios estrictos carecen de SOD y de catalasa o tienen niveles muy bajos de estas enzimas de forma que no pueden sobrevivir en presencia de oxgeno. La deteccin de estas enzimas tiene valor taxonmico. 13.- RENDIMIENTO DE LOS CULTIVOS. El grfico siguiente representa la variacin de la biomasa (o nmero de clulas, etc.) de un cultivo a lo largo del tiempo. En este cultivo, se va consumiendo un substrato cuya concentracin decrece de forma proporcional al crecimiento de la biomasa.

Definiremos el rendimiento de utilizacin del substrato (Ys) al valor que representa la cantidad de biomasa producida por unidad de substrato consumido:

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Microbiologa General Tema 2.- Cultivo de microorganismos. Ys = dN/dS (ecuacin 8)

El rendimiento de utilizacin de diferentes substratos puede ser diferente (hay substratos, o alimentos, que "engordan"1 ms que otros), vara entre diferentes microorganismos (hay microorganismos que "engordan" ms que otras comiendo lo mismo) y vara tambin en funcin de otras condiciones ambientales o fisiolgicas (no engorda lo mismo uno al comer algo si est sano o enfermo o si est en verano o en invierno). Tambin vara el rendimiento en funcin de que el metabolismo sea oxidativo o fermentativo (estos conceptos sern revisados ms adelante). Podemos calcular el rendimiento de la utilizacin del substrato en funcin de la cantidad de substrato aadido al cultivo, o en funcin de la cantidad de carbono presente en ese substrato (por ejemplo). Asimismo, podemos calcular la cantidad de biomasa total (gramos de clulas, por ejemplo) o de carbono presente en las clulas (aproximadamente el 50% de la masa celular corresponde a carbono). Haciendo las transformaciones que se indican a continuacin sobre la frmula que relaciona la variacin de biomasa con la de substrato (8), llegamos a la definicin de un nuevo concepto qs denominado tasa especfica de consumo de substrato por el organismo. Ys = dN/dS dN/dt = Ys (dS/dt) (dN/dt)/N = Ys (dS/dt)/N como, de acuerdo con la ecuacin (5), = (dN/dt)/N, = Ys qs (ecuacin 11) (ecuacin 8) (ecuacin 9) (ecuacin 10)

Esto es, la tasa especfica de consumo de substrato (qs) la podemos considerar la "velocidad" con la que el organismo consume el substrato. Evidentemente, cuanto mayor sea la tasa de consumo mayor ser la tasa de crecimiento (). qs = Ys/ (ecuacin 12)

Asimismo, cuanto mayor sea el rendimiento del substrato consumido, tambin mayor ser la tasa de crecimiento. Sin embargo, hay una cierta compensacin entre la tasa de consumo del substrato y el rendimiento de forma que los microorganismos que tienen altas tasas de consumo de substrato tienen rendimiento ms bajos (o cuando se dan las condiciones para una alta tasa, el rendimiento disminuye). A esta relacin inversa se le conoce con el nombre de efecto Pasteur.

La expresin "3engordar" est usada de forma metafrica: las bacterias no engordan. La uso porque resulta til esta metfora antropmrfica para entender algunos de los conceptos relacionados con el rendimiento de cultivos.

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Microbiologa General Tema 2.- Cultivo de microorganismos. Por ltimo, nos falta relacionar la tasa de crecimiento () con la concentracin de substrato (S). En condiciones de substrato abundante, la concentracin de este no afecta al valor de ; pero cuando el substrato se hace limitante, s existe ese efecto. La expresin matemtica que relaciona ambos parmetros se conoce con el nombre de ecuacin de Monod y es la siguiente: = max [S/(Ks+S)] (ecuacin 13)

En esta ecuacin la tasa de crecimiento () depende de la mxima que puede alcanzar el microorganismo (max), de la concentracin de substrato (S) y de un valor constante, Ks, que representa la concentracin de substrato a la que se alcanza una tasa de crecimiento igual a la mitad de la mxima. La ecuacin de Monod tendr mucha importancia al tratar de cultivos continuos. Para que se cumpla esta ecuacin el rendimiento debe ser independiente de la concentracin de substrato. En la prctica, los valores de Ks suelen ser muy bajos, lo que indica que los microorganismos crecen con tasas () muy prximas a las mximas (max) a concentraciones de substrato bajas y slo cuando estas son extremadamente bajas, la velocidad de crecimiento se reduce. Esto es debido a que los sistemas de transporte de nutrientes suelen tener valores de Km considerablemente reducidos (La Km indica la concentracin de substrato a la que la velocidad de transporte es la mitad de la mxima) 14.- CINTICA DE CRECIMIENTO EN UN CULTIVO CONTINUO. En un cultivo continuo se mantienen los microorganismos en crecimiento constante porque se aade de forma constante medio de cultivo fresco (que aporta nuevos nutrientes) y se elimina cultivo (medio usado con sus microorganismos correspondientes) a la misma velocidad con objeto de mantener el volumen total del cultivo constante. Los cultivos continuos son importantes para trabajar con microorganismos que estn creciendo constantemente de manera que sean capaces de producir constantemente productos de inters (biomasa, metabolitos secundarios, etc.). Este tipo de cultivo es tambin importante en los estudios de fisiologa y de ecologa microbiana. En la naturaleza un ejemplo de cultivo continuo lo constituye el rumen de ciertos animales y el conjunto de procesos microbianos intestinales de todos los animales. En un cultivo continuo se pretende mantener un ambiente constante durante todo el tiempo de cultivo. Esto es imposible en un cultivo estanco en el que los nutrientes se van consumiendo progresivamente y el medio se va cargando de productos de desecho. QUIMIOSTATO El tipo ms frecuente de cultivo continuo es el quimiostato en el que se introduce medio fresco a un flujo constante denominado velocidad de dilucin (D) a la vez que se elimina cultivo viejo al mismo flujo. El medio de cultivo de un quimiostato contiene un nutriente esencial en una cantidad limitante (nutriente limitante). Estos parmetros se relacionan de acuerdo a la siguiente ecuacin:

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Microbiologa General Tema 2.- Cultivo de microorganismos. D = f/V (ecuacin 14)

donde f es la velocidad de flujo (ml h-1) y V el volumen del recipiente en ml. Por consiguiente, las dimensiones de D son [h-1]. El valor D indica el nmero de volmenes de reactor (volmenes de fermentador) que pasan a travs el reactor por unidad de tiempo. Este valor es el recproco del tiempo de residencia o tiempo que una unidad de substrato est dentro del reactor. Tanto la tasa de crecimiento como el nivel de poblacin microbiana estn relacionados con el valor de D. densidad celular o biomasa

Tiempo de generacin

concentracin de substrato Velocidad de dilucin A velocidades de D muy bajas, pequeos incrementos de la velocidad de dilucin producen un cierto incremento de la densidad del cultivo debido a que se aportan ms nutrientes al medio y el microorganismo no ve limitada su tasa de crecimiento () segn lo indicado en la ecuacin de Monod (ecuacin 13). La velocidad de crecimiento aumenta ( aumenta y disminuye) cuando la energa aportada por los nutrientes entrantes supera la energa de mantenimiento de los microorganismos del cultivo. A valores bajos de D la concentracin de nutriente limitante (S) en el efluente es baja porque es consumido casi completamente por los microorganismos del cultivo que alcanzan unas poblaciones de gran tamao creciendo a una tasa () baja porque se encuentran en condiciones de limitacin de nutrientes (S<Ks). A valores ms altos de D no todo el nutriente es consumido por los microorganismos del cultivo por lo que S en el efluente aumenta. En una situacin de equilibrio (steady state), velocidad de dilucin D se iguala a la tasa de crecimiento , de forma que el control de la tasa de dilucin (control del flujo f) permite regular la tasa de crecimiento y, de esa forma, la situacin fisiolgica del orga

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Microbiologa General Tema 2.- Cultivo de microorganismos. nismo. A valores de D> max, el microorganismo no es capaz de crecer lo suficiente como para evitar ser eliminado del cultivo por el rebosadero y, por consiguiente S alcanza un valor mximo (el nutriente limitante no es consumido en el cultivo y la concentracin del substrato en el efluente es igual a la del substrato en el medio inicial) y la tasa de crecimiento de microorganismos () dentro del cultivo se hace nula (el cultivo desaparece). La evolucin de la biomasa de un quimiostato se ajusta a la ecuacin siguiente: dX/dt = crecimiento - salida = X - DX (ecuacin 15)

Por consiguiente, si > D hay un incremento positivo de la poblacin en el quimiostato, cuando = D el tamao de la poblacin se mantendr estable (equilibrio) y si < D la poblacin disminuir como consecuencia de la dilucin de las bacterias. En el steady-state, como (dN/dt) = 0, = D como se haba explicado anteriormente.2 Habida cuenta de que en el estado estacionario D = , la ecuacin de Monod ((13) puede reformularse en los siguientes trminos D = max [Sr/(Ks+Sr)] (ecuacin 16)

donde Sr es la concentracin de nutriente limitante en el efluente del cultivo continuo. Despejando de la ecuacin 16 el valor de Sr en funcin de los dems, se obtiene la ecuacin siguiente: Sr = DKs/(max-D) (ecuacin 17)

que permite calcular cmo vara la concentracin del nutriente limitante en el efluente en funcin de la tasa de dilucin D. Si llamamos SR a la concentracin de nutriente limitante que entra en el fermentador y Sr la concentracin de este nutriente en el efluente; considerando que el substrato consumido en el fermentador (SR-Sr) es transformado en biomasa durante el estado estacionario () con un rendimiento Ys, podemos calcular la produccin de biomasa en el fermentador con las siguiente ecuaciones = Ys(SR-Sr) = Ys{SR-[DKs/(max-D)]} (ecuacin 18) (ecuacin 19)

Estas ecuaciones nos permiten modular la cantidad de biomasa producida o la cantidad de substrato consumido regulando la tasa de dilucin del fermentador. TURBIDOSTATOS
En realidad, esto no es una demostracin de que en el steady state las tasas de dilucin y crecimiento se igualan, ya que en los cculos se parta de esta condicin para poder reformular la ecuacin de Monod.
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Microbiologa General Tema 2.- Cultivo de microorganismos. El segundo tipo de cultivo continuo es el turbidostato en el que se ajusta la velocidad de dilucin de tal forma que la densidad ptica del cultivo se mantiene constante. El valor D en un turbidostato, por tanto, es variable. Por otra parte, en un turbidostato el medio de cultivo no contiene nutrientes limitantes. Los turbidostatos funcionan mejor valores de D altos, mientras que el quimiostato a valores de D bajos. CULTIVO SEMI-CONTINUO Un cultivo semi-continuo (feed-batch) es un cultivo estanco al que se aaden en diferentes momentos nutrientes concentrados para permitir un mayor crecimiento o una produccin ms efectiva de metabolitos secundarios. En un cultivo de estas caractersticas el nutriente aadido suele ser una fuente que aporte el carbono necesario para obtener energa y elementos para la sntesis de los metabolitos secundarios de inters. Por ejemplo, la produccin de penicilina se realiza mediante un cultivo de estas caractersticas. 15.- TIPOS DE FERMENTADORES Podemos distinguir dos grandes tipos de fermentadores segn el estado del medio de cultivo: fementadores lquidos y slidos. FERMENTADORES LQUIDOS En ellos los nutrientes se encuentran en esta forma y los microorganismos se desarrollan flotando libremente en el volumen de medio de cultivo o formando agregados ms o menos esfricos (pellets) en el caso de los cultivos de hongos. Este tipo de cultivos se denomina en ocasiones cultivo sumergido. El diseo de un fermentador lquido requiere tener en cuenta una serie de factores que influyen en el crecimiento, y en el rendimiento del proceso: temperatura, pH, aireacin, etc. Por consiguiente, el diseo fsico de los fermentadores lquidos tienen que incluir la presencia de sondas que permitan medir estos parmetros durante el cultivo y de sistemas que permitan corregir las desviaciones que se puedan producir (sistemas de refrigeracin para control de temperatura, sistemas de ajuste de pH mediante la adicin de cidos o bases, etc.). Un aspecto adicional que considerar en el diseo de un fermentador es la presin hidrosttica que se alcanza en su base y que puede limitar el crecimiento de microorganismos. En general, la altura mxima de un tanque de fermentacin se sita en los 15 m ya que por encima de esa altura se alcanzan valores de presin inhibidores. Tienen especial importancia dos problemas: la agitacin destinada a asegurar una mezcla correcta de los ingredientes del medio y de los microorganismos que crecen en l, y la aireacin. 17

Microbiologa General Tema 2.- Cultivo de microorganismos. Fermentadores en tanque Son los fermentadores ms sencillos. La agitacin se consigue por un sistema de palas unidas a un eje y un motor y por las turbulencias creadas por un sistema de bafles adosados a las paredes de la cuba de fermentacin. La aireacin se consigue por un difusor de aire que emite desde la parte inferior de la cuba de fermentacin. La transferencia de oxgeno al cultivo se hace por las burbujas que van ascendiendo por el volumen de cultivo. El principal problema de estos fermentadores es el elevado coste del sistema mecnico de agitacin, principalmente cuando se realizan cultivos de hongos filamentosos en los que la viscosidad debida al micelio aumenta mucho. Fermentadores Air-lift En estos fermentadores la agitacin y a aireacin se logran mediante la inyeccin de aire por la parte inferior de la cuba de fermentacin,

la entrada de aire produce un conveccin que se canaliza por un tubo vertical interior en la cuba. La aireacin tambin permite reducir la cantidad de calor producida durante la fermentacin. En este fermentador, las burbujas de aire van aumentando de tamao conforme ascienden por el tubo interior por lo que su relacin superficie/volumen disminuye y la transferencia de oxgeno al cultivo es menor. Fermentadores Deep-Jet En ellos el aire se inyecta a presin desde la parte superior de la cuba de fermentacin de forma que las burbujas de aire se van haciendo ms pequeas (mejor transferencia de oxgeno) hasta llegar al final del cilindro interior, y a partir de ah las burbujas vuelven a crecer al ascender por la parte exterior de la cuba de fermentacin. En la prctica, es un fermentador similar al anterior; pero operado al revs.

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Microbiologa General Tema 2.- Cultivo de microorganismos.

FERMENTADORES SLIDOS En ellos los nutrientes se encuentran en esta forma y los microorganismos se desarrollan en la superficie del substrato o penetrando en l. Es un tipo de fermentacin muy aplicada en la produccin de algunos alimentos (setas cultivadas, koji, etc.) y tambin la que tiene lugar en los procesos de compostaje de residuos orgnicos. Hay varios modelos de fermentadores slidos: 1. Tambor 2. Bandejas 3. Sistema de lecho (bed system) Por otra parte, existen sistemas semislidos en los que los microorganismos estn adheridos a superficies estticas y los nutrientes pasan por filtracin o goteo a travs de ellos (sistema de la produccin de vinagre por goteo), o los microorganismos se encuentran formando agregados que se mantienen en suspensin por medio de una corriente de medio de cultivo lquido (reactores de lecho fluidificado).

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