Protenas Totales PROTEINAS TALES Y LA EVALUACION DE PROTEINA VICERAL La mayora de las protenas plasmticas son sintetizadas en el hgado.

Otras protenas se encuentran en el plasma sanguneo, que son de gran importancia para valorar al paciente, son as gamma globulinas (anticuerpos) y la hemoglobulina; la primera se sintetiza en los linfocitos T y la ltima en los eritroblastos (eritrocitos jvenes) Las protenas plasmticas de los tejidos ocupan una posicin central en el metabolismo proteico; interaccionan con todos los tejidos o clulas del organismo y estn muy relacionadas con el metabolismo proteico en el hgado, siendo estos: la albumina las globulinas y el fibringeno.

DETERMINACIN DE PROTENAS SERICAS TOTALES POR EL MTODO DE BIURET OBJETIVO Que el estudiante aprenda a manejar mtodos colorimtricos en la determinacin de protenas INTRODUCCIN Las protenas son compuestos a base de carbono, hidrgeno, oxgeno, nitrgeno y generalmente azufre y fsforo. El elemento caracterstico es el nitrgeno. Todas las enzimas, algunas hormonas y muchos componentes estructurales importantes de la clula son protenas. Las molculas de protena son muy grandes y contienen miles de tomos; su estructura es extremadamente compleja. Gran parte de las protenas intracelulares son enzimas, sustancias que regulan la rapidez con que se han de tener numerosas reacciones celulares. Las molculas de protena estn formadas por componentes ms simples llamados aminocidos. Puesto que cada protena puede tener cientos de aminocidos combinados en ciertas proporciones y orden es posible una variedad prcticamente infinita de molculas de protena. Se han ideado mtodos de anlisis para reconocer la disposicin exacta de aminocidos en una molcula protenica. La insulina, hormona secretada por el pncreas y utilizada en el tratamiento de la diabetes, fue la primera protena cuya estructura se conoci. La ribononucleasa, secretada por el pncreas, fue la primera enzima de la cul se conoci el orden exacto de aminocidos. Pueden distinguirse varios niveles de organizacin en la molcula de protena. El primer nivel es la llamada estructura primaria, que depende de la serie de aminocidos en la cadena de polipptidos. Esta serie, est determinada a su vez, por la serie de nucletidos de RNA y DNA del ncleo de la clula. Un segundo nivel de organizacin de las molculas protenicas supone la adopcin

de la forma de hlice u otra configuracin regular por la cadena de polipptidos. Estas cadenas ordinariamente no se encuentran planas en una molcula de protena, sino que adoptan formas espiralazas para dar una estructura tridimensional. Una de las estructuras secundarias comunes de las molculas protenicas es el hlice en, que se supone una formacin espiralaza de la cadena de polipptidos bsica. La hlice en es una estructura geomtrica muy uniforme con 3.6 aminocidos que ocupan cada vuelta de la hlice. La estructura helicoidal es determinada y mantenida por la formacin de enlaces de hidrgeno entre residuos de aminocidos en vueltas sucesivas de espiral. Un tercer nivel de estructura de molculas protenicas es el desdoblamiento de la cadena de pptidos sobre s misma para formar protenas globulares. De nuevo enlaces dbiles como enlaces de hidrgeno, inicos e hidrofbicos se forman entre una parte de la cadena de pptidos y la otra parte, de modo que la cadena se desdobla de una manera especfica para dar una estructura general especfica de la molcula protenica. Enlaces covalentes como los de disulfuro (-S-S-) son importantes en la estructura terciaria de muchas protenas. La actividad biolgica de una protena depende en gran parte de la estructura primaria especfica que es mantenida junta por esos enlaces. Cuando una protena se calienta o trata con cualquiera de una variedad de productos qumicos, se pierde la estructura terciaria. Las cadenas de pptidos espiralazas se desdoblan para dar una configuracin aleatoria acompaada por una prdida de la actividad biolgica de la protena. Este cambio se llamadesnaturali zacin. Los 20 aminocidos aminados que suelen encontrarse en las protenas poseen todos un grupo amino (-NH2) y un grupo carboxlico (-COOH), pero sus cadenas laterales son distintas. El mas simple de todos, la glicina, tiene como cadena lateral un H; la alanita, un grupo CH3. El grupo amino permite al aminocido aminado actuar como base y combinarse con cidos; el grupo cido, le permite combinarse con las bases. Los aminocidos y las protenas sirven deamortiguadores y pueden resistir a cambios de acidez y alcalinidad. Los aminocidos se unen entre s para formar protenas mediante un enlace peptdico entre el grupo amino de una molcula y el grupo carboxilo de la otra. Los aminocidos puros obtenidos de las protenas tienen sabor dulce. Cuando se ingieren protenas son hidrolizadas a aminocidos antes de ser absorbidas a la corriente sangunea. Los aminocidos son llevados a todas las regiones del organismo, donde sirven para la elaboracin de nuevas protenas, o son metabolizados para liberar energa. Las protenas tienen importancia primordial como componentes estructurales de las clulas y como constituyentes funcionales de enzimas y algunas hormonas, pero pueden servir tambin como combustible para produccin de energa. Los aminocidos pierden primero su grupo amino por una reaccin enzimtica llamadadesaminaci n. El grupo amino reacciona con otras sustancias para formar urea, que se excreta. El resto de la molcula puede transformarse por una serie de fases intermedias en glucosa, que se utiliza pronto como combustible, o almacenarse como glucgeno Las plantas pueden sintetizar todos los aminocidos a partir de sustancias simples. Los aminocidos que los animales no pueden sintetizar y que deben obtener en su alimentacin se llaman aminocidos esenciales. Debe

comprenderse que estos aminocidos no son ms esenciales que otros; slo lo son respecto a la alimentacin, pues no es posible sintetizarlos. Identificacin de aminocidos y protenas: Reaccin de Ninhidrina Reaccin para la deteccin de aminocidos, actualmente acoplada a sistemas de valoracin automtica Tiene como objetivo detectar y cuantificar cantidades de aminocidos libres. Los aminocidos, en general reaccionan con la ninhidrina cuando son calentados con un exceso de la misma. Todos los aminocidos que poseen un grupo amino libre reaccionan y forman dixido de carbono, amonaco y un aldehdo que contiene un tomo de carbono menos que el compuesto original. Esta reaccin da lugar a la formacin de un producto color azul o prpura (que posteriormente puede ser utilizado para cuantificar el aminocido). En el caso de la prolina, que estructuralmente no posee el grupo amino libre, sino un grupo imino, la coloracin final es amarilla. El amonaco, la mayora de los polipptidos y las protenas pueden desarrollar coloracin en esta reaccin, pero a diferencia de los aminocidos, no liberan CO2. La coloracin azulada o violeta ser proporcional a la concentracin del aminocido. La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) es un oxidante energtico que por una desaminacin oxidativa de los aminocidos conduce a la formacin del aldehdo correspondiente, con liberacin de amoniaco y gas carbnico y formacin de la ninhidrina reducida o hidrindrantina. La molcula de hidridantina, en presencia de otra de ninhidrina, condensa a travs del amoniaco produciendo una estructura denominada indanona o prpura de Ruhemann, manifestando un color rojizo, excepto para la prolina, hidroxiprolina y en menor medida para la histidina. Presenta su mximo de absorbancia a los 570 nm, exceptuando los tres aminocidos reseados anteriormente. Reaccin de Biuret El nombre de la reaccin procede del compuesto coloreado formado por la condensacin de dos molculas de urea con eliminacin de amonaco. Esta reaccin est dada por aquellas sustancias cuyas molculas contienen dos grupos carbamino (-CO.NH) unidos directamente o a travs de un solo tomo de carbono o nitrgeno. El reactivo de Biuret contiene Cu2SO4 en solucin acuosa alcalina (gracias a la presencia de NaOH o KOH). La reaccin se basa en la formacin de un complejo de coordinacin entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrgeno que forma parte de los enlaces peptdicos. Esta ltima reaccin provoca un cambio de coloracin: violeta prpura o violeta rosado. Debe sealarse que el color depende de la naturaleza de las protenas; protenas y pptidos dan un color rosado; la gelatina da un color azul Reaccin de Milln La reaccin del Milln se debe a la presencia del grupo hidroxifenilo en la molcula proteica. Cualquier compuesto fenlico que no est sustituido en la posicin 3,5 como la tirosina, el fenol y el timol producen resultados positivos en esta reaccin. De estos compuestos, slo la tirosina est presente en las protenas, de manera que slo las protenas que tienen este aminocido ofrecen resultados positivos. En esta prueba los compuestos mercricos en medio fuertemente cido (cido ntrico del reactivo) se condensan con el grupo fenlico formando un compuesto de color rojo ladrillo o rojizo. La prueba no es satisfactoria para soluciones que contienen sales inorgnicas en gran cantidad, ya que el mercurio del reactivo del Milln es precipitado y se vuelve negativo, razn por

la cual este reactivo no se usa para medir albmina en orina. Debe tomarse en cuenta que en el caso de que la solucin a examinar sea muy alcalina, debe ser previamente neutralizada, ya que el lcali precipitara al ion mercurio en forma de xidos amarillos. Adems, protenas como la ovoalbmina producen un precipitado blanco que progresivamente por accin del calor se torna rojo; pero las peptonas dan solamente una solucin de color rojo. Reaccin de Xantoproteica Esta prueba caracteriza a los aminocidos aromticos (tirosina, fenilalanina, triptfano. Esta reaccin se debe la presencia de un grupo fenilo en la molcula proteica. Los complejos de la molcula proteica que son de importancia en esta reaccin son la tirosina y el triptfano. La fenilalanina no reacciona en las condiciones que se realiza en el laboratorio. Para esta prueba se produce la nitracin del anillo bencnico presente en los aminocidos obtenindose nitrocompuestos de color amarillo, que se vuelven anaranjado en medio fuertemente alcalino (formacin de cido picrmico o trinitrofenol). No puede realizarse esa reaccin para identificar albmina en orina, por el color anaranjado de la reaccin final. Las protenas que tienen en su composicin estos aminocidos tambin darn la reaccin. La positividad se reconoce por la aparicin de un color amarillo o verde debido a la formacin de nitrocompuestos. Prueba de los grupos SH: Es una prueba para identificar aminocidos azufrados y las protenas que los contienen, se reconocen por la formacin de una coloracin negra o gris. Prueba de Sakaguchi Esta prueba es positiva para compuestos que contengan el grupo guanidinio como la arginina ya que casi todas las protenas poseen ese aminocido.El reactivo que se utiliza contiene -naftol e hipoclorito sdico, en medio alcalino. La aparicin de una coloracin roja es indicativa de una reaccin positiva. El desarrollo de un color rojo marca la reaccin positiva y se debe a la presencia del grupo guanidina, que caracteriza la arginina. Prueba de Hopkin-Cole Implica la reaccin del grupo indol del triptofano con el cido glioxlico y las protenas que lo contienen, en presencia de cido sulfrico concentrado. La positividad se reconoce por la aparicin de un anillo color violeta-rojizo. Prueba de Jaff Si acontece la aparicin de una coloracin roja, se tratar de una prueba positiva para la creatinina. Puede ser leda a 520 nm, detectndose hasta 5 g/mL. Prueba de coagulacin: Es una prueba para identificar: albminas, globulinas, glutelinas y prolaminas. La positividad se manifiesta por la formacin de un cogulo. No se conoce exactamente el mecanismo de reaccin, se cree que ocurre cierta deshidratacin de la molcula proteica. Prueba de Sulfato de amonio: Las protenas, como otros coloides son precipitadas por soluciones concentradas de sales de amonio [NaCl. (NH4)2SO4 y NaSO4 ]. Aparentemente la precipitacin se debe a la neutralizacin y deshidratacin de la molcula, seguida de agregacin y precipitacin. Reaccin de Ehrlich La presencia de anillos aromticos fenlicos o nitrogenados en la cadena lateral de los Aminocidos se puede identificar mediante la reaccin con cido sulfanlico y nitrito de Sodio por formacin de sales de Diazonio fuertemente coloreadas permitiendo as detectar la presencia de Tirosina e Histidina libres o formando pptidos y protenas. Reaccin con acetato de Plomo alcalino Los Aminocidos azufrados como Metionina, Cisteina y Cistina se reconocen por la formacin de precipitados de

Sulfuro de Plomo de color gris oscuro o negro que se forman cuando reacciona con Acetato de Plomo en medio alcalino. La mayora de las especies animales tienen valores de protena sricas de alrededor de 7.6 g por 100 ml. En general aumenta cuando hay una ingesta disminuida de fluidos o cuando hay prdida de lquidos (diarrea, vmitos, quemaduras, etc.). Cuando los niveles disminuyen a 5.3 o menos se presenta edema inmediatamente. La disminucin puede deberse a muchas causas tales como excrecin renal (albuminuria) o cuando la sntesis de protena esta disminuida debido a la desnutricin, deficiencia de vitaminas o enfermedades de las vas digestivas y del hgado. Protenas sricas Son protenas globulares que permanecen en el suero tras la acidificacin de la leche a pH = 4,6 o por la accin del cuajo, no interviniendo en la formacin de la cuajada, razn por la que tambin se las denomina protenas sricas. Y se detectan en el suero de quesera una vez separado del gel por tecnologas clsicas. La determinacin de protenas sricas en sangre sirve para confirmar desrdenes relacionados con la sangre, riones, enfermedades hepticas, deficiencias proteicas, diagnstico de tumores. Valores normales: Protenas totales 6.6 a 7.9g/dl Albmina 3.3 a 4.5g/dl Alpha-1-globulina 0.1 a 0.4g/dl Alpha-2-globulina 0.5 a 1g/dl Beta globulina 0.7 a 1.2g/dl Gamma globulina 0.5 a 1.6g/dl Valores aumentados: en enfermedades inflamatorias; enfermedades del colgeno; deshidratacin; diabetes; acidosis diabtica; cirrosis; algunos linfomas; mieloma; enfermedad de Waldenstrom; Lupus eritematoso sistmico; algunas enfermedades infecciosas; artritis reumatoidea; vmitos y/o diarrea. Mtodos de Determinacin de protenas sricas Debido a que la albmina srica y por lo menos una pequea fraccin de las globulinas se sintetizan en el hgado, las protenas del suero son afectadas tanto cualitativa como cuantitativamente en los procedimientos hepticos. En cualquier enfermedad que ocasione alteraciones hepocelulares la concentracin de seralbmina estar disminuida. En diversas hepatopatas las globulinas sricas pueden alcanzar niveles suficientes que basten para mantener la concentracin total de protenas a niveles normales o elevados, aun en presencia de una notable reduccin de la albmina. Debido a estas causas, las cifras cambiantes de albmina srica proporcionan ndices valiosos con respecto a la severidad, evolucin y pronstico de las hepatopatas. Los niveles bajos de albmina y levados de globulina en suero, indican origen hepatocelular de la ictericia o de la hepatopata. En la ictericia obstructiva, los cambios de las protenas del suero se presentan tardamente, una vez que se han instalado las alteraciones hepatocelulares secundarias. Sin embargo, la colangitis y la cirrosis biliar ocasionan alteraciones hepticas que pueden no ser precedidas por alteraciones en las protenas. Ms aun, las alteraciones de las protenas sricas pueden volver a la normalidad antes de que la convalecencia de la hepatitis se haya completado. La interpretacin del significado de la determinacin de las protenas sricas requiere, por lo tanto, un gran cuidado y criterio.

Las concentraciones sricas de protenas totales, albmina y globulina pueden determinarse qumicamente. El fraccionamiento por electroforesis proporciona una determinacin ms exacta de los componentes de las protenas sricas Las protenas normalmente difunden desde el plasma al LCR a travs de la barrera sangre-LCR. La mayor parte de las protenas sricas se hallan en el LCR e incluyen el fibringeno y la lipoprotena beta en concentraciones bajas. Las proporciones de concentracin entre plasma y LCR se relacionan moderadamente bien con los radios hidrodinmicos, y no tan bien con los pesos moleculares. Mtodos Los mtodos utilizados para medir las protenas totales en el LCR pueden clasificarse en 6 categoras: 1. Procedimientos turbidimtricos a) cido sulfosaliclico ms sulfato sdico b) cido tricloroactico (TCA) 4 2. Espectrofotometra ultravioleta a 210 mn despus de: a) Cromatografa en columna. b) Ultrafiltracin 3. Mtodos de Lowry utilizando el reactivo de Folin-Ciocalteau a) Con blanco b) Sin blanco 4. Procedimientos modificados del biuret con medicin a 300 nm 5. Mtodos inmunolgicos. En Estados Unidos se utilizan mucho los mtodos turbidimtricos. Existe una relacin lineal entre la turbiedad y la temperatura, y es esencial en control exacto de esta ltima para obtener resultados reproducibles. El cido sulfosaliclico de mayor turbiedad con la albmina que con las globulinas; sin embargo, las variaciones de la relacin albminaglobulina no tienen efecto significativo sobre el mtodo de SSA/SS (3% de cido sulfosaliclico en 7% de sulfato sdico) de Meulmans o el mtodo del TCA de Meulmans (3% de cido tricloroactico). Como consecuencia de las variaciones de reactividad observadas con la albmina y globulina, no debe utilizarse albmina como estndar para los mtodos turbidimtricos. Las ventajas de estos mtodos comprenden su sencillez y el hecho de que algunos medicamentos que interfieren con los procedimientos de Lowry y del Biuret sin blanco no provocan turbiedad con el SSA o el cido tricloroactico (TCA). Las desventajas incluyen el hecho de que se necesitan aproximadamente 500 l de LCR, en comparacin con 25 a 200 l para los otros mtodos, y la xantocroma y el metotrexato intratecal pueden provocar interencias. La espectrofotometra ultravioleta (UV) a 200 nm se basa en el principio de que las soluciones de protenas muestran una absorbancia intensa entre 210 y 220 nm, lo cual refleja la presencia del enlace peptdico. Las interferencias debidas a los polipptidos de cadena corta y a los frmacos pueden eliminarse por cromatografa de columna o con un blanco preparado por ultrafiltracin. Los trastornos de la relacin albmina-globulina no tienen efecto, puesto que la albmina y la globulina tienen absorbancia comparable a 210 nm. La espectrofotometra UV slo requiere entre 100 y 200 l de LCR y la precisin parece ser algo superior a la de los mtodos turbidimtricos. Por otra parte, requiere ms tiempo y es ms difcil que estos mtodos; el limite superior del

intervalo de regencia por este mtodo es algo mayor (60mg/dl) que para otras tcnicas, y no todos los laboratorios disponen de la instrumentacin necesaria. El mtodo de Lowry con el reactivo de Folin-Ciocalteau se utiliza mucho en Europa. Este mtodo comporta dos reacciones: a) una reaccin inicial de la protena y el cobre, relacionada con la reaccin del biuret; b) una segunda reduccin de los cidos fosfotngstico y fosfohemolbdico con el complejo de cobre-protena, as como con tiosina y triptfano. El mtodo de Lowry slo precisa 100 a 200 l de LCR. Sin embargo, es ms prolongado y ms difcil que los mtodos turbidimtricos, y est sujeto a interferencias variables derivadas de los fenoles y frmacos producidos endgenamente (salicilatos, cloropromacina, tetraciclina y sulfamidas). Varios autores entre ellos Burgi (1967) han descrito mtodos de Biuret modificados. No obstante estos parecen menos utilizados que los procedimientos turbidimtricos, la espectrofotometra UV o el mtodo de Lowry. Solo se necesita de 100 a 200 l de LCR. Los mtodos del Biuret requieren ms tiempo y son ms difciles que los turbidimtricos y estn sujetos a interferencias derivadas de los polipptidos de cadena corta (las cuales pueden compensarse utilizando como blanco un filtrado libre de protenas). Aunque sean descritos mtodos de fijacin de colorantes, la experiencia hasta la fecha parece limitada, en comparacin con otros mtodos de protenas de LCR, es una desventaja. Tambin se han descrito mtodos inmunolgicos para las protenas totales de LCR. Una importante ventaja consiste en que solo se necesita pequeas cantidades de LCR ( 25 a 50 l). Despus de establecer las condiciones de reaccin y estandarizar los reactivos, la tcnica es relativamente simple y comparable a los mtodos turbidimtricos. Las desventajas estriban en que diferentes protenas pueden originar diversas curvas de precipitinas, as como distintas respuestas de dispersin luminosa, cuando estn ligadas a su anticuerpo especficos. As mismo, puede producirse una variacin entre diferentes lotes de antisueros. Aunque los mtodos inmunolgicos ofrecen ventajas significativas para las protenas totales del LCR, su empleo ms amplio exigir mayor experiencia, as como antisueros fiables que reaccionen de manera uniforme con todas las protenas del LCR.