Isocitrato Deshidrogenasa

Estudios moleculares, físico-químicos e ingeniería proteica de isocitrato deshidrogenasa de Haloferax volcanii. Adoración Rodríguez Arnedo.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 2004

UNIVERSIDAD DE ALICANTE
FACULTAD DE CIENCIAS
"ESTUDIOS MOLECULARES, FÍSICO-

QUÍMICOS E INGENIERÍA PROTEICA DE
ISOCITRATO DESHIDROGENASA DE
Haloferax volcaniP'

D. JUAN SÁNCHEZ ANDRÉU, DIRECTOR DEL

DEPARTAMENTO DE AGROQUÍMICA Y BIOQUÍMICA DE LA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA UNIVERSIDAD DE ALICANTE
CERTIFICA: Que la memoria adjunta titulada "Estudios moleculares,

físico-químicos e ingeniería proteica de Isocitrato Deshidrogenasa de
Haloferax volcanif presentada por Dña. Adoración Rodríguez Arnedo, ha
sido realizada en este Departamento bajo la dirección de la Dra. María
José Bonete y la Dra. Monica Camacho. Y para que conste a los efectos
oportunos expido el siguiente certificado en:
Alicante, Octubre de 2004
Dr. Juan Sánchez Andréu

Memoria presentada para optar al grado de Doctora en Biología por la

Universidad de Alicante.
Dña. Adoración Rodríguez Arnedo
DIRECTORAS:
- = ^
Dra. M^ José Bonete Pérez Dra. Monica Camacho Carrasco

Catedrática de Bioquímica y Profesora Titular de Bioquímica y
Biología IVIolecular de la Facultad Biología Molecular de la Facultad
de Ciencias de la Universidad de de Ciencias de la Universidad de
Alicante, Alicante.

El presente trabajo ha sido subvencionado por los proyectos de

investigación:
• Biología molecular y estructural de enzimas implicadas en el

metabolismo del nitrógeno y del carbono en extremófilos. Ministerio
CICYT PB98-0969.
• The structural basis of the enzyme halophilicity. NATO. Colaborative

Research grants (1997-1999).
• Proteínas de extremófilos. Generalitat Valenciana. Ajudes a grups

d'investigació GROO-172.
• Proteínas de extremófilos. Generalitat Valenciana. Ajudes a grups

d'investigació GR01-120.
• Proteínas de extremófilos. Universidad de Alicante. Ajudes a grups

d'investigació (2002-2003).
• Proteínas de extremófilos. Universidad de Alicante. Ajudes a grups

d'investigació (2003-2004).
• Identificación y caracterización de genes implicados en el metabolismo

del Nitrógeno en arqueas halófilos. Generalitat Valenciana.
CTIDIB/2002/154.
• Modificación de enzimas extremófilas. Ministerio BIG 2002-03179.

Parte de los resultados que se expresan en esta memoria han dado lugar a
los siguientes artículos en Revistas Internacionales:
Camacho, M., Rodríguez-Arnedo, A. y Bonete, M. J. (2002) NADP-

dependent isocitrate dehydrogenase from the halophilic archaeon Haloferax
volcanii: cloning, sequence determination and overexpression in Escherichia
coli. FEI\^S Microbiol. Lett. 209, 155-160.
Madern, D., Camacho, M., Rodríguez-Arnedo, A., Bonete, M. J. y Zaccai,

G. (2004) Salt-dependent studies of NADP-dependent isocitrate dehydrogenase
from the halophilic archaeon IHaloferax volcanii. Extremophiles. En prensa
(10.1007/S00792-004-0398-Z).
Rodríguez-Arnedo, A., Camacho, M., Llorca, F. y Bonete, M. J. (2004)

Site-directed mutagenesis of halophilic isocitrate dehydrogenase to switch the
coenzyme specificity. Archaea. Sometido a publicación.

Deseo expresar mi más sincero agradecimiento a todas aquellas

personas que directa o indirectamente han contribuido a la realización de esta
tesis.
En primer lugar, a la Dra. María José Bonete y a la Dra. Monica

Camacho, por haberme dado la oportunidad de iniciarme en la ciencia y
haberme acogido para realizar la tesis bajo su dirección, con ellas he aprendido
todo lo que se y a ellas me debo como investigadora. Agradezco también su
trato humano y cordial, y su atención tanto en lo profesional como en lo
personal.
En segundo lugar, al Dr. Francisco Llorca por su apoyo y por tratarme

como una "amiga de toda la vida", ha depositado en mi mucha confianza y
espero no defraudarle. A la Dra. Carmen Pire y al Dr. Frutos Marhuenda,
porque me ayudaron desde mis inicios y compartieron conmigo ciencia y risas.
A todos mis compañeros del laboratorio, tanto a los que siguen como a
los que por alguna circunstancia ya no están en el grupo; a Adrián, por soportar
siempre mis bromas y quejas, a Rosa, Nuria, Paco, Susana, Jessica, Juan
Antonio, Damiana, Esperanza, Gema, Luís, Sara, María Ximena, Marina,
Mireia, y en particular a Juan Antonio Serrano, con él compartí muy buenos
momentos sobrellevando las dificultades que acompañan a la investigación con
halófilos. Y en general a todos los miembros del departamento de Bioquímica y
Agroquímica.
A los chicos de "micro"; Lenin, Fernando y Arancha, y a sus directores, la

Dra. Pepa Antón y el Dr. Francisco Martínez, por su ayuda y consejo en los
temas referentes a microbiología y halófilos.

En especial, a "mis chicas", Belén, Julia y Vanesa, y a José Luís por

hacerme pasar tan buenos ratos, porque siempre sabéis estar, en los buenos y
en los malos momentos, por saber escuchar y dar consejos, y sobretodo por
ser como sois, como siempre digo: Un beso.
A Elena Soria, desde que empezamos juntas en los departamentos

siempre he tenido su apoyo, aunque estuviésemos lejos, tanto como Huston.
Gracias a ella se lo que es una buena amiga.
A toda mi familia, en especial a mis padres, pues sin su ayuda no habría

llegado donde estoy y a mis hermanos, por saber escuchar y comprenderme,
siempre he recibido de ellos un buen consejo.
A mis tíos, a mis primos y a mis cuñados, porque siempre me hacen reír,
llorar (de alegría) y me dan su cariño. A mis dos bichitos: Alma y Antonio,
porque un beso suyo me hace olvidar los malos momentos.
Y en especial a mi "sol", que me mantiene viva todos los días, tú sufres

mis mejores y peores momentos, y siempre encuentro apoyo en ti, sabes
apaciguarme y darme fuerzas cuando lo necesito. Doy gracias por haberte
encontrado, te quiero mucho Ricardo.

A mi abuela Amalia.

RESUMEN
La proteína isocitrato deshidrogenasa es una enzima clave del ciclo de

los ácidos tricarboxílicos. Cataliza la descarboxilación oxidativa del isocitrato en
a-cetoglutarato en presencia de NAD(P)* y liberando CO2 en el proceso. En el
organismo halófilo Haloferax volcanii, esta enzima es dimérica, dependiente de
NADP"^ y de la presencia de Mg^'*' como catión divalente, siendo estable en un
amplio rango de concentraciones salinas.
En la actualidad existen muchas isocitrato deshidrogenasas

secuenciadas pero muy pocas estructuras tridimensionales de esta enzima
resueltas; en concreto sólo dos, las de los organismos Escherichia coli y
Bacillus subtilis, pero ninguno de ellos presenta comportamiento extremófilo. A
pesar de ello, las isocitrato deshidrogenasas diméricas presentan un elevado
grado de identidad de secuencia, lo que permite trabajar con estas dos
enzimas como modelos.
En particular, en la enzima de E. coli, se han realizado estudios de

regulación por fosforilación, de mutagenesis para producir el cambio en la
especificidad del coenzima a NAD y para identificar los aminoácidos implicados
en la unión del sustrato, así como ensayos cristalográficos con la consecuente
resolución de la estructura tridimensional.
En este trabajo, se han realizado estudios filogenéticos, bioquímicos y

físico-químicos como fluorescencia, dicroísmo circular y ultracentrifugación
diferencial, así como ensayos de mutagenesis dirigida para producir el cambio
de especificidad de la enzima por el coenzima a NAD; además, se ha realizado
el modelado teórico de la enzima, tanto en su forma nativa como mutante.

Para realizar la gran mayoría de estos estudios es necesario obtener

gran cantidad de isocitrato deshidrogenasa que, por cultivo del organismo de
procedencia, Hfx. volcanii, sería muy complicado de conseguir y requeriría
mucho tiempo y esfuerzo. Para ello se ha clonado y expresado la enzima de
forma heteróloga en E. coli, se ha renaturalizadodo a partir de los cuerpos de
inclusión y se ha purificado hasta homogeneidad, obteniendo la cantidad
necesaria para poder realizar cada uno de los ensayos.

ÍNDICE.

ÍNDICE.
1. Objetivos. 4
2. Antecedentes. 6
2.1. Filogenia. 7
2.2. Dom'mlo Archaea. 11
2.3. Halófilos. 12
2.3.1 Haloferax volcanii. 12
2.3.2. Proteínas. 15
2.3.3. Metabolismo. 16
2.4. Isocitrato deshidrogenasa. 18
2.4.1. Tipos. 18
2.4.2. Mecanismo químico. 19
2.4.3. Características y comportamiento cinético de
isocitrato desíiidrogenasa NADP'^-dependiente de
Haloferax volcanii. 20
3. Obtención del gen de isocitrato deshidrogenasa de
Haloferax volcanii. 21
3.1. Introducción. 22
3.1.1. Preparación de un producto de PCR marcado
con digoxigenina. 22
3.1.2. Construcción de una genoteca de DNA
genómico, amplificación y localización del gen. 22
3.1.3. Preparación de muestras de DNA viral y secuenciación. 25
3.1.4. Análisis de secuencias. 29
3.2. Metodología. 32
3.2.1. Preparación del producto de PCR marcado
con digoxigenina. 32
3.2.2. Construcción de la genoteca de DNA genómico,
amplificación y localización del gen. 35
3.2.3. Preparación de muestras de DNA viral y secuenciación. 39
3.2.4. Análisis de secuencias. 45
3.3. Resultados y discusión. 45
3.3.1. Obtención del producto de PCR. 45

3.3.2. Amplificación de la genoteca. 48

3.3.3. Purificación del DNA viral y secuenciación. 49
3.3.4. Análisis de la secuencia obtenida. 55
4. Clonaje y expresión heteróloga del gen de isocitrato desidrogenasa
de Haloferax volcanii. 70
4.1.1. Obtención de genes por PCR. 71
4.1.1. Clonaje en diferentes vectores. 72
4.1.2. Expresión heteróloga. 74
4.2.1. Obtención del gen de isocitrato deshidrogenasa. 78
4.2.2. Fases de clonaje. 81
4.2.3. Expresión heteróloga y purificación de la
enzima recombinante. 85
4.3.1. Síntesis del gen de la enzima por PCR. 89
4.3.2. Obtención del clon de isocitrato deshidrogenasa. 92
4.3.3. Expresión y purificación de isocitrato
deshidrogenasa recombinante 100
5. Caracterización bioquímica y fisico-química de la enzima
recombinante. 110
5.1.1. Caracterización bioquímica. 111
5.1.2. Propiedades físico-químicas. 112
5.2.1. Determinación de los parámetros cinéticos
y termoestabilidad. 119
5.2.2. Estudios de fluorescencia, dicroísmo circular
y ultracentrifugación analítica. 120
5.3.1. Parámetros cinéticos y termoestabilidad. 123
5.3.2. Efecto de ía concentración de sal y de los cationes en la
estabilidad de isocitrato deshidrogenasa de Haloferax
vol canil. 131

6. Ingeniería de proteínas. 147

6.1.1. I\/lodelado de proteínas. 148
6.1.2. IVIutagénesis dirigida. 150
6.2.1. Obtención del modelo teórico. 153
6.2.2. Mutagenesis de los residuos implicados en la unión del
coenzima. 154
7. Conclusiones. 176
8. Bibliografía. 179
9. Apéndices. 207

1. OBJETIVOS.

Objetivos
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1.1 Obtener la secuencia completa del gen que codifica a la proteína

isocitrato deshidrogenasa de Haloferax volcanii utilizando las técnicas de
mareaje no radiactivo de fragmentos y secuenciación automática de
bacteriófagos.
1.2 Realizar análisis filogenéticos y determinar las regiones clave en la

unión de sustrato y coenzima, así como la estructura secundaria de la proteína
isocitrato deshidrogenasa de Haloferax volcanii.
1.3 Expresar de forma heteróloga el gen que codifica la isocitrato

deshidrogenasa de Haloferax volcanii. Renaturalizar y purificar la enzima
recombinante y determinar los parámetros cinéticos.
1.4 Obtener información estructural y de cinética del plegamiento de la

enzima recombinante mediante la realización de estudios físico-químicos.
1.5 Realizar estudios de mutagenesis dirigida para cambiar la especificidad

de isocitrato deshidrogenasa por el coenzima, NAD"" en lugar de por NADP"^.

2. ANTECEDENTES.

Antecedentes 2.1. FILOGENIA
2.1. FILOGENIA.
El acontecimiento más importante referente al conocimiento completo de

los seres vivos fue el enunciado de la hipótesis de que existían dos grupos
principales de organismos, los procariotas (bacterias) y los eucariotas
(organismos con células nucleadas) por Chatton en 1937. Esta clasificación fue
confirmada por Staniery van Niel (1962), y fue aceptada universalmente por los
biólogos hasta 1977 cuando Woese y Fox, basándose en la comparación de
fragmentos de RNA ribosómico 16S o 18S generados por tratamiento con
ribonucleasa, propusieron que los procariotas no eran un grupo homogéneo,
sino que hay dos linajes claramente diferenciados, que llamaron eubactehas y
arqueobacterias. Cada uno de estos grupos tenía tanta entidad como los
eucariotas.
Las arqueobacterias (ahora llamadas arqueas) presentan un interés

especial por dos razones. La primera es la capacidad de englobar a toda clase
de organismos altamente especializados que pueden vivir en ambientes muy
inusuales, que a primera vista parecen totalmente inapropiados para la vida,
como son manantiales calientes, manantiales sulfurados, salmueras, etc. De
cualquier modo, recientemente se ha encontrado que las arqueas son también
comunes en otros ambientes "normales" como agua de mar, arrozales, y
pantanos (DeLong, 1998). La segunda razón es el descubrimiento más
interesante, pues las arqueas comparten muchos de los genes más
importantes con eucariotas; y posteriormente se ha demostrado que los
eucariotas tenían una raíz común a las arqueas (Woese, 1987).
En 1990, Woese y col. realizaron una nueva clasificación basándose en

las secuencias de rRNA. En dicha clasificación propusieron un valor
taxonómico de mayor rango que el reino, al cual denominaron Dominio. Los
tres Dominios son: Bacteria, Eukarya y Archaea (Woese y col., 1990).
Actualmente se sigue manteniendo esta nomenclatura (Figura 1).

Woese presumiblemente basó su decisión en dos supuestos: a) que

bacterias y arqueas provenían independientemente desde el "progenote", su
ancestro de vida hipotético, y b) que "a nivel molecular, las arqueas pudieran
parecerse a otros procariotas, las bacterias, no más (probablemente menos) de
lo que se parecen a los eucariotas" (Woese y col., 1990; Koonin y col., 1997).
Figura 1: Relaciones filogenéticas de los seres vivos en base a comparaciones

de rRNA (Barns y col., 1996)

Antecedentes 2.1. FILOGENIA
En la actualidad existen nnuchos puntos de vista para establecer

similitudes entre bacterias, arqueas y eucariotas. En función de los criterios
considerados por los distintos autores, se pueden enumerar varias hipótesis:
- En primer lugar, autores que discrepan que las arqueas sean más
parecidas a los eucariotas de lo que lo son a los procariotas. Creyentes de esta
hipótesis son autores como Forterre (1997) y Brinkmann y Philippe (1999) que,
basándose en estudios de DNA genómico y comparación de partículas de
reconocimiento de señales (SRP), respectivamente, llegaron a la conclusión de
que las arqueas presentan mayor homología con las bacterias que con los
eucariotas.
- En segundo lugar, otros autores más radicales en sus creencias,

llegaron a l a conclusión de que las arqueas son un grupo de organismos
pertenecientes al Dominio procariota. Dos ejemplos de éstos son Mayr (1998) y
Gupta (1998). El primero de ellos se basó, en gran parte, en comparaciones de
secuencias de DNA genómico que codifica a enzimas implicadas en el
metabolismo, llegando a afirmar que las arqueas debían englobarse dentro del
Dominio Prokarya. El segundo postuló que la asignación de "Dominio" a
Archaea no está justificada, y propuso una reclasificación, debido al alto grado
de homología entre arqueas y bacterias Gram-positivas.
- En tercer lugar, aquellos que opinan que el grado de homología entre

arqueas y bacterias, y arqueas y eucariotas está en función de los genes que
se utilicen para establecer las comparaciones. Ejemplos de esto son Brown y
Doolittle (1997) y Andrade y col. (1999).
- En cuarto y último lugar, los autores que defienden que se mantenga, a

pesar de todo, la estructura en tres Dominios. Entre dichos autores se
encuentra Woese (1998b) que se pronunció reafirmando sus creencias en un
comentario al artículo publicado por Mayr (1998) meses antes; y más
recientemente Doolittle (2000) el cual realiza un nuevo árbol filogenético en el
que engloba los conocimientos actuales sobre el desarrollo de la vida (Figura

2). En éste se confirma que el último ancestro común engendró a bacterias y

arqueas y que de éstas se ramificaron luego los eucariotas.
Como Woese afirmó (1998a, 2002), el antepasado ancestral no fue un

organismo particular en linaje exclusivo. Se trató, por el contrario, de un
conglomerado diverso, de poca consistencia interna, de células primitivas que
evolucionaron al unísono hasta alcanzar un estadio en que los lazos terminaron
por cortarse y se formaron comunidades distintas, que a su vez terminaron por
conformar tres lineas de descendencia {Bacteria, Archaea y Eukarya).
FIGURA 2: Versión revisada del árbol de la vida (Doolittle, 2000).

Antecedentes 2.2. DOMMO Archaea
1.1. DOMINIO ArchSiea.
El Donninio Archaea se compone de nnicroorganisnnos procariotas muy

parecidos en cuanto a forma y tamaño a los microorganismos pertenecientes al
Dominio Bacteria. Las arqueas presentan una amplia variedad de fenotipos.
Woese y Fox, en 1977, propusieron los tres primeros fenotipos: metanógenos
(microorganismos estrictamente anaerobios y que producen metano en su
metabolismo, que expulsan al medio), halófilos (microorganismos capaces de
vivir en lugares con concentraciones salinas saturantes) y termoacidófilos
(microorganismos que viven en ambientes ácidos y con altas temperaturas).
Pero con el paso del tiempo, se han descubierto más fenotipos (Forterre y col.,
2002), como por ejemplo: metanógenos hipertermófilos o psicrófilos
(microorganismos estrictamente anaeróbicos que producen metano y sor
capaces de vivir en ambientes cálidos o fríos respectivamente), metanógeno:
alcalófilos y/o halófilos (microorganismos capaces de producir metano y vivir ei
ambientes alcalinos o hipersalinos respectivamente), e hipertermófilos
anaeróbicos, alcalófilos y neutrófilos (microorganismos capaces de vivir en
ambientes cálidos bajo condiciones de anaerobiosis, basicidad y pH neutro,
respectivamente). Finalmente, el estudio basado en la amplificación mediante
PCR y secuenciación del rRNA 16S de muestras ambientales, ha puesto de
manifiesto una amplia presencia de arqueas mesófilas en diferentes ambientes
(mares y suelos) cuyo fenotipo es desconocido.
Las arqueas se clasifican en tres Dominios: el Dominio Euryarchaeota, el

Dominio Crenarchaeota, y el Dominio Korarchaeota. Recientemente, Huber y
col. (2002) han propuesto un nuevo phylum, denominado Nanoarchaeota,
dentro del Dominio Archaea. Dicho phylum está representado por la especie
Nanoarchaeum equitans, un microorganismo simbionte hipertermófilo de tan
sólo 400 nm de diámetro que se ha encontrado en chimeneas submarinas. Los
estudios filogenéticos basados en secuencias de RNA ribosómico que se han
realizado con esta especie la sitúan en una rama aislada, pero la ubicación
exacta no se podrá determinar hasta que se amplíen dichos estudios a más
miembros de este grupo y se realicen los posteriores estudios filogenéticos.
11

Antecedentes 2.4. ISOCITRATO DESHIDROGENASA
2.3. HALÓFILOS.
Las arqueas halófilas extremas son un grupo clasificado en el Reino

Euryarchaeota, muy relacionados filogenéticamente con los metanógenos
(Woese y col., 1990; Barns y col., 1996).
Los halófilos se cultivaron por primera vez a finales del siglo XIX (Larsen,
1952) a partir de salazones de pescado, aunque se conocían desde muy
antiguo por el color rojizo que proporcionaban a las salinas solares.
Estos organismos, además de halófilos, son algo termófilos, ya que sus

habitats, por la posición geográfica que ocupan (clima mediterráneo y tropical
seco), y por tratarse de aguas estancadas, suelen ser lugares muy cálidos, con
temperaturas que pueden llegar a más de 50 °C, aunque su temperatura
óptima de crecimiento se sitúa en torno a 40-45 °C y no crecen por encima de
55 °C. Estos organismos son halófilos obligados, necesitando para crecer
concentraciones de NaCl superiores a 1.5 M (Larsen, 1986).
2.3.1. Haloferax volcanii.
Haloferax volcanii es un microorganismo halófilo extremo perteneciente

al Dominio Archaea que se aisló de aguas del Mar Muerto (Israel) y se
describió por primera vez en 1975 por Mullakhanbhai y Larsen.
En principio fue clasificado por estos autores como i-ialobacterium

volcanii, recordando al microbiólogo B. Elazari-Volcani, el primero en aislar
organismos (arqueas halófilos) en el Mar Muerto (Elazari-Volcani, 1940), y el
primero en proponer el género Halobacterium en la 7^ edición del Manual de
Bergey (Elazari-Volcani, 1957).
Posteriormente su nombre se cambió, junto con el de Halobacterium

mediterranei y Halobacterium denitrificans, para formar el nuevo género
Haloferax. Esta distinción se hizo en base a diferencias en los lípidos polares
12

de la membrana celular y a otras características morfológicas y fisiológicas

(Torreblanca y col., 1986). Actualmente se distinguen dieciocho géneros
(Figura 3) de haloarqueas: Haloarcula (Har.), Halobacterium (Hbt),
Halobaculum {Hbl.), Halobiforma {Hbf), Halococcus {Hcc), Haloferax {Hfx.),
Halomicrobium (Hmc), Halorubrum (Hrr.), Halosimplex (Hsx) Halogeometrícum
(Hgm.), Halorhabdus (Hrd.), Haloterrigena (Htg.), Natrialba (Nab.), Natrinema
(A/n/77.), Natronobacterium (Nbt.), Natronococcus (A/cc), Natronomonas (Nmn.),
Natronorubrum (Nrr.) (Dyall-Smith, 2001), y seis especies del género Haloferax:
Hfx. denitrificans, Hfx. gibbonsii, Hfx. mediterranei, Hfx. volcanii (McGenity y
col., 1998), Hfx. alexandrinus sp. (Asker y Ohta, 2002), y Hfx. lucentense.
Figura 3: Árbol filogenético del Orden Halobacteriales según la segunda

edición del Manual Bergey's 2001.

Haloferax volcanii es pleomórfico. Requiere concentraciones de NaCl

alrededor de 2 M para crecer. Necesita concentraciones altas de Mg^* (óptimo
0.1-0.5 M), y en su medio natural (Mar Muerto) tolera concentraciones de este
catión de hasta 1.8 M (Mullakhanbhai y Larsen, 1975). Esta concentración de
Mg^"" tan alta es necesaria para mantener la forma de las células (Cohen y col.,
1983), ya que, junto al NaCl, estabiliza la interacción entre la membrana celular
y la capa S (Cohen y col., 1991). Esta capa puede eliminarse por tratamiento
con EDTA (Dyall-Smith, 2001). En cuanto a sus necesidades de carbono, Hfx.
volcanii puede crecer en medios inorgánicos con una sola fuente de carbono
(medios mínimos) y se han descrito varios de ellos para esta especie
(Mevarech y Werczberger, 1985; Kauri y col., 1990; Dyall-Smith, 2001).
En la membrana, como ocurre con otros halófilos, los lípidos polares

mayoritarios son los que tienen la región hidrofílica compuesta por
fosfatidilglicerol metilfosfato; sin embargo no aparece fosfatidilglicerol sulfato ni
un grupo diglucosídico fosfato como en el resto de halófilos (Torreblanca y col.,
1986).
La pared celular (capa S) de Hfx. volcanii esiá formada por un único tipo
de glucoproteína que cubre a la célula con un empaquetamiento de malla
hexagonal. Los glúcidos están unidos al esqueleto polipeptídico tanto por
enlaces N- como 0-glucosídicos. Los enlaces 0-glucosídicos se forman entre
disacáridos (glucosil (1-2) galactosa) y residuos de treonina de la proteína
(Sumper y col., 1990). Este halófilo produce granulos de reserva de poli-p-
hidroxibutirato (PHB) (Garcia-Liilo y Rodríguez-Valera, 1990).
El genoma de Haloferax volcanii está formado por un cromosoma

circular de unas 2923 kb, y por 4 plásmidos: pHVI, de 86 kb, pHV2, de 6354
pb, pHV3, de 442 kb y pHV4, de 688 kb. En los plásmidos, aunque son de gran
tamaño, se han encontrado muy pocos genes, y hay que destacar la gran
cantidad de secuencias de inserción en pHV4, el mayor de ellos.
14

Este organismo se ha utilizado nnucho y se sigue utilizando actualmente

para estudios de biología molecular de halófilos: se han descrito métodos de
transformación con plásmidos (Charlebois y col., 1987); se han construido
vectores de clonaje que pueden utilizarse tanto en Hfx. volcanii como en
Escherichia coli (Lam y Doolittle, 1989) y también se han construido vectores
de expresión (Nieuwlandt y Daniels, 1990); se han hecho transposones
artificiales que confieren resistencia a antibióticos (Dyall-Smith y Doolittle,
1994); se ha construido un mapa físico detallado de su genoma (Charlebois y
col., 1991); se han clonado y secuenciado varios genes y otros elementos
genéticos (Cohen y col., 1992) y se ha descrito las partes del genoma cuya
transcripción es más activa (Trieselmann y Charlebois, 1992). En cuanto a la
regulación de la transcripción, existen muy pocos ejemplos donde se estudie en
profundidad. Por último, en la replicación del DNA, las proteínas que
intervienen son homologas a las de Eulorya, incluyendo las DNA polimerasas,
aunque se ha descubierto un nuevo grupo de estas enzimas en Archaea. Esto
parece indicar que el mecanismo de replicación de arqueas es más parecido al
de eucariotas que al de bacterias, aunque tiene características únicas que no
se dan en los otros dos Dominios (Cann e Ishino, 1999).
2.3.2. Proteínas.
Las proteínas de halófilos necesitan en general altas concentraciones

salinas para su correcto funcionamiento; estas concentraciones pueden
alcanzar valores de 2-4 M de Na'*" o K"", aunque existen excepciones según
especies. Para poder ser solubles y estables a tan altas concentraciones
salinas, las proteínas han desarrollado mecanismos específicos que consisten
en la modificación de la composición aminoacídica (Madern y col., 2000). Así,
las proteínas se caracterizan por presentar un aumento de residuos ácidos
(Lanyi, 1974), un bajo contenido en lisinas, un aumento de los residuos
hidrofóbicos (Gly, Ala y Val) y una disminución de los residuos alifáticos
(Madern y col., 1995).
Las enzimas de organismos halófilos mantienen su estructura y función

a concentraciones de sal cercanas a la saturación, a las que la mayoría de las
15

proteínas no halofílicas precipitan en disolución. La elevada carga negativa

encontrada en la superficie de estas proteínas sirve para mantener una capa
de hidratación en la forma de cationes sodio y potasio hidratados. Además, es
evidente que no sólo la densidad de carga es importante, sino que la
hidratación (y, por tanto, la solubilidad) alivia la interacción coordinada de estas
cargas en el espacio tridimensional (Dyall-Smith y Danson, 2001).
Debido a la importancia biotecnológica de Hfx. volcanii se han

caracterizado muchas de sus proteínas, tanto las proteínas implicadas en los
procesos de síntesis de ácidos nucleicos, como las enzimas implicadas en el
metabolismo. Ejemplos de estas proteínas son: dihidrolipoamida
deshidrogenasa (Vettakkorumakankav y col., 1992), isopropilmalato
deshidrogenasa (Allers y col., 2003) y dihidrofolato reductasa (Rozenblatt-
Rosen yMevarech, 2000), entre otras.
2.3.3.Metabolismo.
Las arqueas halófilas son quimioheterótrofas aerobias. Sin embargo, en

su habitat natural, debido a la elevada concentración salina y a las elevadas
temperaturas, la concentración de oxígeno en el agua puede llegar a ser muy
baja, por lo que los organismos halófilos pueden vivir en medios microaerófilos
o anaerobios mediante varios mecanismos: por fermentación de algunos
aminoácidos (Hartman y col., 1980), usando nitrato, tiosulfato o azufre como
aceptores terminales de electrones (Tindall y Trüper, 1986; Martínez Espinosa,
2004), o comportándose como fotoheterótrofos, al obtener energía en forma de
ATP mediante la fosforilación de ADP mediada por la proteína de membrana
bacteriorrodopsina, que se activa por el efecto de la luz (Stoeckenius y col.,
1979). Este mecanismo de obtención de energía es único de halófilos pero no
lo tienen todas las especies de este grupo.
Aunque pueden obtener energía a partir de la luz, no pueden

comportarse como fotoautótrofos; no pueden crecer con CO2 como única
fuente de carbono aunque se han descrito algnos casos de fijación de CO2 en
halófilos (Javor, 1988).
16

Muchas de las especies de halófilos pueden crecer en medios

inorgánicos con una sola fuente de carbono (Rodríguez-Valera y col., 1980). De
todas las arqueas, los halófilos son los más fáciles de manipular en el
laboratorio. Organismos como Halobacterium salinarum y Haloferax volcanii se
han utilizado como modelos óptimos de estudio del metabolismo de halófilos.
Se ha obtenido mucha información en aspectos metabólicos desde las
primeras investigaciones en Halobacteríaceae por Dunas en 1977 y Hochstein
en 1988 (Oren, 2002).
El catabolismo de la glucosa se realiza por una modificación de la ruta

de Entner-Doudoroff. El producto de esta vía, el piruvato, es transformado en
acetil-CoA mediante la piruvato oxidorreductasa, que usa ferredoxina como
aceptor de electrones, en lugar de NAD"" como en eucariotas y en bacterias.
Recientemente se ha logrado expresar de forma heteróloga la enzima principal
de la vía, la glucosa deshidrogenasa de Hfx. mediterranei (Pire y col., 2001).
Por otro lado, Q\ acetil-CoA se une al oxalacetato para completar el ciclo de los
ácidos tricarboxílicos (CAT) (Danson y Hough, 1992).
En algunas especies de halófilos, entre ellas Haloferax volcanii, además

del CAT existe una vía alternativa en la obtención de energía, el ciclo del
glioxilato. En esta ruta hay dos enzimas exclusivas, la isocitrato liasa y la
malato sintasa. La actividad isocitrato liasa se ha detectado en especies de los
géneros t-ialoferax y IHaloarcula (Nimmo, 1984; Oren y Gurevich, 1995) pero la
actividad malato sintasa únicamente se ha detectado en el organismo
Haloferax volcanii (Serrano y col., 1998). La actividad de estas dos enzimas no
es continua en la célula, sino que está regulada según las necesidades
celulares. Cuando las enzimas están actuando, es decir, ocurre el crecimiento
celular en medio con acetato como única fuente de carbono, tanto la isocitrato
liasa como la isocitrato deshidrogenasa del CAT compiten por el isocitrato. En
bacterias como E. coli, donde mejor se ha estudiado este proceso, la expresión
de las enzimas del ciclo del glioxilato se encuentra regulada por mediación de
un operón formado por ambos genes, y la isocitrato deshidrogenasa se
encuentra regulada postranscripcionalmente por una quinasa/fosfatasa
(Sunnarborg y col., 1990; Chung, 1995). En Hfx. volcanii se ha encontrado la
17

estructura en operón de ios genes del cicio del glioxilato, aunque no se

encontró variación en la actividad de la isocitrato deshidrogenasa cuando la
isocitrato liasa estaba activa. Esto indicaría que la expresión de la isocitrato
deshiidrogenasa es constitutiva y que ésta no se encuentra regulada
posttranscripcionalmente (Serrano y col., 1998; Serrano, 2001).
2.4. ISOCITRATO DESHIDROGENASA
La enzima isocitrato deshidrogenasa (ICDH) cataliza la descarboxilación

oxidativa del D-isocitrato, produciendo 2-oxoglutarato y CO2. Para ello es
necesario NAD* o NADP"" como coenzima y se produce NADH o NADPH,
respectivamente:
D-isocitrato^^-' + NADCP)"*" ^ — • 2-oxoglutarato<2-' + CO2 + NAD(P)H + H*
2.4.1. Tipos.
Según su dependencia por el coenzima, hay tres tipos fundamentales de

isocitrato deshidrogenasas:
• Isocitrato deshidrogenasas NAD'^'-dependientes (EC 1.1.1.41).
Requieren NAD'^ como coenzima para catalizar la reacción. Este tipo de

enzima aparece fundamentalmente en las mitocondrias de organismos del
Dominio Eucarya. También hay organismos del Dominio Bacteria con enzimas
dependientes de NAD"", pero no es algo general y se conocen pocos casos.
Algunos ejemplos de este grupo de enzimas son las de Saccharomyces
cerevisiae (Keys y McAlister-Henn, 1990; Cupp y McAlister-Henn, 1991; Cupp y
McAlister-Henn, 1992; Elzinga y col., 1993), cerdo (Huang y Colman, 1990), y
la subunidad gamma de humanos (Brenner y col., 1997).

• Isocitrato deshidrogenasas NADP*-dependientes (EC 1.1.1.42).
Requieren NADP"" como coenzima para catalizar la reacción. Se

encuentran en organismos de los tres Dominios; Eucarya, Bacteria y Archaea.
En Eukarya se hallan en el citoplasma, en mitocondrias, en cloroplastos y en
peroxisomas (Ehrlich y Colman, 1987; Bailey y Colman, 1987; Udvardi y col.,
1993; Loftus y col., 1994; Sechi y col., 1995; Galvez y col., 1996; Nekrutenko y
col., 1998). Éste es el único tipo de isocitrato deshidrogenasa que aparece en
las arqueas halófilas extremas (Camacho y col., 1995) y en la mayoría de las
bacterias (Edwards y col., 1974; Thorsness y Koshland, 1987; Fukunaga y col.,
1992; Muro-Pastor y Florencio, 1992; Ishii y col., 1993; Eikmanns y col., 1995;
Kaneko y col., 1996; Wang y Lau, 1996; Blattner y col., 1997; Deckert y col.,
1998). Como se verá más adelante, existen diferencias importantes en la
secuencia de aminoácidos de estas enzimas en los tres Dominios.
• Isocitrato deshidrogenasas con especificidad dual.
La enzima utiliza tanto el NAD"" como el NADP* en la descarboxilación

oxidativa del isocitrato. Este tipo de enzimas es el único que aparece en
arqueas termófilos (Camacho y col., 1995; Steen y col, 1997; Steen y col.,
2001). También se ha descubierto en algunas bacterias (Leyland y Kelly, 1991),
2.4.2. Mecanismo químico.
La isocitrato deshidrogenasa de Haloferax volcanii objeto de este estudio

es NADP'^-dependiente. El mecanismo químico que cataliza esta enzima, en
detalle, es el siguiente:
- El grupo hidroxilo del carbono 2 del D-isocitrato ( 2R,3S-isocitrato) es

oxidado, formándose 3S-oxalosuccinato. El agente oxidante es el NADP*, que
se reduce transformándose en NADPH.
- Inmediatamente, el oxalosuccinato pierde el grupo carboxilo unido al
carbono 3, transformándose en 2-oxoglutarato y produciendo CO2.
19

Todas las isocitrato deshidrogenasas NADP^-dependientes conocidas

necesitan de forma esencial un catión divalente, principalmente Mg^* o Mn^'",
para mostrar actividad enzimática. Esto es debido a que el verdadero sustrato
de la enzima es un complejo formado entre el isocitrato y el Mg^"", como ocurre
en todos los casos en que se ha estudiado (Colman, 1972; Maloney y Dennis,
1977; Hurley y col., 1991; Glano y col., 1995).
Tanto las NAD*- como las NADP"'-ICDHs juegan un papel crucial en

procesos biológicos: las enzimas NAD*-dependientes participan en la obtención
de NADH necesario para la producción de ATP en la respiración mitocondrial,
mientras que las enzimas NADP^-dependientes están implicadas en la
producción de NADPH y 2-oxogl uta rato necesarios para la biosíntesis (Bal y
col., 1999).
La isocitrato deshidrogenasa actúa como enzima clave del ciclo de los

ácidos tricarboxílicos en bacterias, arqueas o eucariotas, y como nexo de unión
entre el metabolismo del carbono y del nitrógeno por mediación del producto de
la reacción, el 2-oxoglutarato. Respecto a las ICDHs de arqueas halófilos, se
describió primero en detalle la de Halobacteríum salinarum (Aitken y Brown,
1972). Esta enzima parece tener estructura de dímero cuando en el medio hay
KCI, y de trímero o tetrámero cuando hay NaCI.
2.4.3. Características y comportamiento cinético de ICDH NADP""-

dependiente de Haloferax Volcanii.
La ICDH NADP'^-dependiente de Haloferax volcanii fue purificada y

caracterizada por Camacho y col. (1995). Esta enzima tiene una masa relativa
de subunidad de 62000 ± 8000 Da. En estado nativo, y en presencia de NaCl 1
M, la enzima tiene una masa relativa que indica que se trata de un dímero.
Conio todas las ICDHs NADP'^-dependientes, el Mg^* es esencial para la
actividad. Además, esta enzima no puede usar NAD* como coenzima
alternativo, es totalmente dependiente de NADP*.
20

Antecedentes 2.4. ISOCITRATQ DESHIDROGENASA
Alcanza su máxinria actividad cuando la concentración de NaCI o KCi

está alrededor de 0.5 M, y presenta cierta actividad en ausencia de sal
(Camacho y col., 1995), lo que es bastante inusual en enzimas halofílicas,
aunque se encontró un connportamiento similar en la ICDH de Halobacterium
salinarum (Aitken y Brown, 1972). A concentraciones mayores de sal, la
actividad es mayor con KCI que con NaCI.
En los estudios de estabilidad térmica se comprobó que ésta es mayor

cuanto mayor es la concentración de KCI, por lo que se concluyó que las
concentraciones intracelulares altas de K'^ son necesarias para la estabilidad de
la enzima, y no para su actividad.
A partir de la enzima pura se secuenció el extremo amino terminal,

obteniéndose la secuencia de los primeros 18 aminoácidos de la proteína
(Camacho y col., 1995);
N-term. SYDQIEVPDDGEKITVDE C-term.
21

3. OBTENCIÓN DEL GEN DE

ISOCITRATO DESHIDROGENABA DE
Hfx. volcanii.

Obtención del gen. 3.1. INTRODUCCIÓN.
3.1. INTRODUCCIÓN.
3.1.1. Preparación del producto de PCR marcado con digoxigenina.
Se pueden utilizar oligonucleótidos sintéticos para generar sondas

destinadas a localizar genes, pudiéndose construir a partir de la secuencia de
la proteína en cuyo gen se está interesado (Itakura y col., 1984; Lathe, 1985).
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica capaz de

generar in vitro grandes cantidades de un determinado fragmento de DNA a
partir de cantidades mínimas del mismo, ya que ambas cadenas de DNA son
copiadas simultáneamente; el resultado es una amplificación exponencial de la
secuencia molde. Fue desarrollada por Mullís (1986) y adaptada a una variedad
de aplicaciones que incluyen amplificación, secuenciación, clonaje y síntesis de
sondas. La' reacción está catalizada por la enzima termoestable Taq DNA
polimerasa, aislada de la eubacteria termófila Ttiermus aquaticus.
La técnica de mareaje con digoxigenina se realizó de acuerdo con los

protocolos de la casa comercial Roche Molecular Biochemicals (1993). Esta
técnica de mareaje se basa en la incorporación al azar de nucleotides
marcados con digoxigenina a medida que se genera el fragmento de DNA por
la Taq DNA polimerasa. El producto resultante es un fragmento de DNA con
una mezcla de nucleotides marcados y sin marcar.
3.1.2. Construcción de la geneteea de DNA genómico, amplificación y

localización del gen.
Aunque les plásmidos sen vectores muy eficaces para la clonación, en

algunos casos su uso puede verse limitado per el tamaño relativamente
pequeño de los insertos de DNA que admiten. Además, el rendimiento de la
infección por virus y bacteriófagos es superior a la que se obtiene en la
transformación por plásmidos, aunque su manipulación es más compleja. Los
22

vectores virales, en general, admiten y replican de manera estable insertos

mayores que los plásmidos. La infección viral permite que cada célula
hospedadora contenga muchas copias del gen exógeno y que éste se exprese
abundantemente bajo el control de los promotores de los virus que son muy
activos. En este caso el clon se recupera a partir de las calvas de lisis que el
virus provoca sobre una capa de células infectadas.
El bacteriófago lambda de E. coli constituye un vector de clonación

ampliamente estudiado y utilizado. Su genoma consta de un DNA dúplex de 50
kb de tamaño y que presenta, en sus extremos 5', doce nucleotides monohebra
con secuencias complementarias denominados "extremos eos", cuyo
emparejamiento permite la circularización de la molécula cuando se introducen
en las células hospedadoras, y que se necesitan para que pueda
empaquetarse el DNA dentro de la cápside viral. Durante el ciclo de la vida del
fago X, muchas copias de su DNA se unen formando largas cadenas mediante
los extremos eos. Estas uniones son reconocidas y cortadas por las enzimas
de maduración del fago si distan entre sí un tamaño aproximado al del genoma
del fago X,, y los fragmentos obtenidos se empaquetan en cápsides víricas
(Russell, 2002).
La parte central de la molécula de DNA que constituye el genoma del

fago X sirve para asegurar la integración del DNA del fago en el cromosoma de
la bacteria hospedadora durante la fase lisogénica, pero no es indispensable
para la replicación del virus y, por tanto, puede ser interrumpida o eliminada y
sustituida por el DNA exógeno a clonar. Mediante empaquetamiento in vitro, en
presencia de las proteínas adecuadas, se obtienen virus con capacidad para
infectar bacterias y que llevan el fragmento de DNA clonado. Si solamente se
elimina el DNA no esencial, sin sustituirlo por DNA exógeno, no se produce el
empaquetamiento, dado el pequeño tamaño de la molécula de DNA resultante,
lo que se utiliza como mecanismo de sele i o n de fagos recombinantes
(Cerdánycol., 1997).
23

Algunas características del genoma original del fago X han sido

mejoradas para su uso en la clonación, y se han construido vectores de dos
tipos: los vectores de inserción, que contienen sitios de restricción únicos
donde se inserta el DNA exógeno, el cual no debe ser nnayor de 5 kb, pues si el
tamaño del DNA del fago X recombinante excede en más del 10% al normal no
se produce empaquetamiento; y los vectores de reemplazamiento, más
empleados, que poseen sitios de restricción a ambos lados de la región central
de DNA que no es esencial para la replicación e infectividad del fago, de modo
que esta región central puede ser sustituida por un inserto de DNA exógeno
cuyo tamaño ha de ser similar al de la región del fago X que sustituyen para
que se produzca empaquetamiento. Estos vectores poseen una capacidad para
aceptar insertos de hasta 25 kb, mayores que los que aceptan los plásmidos, lo
que constituye una ventaja y los hace especialmente adecuados para la
construcción de librerías genómicas o genotecas (Russell, 2002).
Las genotecas consisten en todo el genoma de un organismo

fragmentado y clonado. Pueden construirse a partir de DNA genómico o cDNA.
Para las genotecas de DNA genómico se utilizan mayoritariamente vectores de
clonación, como el fago X o cósmidos, que admiten insertos de DNA grandes
(10-30 kb) a fin de garantizar que la mayor parte de los genes y sus secuencias
5' y 3' estén contenidas íntegras en un solo clon. El DNA se digiere
parcialmente con 1 ó 2 endonucleasas de restricción de modo que el
mecanismo de rotura se aproxime al azar; se seleccionan las moléculas con el
tamaño adecuado; se ligan a las moléculas de vector y se propagan en las
células hospedadoras. Las genotecas de cDNA se construyen tanto en
plásmidos, ya que el tamaño de los insertos suele ser menor, que en el caso
anterior, como en vectores derivados del fago X. Cuanto mayor sea el número
de genes representados, de mayor calidad será la genoteca (Cerdán y col.,
1997).
Normalmente, es aconsejable amplificar genotecas preparadas en

vectores de fago lambda, para generar un surtido más grande y aumentar la
cantidad de clones de forma estable.
24

Obtención del gen. ^ 3.1. INTRODUCCIÓN,
Una vez amplificada la genoteca se detecta el clon de interés por el

nnétodo de liibridación en placa de las placas de lisis con sondas de DNA. Este
método se desarrolló inicialmente para analizar colonias bacterianas, y se
adaptó después para placas de lisis de bacteriófagos, permitiendo el análisis
simultáneo de un gran número de transformantes. Es de gran utilidad para
localizar un gen determinado en una genoteca. Ambos casos, el de las colonias
bacterianas y el de las placas de lisis, que han crecido aisladas en la superficie
de un medio sólido en una placa Petri, se replican sobre la superficie de una
membrana de nylon (Hybond™-N+, de Amersham Pharmacia Biotech). Por
tratamiento alcalino se lisan las células y se desnaturaliza su DNA que queda
unido al filtro (Sambrook y Russell., 2001).
3.1.3. Preparación de muestras de DNA viral y secuenciación.
Una vez se ha obtenido la calva de lisis que da positivo en las pruebas de

hibridación,^ el siguiente paso es obtener el DNA viral. El DNA vírico recombinante
está constituido por una molécula linea! de DNA dúplex que contiene un inserto
de DNA genómico, el cual está suplantando la región que codifica a la integración
del fago en el cromosoma de la bacteria hospedadora durante la fase lisogénica,
que como ya se ha visto no es esencial para la replicación del virus y, por tanto,
puede reemplazarse.
Las muestras de DNA que se obtienen en este apartado deben tener una
buena pureza y adicionalmente una buena concentración. Estos requerimientos
se deben a que el DNA resultante va a ser el que se utilice para preparar las
muestras a secuenciar.
Las metas de muchos proyectos de secuenciación (por ejemplo,

Proyecto Genoma Humano, o de otros organismos) para producir la secuencia
nucleotídica completa requieren el desarrollo rápido y eficiente de
determinados métodos. Las técnicas de secuenciación más empleadas son el
método enzimático de Sanger (Sanger y Coulson, 1975; Sanger y col., 1977) el
cual utiliza DNA polimerasas y reacciones de terminación de cadena con
didesoxinucleótidos; y el método de degradación química de Maxam y Gilbert
25

(1977), que utiliza reacciones químicas base-específicas. Aunque en principio

son muy diferentes, estos dos métodos generan poblaciones separadas de
oligonucleótidos radiactivos que comienzan en un punto fijo y terminan al azar
en otro residuo fijo. Luego, estos oligonucleótidos se separan por electroforesis
bajo condiciones tales que pueden discriminar entre fragmentos de DMA
individuales que difieren en longitud únicamente en un nucleótido.
Siguiendo la técnica ideada por Sanger y col. (1977), las moléculas de

DNA molde o template pueden ser de cadena sencilla, como las provenientes
del bacteriófago MI3, o de doble cadena en un vector plasmídico, cósmido o
lambda DNA, y en cualquiera de los casos, desnaturalizadas por acción del
calor o álcalis. Las DNA polimerasas empleadas pueden ser muy variadas. El
fragmento Klenow de la DNA polimerasa de E. coli (Sanger y col., 1977) fue la
primera en utilizarse y sirve para secuenciar fragmentos cortos de DNA. Las
denominadas Sequenasa y Sequenasa versión 2.0 son modificaciones,
química y por ingeniería genética, respectivamente, de la DNA polimerasa del
bacteriófago T7, en las que se ha eliminado la actividad exonucleasa 3' -> 5'.
Éstas se utilizan para secuenciar cadenas largas de DNA y para resolver
regiones de compresión. La Taq DNA polimerasa es una enzima termoestable
que es útil para determinar la secuencia de cadenas simples de DNA que
forman estructuras secundarias estables a 37°C, ya que esta enzima trabaja
eficientemente a 70-75°C. Finalmente la transcriptasa inversa (Mierendorf y
Pfeffer, 1987) no se utiliza rutinariamente, pero sirve para resolver problemas
causados por la presencia de regiones homopoliméricas A/T ó G/C en el DNA
molde.
Los dNTPs marcados más utilizados inicialmente fueron los radiactivos:

a^^P-dNTPs y ^^S-dATP (Biggin y col., 1983). Concretamente los derivados del
^^P fueron los primeros en usarse, pero las partículas p que emiten tienen el
inconveniente de que las bandas que se observan son muy grandes y difusas,
por lo que dificulta la lectura y, además, originan la degradación del DNA, ya
que se produce radiólisis con el tiempo.
26

Una vez que se ha producido el proceso de amplificación, la reacción

que ha ocurrido se carga en un gel de poliacrilamida con urea como agente
desnaturalizante. Después de la separación electroforética y posterior revelado
por autorradiografia, se deduce la secuencia nucleotídica correspondiente
(Figura 4).
FIGURA 4: Secuenciación enzimátlca de Sanger.
La automatización de diferentes aspectos de las reacciones de

secuenciación nucleotídica (purificación del DNA, reacciones enzimáticas, y
transferencia de la información) son objeto de numerosos trabajos, y estos
pasos están siendo mejorados continuamente.
Por todo esto actualmente se emplea la secuenciación automática,

donde la técnica utilizada es una modificación del método enzimático de
Sanger, automatizándose la separación electroforética y la detección de los
productos. De esta forma se obtienen los cromatogramas, que presentan las
bandas (fragmentos de DNA marcado) con la intensidad de los picos en el eje
de ordenadas, y el tiempo de la electroforesis en el eje de abscisas. Cada pico
se identifica como A, T, G, ó C dependiendo del sistema de detección, que aquí

es de DNA marcado con fluorescencia. A cada uno de los ddNTPs se le asigna

un color que posteriormente se visualizará como las bandas correspondientes.
Los aparatos que realizan este tipo de secuenciación usan láser para leer el gel
y detectar los fragmentos de DNA. El grado de fluorescencia se mide mediante
dos tubos fotomultiplicadores (PMT1 y PMT2) que leen a diferentes longitudes
de onda, de modo que el programa de ordenador integra ambos valores.
La electroforesis se realiza de forma continua en un solo carril (o capilar,

que es otra posibilidad) y el color de la banda se determina cuando el fluoróforo
se excita con el rayo láser situado en la base del gel, produciendo así una
señal que recibe un fotomultiplicador y transmite a un ordenador. El análisis de
las señales recibidas en el ordenador permite establecer con gran precisión la
secuencia del fragmento a estudio, incluso cuando hay cierta ambigüedad
debida a la presencia de bandas muy cercanas (Figura 5). Existen numerosas
ventajas en el sistema de secuenciación automática frente al sistema manual,
entre las que se pueden citar: la disminución en el número de reacciones y
geles de secuenciación; la desaparición de problemas de compresiones; la
rapidez a la hora de obtener resultados; la claridad de los datos presentados;
una mayor facilidad para la realización de análisis de secuencias, etc.

3.1.4. Análisis de secuencias.
La biología molecular ha representado un avance muy considerable en

el ámbito científico. Los mecanismos moleculares de las funciones celulares y
de sus alteraciones patológicas han sido ya, o están siendo, conocidos gracias
al desarrollo, durante la segunda mitad del siglo XX, de unas técnicas muy
ingeniosas, pero también muy sencillas, desde el punto de vista del despliegue
instrumental que presuponen.
Se puede decir que los biólogos moleculares, utilizando técnicas de

secuenciación de DNA o proteínas, pueden escribir estas biomoléculas
esenciales en palabras clave. Estas palabras, que encierran en si mismas una
gran información sobre la estructura y función de la biomolécula en cuestión,
pueden analizarse con ayuda de la informática, una ciencia que cada vez se va
aproximando más al fenómeno biológico y que constituye un aliado valiosísimo
para numerosos análisis encaminados a la predicción de funciones y al diseño
de nuevos experimentos (Cerdán y col., 1997).
La informática ha sabido desarrollar las herramientas necesarias para el

tratamiento de toda la información obtenida, tanto de la secuenciación de DNA,
como de la caracterización de cada uno de los componentes celulares. En la
actualidad, hablamos de la bioinformática como una disciplina consolidada al
servicio de las necesidades de los científicos.
Las bases de datos de secuencias, dominios y estructuras actualmente

disponibles representan un ingente acumulo de información biológica.
Contienen el esqueleto genético de los organismos, su programa de desarrollo
y gran parte de la historia evolutiva de las especies. El aumento del número de
datos que en ellas se ha ido acumulando a lo largo de los últimos años ha
llevado por una parte a una necesaria e inevitable especificación y
diversificación, y por otra al desarrollo de nuevos métodos para recopilar, tratar,
distribuir y utilizar la información.
29

Dichas bases de datos intercambian continuamente las secuencias y las

ponen a disposición de investigadores especializados en biología molecular de
todo el mundo, a través de Internet (Lodish y col., 2002).
Las bases de datos que se han utilizado principalmente para realizar el

análisis de secuencias han sido:
- GENBANK: Es la base de datos de EE.UU (Bethesda, Maryland) y

recoge todas la secuencias de ácidos nucleicos y proteínas. Aporta una
descripción de la secuencia, el nombre científico y taxonómico del organismo
del que procede y una tabla de datos que incluye la localización de la región
codificadora y otras señales que pueden tener importancia biológica.
- EMBL Nucleotide Sequence Database: Está organizada por EMBL

(European Molecular Biology Laboratory) (Heidelberg) en colaboración con
GENBANK.y DDBJ (DMA Database of Japan), Una de las principales funciones
de EMBL es la de actuar como distribuidora de otras bases de datos de enorme
interés.
- SWISS-PROT Protein Database: Esta base de datos se creó mediante

una colaboración de EMBL Data Library y Amos Bairoch. Los datos derivan de
la traducción de las secuencias de DMA, y su principal ventaja consiste en que
incluye numerosas anotaciones cruzadas con otras bases de datos como
PROSITE y PDB (Brookhaven grotein structures database).
- PIR-International database: Es una asociación formada por tres centros

de información sobre proteínas; PIR (Protein Information Resource) establecida
en NBRF (National Biomedical Research Foundation, Georgetown University,
Wasington DC USA), MIPS (Martinsried institute for Protein Sequences)
establecida en el Instituto Max Planck de Bioquímica (Alemania), y JIPID
(Japan International Protein Information Database) establecida en la
Universidad de Tokio.
30

Obtención del gen. , 3.1. INTRODUCCIÓN.
Las secuencias obtenidas más recientenriente se pueden connparar con

otras determinadas con anterioridad, para buscar similitudes: las secuencias
homologas. Se traducen regiones codificantes de proteínas a secuencias de
aminoácidos. Debido a la degeneración del código genético, las proteínas
relacionadas a menudo exhiben una mayor homología que los genes que las
codifican.
31

Obtención del gen. 3.2. METODOLOGÍA.
3.2. METODOLOGÍA.
3.2.1. Preparación del producto de PCR marcado con digoxigenina.
Con la información de la secuencia N-terminal de isocitrato

deshidrogenasa de Haloferax volcanii, y la frecuencia de uso de codones de
esa especie en base a varias proteínas secuenciadas, se construyó un
oligonucleotide sintético de 41 residuos mediante el método de la fosforamitida
con un sintetizador de DNA Applied Biosystems 381, Universidad de Bath,
Reino Unido.
La secuencia de bases extraída de dicho extremo utilizando la

frecuencia de uso de codones para halófilos fue la siguiente:
5' d( TACGACCAGATCGAGGTCCCCGACGACGGCGAGAAGATCAC ) 3' ,
que codificaría a los aminoácidos desde tirosina (Y) a treonina (T):
N-term. YDQIEVPDDGEKIT C-term.
Dado que el anterior oligonucleotide resultaba demasiado largo e

inespecífico, se generaron otros dos de menor tamaño y degenerados,
aproximadamente las dos mitades de longitud del total anterior ("oligo 1" y
"oligo 2").
Para la obtención de un producto de PCR inicial se utilizó uno de los dos

oligos anteriores, "oligo 2", y otro generado a partir de una secuencia
conservada en los genes de varias ICDHs, a unas 690 pb corriente abajo, que
se denominó "oligo 3" y también fue degenerado (Y=C,T¡ R=A,G; S=C,G).
OLIGO 2:
5' GAY GAY GGS GAR AAR AT 3' (17pb; Tm= 53.9°C)
OLIGO 3:
5'CCC I C S G I G AAC n C A I 3' (17 pb; Tm= 61.rC)
32

La reacción se llevó a cabo con un PCR Progene 0,5 de Techne

(Cambridge), y se preparó una mezcla de reacción que contenía todos los
reactivos que aparecen en la Tabla 1:
Tabla 1: Concentraciones de todos los componentes de la reacción utilizada

para generar el producto inicial de PCR (Roche Molecular Biochemicals, 1999).
REACTIVOS CONCENTRACIÓN FINAL

50 mM MgCla 2mM
10x tampon de PCR 1x
12.5mMdNTP 0.2 mM
oligo 2 (N-term) 100 pmol
oligo 3 (C-term) 100 pmol
DNAgenómico de 1 i^g
Hfx. volcanii
Taq polimerasa 2.5 U
agua hasta un volumen final de
100 fil
Los ciclos del PCR fueron;

Un ciclo inicial de 96°C 5 minutos; 30 ciclos de 96°C 1 minuto, 60°C 1
minuto y 72°C 2 minutos; y un último ciclo de 4°C a tiempo infinito:
96°C 96°C 60°C 72°C! 4°C

5' 2'
r
r
30 ciclos
00
El producto de PCR que debía generarse se había calculado con una

longitud de unas 650 pb, teniendo en cuenta que las secuencias de ICDH de
33

los organismos seleccionados tenían aproximadamente la primera base en la

misma posición.
El mareaje de productos de PCR se realiza durante la amplificación del

DNA. Para la reamplificación del producto obtenido se utilizan nucleotides
marcados con digoxigenina del kit "PCR DIG Probe Synthesis" de Roche
Molecular Biochemicals.
Los ciclos de reacción fueron los mismos que se utilizaron para el PCR
anterior. Como se puede observar en la Tabla 2, en la descripción de esta
mezcla se añaden los nucleotides marcados con digoxigenina, pero también se
incluyen los nucleotides sin marcar para diluir la intensidad del mareaje.
Tabla 2: Mezcla de reacción utilizada para el mareaje y reamplificación del

producto de PCR, donde se especifican los volúmenes y concentraciones de cada
reactivo.
REACTIVOS VOL. - CONC. FINAL
tampón de PCR 10x + 5 |.il -1X

MgCIs
mezcla de dNTP* 2.5|il-100|iM
12.5mMdNTP 2.5|il-0.2mM
eligo 2 (N-term) 0.56 1^1 - 50 pmel
elige 3 (C-term) 0.50 i-il - 50 pmel
Producto del PCR 1 ^ 1 - 160 pg
Mezcla enzimática. 0.75 lal-2.6 U
Expand™ alta fidelidad
agua 37.19 |.il (hasta un volumen de
50 í,il)
(dNTP* = dNTPs marcados con digoxigeneina)
Se comprobó que la reacción había funcionado correctamente mediante

electreferesis en gel de agaresa al 1%.
34

Tannbién se realizó la estinnación del rendinniento del mareaje (según

Roche Molecular Biochemicals). Esta técnica consistió en fijar a una membrana
de nylon Hybond H* (de la casa Amersham Pharmacia Biotech) varias
diluciones del producto marcado y las mismas de un control de concentración
conocida, suministrado en el kit de mareaje, y con ambos seguir los pasos de
detección que se realizaron en las técnicas de hibridación. Así se obtuvieron
una serie de señales en una placa autorradiográfica, de mayor o menor
intensidad en función de la mayor o menor concentración, respectivamente, de
producto marcado fijado en la membrana.
El protocolo básico para la realización de la técnica se puede encontrar

en el libro "The DIG Systems User's Guide for Filter Hybridization" (1995)
(Roche Molecular Biochemicals).
3.2.2. Construcción de la genoteca de DNA genómico, amplificación y

localización del gen.
Los pasos a seguir en la construcción de la genoteca de DNA genómico

de Haloferax volcanii en fago X se basaron en el método de Sambrook y col.
(1989). Este trabajo se realizó con la ayuda del Departamento de Bioquímica
de la Universidad de Bath (Reino Unido) con el que nuestro grupo de
investigación mantiene una estrecha colaboración, en concreto con los
doctores M.J. Danson y D.W. Hough del centro de Extremófilos de dicha
Universidad.
Para ello se digirió DNA genómico de Hfx. volcanii con la enzima de

restricción Sau3A I realizando una digestión parcial, de modo que se obtuviera
un tamaño medio de fragmento de unas 20 kb. Este tipo de digestión permite
obtener un conjunto de fragmentos de DNA cortados lo más parecido posible al
azar ya que la secuencia de reconocimiento es muy frecuente en el genoma.
Aderiiás, los extremos que deja la enzima son compatibles con los que se
usarán para ligar en el vector (generados con la enzima BamH I).
35

La secuencia de restricción que reconoce y corta la enzima Sau3A I es

la siguiente:
i
5'. . . GATC . . .3'
3'. . . CTAG . . .5'
t
El DNA de Hfx. volcanii cortado se ligó al vector Lambda EMBL3, y las
moléculas recombinantes DNA Hfx. volcanii- X EMBL3 se encapsidaron, todo
de acuerdo a los protocolos de los kits usados: "Lambda EMBL3/fía/r7H I Vector
Kit" y "Gigapack® III Gold Packaging Extract", ambos de la casa comercial
Stratagene.
El vector Lambda EMBL3 es una modificación del fago X, capaz de

aceptar fragmentos de DNA con extremos compatibles a los de BamlH I de 9 a
23 kb (Figura 6).
FIGURA 6: Mapa del vector Lambda EMBL 3 (Copyright 1997 por Stratagene).
El fragmento Bami-I I 19.99- Baml-I I 33.12 fue eliminado por digestión

con Bamhi I, y en su lugar fue ligado el DNA de interés. La selección de clones
recombinantes se realizó usando cepas de Escherichia coli que contienen
fagos lisógenos P2, ya que los vectores sin DNA extraño contienen los genes
red y gam, qué hacen que estos fagos no puedan crecer en E. coli con P2.
Para este trabajo se utilizó XL1 -Blue MRA (P2).

Una vez encapsidados, los reconribinantes se annplificaron en E. coli

XL1-Blue MRA (P2) de acuerdo a los protocolos del kit, y se guardaron en
alícuotas a -85 °C.
Para la amplificación de la genoteca se siguieron los protocolos

recomendados por el manual de instrucciones del "Lambda EMBLS/SamH I
Vector Kit" de Stratagene (1997), y el manual de Sambrook y col. (1989), en
los que se exponen los pasos a seguir para la preparación de las células
hospedadoras; la infección de éstas por la genoteca, así como la técnica de
siembra en placa.
La preparación de las células hospedadoras se llevó a cabo por

crecimiento en medio LB, suplementado con lOmM de MgS04 y 0.2% (p/v) de
maltosa. Una vez cosechadas las células se resuspendieron en MgS04 10 mM.
En el protocolo de amplificación se prepararon alícuotas de 300 |JI de las

células hospedadoras, se infectaron con 1 pl de una dilución 1:100 y se
sembraron en placa con LB Top agar. Se incubó a 37°C durante la noche,
aunque las calvas de lisis suelen ser visibles a partir de 8 ó 12 horas de
incubación. El número de placas que se deben preparar ha de ser del orden de
20 ó superior para que los resultados sean estadísticamente representativos.
La hibridación en placa de calvas de lisis se llevó a cabo siguiendo los

protocolos recomendados por Roche Molecular Biochemicals en "The DIG
System User's Guide for Filter Hybridization" (1995).
La transferencia a membrana de nylon de las calvas de lisis se realizó

mediante cinco pasos: transferencia a la membrana de las calvas,
desnaturalización de las cápsides proteicas con una solución alcalina,
neutralización del pH, lavado de las membranas en tampon 2 x SSC y fijación
con luz ultravioleta. La sonda marcada con digoxígenina híbrido con el DNA si
éste contenía el gen exógeno, produciendo una mancha detectable por
autorradiografía (Figura 7).
37

FIGURA 7: Esquema de la amplificación y selección de calvas de lisis en una

placa Petri.

A partir de los resultados obtenidos en las placas autorradiográficas, en

las que se observaban diferentes positivos, se realizó un primer proceso de
selección aislando al azar varios de ellos nnediante extracción de la calva de
lisis correspondiente y posterior difusión del fago en una disolución de
cloroformo a una concentración final del 5% (v/v) en tampon SM. Cada una de
las calvas aisladas se utilizó para infectar de nuevo células de la cepa XL-Blue
MRA (P2), y seguir los mismos pasos que se habían seguido hasta el
momento. En este caso se obtuvieron placas autorradiográficas en las que sólo
se observaban positivos si la calva original era realmente positiva para el gen
de interés.
De estas placas se podrían extraer más calvas de lisis si se observaba,

por comparación entre la placa de medio LB con las calvas de lisis y la placa
autorradiográfica, que no todas las calvas se correspondían con positivos en la
placa de autorradiografía, por lo que en la calva original debía existir mezcla de
clones. Para solventar este problema se realizó una segunda selección
llevando a cabo los mismos pasos.
El objetivo final era obtener una única calva de lisis, o lo que es lo

mismo, un único clon de fago X conteniendo el gen de isocitrato
deshidrogenasa.
3.2.3. Preparación de muestras de DNA viral y secuenciación.
En la extracción del DNA se requirió un cultivo líquido fresco; para ello, se

prepararon las células hospedadoras y se infectaron de la misma forma que en el
apartado 3.2.2. La mezcla se utilizó para inocular un medio de cultivo LB de 300
mi suplementado únicamente con MgS04 y una mezcla de DNasa / RNasa. Este
cultivo se dejó crecer durante toda la noche.
A partir dé este cultivo se aisló del DNA viral siguiendo el protocolo de

Qiagen "Lambda DNA Maxi Kit". El DNA extraído se observó mediante
electroforesis en gel de agarosa al 0.8%, comprobando su tamaño e integridad.
También se calculó su concentración y pureza por espectrofotometría ultravioleta.
39

Para cerciorarnos del origen genómico del DNA clonado en el vector, o

para comprobar si el DNA exógeno se integró en el genoma, se aplicó la técnica
denominada Southern blot, que consiste en transferir el DNA contenido en un gel
de eiectroforesis a una membrana de nylon; y tras la desnaturalización por
tratamiento alcalino, el DNA se híbrida con la sonda marcada conteniendo la
secuencia clonada.
Otra técnica, más rápida y sencilla, es la caracterización del inserto por

PCR. Para ésta se emplean los mismos oligonucleotides que se utilizaron para
generar el fragmento inicial que sirvió como sonda, de forma que si en el DNA
genómico contenido en la partícula viral se encuentra el gen de interés, se podrá
amplificar de nuevo el fragmento de DNA que se observó cuando se generó la
sonda. Para este trabajo se siguió esta segunda técnica, mediante PCR del DNA
viral como molde, y se obtuvo un fragmento del mismo tamaño que la sonda
generada.
Para la secuenciación del inserto contenido en el DNA viral se usó la

técnica de "primer walking" o "secuenciación por paseo". En esta técnica se
diseñan los oligonucleotides a medida que se va conociendo la secuencia del
gen. Para este trabajo se empleó un secuenciador ABI PRISM™ modelo 310
Genetic Analyzer de la casa comercial Perkin Elmer.
Cada uno de los oligonucleotides utilizados poseía una temperatura de

hibridación (Tm) característica y un número determinado de bases. En la Tabla
3 se puede observar cada uno de ellos.
40

Tabla 3: Oligonucleótidos empleados para la secuenciación del gen que

codifica a ICDH de Hfx.volcanii.
CEBADOR Tm (°C) longitud en pb

olí. 2 53.9 17
oli. 4 50.1 18
olí. 6 47.2 15
oli. 8 54.2 21
oli. 10 52.2 21
oli. C-term 54.2 25
oli. 5 47.2 15
oli. 7 49.9 15
Para la secuenciación del gen que codifica a isocitrato deshidrogenasa

se preparó la mezcla de reacción que se presenta en la Tabla 4, teniendo en
cuenta que las variaciones en las concentraciones se modificaron en función de
los resultados que se obtuvieron hasta llegar a una relación óptima resultados /
costes.
Tabla 4: Mezcla de reacción utilizada para la preparación de la muestra que

posteriormente se va a secuenciar, presentando las concentraciones recomendadas
por la casa Perkin Elmer (actualmente Applied Biosystems) y las utilizadas para este
trabajo.
REACTIVO concentración recomendada concentración en la muestra
DMSO 5% 5%
Cebador S.Bpmol te 5 pmol
DNA 0.5-1.0|ig « 1 i-ig

PREMIX* 4^1 4 ¡al
agua hasta un volumen de 10 f.il hasta un volumen de 10 |.il
*PREMIX = Terminator Ready Reaction Mix
41

Los ciclos de PCR variaron en función de la tennperatura de hibridación

de cada uno de los cebadores (entre 50 y 55°C). El progranna de PCR utilizado
se representa en la Figura 8.
96°C 96°C 60°C

50" \ 50-55°C /
4°C
50" 00
30 ciclos
FIGURA 8: Esquema de los ciclos de PCR para secuenciación de DNA que

codifica a isocitrato deshidrogenasa.
Con este progranna de PCR y la técnica de "primer walking" se obtuvo la

secuencia completa del gen que codifica a isocitrato deshidrogenasa.
3.2.4. Análisis de secuencias.
Una vez obtenida la secuencia del gen que codifica a ICDH de Haloferax
volcanii se procedió a su análisis. Todos los programas utilizados pertenecían
al paquete informático GCG (Genetics Computer Group Inc, University
Research Park, Madison, U.S.A.) a los que se accedió a través del CNB de la
Universidad Autónoma de Madrid, vía Telnet. Se utilizaron los comandos que
se describen a continuación:
- FASTA: Realiza una búsqueda de Pearson y Lipman por similaridad

entre la secuencia deseada y un grupo de secuencias del mismo tipo (ácidos
nucleicos o proteínas).
- PILEUP: Crea un alineamiento múltiple de secuencias relacionadas
entre sí.
42

- MAP: Mapea una secuencia de DNA y muestra las dos hebras de la

secuencia con sitios de corte de enzimas de restricción por la parte superior, y
la traducción a aminoácidos, produciendo los seis marcos de lectura posibles.
- EXTRACTPEPTIDE: Escribe la secuencia de uno o más de los marcos
de lectura abiertos obtenidos en el map.
- BESTFIT: Proporciona un alineamiento óptimo de los segmentos de
mayor similaridad entre dos secuencias. Los alineamientos óptimos se
encuentran por inserción de huecos para maximizar el número de
aciertos,utilizando para ello el algoritmo de Smith Waterman de homología
local.
Se procedió del siguiente modo:
a) Se tradujo la secuencia de nucleotides a secuencia de aminoácidos,

con ayuda del programa MAP. Había 6 posibles marcos de lectura (3 en una
cadena y 3 en la complementaria). Por ejemplo:
5' GTGCCATAGGCGTCCATCTG 3'

—•.
3' CACGGTATCCGCATGTAGAC 5'

M—
De esta forma se obtuvieron 6 secuencias de aminoácidos, 3 para cada

cadena. Gracias a que los oligonucleótidos son específicos de secuencia,
cuando se secuenciaba en sentido directo, no era necesario establecer
comparaciones con las secuencias de aminoácidos establecidas en sentido
reverso, lo que simplificaba la tarea.
Se puede intuir que para cada secuencia que se realizó con cada uno de
los oligos se llevó a cabo el trabajo que se va a exponer, pero para simplificar
se hará con la secuencia completa.
43

b) Para seleccionar el marco de lectura se tuvo en cuenta el inicio de la

proteína ATG y el codón de terminación o stop, que puede ser TAA, TAG o
TGA.
Se comparó, con la ayuda de los programas FASTA y PILEUP, la

secuencia de aminoácidos obtenida con secuencias que codifican a iCDHs
NADP-dependientes de otros organismos, seleccionando el marco de lectura
mediante el programa EXTRACTPEPTIDE.
44

Obtención del gen. , 3.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
3.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
3.3.1. Obtención del producto de PCR.
La utilización de productos de PCR marcados como sondas es una

estrategia de localización relativamente reciente en nuestro Departamento, ya
que hasta el momento se empleaban oligonucleotides marcados en el extremo
3' con colas de adenina marcadas con digoxigenina, utilizando el "DIG
oligonucleotide tailing kit" (Roche Molecular Biochemicals).
Los productos generados por PCR permiten localizar genes de una

forma más fiable que los oligonucleotides marcados. Presentan mayor
especificidad al ser de mayor tamaño, ya que la probabilidad de encontrar en el
genorna una zona homologa de un número elevado de pares de bases es
menor que encontrar zonas homologas de aproximadamente 20 nucleotides
que podrían generarse por el propio azar, y de esta forma evitamos encontrar
falsos positivos.
La hibridación con oligonucleotides marcados implicaba realizar pruebas

comparativas con dos oligonucleótidos pertenecientes al mismo gen y
localizados en zonas diferentes. De esta forma se obtenían dos tipos de placas
con positivos diferentes, y se consideraban positivos reales aquellos que
coincidían en la localización. Con la utilización de productos, se evita realizar
este tipo de proceso ya que con un paso de hibridación se obtienen positivos
claros.
Otra ventaja que poseen los productos de PCR frente a los

oligonucleótidos es la temperatura de hibridación. Mientras que para el
oligonucleótido es su temperatura de annealing (« 50°C), para productos
generados por PCR, la temperatura a la que se híbrida es superior a 65°C, por
lo que las uniones son, también en este caso, más específicas.
Como se puede observar, las ventajas que presentan los productos

generados por PCR respecto a los oligonucleótidos marcados en el extremo 3'
45

Obtención del gen. 3.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
se centran en aumentar la especificidad y la fiabilidad en la localización del gen

de interés, habiendo llegado a desbancar la utilización de oligos en las técnicas
de hibridación.
En la obtención del producto de PCR, mediante electroforesis en gel de

agarosa al 1%, se comprobó que se obtenía una única banda de DNA a la
altura deseada, y se utilizó el producto obtenido directamente de la primera
reacción para preparar el segundo PCR (PCR de mareaje). Esto es posible
debido a que en la técnica de PCR no se necesita que el DNA esté muy
purificado. Por el contrario, muchos de los métodos que se utilizan actualmente
parten de las placas de lisis de fagos o de células enteras, colonias
bacterianas, muestras de sangre, cabellos, restos de fósiles, etc. Suelen ser
suficientes 200 ng de DNA molde (o incluso bastante menos si el gen está
presente en varias copias o si el genoma es pequeño).
En este PCR, la cantidad de DNA molde fue inferior en varios órdenes

de magnitud a la que se usó en el PCR anterior. El protocolo de "PCR DIG
Probe Synthesis Kit" (Roche Molecular Biochemicals) recomienda el uso de 10
a 100 pg de DNA plasmidico, y considerando que el DNA molde era en su
totalidad el fragmento de interés, sería suficiente con unos pocos pg de DNA.
Llevar a cabo el proceso de esta forma conllevaba un problema añadido,

no se pudo estimar la concentración del DNA molde por espectrofotometría,
debido a que en la mezcla de reacción se encontraban nucleótidos en
suspensión que podrían dar un valor superior de la concentración real de la
muestra. Para solventar este problema se estimó la concentración de DNA
mediante comparación de intensidades de diferentes diluciones de la muestra
problema y un patrón de concentración conocida en una electroforesis en gel
de agarosa al 1%.
Mediante esta técnica se obtuvo una concentración aproximada de 250

ng/|.il por lo que se tuvo que diluir la muestra 1500 veces para obtener una
concentración aproximada de 160 pg/|.il, que seguía siendo una cantidad muy
46


FIGURA 10: Placa autorradiográfica en la que se observan las distintas

intensidades en función de la concentración de sonda (por |il).
3.3.2. Amplificación de la genoteca.
La construcción de genotecas es una técnica verdaderamente útil para la

localización de genes de un determinado organismo y, como se verá en este
trabajo, para su posterior secuenciación.
Entre las ventajas que tiene se puede resaltar la cantidad de copias que
se obtienen del gen de interés durante la infección viral, y gracias a los kits de
purificación de DNA que permiten extraer muestras de alta pureza, se puede
secuenciar directamente el inserto contenido en el DNA viral sin un paso previo
de subclonaje en plásmido.
En un primer momento se utilizó el genoma de lambda para el clonaje de

grandes fragmentos de DNA en E. coli (Leonardo y Sedivy, 1990), viéndose
modificada la técnica posteriormente para la construcción de genotecas
(Slightom y col., 1993). Es un procedimiento habitual utilizado por varios
autores como Dodd y col. (1990); Griffin y col. (1992); Miyazaki (1996);
Rasmuson y Ekstrom (1996) o Baas y Retey (1999), entre otros.
Es una técnica sencilla que permite aumentar la probabilidad de

encontrar genes completos gracias a que los insertos son de elevado tamaño,
alcanzando valores de aproximadamente 21 kb que, comparado con los

insertos para vectores plasnaídicos convencionales, del orden de varios kb,

supone una gran diferencia.
Aún así, el uso de genotecas construidas en plásmido sigue suponiendo

una elevada proporción del total de las utilizadas, debido a que las técnicas
para su manipulación son nnás habituales y están a la orden del día.
Existen también genotecas construidas en plásmidos con cDNA como

inserto. Si se comparan con las genotecas construidas en plásmido con inserto
de DNA genómico se puede comprobar que poseen la misma ventaja que las
construidas en fago lambda, y ésta es que la secuencia del gen clonado
aparece completa, ya que proviene del mRNA por transcripción inversa. Estas
genotecas presentan un problema adicional, es necesario obtener el mRNA
para poder retrotranscribirlo y este paso es muy complicado debido a que el
mRNA es altamente inestable.
Por lo tanto, se puede considerar que la construcción de genotecas en

fago X para localízación y secuenciación de genes es una vía rápida y fiable,
aunque es necesario optimizar su utilización.
Para la amplificación de la genoteca, en primer lugar se prepararon

diferentes diluciones de ésta en tampon SM, con el fin de obtener placas con
calvas de lisis aisladas, pero en número suficiente para que la representación
de los genes del organismo fuera estadísticamente fiable. Una vez obtenida la
dilución óptima se trabajó en todo momento con ella; que en este caso fue de
1:100.
3.3.3. Purificación del DNA viral y secuenciación.
La purificación del DNA es un proceso sencillo que está suficientemente

estandarizado. En el caso del DNA viral, los kits de purificación presentan
modificaciones respecto a los de purificación de DNA plasmídico y genómico,
debido a que las partículas virales se encuentran en el medio de cultivo y no en el
precipitado celular; y es rtecesario precipitar las partículas virales para la
49

extracción del DNA vírico. Salvo este paso, el resto de la purificación viene a ser
muy similar a la realizada para los DNAs convencionales.
Como ya se ha comentado anteriormente, la calidad del DNA es un factor

importantísimo debido a su destino, que es la obtención de su estructura primaria.
Un DNA con un grado de pureza bajo daría problemas de dobles secuencias o
ruido de fondo en las reacciones de secuenciación, dando lugar probablemente a
falsos resultados. De todas formas, se comprobó que el grado de pureza obtenido
en este trabajo fue suficiente para la secuenciación completa del gen.
Para la estimación de la concentración del DNA se cargaron diferentes

concentraciones (diluciones) de la muestra en las calles del gel (Figura 11), con el
fin de tener una idea de la cantidad necesaria para el proceso de secuenciación.
FIGURA 11: Electroforesls en gal de agarose al 0.8%, donde se observa lo

siguiente: Patrones de tamaño de DNA (Marker III) (1); muestra de DNA viral purificada
en concentraciones decrecientes: sin diluir (2), dilución 1:3 (3), dilución 1:5 (4), dilución 1:
10 (7), dilución 1:16 (6), dilución 1:50 (5).
La concentración del DNA también se determinó

espetrofotométricamente y se estimó el grado de pureza de la muestra
mediante la relación de absorbancias de proteínas y ácidos nucleicos. Estos
datos se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5: Lecturas de las absorbanclas de la muestra de DNA viral.
Muestra A260 A28O A260/A280 A26O X
50(ng/ml)
Ref. 0.000 0.000
1 0.535 0.360 1.486 26.75
En la penúltima columna aparece el grado de pureza de la muestra, y en la

última columna se observa el valor de la concentración del DNA, en |ag/ml. La
muestra presentada para elaborar la tabla anterior tenia una dilución 1:10, con lo
que la concentración de la muestra original fue de 267.5 ng/|al. A la vista de los
resultados obtenidos dicha muestra era apta para la secuenciación.
La secuenciación del DNA viral y cósmidos es más complicada que la

del DNA plasmidico, debido al mayor tamaño del vector y del inserto contenido
en éste. Por ello no es muy común encontrar bibliografía referida al tema en
cuestión, siendo mayoritaria la secuenciación en plásmidos frente a vectores
virales y cósmidos.
Bien es cierto que en la revisión realizada por Harvey y col. (1999) con
DNAs de lambda, de cósmido y bacteriófago P1 se presentan métodos para
optimizar la secuenciación de estos DNAs "difíciles"; pero éstos se probaron en
nuestro laboratorio no obteniéndose los resultados esperados; es más,
implicaban un mayor consumo de reactivos y no se observaba una mejora en
los resultados de la secuenciación. De esta forma se trataron de optimizar los
ciclos de PCR en función de los resultados que se iban obteniendo, llegando a
estandarizar el método.
Antes de comenzar a secuenciar es importante desarrollar una

estrategia general que tenga en cuenta él tamaño de la región que va a
sécuenciarse, la exactitud de la secuencia requerida, y las facilidades de que
se disponga. A la hora de plantearse la secuenciación de un DNA desconocido
y extenso es necesario poder ir obteniendo datos parciales de secuencia y
reagruparlos en la secuencia definitiva total. Por lo tanto, la estrategia llevada a
51

Obtención del gen. 3.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓNI^
cabo en este trabajo fue la secuenciación por Paseo o Primer Walking, los
ciatos de las secuencias obtenidas en fases previas se utilizaron para diseñar
nuevos cebadores específicos que permitieron ir avanzando progresivamente,
a medida que avanzaba la secuenciación en el fragmento de DNA a estudio.
Esta estrategia requirió sintetizar un gran número de oligonucleotides que se
utilizaron como cebadores (Figura 12).
2 4 6 8 10
g,-^ -> -• -• -> 2-
7 5 C^term
3' 5'
FIGURA 12: Secuenciación por la estrategia del Primer Walking, mediante

síntesis progresiva de los distintos cebadores (indicados con números).
Con esta estrategia de secuenciación se utilizaron varios

oligonucleótidos (cebadores), cinco para secuenciar en sentido directo, de 5' a
3' (oligos 2, 4, 6, 8, 10), y tres en sentido reverso, de 3' a 5' (oligos C-term, 5,
7). La localización y orientación de cada uno de ellos se puede observar en la
Figura 15, donde se presenta la secuencia completa del gen que codifica a
ICDH de Hfx. volcanii.
Los ciclos de PCR utilizados para la secuenciación del gen fueron

optimizados en este trabajo, sufriendo modificaciones respecto al ciclo
recomendado por Perkin Elmer. Éstos podrían esquematizarse de la siguiente
forma (Figuras 13 y 14):
52

94°C 94°C
3' 30" 50°C
4°C
25 ciclos 00
FIGURA 13: Esquema de los ciclos de PCR para secuenciación de DNA

recomendados por Perkin Elmer (método de Big Dye).
96°C 96°C 60°C

3' 50" \ 50-55°C
4' 4°C
50" 00
30 ciclos
FIGURA 14: Esquema de los ciclos de PCR modificados para secuenciación de

DNA que codifica a isocitrato desiiidrogenasa.
Se nnodificaron las temperaturas de hibridación y elongación, los tiempos

de desnaturalización y elongación, así como el número de ciclos. Se
prolongaron los tiempos de desnaturalización para permitir que las hebras de
DNA se disociaran por completo, y se aumentaron el tiempo y la temperatura
de elongación, ya que se observó que a mayor temperatura se obtenía mayor
lectura, y aumentando el tiempo, una lectura más limpia, con menos ruido de
fondo. De esta forma se consiguió secuenciar DNA viral, que se había
considerado hasta el momento difícil de secuenciar y que requería el
subclonaje en plásmido del fragmento de interés. Por lo tanto, se obtuvo la
secuencia completa del gen que codifica a isocitrato deshidrogenasa de Hfx.
volcanii en un vector de fago X, formada por 1260 pb (Figura 15).
53

OLÍ 2
•
1 ATGAGCTACG ACCAGATTGA GGTTCCGGAC GACGGCGAGñ AAATCACGGT
51 CGACGAGGAG ACGGGCGAGC TCTCCGTCCC CGACAACCCG ATTATTCCGA
101 TCATCCACGG CGACGGAATC GGAACGGACG TCGGCCCCGC CGCACAGAAG

OLÍ 4
151 GTCCTCGACG CCGCCGCCGA GGCGACCGGC CGCTCTGTCT CTTGGATGCG
201 CGTCTACGCC GGTTCGTCCG CCCGCGACAA GTACGACGAG 7\ACCTCCCGG
251 AGGACACGGT AAGCGCCATC CGCAACCACC GCGTCGCAAT CAAGGGCCCG

OLÍ 7
301 CTCACGACAC CCGTCGGTGC CGGCTTCCGC TCGCTCAACG TCGCGCTCCG
351 CAAGAAGCTC GACCTCTACG CGAACGTCCG CCCGACCTAC CACCTCGACG

OLÍ 6 ^
4 01 GCGTCCCGTC GCCCGTGAAG AACCCCTCGG CGATGGACAT GGTCACGTTC
4 51 CGCGAGAACA CCGAAGACGT GTACGCCGGC ATCGAGTGGG AAGCCGGCAC
501 CGACGAGGTC CAGAAGGTCA AGGAGTTCGT CGAAGAAGAG ATGGGCGCGG

^ OLÍ 5
551 ACGGCGTCAT CCACGACGGT CCCGTCGGCA TCGGCATCAA GCCCATCACC
601 GAGTTCGGGA CGAAGCGCCT CGTCCGCGAG GCTATCGAGT ACGCCCTCGA

OLÍ 8 ^
651 AAACGACCGC CCGTCGGTCA CGCTCGTCCA CAAGGGCAAC ATCATGAAGT
701 TCACCGAGGG TGCCTTCCGT GACTGGGGCT ACGAACTCGC AGAAGAGGAG
7 51 TTCGGCGACG TCACCATCAC CGAAGACGAA CTGTGGGAAG AGTACGACGG
801 CAAGCGTCCC GAGGACAAGG TCGTTGTCAA GGACCGCATC GCCGACAACA
851 TGCTCCAGCA GCTTCTCACC CGCACCGCCA ACTACGATGT CATCGCCACG
901 ATGAACCTCA ACGGCGACTA CATGTCCGAC GCCGCCGGCG CGCAGATTGG
951 CGGCCTCGGC ATCGCCCCCG GTGCGAACTT CGGTGAGGGC CTCTGTCTCG
1001 CAGAGCCCGT CCACGGCTCC GCACCCAAGT ACGCCGGCAA GGACAAGGTC

OLÍ 10 •
1051 AACCCGACCG CGATGATTCT CTCCGGCCGT CTCATGTTCG AGTACATGGG
1101 CTGGAAGGAC GCCGGTAAGC TCATCCGCGA CACCGTCGAG AAGACCATCT
1151 CGGACGGCGA CGTGACCTAC GACCTCGAAC GCCAGATCGA GGGCGGCAAC

12 01 AAGCTCGCCA CGAGCGAGTA CGCCGACAAG GTCGTCGAGA ACATCAAAGA
C-TERM
12 51 GTTAGCTTAA
FIGURA 15: Secuencia completa del gen que codifica a isocitrato

desliidrogenasa del organismo halófilo Hfx.volcanii.
54

3.3.4. Análisis de la secuencia obtenida.
Las proteínas con función similar a menudo contienen secuencias de

aminoácidos similares, que corresponden a importantes dominios funcionales en
la estructura tridimensional de las proteínas. El descubrimiento de que una
proteína codificada por un gen recién clonado exíiibe estas homologías con
proteínas de función conocida, proporciona conocimientos reveladores sobre la
función del gen clonado (Lodish y col., 2002).
El análisis de secuencias de proteínas, utilizando las bases de datos

como herramienta fundamental, es un paso necesario a la hora de obtener
unas conclusiones veraces. Este proceso tomó absoluta relevancia desde los
momentos iniciales del trabajo, puesto que era necesario establecer
comparaciones entre el fragmento obtenido (por PCR y utilizado como sonda) y
el gen que codifica a la proteína de interés en otro organismo y corroborar la
secuencia,x hasta el análisis de los datos finales para conocer toda la
información posible sobre la proteína encontrada.
Este apartado del trabajo se ha centrado en el análisis de la secuencia

final obtenida obviando el análisis de los diferentes fragmentos, aunque éste es
absolutamente necesario para el correcto desarrollo del trabajo de
investigación.
En primer lugar se realizó el análisis de las secuencias mediante

PILEUP. Se establecieron comparaciones de las secuencias de aminoácidos
que codifican a una misma proteína en diferentes organismos. En este caso se
han utilizado las secuencias que codifican a isocitrato deshidrogenasa de
cuatro organismos; Caldococcus noboribetus (Archaea, Crenarchaeota,
hipertermófilo, P96318), Sulfolobus solfatarícus (Archaea, Euryarchaeota,
hipertermófilo, Q9UWG7), Archaeoglobus fulgidus (Archaea, Euryarchaeota,
hipertermófilo, 029610) y Escherichia coli (Bacteria, Gram', P08200), además
de la secuencia obtenida para la enzima de Ha/oferax volcanii (Q8X277). Todas
las ICDHs son NADP'*'-dependientes o presentan especificidad dual con una
marcada preferencia por NADP"" como es el caso de las enzimas de los
55

organismos termófilos C. noboribetus, S. solfatarícus y A. fulgidus.
En la Figura 16 se puede interpretar de forma gráfica el grado de

homología tan elevado que existe entre las secuencias de isocitrato
deshidrogenasas presentadas, y la estrecha relación que se da aunque los
organismos a los que pertenecen hayan divergido en la evolución. Si
adicionalmente se presta atención a los porcentajes de identidad de
aminoácidos y de similaridad de aminoácidos equivalentes, calculados
mediante BESTFIT (también disponible en el paquete informático del GCG)
(Tabla 6), se puede observar numéricamente este grado de homología, siendo
el mayor el obtenido con Archaeoglobus fulgidus. Se puede llegar a la
conclusión, como ya lo hicieron autores como Aoshima y col. (1996), de la
existencia de un gen que codifica a isocitrato deshidrogenasa en Archaea
similar a los de Bacteria.
Tablg 6: Porcentajes de identidad y similaridad entre ICDH de Haloferax

volcaniiy de otros organismos.
ORGANISMO IDENTIDAD SIMILARIDAD

Archaeoglobus fulgidus 65.05% 72.57%
Escherichia coli 56.61% 63.97%
Caldococcus noboribetus 51.35% 61.18%
Sulfolobus solfatarícus 45.70% 58.72%
En la siguiente comparación de secuencias se observó el gen

correspondiente a la proteína halófila con las secuencias de ICDHs de los
organismos Archaeoglobus fulgidus (She y col., 2001), Escherichia coli,
Caldococcus noboribetus (Hurley y col., 1991; Steen y col., 1997) y Sulfolobus
solfatarícus (comunicación personal) mediante PILEUP (Figura 16).
56

1 50
caldoc MVSHPCTADE AKPPSEGQLA RF..ENGKLI VPDNLIVAYF KGDGIGPEIV
ssidh M QKIPEDGEVI KF..ENGKWI VPKKPIILYV EGDGIGHEIT
hfvolc ~~ MSYDQ lEVPDDGEKI TVDEETGELS VPDNPIIPII HGDGIGTDVG
afulgid ~~ MQYEK VKPPENGEKI RY..ENGKLI VPDNPIIPYF EGDGIGKDVV
ecoli MESK VVVPAQGKKI TL..QNGKLN VPENPIIPYI EGDGIGVDVT
caldoc ESAKKVLDAA VDKAYGGTRR IVWWEVTAGE EAQKECGSL. .LPDGTLQAF

ssidh HAAMKVINKA VEKAYGSDRE IKWVEVLAGD KAEKLTGNR. .FPKESEELI
hfvolc PAAQKVLDAA AEAT . . . GRSVSWMRVYAGS SARDKYDE.. NLPEDTVSAI
afulgid PAAIRVLDAA ADKI...GKE VVWFQVYAGE DAYKLYGN.. YLPDDTLNAI
ecoli PAMLKVVDAA VEKAYKGERK ISWMEIYTGE KSTQVYGQDV WLPAETLDLI
101 150
caldoc KLARVNLKGP LTTPVGGGFR SLNVTLRMVL DLYSNVRPVK WY.GQPTPHC
ssidh EKYRVLLKGP LETPIGKGWK SINVAIRLML DLYANIRPVK YIPGIESPIK
hfvolc RNHRVAIKGP LTTPVGAGFR SLNVALRKKL DLYANVRPTY HLDGVPSPVK
afulgid KEFRVALKGP LTTPVGGGYR SLNVTIRQVL DLYANVRPVY YLKGVPSPIK
ecoli REYRVAIKGP LTTPVGGGIR SLNVALRQEL DLYICLRPVR YYQGTPSPVK
151 200
caldoc HPENIDWVIF RENTEDVYAG lEWPFDSPEA QKIRDFLKKE FGIEL...TP
ssidh NADKIDLIIF RENTDDLYRG lEYPYDSEQA KKIRDFLRKE LGVEV...ED
hfvolc NPSAMDMVTF RENTEDVYAG lEWEAGTDEV QKVKEFVEEE MGADGVIHDG
afulgid HPEKVNFVIF RENTEDVYAG lEWPRGSEEA LKLIRFLKNE FGVT.IREDS
ecoli HPELTDMVIF RENSEDIYAG lEWKADSADA EKVIKFLREE MGVKKIRFPE
201 250
caldoc DTGIGIKPIS KWRTQRHVRR AMEWAIRNGY KHVTIMHKGN IMKYTEGAFR
ssidh DTGIGIKLIS RFKTQRIARM AIKYAIDHKR KKVTIMHKGN VMKYTEGAFR
hfvolc PVGIGIKPIT EFGTKRLVRE AIEYALENDR PSVTLVHKGN IMKFTEGAFR
afulgid ..GIGIKPIS EFATKRLVRM AIRYAIENNR KSVTLVHKGN IMKYTEGAFR
ecoli HCGIGIKPCS EEGTKRLVRA AIEYAIANDR DSVTLVHKGN IMKFTEGAFK
251 300
caldoc QWAYDLILSE FRDYVVTEEE VNTKYGGKAP EGKIIVNDRI ADNMLQQIIT
ssidh EWSYEVATKE FRDYIVTEEE VTKNYNGVPP SGKVIINDRI ADNMFQQIII
hfvolc DWGYELAEEE FGDVTITEDE LWEEYDGKRP EDKVVVKDRI ADNMLQQLLT
afulgid DWGYEVAKQE FGEYCITEDE LWDKYGGKQP EGKIVVKDRI ADNMFQQILT
ecoli DWGYQLAREE FGGELI.DGG PWLKVKNPNT GKEIVIKDVI ADAFLQQILL
301 350
caldoc RPGEYNVIVT PNLNGDYISD EANPLVGGIG MAAGLDMGDG lAVAEPVHGS
ssidh RPDEYDIILA PNVNGDYISD AAGALVGNIG MLGGANIGDT GGMFEAIHGT
hfvolc RTANYDVIAT MNLNGDYMSD AAGAQIGGLG lAPGANFGEG LCLAEPVHGS
afulgid RTDEYDVIAL PNLNGDYLSD AAAALIGGLG lAPGSNIGDG IGVFEPVHGS
ecoli RPAEYDVIAC MNLNGDYISD ALAAQVGGIG lAPGANIGDE CALFEATHGT
351 400
caldoc APKYAGKNVI NPTAEILSGM YLLSDFVGWP EVKLLVEYAV KQAIAHKQVT
ssidh APKYAGKNVA NPTG.IIKGG ELMLRFMGWD KAAELIDSAI MESIRQKKVT
hfvolc APKYAGKDKV NPTAMILSG. RLMFEYMGWK DAGKLIRDTV EKTISDGDVT
afulgid APKYAGQNKV NPTAEILTG. ALMFEYIGWK DASEMIKKAV EMTISSGIVT
ecoli APKIAGQDKV NPGSIILSA. EMMLRHMGWT EAADLIVKGM EGAINAKTVT
401 441
caldoc YDLAREMGGV TPISTTEYTD VLVDYIRHAD LKPSRASEGL P
ssidh QDLARFM.GV RALSTTEYTD ELIAIIDTLS * ~
hfvolc YDLERQIEGG NKLATSEYAD KVVENIKELA * ~ ~
afulgid YDIHRHM.GG TKVGTREFAE AVVENLQSL- ~
ecoli YDFERLMDGA KLLKCSEFGD AIIENM ~ ~
FIGURA 16: Alineamiento de secuencias de aminoácidos correspondientes a

isocitrato deshidrogenasa de Caldococcus noboribetus ("caldoc") obtenida con el
Swiss-Prot, Sulfolobus solfataricus ("ssidh") aislada en la Universidad de Bath,
Haloferax volcanii ("hfvolc") obtenida en este trabajo, Archaeoglobus fulgidus
("afulgid"), y Escherichia coli ("ecoli") ambas también obtenidas de Swiss-Prot.
57

Obtención del gen. 3.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se han marcado en rojo los aminoácidos idénticos entre sí en todas las

especies, y en azul aquellos que son idénticos para ICDH de Hfx.volcanüy para
uno o varios organismos más (pero no en todos) con el fin de representar de
forma gráfica la relación entre secuencias.
Una vez se ha comprobado, mediante alineamiento de secuencias y

cálculo de los porcentajes de identidad y similaridad, que la secuencia obtenida
de Haloferax volcanii presentaba homología con el mismo gen en otros
organismos, se pudo llegar a la conclusión de que ésta se corresponde con una
isocitrato deshidrogenasa NADP-dependiente compuesta por 419 aminoácidos.
La longitud de la enzima halofílica es similar a las de arqueas y bacterias,
salvando excepciones como las pertenecientes a Azotobacter vinelandii y
Corynebacteríum glutamicum, que superan los 700 aminoácidos. En el caso de
las enzimas pertenecientes a eucariotas, la longitud también es aproximada a
la ICDH de Hfx. volcanii si se tiene en cuenta que las secuencias primarias
pertenecientes a las proteínas de eucariotas se corresponden con ICDH
citoplasmática. Estudios de clonaje y secuenciación de isocitrato
deshidrogenasas homodiméricas y multiméricas pertenecientes a procariotas y
a eucariotas revelaron la conservación de la estructura primaria al menos en
estas isocitrato deshidrogenasas (Thorsness y Koshland, 1987; Eguchi y col.,
1989; Cupp y McAlister-Henn, 1991; Haselbeck y col., 1992; Miyazaki y col.,
1992; Shorrosh y Dixon, 1992; Huh y col., 1993; Ishii y col., 1993; Nichols y
col., 1993; Udvardi y col., 1993; Jin y Sonenshein, 1994; Loftus y col., 1994;
Muro Pastor y Florencio, 1994; Kim y col., 1995; Zeng y col., 1995; Aoshima y
col., 1996; Kaneko y col., 1996; Miyazaki, 1996; Muro Pastor y col., 1996;
Wang y Lau, 1996; Yang y col., 1996).
La predicción de la estructura secundaria se llevó a cabo mediante la

utilización del apartado informático "Predict Protein" disponible en Internet
dentro del programa EMBL. Este programa basa sus resultados en
comparaciones de secuencia establecidas entre la proteína problema y
proteínas del mismo grupo cuya estructura se ha observado mediante un
sistema de redes neurales que contribuyen a una precisión media esperada
superior al 72% para los tres estados: hélice, hoja y lazo. En este caso el
58

resultado final es la predicción de doce hélices a y doce hojas (3 en la

estructura de ICDH de Hfx. volcanii. Teniendo en cuenta las proteínas
pertenecientes a otros organismos estudiados, se ha visto que la de E. coH
posee el misnno contenido de estructura secundaria; esta información se puede
encontrar en EXPASSY-SWISS-PROT, donde se hace referencia a todos los
datos conocidos sobre esta proteína.
Es bien sabido que las secuencias de aminoácidos de proteínas nativas

presentan periodicidades. En particular, las hélices a se caracterizan por una
alternancia de aminoácidos hidrofóbicos e hidrofílicos en una distancia de 3-4
aminoácidos (Hobohm y Sander, 1995).
Como el código genético es degenerado, no es obvio que estas

periodicidades en secuencias de proteínas induzcan a periodicidades en las
correspondientes secuencias de DNA. Sin embargo, hay una peculiaridad del
código genético que implica una correspondencia directa de correlaciones entre
DNA y proteína. La 2^ base de los codones está estrechamente relacionada
con las propiedades físicas del aminoácido. Más específicamente, los cinco
aminoácidos hidrofóbicos L, I, V, F, M tienen una T en esa posición, y los
aminoácidos hidrofílicos D, E, K, Q poseen una A en dicha posición de sus
codones (Woese y col., 1966).
En la Figura 17 se observa la estructura primaria de la proteína isocitrato

deshidrogenasa de Hfx. volcanii. Con la ayuda del apartado "Predict Protein",
correspondiente al programa EMBL, se pudieron obtener las posiciones de los
diferentes elementos de estructura secundaria, hojas p y hélices a. También,
por comparación de las secuencias de los organismos anteriormente
mencionados, se pudieron deducir las posiciones de los centros activos
correspondientes a la unión del coenzima NAÜP"" y del sustrato isocitrato.
59

1 MSYDQIEVPD DGEKITVDEE TGELSVPDNP IIPIIHGDGI GTDVGPAAQK
51 VLDAAAEATG RSVSWMRVYA GSSARDKYDE NLPEDTVSAI RNHRVAIKGP
101 LTTPVGAGFR SLNVALRKKL DLYANVRPTY HLDGVPSPVK NPSAMDMVTF

• • •
151 RENTEDVYAG lEWEAGTDEV QKVKEFVEEE MGADGVIHDG PVGIGIKPIT
* •
201 EFGTKRLVRE AIEYALENDR PSVTLVHKGN IMKFTEGAFR DWGYELAEEE
•
251 FGDVTITEDE LWEEYDGKRP EDKVVVKDRI ADNMLQQLLT RTANYDVIAT
•
301 MNLNGDYMSD AAGAQIGGLG lAPGANFGEG LCLAEPVHGS APKYAGKDKV
351 NPTAMILSGR LMFEYMGWKD AGKLIRDTVE KTISDGDVTY DLERQIEGGN
401 KLATSEYADK VVENIKELA*
FIGURA 17: Secuencia de aminoácidos completa del gen que codifica a ICDH
de Haloferax volcanii en formato GCG. En ésta aparecen subrayados aquellos
aminoácidos implicados en la unión del coenzima y del sustrato y diferenciados entre
sí por una i^ y una * , respectivamente. Además aparece en color la predicción de
estructura secundaria; se indican en rojo aquellos aminoácidos que conformarían las
hélices a y en azul los que conformarían las hojas p.
En la secuencia de aminoácidos que codifica a isocitrato deshidrogenasa

no se consiguió identificar el motivo de unión al coenzima, típico de las
deshidrogenasas, también llamado "Plegamiento de Rossman". La explicación
se encuentra cuando se observan las secuencias de isocitrato
deshidrogenasas de otros organismos; en éstas tampoco se encuentra este
tipo de motivo, lo que ha llevado a autores como Hurley y col. (1989) e Imada y
col. (1991) a enunciar que las isocitrato deshidrogenasas no están relacionadas
evolutivamente con enzimas del grupo de las alcohol deshidrogenasas y lactate
deshidrogenasas, en las que se conserva el "Plegamiento de Rossman", como
ocurre en enzimas como glucosa deshidrogenasa y glutamato deshidrogenasa
pertenecientes a Hfx. mediterranei y Thermus thermophilus, respectivamente,
estudiadas en nuestro grupo de investigación por la Dra. Carmen Pire (1998) y
el Dr. José Luis Ruiz (2000), en las que el motivo de unión al coenzima fue
claramente identificado.
60

De la secuencia de aminoácidos de la proteína se pudieron predecir los

parámetros bioquímicos teóricos con la ayuda del programa PROTPARAM
TOOL de EXPASSY-SWISS-PROT, obteniéndose los siguientes datos (Tablas
7, 8 y 9):
Tabla 7: Valores numéricos de las propiedades bioquímicas, químicas y físicas

de la isocitrato deshidrogenasa NADP-dependiente de Hfx.volcanii.
Número de aminoácidos: 419

Peso Molecular: 45837.3 Da
pl Teórico: 4.56
índice Alifático: 82.39
En la Tabla 7 se observa el número de aminoácidos de la proteína, la

masa molecular relativa para la subunidad, el punto isoeléctrico que se define
como el pH al cual la proteína se encuentra sin carga eléctrica neta, y el índice
alifático o íiidropático, definido como la escala que expresa las tendencias
íiidrofóbica e hidrofílica relativas de un grupo químico. El valor del punto
isoeléctrico tan bajo se debe a la influencia de los aminoácidos cargados
negativamente. En el caso de Archaeoglobus fulgidus, el punto isoeléctrico se
encuentra en torno a valores de 6.3 (Steen y col., 1997), un valor muy diferente
al calculado para Hfx. volcanii, teniendo en cuenta la homología de secuencia
tan elevada, y salvando las diferencias en la composición de aminoácidos
ácidos, que en Hfx. volcanii supera a la de A. fulgidus, ya que éste es un
organismo termófilo y Hfx. volcanii halófilo.
61

Obtención del gen. 3.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 8: Composición de aminoácidos correspondiente a la estructura primaria

de la proteína halófila.
RESIDUO N° PROPORC. RESIDUO N° PROPORC.

Ala (A) 37 8.8% Met (M) 12 2.9%
Arg (R) 19 4.5% Phe (F) 9 2.1%
Asn (N) 17 4.1% Pro (P) 20 4.8%
Asp (D) 36 8.6% Ser (S) 16 3.8%
Cys (C) 1 0.2% Thr (T) 25 6.0%
Gln (Q) 7 1.7% Trp(W) 5 1.2%
Glu (E) 40 9.5% Tyr (Y) 15 3.6%
Gly (G) 41 9.8% Val (V) 35 8.4%
His (H) 6 1.4% Asx(B) 0 0.0%
He (1) 26 6.2% Glx(Z) 0 0 0.0%
Leu (L) 27 6.4% Xaa(X) 0 0 0.0%
Lys (K) 25 6.0%
Número total de residuos cargados negativamente (Asp + Glu): 76
Número total de residuos cargados positivamente (Arg H• Lys): 44
En cuanto a la composición de aminoácidos, se puede comprobar en la

Tabla 8 cómo se produce una gran diferencia entre el número total de residuos
cargados positiva y negativamente, alcanzando una proporción de 10.5% y
18.1% del total de residuos, respectivamente. En el caso de organismos
termófilos y mesófilos estos porcentajes no difieren considerablemente entre si,
en A. fulgidus se encuentra un 12.9% de residuos ácidos y un 11.7% de
residuos básicos, y en el caso de E. coli estos porcentajes son 14.1% de
residuos ácidos y 10.8% de residuos básicos. Con esto se puede observar el
mismo hecho que se da en otras proteínas halófilas caracterizadas con
anterioridad, la elevada proporción de aminoácidos cargados negativamente
respecto a los cargados positivamente.
La comparación de estructuras primarias y composición de aminoácidos

de organismos termófilos con las de organismos mesófilos y psicrófilos no
62

revelan ninguna razón obvia para dilucidar el nnecanisnao de termoestabilidad.

Aún así, comparando las secuencias de ICDH de Hfx. volcanii, E. coli y A.
fulgidas, un hecho apreciable es la aparición de una única cisteína en la
molécula de las ICDHs halófila y termófila. Esto se ha interpretado por autores
como Hensel (1993) y Russel y Taylor (1995) como una característica que
confiere a las moléculas mayor termoestabilidad respecto a sus semejantes
con un mayor número de residuos de cisteínas, como puede ser el caso de la
ICDH de Escherichia coli (Hurley y col., 1991) que posee seis cisteínas,
mientras que las ICDHs de Archaeoglobus fulgidus (Steen y col., 1997) y
Haloferax volcanii poseen una única cisteína. Este menor porcentaje en
residuos de cisteína en proteínas termófilas y halófilas comparado con
proteínas mesófiias, únicamente revela las diferencias filogenéticas entre
organismos mesófilos y termofilos, aunque podría estar de acuerdo con la
termoestabilidad encontrada para la ICDH de Hfx. volcanii (Camacho y col.,
1995). La posición de los residuos de cisteína en la secuencia no está
conservada en la evolución, presentando posiciones diferentes para cada
organismo y, por poner un ejemplo, en A. fulgidus se encuentra en la posición
255 (Cys 255), en Hfx. volcanii se encuentra en la posición 332 (Cys 332) y en
E.coli no coincide ninguna de ellas. Esto indicaría que la presencia de un mayor
número de residuos de cisteína puede disminuir la termoestabilidad (Steen y
col., 1997).
Tabla 9: Composición atómica de la molécula de ICDH de Hfx. volcanii.
Carbono C 2015
Hidrógeno H 3170
Nitrógeno N 542
Oxígeno 0 652
Azufre S 13
Número total de átomos. 6392
63

En la Tabla 9 se puede observar la composición de átomos de la

proteína mediante un desglosamiento de cada uno de los aminoácidos en los
elementos carbono, hidrógeno, oxígeno, y nitrógeno (composición atómica
fundamental) y las cadenas laterales de cada uno de ellos, obteniéndose la
siguiente fórmula:
C2015H3170N542O652S13
En la Tabla 10 se calculan los coeficientes de extinción molar para la

isocitrato deshidrogenasa de Haloferax volcanii a varias longitudes de onda.
Tabla 10: Coeficientes de extinción molar obtenidos en las condiciones de

absorbancia 0.1% y concentración de 1 g/l.
276 nm 278 nm 279 nm 280 nm 282 nm

48750 49000 48475 47650 46000
1.064 1.069 1.058 1.040 1.004
El coeficiente de extinción molar varía con la naturaleza del compuesto

absorbente, con el disolvente, la longitud de onda y también con el pH, si la
especie absorbente de luz está en equilibrio con otra especie que tiene un
espectro diferente debido a la ganancia o pérdida de protones. En este caso el
programa informático calculó los coeficientes de extinción molar manteniendo
constante el disolvente y el pH (6.0 M de hidrocloruro de guanidinio y 0.02 M de
tampon fosfato pH 6.5) y por supuesto la especie absorbente, de forma que los
datos obtenidos únicamente varían en función de la longitud de onda.
Otra forma de observar homologías entre las secuencias de ICDH de

diferentes organismos consiste en la realización de árboles filogenéticos. Para
ello se debían seleccionar en un primer término las secuencias que se querían
comparar entre sí, estas secuencias se encontraron en las bases de datos. En
esta ocasión se buscaron ías secuencias en EXPASY-SWISS-PROT y TrEMBL
(Tabla 11). Se creó un fichero en el que todas estas secuencias aparecían en
formato fasta y se archivaron con formato texto. Se accedió a SCI (Sistema
64

Científico Interactivo) vía Telnet, a través del CNB de la Universidad Autónoma

de Madrid, y se utilizó el programa "CLUSTALW" para realizar el árbol
filogenético a partir de las secuencias del fichero.
Llegado a este punto, el programa ejecutó el alineamiento a partir del

fichero en el que se encontraban los datos de las diferentes secuencias.
Automáticamente este programa realizó un árbol filogenético al que fue
necesario dar formato. En este caso, se utilizó el formato dendrograma, que
para un número tan elevado de secuencias resulta ser el más claro (Figura 18).
Adicionalmente se ha indicado en la cuarta columna de la Tabla 11 las

distancias existentes, en el árbol filogenético, entre isocitrato deshidrogenasa
de Hfx. volcaniiy del resto de organismos.
65

Tabla 11: Organismos empleados, dentro de los tres Dominios existentes, para
confeccionar el árbol filogenético en el que se incluye Hfx. volcanii.
Clasificación Organismo Aminoác. Distancia

Haloferax volcanii 419 0
C3
Methanococcus jannaschii 347 0.61
U
Euriarchaeota Methanobacterium thermoautotrophicum 331 0.60
o
< Archaeoglobm fulgidus 412 0.34
Crenarchaeota Caldococcus noboribetus 429 0.46
Escherichia coli 416 0.47
Azotobacter vinelandii 741 0.83
Gram negativas Helicobacter pylori (Campylobacter pylori) 425 0.50
Rickettsia prowazekii 483 0.65
Sphingomonas yanoikuyae 406 0.77
Vibrio sp. 414 0.49
Gram negativas Synechocystis sp. 475 0.50
.2 Cianobacterias Anabaena sp. 473 0.45
D
O
Gram negativas Aquifex aeolicus 426 0.55
Hipertermófilas Thermotoga marítima 399 0.76
Thermus aquaticus (subsp. thermophilus) 495 0.62
Bacillus siibtilis 423 0.47
Cory neb acterium glutamicum 738 0.83
Gram positivas Streptococcus mutans 393 0.45
Streptococcus salivarius 391 0.45
Mycobacterium tuberculosis 409 0.76
Hongos Aspergillus niger 498 0.77
Levaduras Candida tropicalis 430 0.77
Saccharomyces cerevisiae 420 0.81
Medicago sativa (Alfalfa) 433 0.70
Glycine max (Soja) 413 0.76
Lycopersicon esculentum (Tomate) 393 0.70
TO
b Plantas Dauciis carota (Zanahoria) 416 0.78
U
Apiiim graveolens (Apio) 412 0.78
Solamim tuberosimj (Patata)) 416 0.78
Nicotianfl tabacimi (Tabaco común) 415 0.78
Microtus mexicanas (Ratón mejicano) 414 0.78
Rattiis norvegicus (Rata) 414 0.78
Animales Mus musculus (Ratón común) 414 0.78
66

Rickettsia prowazekii
- Thermus aquaticus
672
- Methanococcus ¡annaschii
994
Methanobacterium ttiermoautotrophicum
Aquifex aeolicus
Caldococcus noboribetus (*)
833
>- Archaeoglobus fulgidus
o 920
I- 1000 — Haloferax volcanii
o
X
o 984 — Anabaena sp.
a: 1000
Synechocystis sp.
980 Streptococcus mutans
1000
— Streptococcus salivarius
465 919
Bacillus subtilis
937
— Helicobacter pylori
942
— Vibrio sp.
I— 918
Escherichia coli
Lycopersicon esculentum
Azotobacter vinelandii
958 1000
— — Corynebacteñum glutamicum
1000 - Thermotoga marítima
- Mycobacterium tuberculosis
941
1000 Sphingomonas yanoikuyae
Saccharomyces cerevisiae
606
1(00 Aspergillus niger
990
Candida tropicalis
420 [- Musmusculus
1000
r Microtus mexicanus
636
Rattus norvegicus
>— 678
Daucus carota
1000
i- Solarium tuberosum
970
1000 Nicotiana tabacum
Apium graveolens
637
Glycine max
'- 912
Medicago sativa
0.1
FIGURA 18: Relaciones filogenéticas de los tres Dominios en base a

comparaciones de secuencias de isocitrato deshidrogenasas. En rojo se muestran las
bacterias, en azul las arqueas y en negro los eucariotas. (*Crenarchaeota sin
clasificar)
67

En el árbol filogenético obtenido se observan tres agrupaciones: por un

lado, el perteneciente a las bacterias (preferentemente), otro perteneciente a
eucariotas (con excepción de algunas bacterias) y un tercer grupo
perteneciente a las arqueas (donde también aparecían algunas bacterias).
Otras indicaciones de las estrechas relaciones entre las isocitrato

deshidrogenases de Archaea y las respectivas diméricas en Bacteria se
encontraron por comparación de las secuencias N-terminal de enzimas de
Haloferax volcaniiy Sulfotobus solfataricus (Camacho y co!., 1995).
Como se esperaba por los elevados porcentajes de identidad de

secuencia entre las isocitrato deshidrogenasas de Bacteria y Arcliaea, el
análisis filogenético (Figura 18) reveía que las bacterias y las arqueas halófilas
y íermófilas están más relacionadas entre sí que con ¡as arqueas
metanógenas, aunque esto podría deberse a la diferencia tan elevada entre las
necesidades fisiológicas de estos organismos y los organismos halófilos, más
similar a las condiciones requeridas por los organismos termófilos. Tomando el
valor de la distancia existente entre isocitrato deshidrogenasa de H6c. volcaniiy
el resto de isocitrato deshidrogenasas pertenecientes a los otros organismos,
se pueden diferenciar cuatro grupos principales:
- Un primer grupo formado por Hfx. volcanii, A. fulgidas y C. noboribetus,
estableciendo distancias entre ellos del orden de 0.45.
- Un segundo grupo formado por aquellos organismos (bacterias) que
distan un valor superior a 0.45 e inferior a 0.55.
- Un tercer grupo formado por aquellos organismos (arqueas
metanógenos y algunas bacterias) que distan un valor superior a 0.55 e inferior
a 0.65.
- Y un cuarto grupo formado por aquellos organismos (eucariotas y
algunas bacterias) que distan un valor superior a 0.65.
Por el contrario, los análisis füogenéíicos establecidos a partir de

factores de elongación (Baldauf y col., 1996) y secuencias de rRNA 16S
(Woese y col., 1990) predecían que las ICDHs de Archaea estarían más
relacionadas con las de Eucarya que con las de Bacteria.
68

Sin embargo el elevado grado de identidad de secuencia entre las

ICDHs de arqueas y de bacterias debería interpretarse como una divergencia
tardía de las ICDHs de Archaea y de Bacteria o como resultado de una
transferencia lateral de genes. Esta teoría casaría con la enunciada por
Doolittle (2000) mencionada en. el apartado 2.1 de este trabajo en la que
postula que durante la evolución de las especies existió transferencia lateral de
genes entre organismos de diferentes Dominios, transfiriéndose no sólo genes
que codifican a enzimas implicadas en características especiales (como
resistencia a antibióticos), sino también para aquellas que están implicadas en
rutas metabólicas esenciales como podría ser, en este caso, el ciclo de los
ácidos tricarboxílicos. Adicionalmente, se observó que la ICDH de algunas
bacterias, como Sphingomonas yanoikuyae, presentaban homología con
ICDHs NADP-dependientes de eucariotas y con ICDHs de arqueas (Wang y
Lau, 1996), lo que sugirió que isocitrato deshidrogenasa es una enzima
temprana en la evolución, ya que estuvo presente en los organismos antes de
la separación en los tres Dominios de la vida (Steen y col., 1997).
69

4. CLONAJE Y EXPRESIÓN
HETERÓLOGA DEL GEN DE ISOCITRATO
DESHIDROGENSA DE Hfx. volcanü.

Clónale y expresión heteróloga. 4.1. INTRODUCCIÓN.
4.1. INTRODUCCIÓN.
4.1.1. Obtención de genes por PCR.
La reacción en cadena de la polimerasa o PCR es un método rápido de

clonaje de genes. A pesar de ser relativamente reciente (la primera patente
data de 1987 por un investigador de la CETUR Corporation, K. Mullís, premio
Nobel en Química en 1993), su uso se ha generalizado, además de la
clonación, en una amplia variedad de campos como secuenciación,
mutagenesis, preparación de sondas, estudios de expresión, diagnóstico,
terapia génica, taxonomía molecular, medicina forense, etc. (Cerdán y col.,
1997), y se ha convertido en una herramienta importante para la biología
molecular moderna (Russell, 2002).
Como se ha visto en el capítulo 3 de este trabajo se pueden utilizar

oligonucleótidos sintéticos para generar sondas destinadas a localizar genes,
construyéndose a partir de la secuencia de la proteína en cuyo gen se está
interesado (Itakura y col., 1984; Lathe, 1985). Pero en este capítulo no interesa
construir una sonda perteneciente al gen de interés, sino el gen completo, con
el fin de clonarlo en vectores de clonaje y posteriormente en vectores de
expresión.
Se pueden utilizar diferentes DNAs molde para obtener el gen por PCR;
a partir de una genoteca de cDNA por retrotranscripción, a partir de una
genoteca de DNA genómico construida en plásmidos o en vectores virales, y a
partir de DNA genómico directamente (Watson y col., 1992). En los dos
primeros caSos, con la utilización de genotecas, es necesario localizar el gen
en éstas con anterioridad, como se ha explicado en el capítulo 3.
Para obtener el gen por PCR se seguirá una aproximación al método

utilizado por autores como Connaris y col. (1999) o Ceciliani y coi. (2000), entre
otros, ya que la secuencia de la reacción en cadena de la polimerasa es
diferente para cada producto, y varía principalmente en función de la longitud
de producto a amplificar y del porcentaje de pares GCs, entre otros parámetros.
71

Clónale v expresión heteróloga. 4.1. INTRODUCCIÓN.
4.1.2. Clonaje en diferentes vectores.
Para introducir los productos de PCR en un vector de clonación existen

diversas posibilidades. Los fragmentos de DNA amplificados por PCR no
poseen extremos perfectamente romos sino que presentan protuberancias 3'A.
Estos extremos pueden convertirse en romos por tratamiento con una
exonucleasa específica para DNA monohebra o con la polimerasa de Klenow, y
entonces unirlos a un vector digerido con una enzima que deje extremos
romos. En este caso suele ser necesario fosforilar los extremos de los
cebadores antes o después del PCR, ya que el vector se desfosforila para
evitar que se recircularice.
Actualmente se comercializan plásmidos linealizados y con extremos

protuberantes 3T, que permiten la clonación directa de cualquier producto de
PCR por complementariedad de sus extremos. Estos plásmidos también
pueden prepararse en el laboratorio con la transferasa terminal y didesoxITTP;
sólo se puede añadir un ddTTP en los extremos 3' del plásmido, con lo cual no
puede recircularizarse y no necesita ser desfosforilado (Chuang y col., 1995).
También se puede optar por añadir secuencias de corte para enzimas de

restricción en los extremos 5' de los cebadores. Estas secuencias quedarán
incorporadas en los productos del PCR y permitirán hacer sus extremos
compatibles con los del vector tras la digestión enzimática con la misma
restrictasa. Sin embargo, algunas enzimas de restricción cortan muy mal en los
extremos de los productos de PCR. Para reducir este problema hay varias
opciones: una de ellas es añadir al menos 6 nucleotides extra en el lado 5' de
la secuencia de reconocimiento de la enzima. Otra posibilidad es diseñar los
cebadores sin colas 5', pero que sean complementarios en una zona tal que
cambiando un solo nucleótido se establezca una secuencia de corte para una
enzima de restricción que antes no existía (Cerdán y col., 1997).
Un vector es una molécula de DNA con un origen de repllcaclón

autónomo y que posee zonas donde pueden introducirse fragmentos de DNA
exógeno. De este modo, el DNA exógeno se replica como parte del vector en la
72

Clonaie y expresión heteróloqa. 4.1. INTRODUCCIÓN.
célula receptora, pudiendo obtenerse así en grandes cantidades. Los vectores

más comúnmente utilizados derivan de plásmidos o de virus (Sambrook y
Russell, 2001).
Los fragmentos de DNA deben unirse al vector para crear las moléculas
recombinantes. La unión de dos moléculas de DNA puede realizarse con la
enzima DNA ligasa, que sella las mellas existentes entre nucleotides
adyacentes en una de las hebras de DNA bicatenario, por formación de un
enlace fosfodiéster entre los extremos 3'OH y 5'fosfato. Las dos DNA ligasas
más utilizadas son la de E. coli, que necesita NAD"" como cofactor, y la del
bacteriófago T4, que necesita ATP.
Cuando las dos moléculas que se van a unir han sido cortadas con la
misma enzima de restricción (o con enzimas compatibles), que les ha dejado
los extremos cohesivos, la unión es eficaz y se ve facilitada por el
apareamiet:ito de secuencias complementarias. La eficacia es menor cuando
los fragmentos de DNA poseen extremos romos; en este caso debe
incrementarse la concentración tanto de DNA como de ligasa (preferentemente
T4 ya que la de E. coli apenas funciona con extremos romos). Es muy
importante mantener una relación adecuada de concentraciones entre el DNA a
insertar y el vector; en general, se recomienda que el DNA a insertar esté en
una concentración siete veces superior al vector.
El vector de expresión pET posee un promotor inducible por IPTG. Los

genes clonados en este tipo de vectores se encuentran bajo el fuerte control de
la maquinaria transcripcional del bacteriófago T7 y, opcionalmente, bajo el
control de señales de translación. La expresión de la proteína de interés se
produce gracias a la presencia de la T7 RNA polimerasa en las células
hospedadoras. La T7 RNA polimerasa es tan activa y selectiva que el producto
deseado puede llegar a niveles de expresión superiores al 50% del total de las
proteínas expresadas en la célula hospedadora (pET System Manual, Novagen
2000).
73

Clónale y expresión heteróloga. 4.1. INTRODUCCIÓN.
Una vez formada la nnolécula de DNA recombinante, es decir, que el

fragnriento de DNA exógeno ha sido ligado en el vector, debe introducirse en la
célula hospedadora, desarrollando diversos métodos para ello. Con frecuencia,
E. coli es la célula hospedadora pues, o bien la clonación se realiza
directamente en esta bacteria, o bien se utiliza para la amplificación del DNA
recombinante, que posteriormente será introducido en otra célula hospedadora
(Cerdány col., 1997).
La cepa de E. coli BL21(DE3) de Novagen posee una copia de la T7

RNA polimerasa en su cromosoma. Estos hospedadores son lisógenos del
bacteriófago DE3, un derivado de fago lambda que posee la región de
inmunidad del fago 21 y contiene un fragmento de DNA que posee el gen lacl,
el promotor lacUV5 y el gen de la T7 RNA polimerasa. Una vez formado un
lisógeno DE3, el único promotor conocido para la transcripción directa del gen
de la T7 RNA polimerasa es el promotor lacUV5, inducible por IPTG. La adición
de IPTG al cultivo en crecimiento induce la T7 RNA polimerasa, la cual
transcibe el DNA diana en el plásmido (pET System Manual, Novagen 2000).
4.1.3. Expresión heteróloga.
La expresión heteróloga de genes es una técnica cuyo objetivo principal

es la obtención de elevadas cantidades de proteína exógena al organismo
hospedador en el mínimo tiempo posible. Por ello, se utiliza como organismo
hospedador principalmente la bacteria gram negativa E. coli, organismo bien
caracterizado genéticamente y cuyo tiempo de generación es muy breve
(Baneyx, 1999). Este organismo es muy versátil a la hora de aceptar plásmidos
exógenos, lo que permite utilizarlo como modelo en diversas técnicas de
biología molecular.
La sobreexpresión de proteínas en E. coli es una herramienta de gran

utilidad para la purificación, localización y análisis funcional de las proteínas. La
técnica de expresión se basa en la inserción de un promotor fuerte y una zona
de unión al cromosoma muy eficaz delante del ORF del gen a estudiar (Claros
74

Clónale v expresión heteróloga. 4.1. INTRODUCCIÓN.
y col., 2001). Estas pueden expresarse en modo nativo o como proteínas de

fusión..
Las proteínas que se obtienen en la fracción citoplasmática de la

bacteria pueden aparecer en dos formas posibles: insoluble, lo que se conoce
como "cuerpos de inclusión", o en forma soluble. Las proteínas que aparecen
solubles en el citoplasma pueden estar en forma activa o inactiva. Si las
proteínas presentan actividad, únicamente se requiere un proceso de
purificación de la proteína recombinante que dependerá de dicha proteína en
cuestión. Si estas proteínas no presentan actividad se requiere un paso previo
de reactivación, y luego la posterior purificación de la proteína.
A menudo, las proteínas expresadas a elevados niveles tienden a

asociarse entre sí mediante interacciones hidrofóbicas para íiacerse más
solubles. Estas asociaciones acaban siendo finalmente insolubles debido a su
gran tamaño,, ya que la proteína es muy abundante y forman los denominados
"cuerpos de inclusión" (Claros y col., 2001).
Las proteínas que se obtienen en forma de cuerpos de inclusión se

encuentran como un aglomerado de estructuras primarias y material
contaminante, como vesículas de membrana que se adhieren a los cuerpos de
inclusión tras la lisis celular, por lo que no presentan actividad (Georgiou y
Valax, 1999). En este caso se requiere un paso previo de solubilización de
estos cuerpos de inclusión, a continuación un plegamiento de la proteína para
que adquiera su estructura tridimensional, y por último la purificación de la
proteína de interés de los restos que la acompañaban en los cuerpos de
inclusión (Figura 19).
75

FIGURA 19: Micrografía electrónica de barrido de cuerpos de inclusión

purificados.
La obtención de proteínas expresadas en forma de cuerpos de inclusión

presenta varias ventajas. En primer lugar, se obtienen altos niveles de proteína
recombinante; además, se evita el paso de la proteína a través de las
membranas celulares y la proteína obtenida de esta forma se encuentra
protegida del ataque de proteasas del íiospedador presentes en el citoplasma y
el espacio periplásmico; incluso, si la proteína, a tan altos niveles de expresión,
resultara tóxica para el organismo hospedador, la producción de cuerpos de
inclusión sería el método más eficaz para obtener la proteína recombinante (De
Bernárdez, 2001).
Sin embargo, tiene una gran desventaja. Durante el proceso de

renaturalización in vitro de la proteína se pueden formar estructuras
intermedias inactivas de forma irreversible, o agregaciones, lo que abortaría el
proceso de plegamiento impidiendo la formación de la proteína nativa (Figura
20). Este proceso improductivo puede llegar a predominar sobre el correcto
plegamiento bajo las condiciones convencionales de dicíio plegamiento,
cuando se trata de proteínas complejas (Rudolph y Lilie, 1996); por ello, este
proceso debe ser cuidadosamente desarrollado.

FIGURA 20: Esquema de las fases de plegamiento o agregación de la proteína

a partir de los cuerpos de inclusión durante la renaturalización. Adquisición del estado
nativo (1 y 2) y reacciones de agregación irreversible a partir de conformaciones
diferentes durante el proceso de renaturalización (3 y 4).

Clónale v expresión heteróloga. 4.2. METODOLOGÍA.
4.2. METODOLOGÍA.
4.2.1. Obtención del gen de isocitrato deshidrogenasa.
• Diseño de dos oligonucleótidos específicos para el gen que codifica a

isocitrato deshidrogenasa de Haloferax volcanii.
Los oligonucleótidos que se sintetizaron abarcan las zonas que incluían

las secuencias correspondientes a los extremos amino y carboxilo terminal de
isocitrato deshidrogenasa de Hfx. volcanii. A estos oligonucleótidos se les
denominó IDH-FOR (para el oligo directo) e IDH-REV (para el oligo reverso).
Para ello se partió de la secuencia obtenida del gen y de los extremos anterior
y posterior (Figura 21).
1 ACTGACAGGC AGCAACGACC GCGTGAACGG GTGGTCGATT CGAGACGCGG
51 ACTGCGGTCT GACCGCCGAA AGCGGGTCGG GTTAGCTCGC GCCCGCGTCG
101 ACCGCGTCGT CCAGGACGGC CTGTCTGGGT TCCGGTTAGC CGGGGATGCC
151 GCCGGCACCG CCGTGGAGGA TAATTCGCAT ACGAGAGTGT CTTCGGAGCA
201 CGGTCCTAAA CGTATCGACC GACGAATAGA GCGATACTTG CACTTCGCCG
251 TCGATAACGG CAGGACTTTT ACACCGCACT GGAAAACCCA 7Uy\TGTTCAT
301 GAGCTACGAC CAGATTGAGG TTCCGGACGA CGGCGAGAAA ATCACGGTCG

351 ACGAGGAGAC GGGCGAGCTC TCCGTCCCCG ACAACCCGAT TATTCCGATC
401 ATCCACGGCG ACGGAATCGG AACGGACGTC GGCCCCGCCG CACAGAAGGT
451 CCTCGACGCC GCCGCCGAGG CGACCGGCCG CTCTGTCTCT TGGATGCGCG
501 TCTACGCCGG TTCGTCCGCC CGCGACAAGT ACGACGAGAA CCTCCCGGAG
551 GACACGGTAA GCGCCATCCG CAACCACCGC GTCGCAATCA AGGGCCCGCT
601 CACGACACCC GTCGGTGCCG GCTTCCGCTC GCTCAACGTC GCGCTCCGCA
651 AGAAGCTCGA CCTCTACGCG AACGTCCGCC CGACCTACCA CCTCGACGGC
701 GTCCCGTCGC CCGTGAAGAA CCCCTCGGCG ATGGACATGG TCACGTTCCG
751 CGAGAACACC GAAGACGTGT ACGCCGGCAT CGAGTGGGAA GCCGGCACCG
801 ACGAGGTCCA GAAGGTCAAG GAGTTCGTCG AAGAAGAGAT GGGCGCGGAC
851 GGCGTCATCC ACGACGGTCC CGTCGGCATC GGCATCAAGC CCATCACCGA
901 GTTCGGGACG AAGCGCCTCG TCCGCGAGGC TATCGAGTAC GCCCTCGAAA
951 ACGACCGCCC GTCGGTCACG CTCGTCCACA AGGGCAACAT CATGAAGTTC
1001 ACCGAGGGTG CCTTCCGTGA CTGGGGCTAC GAACTCGCAG AAGAGGAGTT
1051 CGGCGACGTC ACCATCACCG AAGACGAACT GTGGGAAGAG TACGACGGCA
1101 AGCGTCCCGA GGACAAGGTC GTTGTCAAGG ACCGCATCGC CGACAACATG
1151 CTCCAGCAGC TTCTCACCCG CACCGCCAAC TACGATGTCA TCGCCACGAT
1201 GAACCTCAAC GGCGACTACA TGTCCGACGC CGCCGGCGCG CAGATTGGCG
1251 GCCTCGGCAT CGCCCCCGGT GCGAACTTCG GTGAGGGCCT CTGTCTCGCA
1301 GAGCCCGTCC ACGGCTCCGC ACCCAAGTAC GCCGGCAAGG ACAAGGTCAA
1351 CCCGACCGCG ATGATTCTCT CCGGCCGTCT CATGTTCGAG TACATGGGCT
1401 GGAAGGACGC CGGTAAGCTC ATCCGCGACA CCGTCGAGAA GACCATCTCG
1451 GACGGCGACG TGACCÍACGA CCTCGAACGC CAGATCGAGG GCGGCAACAA
78

Clónale y expresión heteróloga. 4.2. METODOLOGÍA.
1501 GCTCGCCACG AGCGAGTACG CCGACAAGGT CGTCGAGAAC ATCAAAGAGT

1551 TAGCTTAAGG CAACTCTCTG AGCAGCCAGA AATCTTCGAT TTCTGGATAC
1601 ATTCACGAAC TCGCTGTAAG CGACCACACA ACTTCTCTCT CGCGGCACCG
1651 ACGCCGCACT CGTTTCGCGC CGCTTACAGT CGATTCGGGT CCCGCCAGCG
17 01 ACGAATCCGG TTCCACAGCG GTCTGACGAC GCCAAGACGA CCGCGCCGGC
17 51 GGTGTCGGCG ACGATATCGA CGGCCGTGTC TTCCAGGTAG ACCGAGCGGG
18 01 GCACTCGACC CAAAAGCCGG TTAAGAGCCC GCTCGTCACC TCGAACCACC
1851 GTCCCGATCC GCCGCTACGC ATTGGAGGAA CGACTAGGA
FIGURA 21: Secuencia completa del gen que codifica a isocitrato

deshidrogenasa de Haloferax volcanii delimitada por el codón de inicio y el codón de
terminación marcados en rojo. Adicionalmente se puede observar la secuencia externa
al gen.
Los oligonucleótidos se diseñaron incluyendo las secuencias de

restricción para dos endonucleasas con el fin de dirigir el inserto en el proceso
de clonaje. Estas endonucleasas fueron Nde I para el extremo amino terminal y
BamH I para el extremo carboxilo terminal. Los oligonucleótidos utilizados
fueron sintetizados por PE- Applied Biosystems UK y se observan en la Figura
22.
Nde 1 N° pb Tm
"IDH-FOR" CAAATTGCA'TAIGAGCTACGAC 22 pb 50.9 °C
BamH\
"IDH-REV" G'GATCCTTAAGCTAACTCTTTG 22 pb 51 °C
FIGURA 22: Oligonucleótidos utilizados en la amplificación del gen. En el

oligonucleotide directo ("IDH-for") aparece subrayado el codón de iniciación del gen
que codifica a isocitrato deshidrogenasa de Haloferax volcanii, y que forma parte de la
secuencia de restricción de Nde I. En ambos oligos se ha marcado el sitio de corte de
la endonucleasa con una coma, y la secuencia de reconocimiento en negrita.
79

Clónale y expresión heteróloqa. 4.2. METODOLOGÍA.
• Reacción y secuencia de amplificación del gen que codifica a isocitrato

deshidrogenasa de Haloferax volcanii.
Para generar el producto de PCR se preparó una mezcla de reacción

que contenía los reactivos que aparecen en la Tabla 12. Al igual que en
apartados anteriores (3.2.1) las concentraciones vinieron dadas, como
referencia, en el manual "PCR Applications Manual", de la casa comercial
Roche Molecular Biochemicals (1999).

para generar el producto de PCR.
REACTIVOS CONCENTRACIÓN FINAL

50 mM MgCla 2mM
lOx tampon de PCR 1x
12.5mMdNTP 0.2 mM
IDH-FOR 150 pmol
IDH-REV 150 pmol
DMSO 1.2 %
DNAgenómico de 1.5 |ig
Hfx. volcanii
Taq polimerasa 2.5 U
agua hasta un volumen final de
100 (al
Los ciclos del PCR fueron:

Un ciclo inicial de 96°C 5 minutos; 30 ciclos de 96°C 1 minuto, 60°C 1
minuto y 72°C 2 minutos; un ciclo de 72°C 7 minutos y un último ciclo de 4°C a
tiempo infinito:
80

96°C 96°C 50°C 72°C 72°C 4°C
^ " ^ A 7'
r
30 ciclos
00
4.2.2. Fases de clonaje.
El gen obtenido por PCR se clonó en varios vectores y se transformó en

las correspondientes cepas de E. coli hasta llegar al vector y la cepa de
expresión. Los vectores y las cepas utilizados se enumeran en la Tabla 13.
Tabla 13: Vectores y cepas utilizadas en las distintas fases de clonaje,

enumeradas de forma secuencial.
VECTOR CEPA
pCR®2.1 (TA cloning) Novablue (E. coli)
pET- 3a Novablue (£. coli)
pET- 3a BL21(DE3)(£. coli)
En primer lugar, se clonó el producto de PCR en el vector pCR® 2.1

(Original TA Cloning® Kit) de Invitrogen. Este vector está preparado para
admitir insertos obtenidos de PCR, Una vez optimizada la concentración de
producto recomendada por el kit se preparó la mezcla de reación que aparece
en la Tabla 14.
81

Clonaje v expresión heteróloga. 4.2. METODOLOGÍA.

para la ligación del producto y del vector.
REACTIVOS VOLUMEN (ni)

Agua ultrapura estéril 4.3
10x tampon de ligación 1.0
vector pCR® 2.1 (25 ng/jal) 2.0
Producto de PCR fresco 1.7
T4 DNA ligasa 1.0
Por último se incubó a 14°C durante toda la noche.
Una vez obtenida la molécula recombinante, por ligación de vector e

inserto, se procedió a la transformación físico-química de las células
competentes Novablue, de la casa comercial Novagen. Estás células vienen
preparadas para la transformación, de manera que no deben ser pretratadas
como ocurre con las que se hacen competentes en e! laboratorio. El protocolo
de transformación se llevó a cabo según el manual de instrucciones "pET
System Manual" (Novagen, 2000).
Las colonias positivas se crecieron en medio LB líquido con kanamicina

durante toda la noche a 37°C. A continuación se aisló plásmido con el kit
"Concert™ Rapid Plasmid Purification Systems", de Life Technologies.
Se comprobaron los insertos de los plásmidos obtenidos y su integridad

mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%. En determinadas ocasiones
fue necesario digerir una alícuota de la molécula recombinante para comprobar
que realmente contenía el inserto deseado.
Para el clonaje del gen en el vector pET-3a se digirieron tanto la

molécula reconnbinante como el nuevo vector con las enzimas de restricción
A/de / y BamH I. Tanto la enzima Nde I como la BamH I requieren las mismas
condiciones de corte, pero con el fin de obtener buenos resultados se
82

Clonaie v expresión heteróloga. 4.2. METODOLOGÍA.
digirieron, tanto la molécula recombinante como el vector pET-3a.(Novagen) de

forma secuencial, como se especifica en la Tabla 15. Una vez que se
mantuvieron en incubación el tiempo requerido, se realizó una electroforesis en
gel de agarosa al 1% para observar el resultado de ambas digestiones.
Tabla 15: Componentes utilizados en la digestión de la molécula recombinante

y vector pET-3a de Novagen.
REACTIVOS CANTIDADES
Plásmido 0 vector 2m
A/del lOu
OFAIOx Buffer plus 4 lal (2x)
Volumen final 20^1
Se incuba con la primera enzima a 37°C
durante toda la noche y se añade la segunda
BamH\ lOu
OFA lOx Buffer plus 1 nl(1x)
Agua ultrapura estéril 3.5 III
Volumen final 30)il
Se incuba con la segunda enzima a 37°C
durante 2 horas.
La reacción de ligación del gen con el vector se llevó a cabo siguiendo el

protocolo de Roche Molecular Biochemicals para la enzima T4 DNA ligasa.
Se preparó la reacción de ligación con una relación de concentraciones

3:1 inserto:vector, de forma que la composición de la mezcla quedó como se
indica en la Tabla 16. Finalmente se incubó durante 16 horas a 4°C.
83

Tabla 16: Reactivos necesarios para la ligación entre el gen de isocitrato

deshidrogenasa de Hfx. volcaniiy el vector pET-3a.
REACTIVOS VOLUMEN (îl)

Gen de isocitrato deshidrogenasa 6
Vector pET-3a 1
T4 DNA llgasa 0.5
10x tannpón de ligación 1
Agua ultrapura estéril 1.5
Una vez transcurrido dicho tiempo, se transformaron células

competentes de la cepa Novablue de E. coli siguiendo el mismo protocolo que
se ha comentado anteriormente ("pET System Manual", Novagen, 2000).
Las células transformadas se sembraron en placa con medio LB-agar y

50 i^g/ml de ampicilina, sin X-Gal ni IPTG. En este caso, la selección de clones
positivos no se realizó por colonias blancas y azules, ya que el vector no posee
el gen de la enzima p-galactosidasa. Para dicha selección se aislaron un
número estadísticamente representativo de colonias, se crecieron en medio
líquido y se comprobaron los plásmidos con inserto por electroforesis en gel de
agarosa al 1%.
Para la transformación de la cepa de E. coli, BL21(DE3), se siguió el

protocolo "pET System Manual" de Novagen.
Las colonias positivas se identifican por ensayos de expresión. Para ello

se aislaron un número de clones estadísticamente representativo, se crecieron
en medio LB líquido con ampicilina (50 \ig/m\) hasta una ODeoo de 0.5 y se
indujeron durante 3 h con IPTG 0.4 mM. Los clones válidos son aquellos que
presentan sobreexpresión de la proteína recombinante.
84

Obtenido el clon positivo para el ensayo de expresión se deternriinó la

estabilidad del plásnnido. Para este ensayo se preparó una dilución de 10"^ de
las células y se sembró en varias placas de LB, unas conteniendo IPTG (0.4
mM) y ampicilina (50 pg/ml), y otras sólo con IPTG (0.4 mM). De igual modo, se
preparó otra dilución de 2 x 10"^ de las células y se sembraron varias placas de
LB, unas con ampicilina (50 |ag/ml), y otras sin nada añadido al agar.
4.2.3. Expresión heteróloga y purificación de la proteína recombinante.
• Aislamiento de fracciones
Tras la comprobación de la estabilidad del clon se preparó el ensayo de

expresión para obtener la proteína recombinante. El proceso de crecimiento e
inducción se llevó a cabo según el "pET System Manual" (2000) (Novagen).
Según éste, la colonia seleccionada se creció en 3 mi de medio LB líquido
suplementado con ampicilina (50 |j.g/ mi), se incubó a 37 °C y 225 rpm en un
agitador orbital íiasta una ODeoo de 0.5. Este cultivo recibe el nombre de
preinóculo.
Este preinóculo se utilizó para sembrar un medio de 100 mi de LB

líquido, también suplementado con ampicilina a la misma concentración, y se
incubó a 37 °C con agitación liasta una ODeoo comprendida entre 0.5-1. Este
cultivo, una vez crecido a la densidad óptica deseada, se separó en dos de 50
mi cada uno; uno de ellos se indujo con IPTG a una concentración de 0.4 míVI
en el cultivo y el otro no, utilizándose como control negativo de la inducción.
Ambos cultivos se incubaron durante 3h de la misma forma que antes. Una vez
transcurrido ese tiempo, los cultivos se almacenaron a 4°C hasta el aislamiento
de las fracciones.
Dicho aislamiento también se llevó a cabo según el protocolo de

Novagen, aunque se modificaron varios pasos debido a la naturaleza de la
proteína sobreexpresada. Las fracciones que se analizaron fueron: fracción
celular total, fracción de medio extracelular, fracción periplásmica, fracción
85

citoplásmica soluble y fracción citoplásmica insoluble o cuerpos de inclusión. El

protocolo ennpleado para cada aislamiento fue diferente según el tipo de
fracción:
La fracción celular total, la fracción del medio extracelular y la fracción

periplásmica se aislaron según el protocolo recomendado. Las fracciones
citoplásmicas soluble e insoluble se aislaron de forma distinta a la
recomendada por Novagen, en estos casos se siguió el método propuesto por
Connaris y col. (1999) en la expresión de proteínas halófilas.
Una vez aisladas las fracciones se procedió a la localización de la

proteína sobreexpresada. Para esto se prepararon dos geles de poliacrilamida
al 12% conteniendo SDS al 1%, y se cargaron las muestras obtenidas a partir
de cada una de las fracciones aisladas, utilizando como control la proteína
nativa purificada. El procedimiento para preparar el gel es el descrito por
Laemmii (1970).
Se observó que la proteína aparecía en la fracción citoplásmica insoluble

por lo tanto era necesario proceder a la solubilización de los cuerpos de
inclusión y la renaturalización de la proteína recombinante.
• Solubilización de los cuerpos de inclusión.
Antes de renaturalizar la proteína se solubilizaron ios cuerpos de

inclusión en tampon Tris-HCl 20 mM pH 8 conteniendo 8 M de urea, 50 mM de
DTT y 2 mM de EDTA. Se incubaron a 37 °C agitando vigorosamente durante
el proceso de incubación hasta la completa solubilización de la muestra.
Solubilizados los cuerpos de inclusión se procedió a determinar la

cantidad de proteína con el método de Bradford (1976). Para ello se diluyó 1:20
la muestra en tampon Tris-HCl 20 mM pH 8 conteniendo 1 mM de EDTA y 10
mM de MgCIs (Tampon A). El blanco se preparó también diluyendo 1:20 el
tampon Tris-HCl 20 mM pH 8 que contenía 8 M de urea, 50 mM de DTT y 2
mM de EDTA en el mismo tampon A.

• Renaturalización.
Una vez determinada la concentración de proteína se preparó una

dilución de los cuerpos de inclusión, en tampon Tris-HCI 20 mlVI pH 8
conteniendo 3 M de NaCI, 10 ml\/l de MgCla y 1 mM de EDTA (tampon de
renaturalización), íiasta una concentración de proteína final de 20 |j,g/ml. La
solución se incubó durante un mínimo de 16 h (para volúmenes de muestra
superiores es conveniente aumentar el tiempo de incubación) a temperatura
ambiente y con agitación muy suave hasta el completo plegamiento de la
enzima, el cual se detecta realizando medidas de actividad enzimática según el
protocolo descrito por Camacho y col., 1995.
Tras la renaturalización de la proteína se procedió a la purificación de

ésta siguiendo un proceso total de cuatro etapas que se describen a
continuación:
• Purificación.
a) Concentración de la muestra utilizando células de ultrafiltración bajo

presión.
La célula de ultrafiltración utilizada fue la "Stir bar ultrafiltration cell" de
Millipore. La membrana de ultrafiltración presentaba un tamaño de poro para
retener proteínas de masa relativa superior a 50000 Da. Se concentró la
muestra hasta un volumen mínimo, y para comprobar que no se perdía nada de
enzima a través del filtro, se realizaron constantes medidas de actividad en el
filtrado. Con este tipo de células se pueden concentrar volúmenes de varios
litros de tampon y llevarlos hasta varios mililitros.
c) Cambio de tampon de la muestra y cromatografía en DEAE celulosa.

Se intercambió el tampon de renaturalización con tampon Tris-HCI 20
mM pH 8 conteniendo 2.5 M de sulfato amónico, 10 mM de MgCb y 1 mM de
EDTA, ya que era necesario para que la enzima quedara adherida en el lecho
del gel de la columna que a continuación se iba a utilizar; se concentró con la
87

Clonaie v expresión heteróloga. 4.2. METODOLOGÍA.
misma célula de ultrafiltración de la etapa anterior y se repitió este paso de

lavado. La proteína concentrada se introdujo en una columna de DEAE
celulosa previamente equilibrada con el mismo tampon de sulfato amónico. La
proteína recombinante quedó unida al lecho del gel. El lavado se llevó a cabo
con el mismo tampon que contenía sulfato amónico. La elución de la proteína
se realizó con tampon de renaturaiización, produciéndose el intercambio de
sulfato amónico por cloruro sódico, y obteniéndose la enzima concentrada en
dos o tres fracciones y con elevada actividad.
d) Diálisis de la muestra.
Las fracciones de elución que poseían actividad isocitrato
deshidrogenasa se dializaron frente a tampon de renaturalización durante 24 h.
Este paso fue necesario para eliminar los posibles residuos de sulfato amónico
en la muestra que pudieran afectar la estabilidad de la proteína.
Las , diferentes etapas de purificación se analizaron mediante

electroforesis en gel de poliacrilamida al 12% en presencia de SDS como
agente desnaturalizante.

Clónale v expresión hetéróloqa. 4.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
4.3.1. Síntesis del gen por PCR,
Las secuencias de restricción de las enzimas A/de I y BamH I podrían ser

insertadas en el extremo 5' del oligonucleotide, como ocurre con el oligo
reverso ("IDH-REV"), o en una zona interna del oligonucleotide, como ocurre
con el oligo directo ("IDH-FOR") (Connaris y col., 1999). Por lo general, en este
último caso, las secuencias de restricción no se emparejan con su homólogo en
el gen, quedando una zona de varias bases desapareadas en el segmento de
annealing, de forma que cuanta más separación exista entre la secuencia de
restricción y el extremo 3' de la secuencia del oligonucleótido se obtendrán
mejores resultados en el segmento de elongación. Según esto, el lugar óptimo
para localizar la secuencia de restricción sería el extremo 5' del oligo, pero
autores como Connaris y col. (1999) indican que la localización de la secuencia
de restricción en el centro del oligonucleótido permite al investigador eliminar
los nucleotides exteriores a la secuencia de restricción una vez sintetizado el
producto, evitando un paso previo de clonaje como se verá más adelante.
La localización de las secuencias de restricción también se ve afectada

por las estructuras secundarias que pueden formar los dos oligonucleotides
entre sí, como pueden ser dímeros, o con ellos mismos, como por ejemplo
bucles. Este tipo de análisis sobre los oligos se realizó con la ayuda de los
programas informáticos "Net Primer" y "Oligo Calculator", ambos disponibles en
Internet.
Otro factor limitante en el diseño de oligonucleótidos es la temperatura

de annealing. La temperatura a la que funden los oligos con la hebra de DNA
molde ha de ser la misma, o diferir en pocos grados, entre los dos oligos. En
este caso, las temperaturas obtenidas fueron 50.9°C y 51 °C, por lo que la
temperatura a la que se realizó el annealing fue 50°C.
Una vez obtenidos los oligos se procedió a la amplificación del gen. Para
ello se podría utilizar como molde DNA genómico de Haloferax volcanii o el
89

Clónale v expresión heteróloqa. 4.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
clon de fago 1 (Clon9=IDH) a partir del cual se obtuvo la secuencia completa del
gen.
Se probaron ambos DNAs como molde en la amplificación del gen,

obteniéndose idénticos resultados en cada uno de los casos. Al final se optó
por DNA genómico ya que éste es más fácil de obtener que el DNA viral
(Figuras 23 y 24).
12 3 4 5
1500pb
eOOpb
FIGURA 23: Electroforesis en ge! de agarosa al 1.5% de la reacción de

amplificación del gen que codifica a isocitrato deshidrogenasa, utilizando DNA vira!
como DNA molde: marcadores de DNA de 100 pb (1); reacciones de amplificación con
1.5 |u.g de DNA (3 y 4); reacciones de amplificación con 1 |ug de DNA (2 y 5); control
negativo de la reacción (6).
90

FIGURA 24: Electroforesis en gel de agarosa al 1.5% de la reacción de

amplificación del gen que codifica a isocitrato deshidrogenasa, utilizando DNA
genómico de Haloferax volcanii como DNA molde, y comparando reacciones idénticas
con y sin DMSO: marcadores de DNA de 100 pb (1); reacción de amplificación con 1
|u.g de DNA sin DMSO (2); y con DMSO (3); reacción de amplificación con 1.5 )a,g de
DNA y con DMSO (4); control negativo de la reacción con DMSO (5).
En la mezcla de reacción se observan diferencias con respecto a la que

se utilizó en el apartado 3.2.1, principalmente en lo que concierne a las
concentraciones de DNA y oiigos y a la presencia de DMSO. Las cantidades de
los oiigos y DNA se aumentaron en esta ocasión debido a que se obtenían
mejores resultados.
El DMSO se añadió a la muestra con el fin de aumentar la cantidad de

producto obtenido. El efecto que produce ei DMSO en la reacción de
amplificación es impedir la formación de estructuras secundarias en la hebra de
DNA molde durante la fase de elongación de la hebra sintetizada.
El DMSO, por otro lado, produce un efecto negativo en la reacción de

amplificación, ya que a elevadas concentraciones de DMSO se inhibe la
actividad de la DNA polimerasa y, por lo tanto, la reacción de amplificación
(Shen y Hohn, 1992). Por este motivo se ensayaron diferentes concentraciones
de DMSO en la mezcla de reacción, con el fin de optimizar el proceso y
encontrar la concentración de este compuesto a la que se produce mayor

Clonaie v expresión heteróloaa. 4.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
amplificación sin inhibición de la DNA polimerasa. Esta concentración fue del

1.2% (v/v).
La secuencia de amplificación por PCR del gen es la misma que se

utilizó para amplificar el producto inicial del apartado 3.2.1, con la salvedad de
un último segmento de 72 °C, 7 minutos. Este segmento se añadió a la
secuencia de amplificación ya que el gen obtenido se clonaría en el vector
pCR® 2.1 del kit "TA Cloning" de Invitrogen. Durante este segmento se produce
la adición de colas de adenina a los extremos 3' del producto generado,
obteniéndose extremos cohesivos con el vector de clonaje, y se finalizan los
productos que pudieran quedar inacabados (Original TA Cloning® kit).
4.3.2. Obtención del clon de ICDH.
• Clonaje del producto de PCR en el vector pCR® 2.1.
Para el clonaje del producto de PCR en el vector pCR® 2.1 se siguió el

protocolo que recomienda su casa comercial. En primer lugar se estimó la
concentración de DNA necesaria en la reacción de ligación. La concentración
del producto de PCR se calculó espectrofotométricamente y, como es bien
sabido, el valor obtenido por este método está sobreestimado, y más teniendo
en cuenta que en la reacción de amplificación existen, entre otras cosas,
nucleotides libres que pueden dar interferencias en el cálculo de concentración.
Para evitar esto se podría purificar la muestra con kits destinados a este fin,
pero se comprobó que la eficiencia de la ligación disminuía, y ya que los
reactivos presentes en la reacción de amplificación no interferían, se optó por
no purificar la muestra. La concentración del producto de PCR se estimó en
104.5 ng/|.il, lo que implicó hacer una dilución de 1:10 y coger
aproximadamente 1.7 \x\ de la dilución para obtener los 16.3 ng teóricos
necesarios que sé habían calculado.
92

Clónale v expresión heteróloaa. 4.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
El resultado de la reacción de ligación no se puede comprobar

electroforéticamente, ya que la cantidad de plásmido es insuficiente para que
se pueda ver; así que una vez había concluido la ligación se pasó directamente
a la transformación de las células competentes Novablue de E. coH.
• Transformación de células Novablue con la molécula recombinante,

aislamiento del plásmido y electroforesis en gel de agarosa.
La cepa Novablue de E. coli se transformó físico-químicamente con el

clon obtenido en el paso anterior. Se utilizó esta cepa y no la suministrada en el
kit de TA Cloning, la INVaF', debido a que las células del kit presentaban
problemas de mutaciones no deseadas en la secuencia. Este problema se
evitaba con la utilización de las "Novablue Competent Cells", de Novagen.
En este paso se seleccionaron los clones por diferente coloración de las

colonias, azul correspondía a los clones negativos y blanco a los positivos. Se
aislaron seis colonias blancas de un porcentaje inicial elevado obtenido en las
placas, y se crecieron en un medio LB líquido durante toda la noche.
En la electroforesis de la Figura 25 se puede observar el resultado

obtenido del aislamiento y purificación de los plásmidos seleccionados. Como
se puede apreciar, aparentemente, las calles de la 4 a la 7 contenían plásmido
con inserto, mientras que las dos primeras no.
93

FIGURA 25: Electroforesis en gel de agarosa al 1% de los plásmidos aislados:

patrones de tamaño de DNA (Marker III) (1); plásmidos purificados (2 a 7); plásmido
sin inserto (8).
En ocasiones fue necesario digerir los plásmidos obtenidos para

comprobar que realmente contenían el inserto deseado. Para ello caben dos
posibilidades, digerir el plásmido con una sola enzima para linealizarlo, o
digerirlo con dos enzimas para comprobar que se obtiene, por una parte, el
vector lineal y por otra el inserto. En este caso se probaron dos plásmidos, el
que aparece a mayor altura en e! gei anterior (calle 4) y uno de los que
aparecen a igual altura entre varios (calle 7), El resultado de la digestión se
puede obsen/ar en la Figura 26.
FIGURA 26: Electroforesis en gel de agarosa al 1% de los plásmidos aislados:

patrones de tamaño de DNA (Marker III) (1); plásmido de la calle 4 de la figura anterior
digerido con una única enzima (2); plásmido de la calle 7 de la figura anterior, digerido

con dos enzimas (3); plásmido de la calle 4 de la figura anterior, digerido con dos
enzimas (4); plásmido de la calle 4 de la figura anterior, no digerido (5),
Se puede observar cómo el plásmido qué contenía el inserto aparece

más alto en la Figura 25 que el que no lo contenía. Sin embargo, al linealizar, la
diferencia entre plásmidos con y sin inserto apenas se aprecia (calles 2 y 3,
Fig. 26), siendo conveniente digerir el vector con dos enzimas para observar el
inserto.
• Digestión de la molécula recombinante y del vector pET-3a con las

enzimas de restricción A/de I y BamH I.
La digestión de la molécula recombinante con las enzimas de restricción

Nde I y BamH I dio como resultado un fragmento de 3900 pb correspondiente
al vector pCR® 2.1, y otro fragmento de 1250 pb que coincidía con el gen que
codifica a Isocitrato deshidrogenasa de Hfx. volcanii, incluidos los pocos
nucleotides correspondientes a los oligos internos a la secuencia de restricción.
En la secuencia del vector pCR® 2.1 existen muchos sitios de restricción

para muchas enzimas (Figura 27), entre ellas BamH 1; de forma que la
digestión de la molécula recombinante tuvo que diseñarse meticulosamente.
Para ello se utilizaron las enzimas de forma secuencial; en primer lugar Nde I,
ya que la eficiencia de corte es menor y que al actuar primero se obtenía libre
el extremo 5' del gen. En segundo lugar se digirió con BamH I, de corte más
frecuente y con mayor eficiencia de corte. En la secuencia del vector existe un
sitio de corte para esta enzima a 39 pb del lugar de inserción del producto de
PCR. Dicha inserción no se produce de forma direccional en el vector, de forma
que si se cortase en primer lugar con esta enzima se podrían dar las siguientes
posibilidades:
- Un fragmento de 39 pb cortado en ambos extremos con BamH I.

- Un fragmento de 1300 pb aproximadamente cortado en ambos
extremos con BamH 1. Este fragmento se correspondería con el gen
de isocitrato deshidrogenasa y el fragmento del vector de 39 pb.
95

Clonaje y expresión heteróloga. 4.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
- Un fragmento de 1250 pb aproximadamente cortado en un extremo

con BamH I y en otro extremo con A/de I. Éste es el fragmento que
interesa.
El inconveniente es que, en un ge! de electroforesis, no es posible

diferenciar entre tamaños tan aproximados, con lo que el fragmento de 1300 pb
podría interferir en la reacción de ligación, se realiza por tanto el corte
secuencial del gen.
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TCA C T C A'H: ATA A l íiTTA AÍST OKL o o a C A Ú L A A AAT L TT í •3:A LT'S A C L LTT T T G
FIGURA 27: Vector pCR® 2.1 del kit de clonaje de productos de PCR "Original
TA Cloning" de Invitrogen. En la figura se observan todas las secuencias de restricción
para las endonucleasas en el vector.
E! vector pET-3a se digirió con las mismas enzimas de restricción que la

molécula recombinante, generándose extremos cohesivos con el gen que
codifica a isocitrato deshidrogenasa de Hfx. volcanii, de forma que se pudiera
96

insertar direccionaimente. El resultado de las digestiones se observó mediante

electroforesis en ge! de agarosa al 1% (Figura 28).
21226
5148
3530
2027
1375
947
564
FIGURA 28: Electroforesis en gel de agarosa al 1%: patrones de tamaño de

DNA (Marker III) (1); plásmido de la calle 4 de la Figura 25 digerido con una única
enzima (2); vector de expresión pET-3a digerido con Nde I y BamH I (3); plásmido de
la calle 4 de la Figura 25 digerido con Nde I y BamH I (4).
• Clonaje del gen que codifica a isocitrato deshidrogenasa de Haloferax

volcanii en el vector pET-3a y transformación de las células Novablue de E.coli.
La proporción de inserto y vector para su ligación fue de 3:1, estimada

por intensidad en la electroforesis y por medidas espectrofotométricas. El
resultado de la ligación, al igual que en casos anteriores, no se puede observar
directamente y es necesario transformar células de clonaje para aislar la
molécula recombinante y comprobar la integridad del vector. Además, es
necesario clonar inicialmente la molécula recombinante en células
hospedadoras que no contengan el gen de la T7 RNA polimerasa, eliminando
así la inestabilidad del plásmido debida a la producción de proteínas
potencialmente tóxicas en las células hospedadoras. Por ello se transformó la
cepa Novablue de E. coli.
A partir de las células transformadas, crecidas en medio líquido, se

purificaron los plásmidos y se comprobó el resultado mediante electroforesis en
gel de agarosa, como se puede observar en la Figura 29.
97

12 3 4 5 6 7 8
FIGURA 29: Electroforesls en gel de agarosa al 1% de los plásmidos aislados:

plásmido sin inserto (4); el resto de las calles contienen plásmidos con inserto.
e Transformación de E. coli BL21(DE3) con el plásmido recombinante y

ensayo de expresión de la proteína recombinante.
Estas células vienen preparadas para la transformación con el vector

correspondiente, en este caso el que se aisló de la cepa Novablue de E. coli,
de forma que ai transformar con plásmido aislado la eficiencia de la
transformación fue superior a la que se obtendría si se hubiera transformado
con el producto resultante de la ligación entre vector e inserto.
La selección de las colonias positivas se llevó a cabo por la resistencia a

ampicilina que confiere el vector a las células transformadas, ya que no
presentan diferente coloración debido a que el vector, como se ha mencionado
con anterioridad, no posee el gen que codifica a p-galactosidasa. Aún así, no
todas las colonias que poseen el vector presentan expresión de la proteína
recombinante, en ocasiones algunas de las colonias seleccionadas no
presentaban la típica banda de sobreexpresión de la proteína recombinante,
esto implicaba que debía hacerse otra selección de los clones positivos.
Después de transformar las células BL21(DE3), y dejar crecer las

colonias durante la noche, se requería un método para determinar los clones
positivos con la presencia del vector y para la sobreexpresión de la proteína
recombinante; este método es el ensayo de expresión de la proteína.
98

Clonaje y expresión heteróloga. 4.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
Para ello se aislaron un número de clones estadísticamente

representativo de cada placa, se crecieron en medio LB liquido con ampicilina y
posteriormente se indujeron con IPTG, se realizó un extracto de proteína total y
se observó el resultado mediante SDS-PAGE al 12%, como se puede ver en la
Figura 30.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
ICDH
«Ü
FIGURA 30: SDS-PAGE del ensayo de expresión de la proteína recombinante.

Isocitrato deshidrogenasa nativa aislada de Hfx. volcanii (1); extracto de proteína total
de las colonias analizadas (2 a 10).
Se comprobó que todas las colonias analizadas en este caso

presentaban sobreexpresión de la proteína recombinante, y que la banda de
expresión presentaba el mismo tamaño que la proteína nativa de Hfx. volcanii.
Para continuar con el trabajo se seleccionó una de estas colonias.
• Ensayo de estabilidad del plásmido.
Con la colonia seleccionada se hizo el ensayo de estabilidad del

plásmido. Para ello se prepararon diluciones del cultivo y se sembraron en
distintas placas como se ha explicado en el apartado 4.2.3. Los resultados que
implicaban una buena estabilidad del vector en el interior de las células eran los
siguientes:
99

- En la placa de LB debían crecer todas las colonias.

- En la placa de LB con ampicilina, aquellas que poseían el vector.
- En la placa de LB con ampicilina e IPTG sólo crecerían mutantes que
contuvieran el plásmido pero hubieran perdido la capacidad de expresar el gen.
- En la placa de LB con IPTG las que hubieran perdido el plásmido.
Resumiendo, en un cultivo típico, todas las células crecerían en

ausencia de aditivos y en presencia de ampicilina, menos de un 2% crecerían
en las placas con IPTG, y menos de un 0.01% lo harían en presencia de IPTG
y ampicilina (pET System Manual, 2000).
Estos resultados fueron los que se obtuvieron para la colonia

seleccionada, comprobando que el vector era estable en las células utilizadas.
4.3.3. Expresión y purificación de ICDH recombinante.
La expresión de proteínas en organismos mesófilos, y de tiempos de

generación cortos como £. coli, es un método rápido y sencillo de obtener
grandes cantidades de proteína que no se obtendrían si se utilizasen los
protocolos de purificación de proteínas convencionales a partir del organismo
de procedencia. Aún así presenta ciertos inconvenientes que es necesario
eliminar para que el método en sí sea eficiente; entre ellos está el plegamiento
de la proteína en el caso en que la proteína aparezca como fracción insoluble
en forma de cuerpos de inclusión. Como se ha comentado en la introducción
4.1.3., se ha visto que durante el proceso de plegamiento a la forma nativa se
pueden formar intermediarios que aborten dicho plegamiento, si esto sucediese
se obtendría mucho menos rendimiento en la expresión, por lo que en
determinados casos no sería un proceso rentable. La forma de evitar estas
estructuras abortivas es optimizando las condiciones de plegamiento de la
enzima "/n vitro". Esto implica variar todos aquellos parámetros que puedan
afectar al plegamiento, así como a la estabilidad de la enzima una vez plegada.
Estos parámetros son característicos de cada enzima, por lo que los datos
publicados con anterioridad para enzimas de organismos similares entre si
pueden o no corresponderse con los que se requerirán para el plegamiento de
100

la enzinna en cuestión. Tal es el caso, que las enzimas dihidrolipoamida

deshidrogenasa y citrate sintasa de Hfx. volcanii (Connaris y col, 1999) y
dihidrofolato reductase (Blecher y col, 1993) y en nuestro caso, isocitrato
deshidrogensasa de dicho organismo requieren para el plegamiento
condiciones completamente distintas, y debería esperarse que al pertenecer al
mismo organismo las condiciones se parecieran en algún paso.
En la sobreexpresión de genes, E. coli es el organismo más utilizado

hasta el momento, tanto para la expresión de proteínas directamente o como
paso previo a la transformación en otros organismos que presentan mayor
dificultad. Ejemplos de ambos casos son la sobreexpresión proteica llevada a
cabo por autores como Connaris y col. (1999), Pire y col. (2001), y la utilización
de la bacteria E. coli como fase previa a la transformación de plantas con
AgrQbacteríum tumefaciens, en concreto el clonaje y la amplificación del vector
iv que contiene el T-DNA (Cerdán y col., 1997), o como fase previa a la
transforniación de halófilos propuesta por Dyall-Smith (2001).
Empleando E. coli como hospedador de expresión y los diferentes

vectores que facilitan las casas comerciales para ello, se han expresado
proteínas en el citoplasma bacteriano, el espacio periplásmico o incluso se han
encontrado proteínas que han sido excretadas al medio extracelular (Bass y
Yang, 1997).
Hay muy pocas proteínas halofílicas expresadas en organismos

mesófilos como E. coli, ya que las enzimas pertenecientes a organismos
halófilos requieren la presencia de elevadas concentraciones de sal para
mostrar actividad, y en algunos casos la eliminación de la sal da como
resultado una inactivación irreversible de la proteína (Connaris y col., 1999).
101

Clónale y expresión heteróloga. 4.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
• Aisianniento y análisis de las fracciones aisladas a partir del cultivo de

la colonia seleccionada.
Una vez que se obtuvieron todas las fracciones se analizaron mediante

SDS-PAGE. El aislamiento de las fracciones se realizó tanto para el cultivo
inducido con IPTG como para el no inducido.
Las muestras analizadas en SDS-PAGE mostraron que se obtenía

expresión de la proteina en la fracción insoluble del cultivo, no obteniéndose
ninguna banda de expresión en el resto de las fracciones (Figura 31). A su vez
se observó que se producía expresión en el cultivo que no se había inducido
con IPTG, en la misma fracción y a niveles comparables con el del cultivo
inducido. Por este motivo se decidió preparar un cultivo de las células de
expresión transformadas con el mismo plásmido, pero sin el inserto del gen que
codifica a isocitrato deshidrogenasa de Hfx. volcanii, para utilizarlo como
control negativo (Figura 31).
102

FIGURA 31: Análisis de las fracciones inducidas a SyC y a 25 °C.

Calles 1 y 9: Patrones de peso molecular
Calles 2 y 10: Isocitrato deshidrogenasa nativa purificada
Calles 3 y 4: Fracciones solubles de la inducción a 37 y 25 °C respectivamente,
del cultivo que contiene el plásmido sin inserto
Calles 5 y 6: Fracciones solubles de la inducción a 37 y 25 °C respectivamente,
del cultivo que contiene el plásmido con inserto
Calles 7 y 8: Fracciones solubles a 37 y 25 °C respectivamente, del cultivo que
contiene plásmido con inserto sin inducir
Calles 11 y 12: Fracciones insolubles de la inducción a 37 y 25 °C
respectivamente, del cultivo que contiene el plásmido sin inserto
Calles 13 y 14: Fracciones insolubles de la inducción a 37 y 25 °C
respectivamente, del cultivo que contiene el plásmido con inserto
Calles 15 y 16: Fracciones insolubles a 37 y 25 °C respectivamente, del cultivo
que contiene el plásmido con inserto sin inducir

Clónale v expresión heteróloga. 4.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
• Solubilización de los cuerpos de inclusión.
Una vez comprobado que la sobreexpresión de la proteína recombinante

se producía en la fracción insoluble se procedió al tratamiento de los cuerpos
de inclusión y posterior plegamiento de la proteína. En un primer término se
trató de solubilizar la proteína en el interior celular durante el proceso de
crecimiento e inducción; para ello se creció un cultivo a 25 °C, ya que de esta
forma es posible, en determinados casos, dirigir la expresión proteica a la
fracción soluble. En este caso no fue así, ya que la proteína se continuaba
encontrando en la fracción insoluble (Figura 31).
La solubilización de los cuerpos de inclusión se llevó a cabo siguiendo el

procedimiento de Connaris y col. (1999), donde se utiliza urea 8 M como
agente solubilizante. Para la solubilización de los cuerpos de inclusión se
probaron diferentes agentes con el fin de encontrar aquel que proporcionara
mejores resultados. En un primer término se probó con SDS al 1% y
calentando a 70°C ("pET System Manual", Novagen, 2000); mediante este
proceso se conseguía solubilizar los cuerpos de inclusión, pero después era
imposible replegar la enzima ya que estaba expuesta a la acción del detergente
y había sufrido un choque térmico a elevadas temperaturas. El segundo agente
utilizado fue el hidrocloruro de guanidinio 6 M, recuperándose actividad en la
muestra, pero siempre se obtenían peores resultados que con urea, y la curva
de actividad no presentaba la misma progresión ascendente, sino
fluctuaciones; por lo tanto, se optó por la utilización de urea 8 M como agente
solubilizante.
• Renaturalización de la proteína recombinante.
Para la renaturalización de la proteína recombinante se realizaron

numerosos ensayos con el fin de encontrar las condiciones óptimas de
plegamiento. Dichos ensayos se resumen a continuación y permiten dilucidar el
proceso final realizado.
104

Clónale v expresión heteróloga. 4.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
- Renaturalización por adición rápida o lenta de la proteína sobre el

tampon de renaturalización.
En este caso los resultados obtenidos fueron equiparables, por lo que se
optó por la adición rápida de la muestra.
- Renaturalización a varias temperaturas de ensayo.

Se probaron 3 temperaturas distintas, a 8 °C, a temperatura ambiente y
a 40 °C. Se observó que a 8 °C la proteína se plegaba, pero durante el proceso
se producían oscilaciones en las medidas de actividad y estas eran muy bajas.
A 40 °C la proteína no recuperaba actividad, y a temperatura ambiente no sólo
recuperaba actividad sino que además el incremento de unidades enzimáticas
en función del tiempo presentaba la curva típica exponencial.
Temperaturas de plegamiento
•Í5
-(O
plegamiento a 8 "C
E plegamiento a TA
•§3 plegamiento a 40 °C
0)
TJ
:E
t3
te-I
O 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
Tiempo (min.)
FIGURA 32: Plegamiento de la enzima a varias temperaturas de ensayo.
- Adición de DTT al tampon de solubilización.

Se realizaron dos ensayos con dos cantidades diferentes de DTT en el
tampon de solubilización, a concentración de 50 mM, y sin DTT. Cuando no
había DTT no se producía plegamiento de la proteína, por lo que se determinó
que el ambiente reductor que genera el DTT es necesario para el plegamiento
de la enzima.
105

Clonaie v expresión heteróloaa. 4.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
- Concentración de MgCb en el tampon de renaturalización-

Se probaron cuatro concentraciones de MgCb en el tampon de
renaturalización, O mM, 2.5 mM, 10 mM y 20 mM. En este caso no se
encontraron resultados claros sobre si era o no necesario el magnesio para el
correcto plegamiento de la enzima, ya que se recuperaba actividad en todos los
casos y esta era aproximadamente del mismo orden; pero estudios posteriores
revelaron que el magnesio era necesario para la estabilidad de la enzima una
vez plegada. De esta forma se optó por incluir MgCb 10 mM (concentración
utilizada para la enzima nativa) en el tampon de renaturalización.
- Efecto del pH en el correcto plegamiento de la enzima.

Para determinar el efecto del pH en el plegamiento de la enzima se
prepararon tampones de los siguientes pHs: 6.5, 7.0, 7.4, 8.0, 8.5. Se
obtuvieron resultados aproximados para los pHs entre 7.0 y 8.0, pero siempre
se obtenía una mejor renaturalización cuando el tampon era de pH 8.0.
- Efecto de la concentración de sal y de la naturaleza de la sal presente

en el tampon de renaturalización.
Se probaron dos sales diferentes, KCI y NaCI, y las concentraciones
utilizadas fueron: 0.5, 2.0, 3.0 y 4.0 M. A las dos concentraciones más bajas de
sal el incremento de actividad apenas fue apreciable, pero en el caso de las
concentraciones de 3.0 y 4.0 M de sal se observó un rápido incremento de la
actividad registrada, aunque los valores obtenidos para el NaCI fueron un poco
superiores a los obtenidos para el KCI. A concentraciones de 4 M se obtenía
más actividad que a concentraciones de 3 M, pero tal y como transcurría el
tiempo estos valores se aproximaban hasta llegar a coincidir. Se optó por
utilizar la concentración de 3 M de NaCI para realizar la renaturalización debido
a que esta concentración de sal favorecía la estabilidad de la enzima, aunque
se debiese esperar más tiempo para obtener la proteína plegada por completo.
106

- Efecto de la concentración de proteína durante el proceso de

plegamiento.
Según Jaenicke y Seckier (1997), el correcto plegamiento de una enzima
recombinante está claramente afectado por la concentración de proteína que
esté presente en solución. Este autor postula que a elevadas concentraciones
de proteína se inhibe el plegamiento por la formación de agregados que
abortan el proceso de renaturalización hasta la proteína nativa. Además, esta
concentración óptima varía en función de la proteína que se trate de plegar. Por
este motivo se prepararon diferentes diluciones de los cuerpos de inclusión en
el tampon de renaturalización con el fin de determinar la concentración óptima
de proteína para el correcto plegamiento de isocitrato deshidrogenasa de
Haloferax volcanii. Se prepararon diluciones a concentraciones de 1, 10, 15,
20, 25 y 45 i^g/ml. Se comprobó que la isocitrato deshidrogenasa de Haloferax
volcanii se pliega y recupera actividad cuando la concentración de proteína en
el medio es de 20 ¡ag/ml.
• Purificación de la proteína recombinante.
Respecto a la purificación de la enzima recombinante, el método

utilizado fue una aproximación al desarrollado en la purificación de glucosa
deshidrogensa de Hfx. mediterranei (Pire y col., 2001) el cual se basa én una
precipitación de proteína con 2.5 IVl de sulfato amónico y posterior
cromatografía en DEAE celulosa. Este es un método rápido y permite obtener
la enzima pura a elevada concentración. Además, éste es un método utilizado
con gran cantidad de enzimas halofílicas, ya que a esta concentración de
sulfato amónico no precipitan permaneciendo activas durante la purificación
(Mevarech y col., 1977; Fitt y Baddoo, 1979; Ferré y col., 1996; Marhuenda
Egeaycol., 2001).
a) Precipitación previa.
La fase de plegamiento en sí puede considerarse como un paso de
purificación ya que, a tan elevadas concentraciones de NaCI, gran parte de las
proteínas de E. coli precipitan, puesto que previamente habían quedado
107

Clonaie y expresión heteróloqa. 4.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
adheridas a los cuerpos de inclusión durante el tratamiento con lisozima y tritón

X-100 en el aislamiento de las fracciones, mientras que la proteína expresada
permanece en solución. Debido a esto fue necesario realizar una filtración de la
muestra a través de papel de filtro para clarificar la solución.
La purificación de la proteína, que se describe paso a paso en el

apartado 4.2.3., dio como resultado la tabla que aparece a continuación (Tabla
17a), donde se puede observar el rendimiento obtenido y el valor de la
actividad específica de la proteína recombinante. También se presenta la tabla
de purificación obtenida para la enzima nativa de Haloferax volcanii (Camacho
y col., 1995) (Tabla 17b). El rendimiento final del proceso así como la actividad
específica obtenidos resultaron ser mejores en el procedimiento utilizado para
la proteína recombinante, con la ventaja de emplear menos etapas de
purificación en las que la proteína pudiera perder su estructura nativa o
inactivarse parcialmente.
Tabla 17a: Purificación de la enzima recombinante isocitrato deshidrogenasa

de Haloferax volcanii.
Actividad Rendi-
Pasos de Actividad Proteína específica miento Purificación
purificación (U) (mg) (U/mg) (%) (-veces)
Extracto celular (A) 345 92.5 3.7 100 1

Ultrafiltración 321 24.6 13.0 93 3.5
DEAE-Cellulosa 192 8.3 23.5 56 11.1
Diálisis 197 2.6 77.0 57 36
Tabla 17b: Purificación de la enzima nativa isocitrato deshidrogenasa de

Haloferax volcanii.
Actividad Rendi-
Pasos de Actividad Proteína específica miento Purificación
purificación (U) (mg) (U/mg) (%) (-veces)
Extracto celular (B) 11.6 325 0.04 100 1

Blue sepharosa 4.1 1.50 2.70 35 68
Mono Q 1.0 0.10 10.0 9 250
Superdex-200 0.4 0.01 40.0 3 1000
108

Clónale y expresión heteróloga. 4.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
Conno se puede observar conriparando las dos tablas, las unidades

totales obtenidas en ambos casos difieren considerablemente. En el primero de
ellos (A), gracias a la expresión heteróloga se obtiene 30 veces más cantidad
de ICDH que en extractos crudos a partir de! organismo cultivado (B), siempre
utilizando los mismos volúmenes de partida. También se puede observar como
la cantidad de proteína total obtenida en la sobreexpresión (A) es mucho menor
que en el cultivo original (B). Esto es debido a que en la purificación (Tabla
17a) se considera como extracto crudo la fracción insoluble, que es donde se
encuentra la protelna recomblnante. En dicha fracción aparece
mayoritariamente la isocitrato deshidrogenasa acompañada de desechos
celulares y algunas proteínas contaminantes, mientras que en el extracto crudo
(B) nos encontramos con todas las proteínas de la fracción citoplásmica de
Haloferax volcanii. Estos dos hechos propician que la actividad específica del
extracto crudo (A) sea 90 veces superior a la obtenida en el extracto crudo (B).
A su vez, la baja cantidad de proteínas totales del extracto (A) respecto al de la
nativa, da lugar a que el factor de purificación en la enzima recomblnante sea
menor que en la nativa, ya que se parte de una cantidad de proteína inicial muy
inferior.
Posteriormente, se realizó una electroforesis de cada una de las etapas

de purificación de la enzima recombinante (Figura 33), comprobándose que en
el último paso la proteína se encontraba pura a homogeneidad.
1 2 3 4 5 FIGURA 33: Electroforesis en

^^Q :-ir^^'' SDS-PAGE al 12% de las diferentes
66,2 — etapas de la purificación de la proteína
45
recombinante: Patrones de tamaño
S (kDa) (1); Isocitrato deshidrogenasa
35
nativa (2); Fracción Insoluble (cuerpos
25 -«» de inclusión) (3); Ultrafiltración (4);
Diálisis (5).
18,4
109

5. CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA Y
FÍSICO-QUÍMICA DE LA ENZIMA
RECOMBINANTE.

Estudios físico-quínnicos. 5.1. INTRODUCCIÓN.
5.1. INTRODUCCIÓN.
5.1.1. Caracterización bioquímica.
En las células se producen un gran número de reacciones redox

catalizadas por enzimas que utilizan como coenzima NAD* o NADP'^. Algunas
de estas enzimas pueden funcionar con ambos coenzimas, actuando en este
caso en diferentes aspectos del metabolismo.
En general las deshidrogenasas que utilizan NAD* como coenzima, son

enzimas catabólicas que producen energía e intervienen principalmente en la
respiración, mientras que las que utilizan NADP* participan principalmente en la
transferencia de electrones desde los intermediarios del catabolismo hasta los
intermediarios de la biosíntesis (Sund, 1968).
Estas enzimas catalizan reacciones del tipo:
Sustrato reducido + NAD(P)* <^ Sustrato oxidado + NAD(P)H +H*
Las formas oxidadas del NAD* y del NADP* absorben luz en la zona
ultravioleta, cerca de los 260 nm, que es el máximo de absorción del anillo de
adenina.
Cuando estos coenzimas se reducen, aparece un nuevo máximo de

absorción a 340 nm; este incremento refleja la reducción de la porción de
nicotinamida del anillo aromático de piridina. La aparición o desaparición de la
absorción a 340 nm se emplea para seguir el curso de las reacciones
catalizadas por las deshidrogenasas piridín-dependientes.
111

Estudios físico-químicos. 5.1. INTRODUCCIÓN.
5.1.2. Propiêdades físico-químicas.
Los estudios físico-químicos de la estabilidad de la enzima se llevaron a

cabo en colaboración con el Laboratorio de Biofísica Molecular del instituto de
Biología Estructural CEA-CNRS-UJF de Grenoble, Francia.
Los métodos empleados en este trabajo fueron: espectrofotometría

ultravioleta-visible, espectroscopia de fluorescencia, dicroísmo circular y
ultracentrifugación analítica. El objetivo principal era determinar el efecto que
producen las bajas concentraciones de sal en el estado oligomérico de la
enzima, el contenido en estructuras secundarias, la exposición de los residuos
de triptófano al disolvente y la actividad residual. En segundo lugar, determinar
el papel que juegan los cationes y los aniones en la estabilidad de ICDH de
Hfx. volcanii.
- , Estudios de fluorescencia.
Algunas moléculas, una vez absorbida la radiación electromagnética,

son capaces de emitir luz. La fluorescencia es uno de estos fenómenos de
emisión. Su estudio proporciona una valiosa información, tanto cualitativa como
cuantitativa, sobre aspectos estructurales de la molécula responsable, o de su
relación con el medio que la rodea. En las medidas de fluorescencia de
muestras biológicas, el fluoróforo usualmente está en disolución.
En el caso de cadenas polipeptídicas, éstas poseen varios cromóforos

característicos: enlace peptídico, responsable de la absorción de la luz en el
UV lejano (200 nm), y las cadenas laterales de los residuos de fenilalanina,
tirosina y triptófano, cuyas principales bandas de absorción se localizan en la
zona del UV próximo (260-290 nm). De estos cromóforos, sólo los que
absorben en el UV próximo tienen rendimientos cuánticos apreciables (relación
entre el número de fotones emitido por fluorescencia y el número total de
fotones absorbidos), y constituyen los fluoróforos intrínsecos. Los cromóforos
capaces de emitir radiación luminosa fluorescente se denominan fluoróforos.
112

Tabla 18: Características de ios fluoróforos intrínsecos de proteínas.
Trp Tyr Phe

Absorción A, max (nm) 280 274 257
S max (10-^) 5.60 1.40 0.20

Ennisión ^ max (nm) 348 303 282
^F 0.20 0.14 0.04

To (vida media del estado 2.60 3.60 6.40
excitado) (ns)
Sensibilidad £max(|)F(10"^) 11.20 1.96 0.08
En todos los casos en agua a pH 7.
A las longitudes de onda a las cuales el Trp y la Tyr presentan sus

máximos de absorción, la Phe posee un bajo coeficiente de extinción molar
(smax)- Este hecho, junto con su bajo rendimiento cuántico ((J)F), hace que el
espectro de emisión fluorescente de una proteína esté normalmente dominado
por la emisión de sus Tyr y Trp (Doring y col., 1995), en el caso de que los
hubiera.
El máximo de emisión de la tirosina se encuentra a 300-305 nm,

mientras que el del triptófano está muy desplazado hacia el rojo respecto al
anterior, concretamente a 345-350 nm. En una proteína, si contiene varios
fluoróforos y se excita a una longitud de onda a la que absorban ambos, el
espectro de emisión suele estar dominado por el triptófano, debido a que la
sensibilidad del Trp es mayor y los grupos carboxilo y amino del enlace
peptídico producen desactivación de la fluorescencia por tirosinas (García-
Segura y col., 1996).
113

- Ultracentrifugación analítica.
El objetivo de los procesos analíticos de ultracentrifugación es la

determinación de los parámetros moleculares y juzgar el grado de pureza de
una muestra. La instrumentación necesaria no difiere considerablemente de la
requerida en los procesos preparativos. Una ultracentrífuga analítica necesita
los mismos componentes que una preparativa, pero además precisa unos
sistemas de observación. Éstos se incorporan a una ultracentrífuga analítica
porque con ella se estudia lo que sucede a la muestra durante la aplicación del
campo centrífugo. Esto hace que los recipientes para la muestra, llamados
células de centrifugación, sean muy diferentes a los tubos de los procesos
preparativos. Tales recipientes son cilindros en los que hay una perforación,
cuya sección transversal tiene forma de sector circular y dos láminas de
material transparente, generalmente cuarzo. La forma de estas células evita
que haya sedimentación de la muestra en las paredes, pues éstas tienen una
dirección radial respecto al eje de giro y el material transparente permite la
observación de la muestra. Los sistemas de observación permiten determinar
la velocidad de desplazamiento del soluto, bajo la acción del campo centrífugo
(velocidad de sedimentación) mediante la ecuación;
\nX=S(D^t+ K
siendo K una constante de integración (dependiente de la distancia a la que se

encuentra la célula de centrifugación del eje de giro), X e l espacio recorrido por
el soluto, s el coeficiente de sedimentación, co la velocidad angular y t el tiempo
de análisis.
Asimismo, los sistemas de observación permiten conocer la distribución

de concentraciones del soluto en la célula de centrifugación, cuando el sistema
ha alcanzado el equilibrio. Su utilidad radica en que permiten conocer la masa
molecular dej soluto analizado. Así, cuando se ha alcanzado el equilibrio en el
proceso de transporte.
114

Mco^XH^ - 'op)
lnC = +K
2RT
donde"ües el volumen específico parcial, pía densidad del líquido desplazado,

R la constante universal de los gases y T la temperatura absoluta. Una
representación de In C (o lo que es equivalente a In >A ya que absorbancia, A, y
concentración, C, son proporcionales según indica la ley de Lambert-Beer)
frente a X^ permite conocer la masa molecular, M, del soluto estudiado.
La ultracentrifugación analítica también es muy útil en estudios de

asociación de macromoléculas, y para detectar cambios conformacionales que
repercutan en las propiedades hidrodinámicas de una estructura molecular.
Asimismo permiten juzgar la homogeneidad de un soluto. Una muestra
heterogénea daría lugar a diferentes frentes de avance bajo la acción del
campo centrífugo, lo que a su vez se traduciría en varios picos, o varios
cambios de absorción o de índice de refracción, según cual sea el sistema de
observación empleado. Todo ello bajo la perspectiva, siempre, de que sería un
"criterio negativo" de homogeneidad: un comportamiento homogéneo no
permite asegurar que la muestra analizada lo sea (García-Segura y col., 1996).
- Dicroísmo circular.
El dicroísmo circular pertenece a un grupo de técnicas que permiten

elucidar tanto la conformación de las macromoléculas o complejos
macromoleculares en disolución, como las interacciones entre tales
macromoléculas. Aunque con la espectroscopia de absorción puede obtenerse
una gran cantidad de datos útiles de este tipo, todavía aporta más información
el estudio de la absorción de la luz polarizada, es decir, las técnicas de
espectroscopia de la dispersión óptica rotatoria (DOR) y el dicroísmo circular
(DC). Ambas satisfacen los criterios de rapidez y aplicabilidad a las
disoluciones, aunque lo hacen a costa de una complejidad teórica y de un
instrumental ligeramente mayor que en la espectroscopia de absorción. El
dicroísmo circular mide la dependencia, respecto a la longitud de onda, de la
115

absorción diferencial de la luz polarizada circularmente a la derecha y a la

izquierda. Puesto que una gran cantidad de moléculas importantes en biología
disponen de centros ópticamente activos, se comprende que el DC tenga un
amplio campo de aplicaciones (Freifelder, 1991).
Puesto que los espectros de DC de las proteínas y ácidos nucleicos son

consecuencia principalmente de los aminoácidos y nucleotides constituyentes
de sus cadenas, respectivamente, el DC es sumamente útil en los estudios
estructurales de proteínas, ácidos nucleicos y nucleoproteínas.
Para la comprensión de la técnica es necesario describir algunos

conceptos:
ELIPTICIDAD (0): Éste es el ángulo cuya tangente es la razón del eje

menor (b) de la elipse que describe el vector de la luz polarizada respecto al
mayor (a).
REFfRACCIÓN (n): Se produce cuando un rayo de luz atraviesa un

objeto y su vector eléctrico E interacciona con los electrones de los átomos que
componen dicho objeto. Esta interacción tiene el efecto de disminuir la
velocidad de propagación.

ABSORCIÓN: Durante el mismo proceso anteriormente descrito se

produce también la disminución de la amplitud del vector E, la cual viene
descrita por el coeficiente de extinción molar, s.
Tanto n como s dependen de la longitud de onda de una forma tal que
refleja la estructura electrónica y la geometría de las moléculas.
El resultado de estas interacciones, incluso si la luz incidente está

polarizada, suele ser, para muchas sustancias, la refracción y la absorción
simples. Sin embargo, la conducta de ciertas moléculas es sensible al plano de
polarización de la luz incidente. Estas moléculas, o cromóforos, se dice que son
ópticamente activas y se caracterizan por tener distintos índices de refracción y
coeficientes de extinción molar para la luz polarizada circularmente a la
derecha y a la izquierda. Si una molécula es asimétrica, en el sentido de que no
puede superponer sus imágenes especulares, resulta ópticamente activa.
Se puede describir cuantitativamente el ángulo de rotación observado

(ax), expresado en grados, como
_ (180 c/) (,,.„^)

' X
donde d es la longitud del camino recorrido y ni y HD son los índices de

refracción a la izquierda y a la derecha, respectivamente.
Dentro de los márgenes de longitudes de onda que son absorbidas (la

banda de absorción) habrá, para cada longitud de onda, absorción diferencial
de la luz polarizada circularmente a D y a I. La diferencia suele expresarse en
términos de coeficientes de extinción para la luz D y para la I, SD y si; es decir,
Si - 8D = As
donde As se llama dicroísmo circular (DC). Es positivo cuando si - SD > O y

negativo cuando si - SD < 0. Un punto importante es que si una molécula
117

ópticamente activa posee un DC positivo su innagen especular lo tendrá

negativo y exactamente de la misma magnitud. 9 se relaciona con As por la
ecuación,
^=3300A8
Se llama espectro de DC a la curva que representa la dependencia de 6

respecto a la longitud de onda. Para la mayor parte de los trabajos se emplean
las expresiones elipticidad molar y elipticidad residual media,
10dc
donde 6^ es la elipticidad observada en grados, M es el peso molecular residual

medio, d es la longitud del camino recorrido en centímetros y c es la
concentración en g/ml. La longitud de onda correspondiente a la máxima
absorción, Xo, se suele denominar pico de absorción o Xmax- (Freifelder, 1991).
118

Estudios físico-químicos. 5.2. IVIETQDOLOGÍA.
5.2. METODOLOGÍA.
5.2.1. Determinación de ios parámetros cinéticos y termoestabilidad.
• Parámetros cinéticos.
Tras la purificación a homogeneidad de la enzima recombinante, la

determinación de los parámetros cinéticos Km y Vmax se realizó mediante el
estudio de la variación de las velocidades iniciales con diferentes
concentraciones del sustrato de la enzima, el isocitrato, y del coenzima NADP"^.
Los ensayos de velocidades iniciales se efectuaron manteniendo un

sustrato fijo a diferentes concentraciones y variando el otro sustrato en un
rango de concentraciones no saturantes. En todos los ensayos se mantuvo una
concentración fija de Mg^"" 10 mM, EDTA 1 mM y KCI 0.5 M, y las medidas de
actividadxse llevaron a cabo incubando 2 minutos la enzima a 40°C con 0.4 mM
de NADP"^ como sustrato fijo y disparando la reacción con cantidades variables
de D,L-¡socitrato; o bien con cantidades variables de NADP"" y disparando la
reacción con 1mM de D,L-isocitrato como sustrato fijo (Camacho y col., 1995).
Los datos obtenidos se procesaron según la ecuación de velocidades

iniciales propuesta por Cornish-Bowden:
Con esta ecuación se obtiene una familia de rectas secantes en un

mismo punto. Del valor de la pendiente se determina Vmax y del valor de la
ordenada en el origen, o de la abcisa en el origen la Km.
119

Estudios fisico-auimicos. , 5.2. METODOLOGÍA.
• Termoestabilidad.
La termoestabilidad de la enzima se llevó a cabo por incubación de la

enzima, diluida 20 veces en tampon Tris-HCI 20 mM conteniendo EDTA 1 mM,
Mg^* 10 mM y NaCI 3 M a varias temperaturas (60°, 65°, 68°, 70° y 80°C) hasta
la inactivación enzimática. Se extrajeron alícuotas a tiempos conocidos,
rápidamente se enfriaron en hielo y se determinó la actividad residual por el
procedimiento de ensayo estándar.
Con los datos obtenidos se realizó la representación de Arrhenius que

relaciona el logaritmo de la actividad residual frente a la inversa de la
temperatura, dando como resultado la energía de activación del proceso de
inactivación térmica.
log k = log A -
2.3 R T
Donde k es la constante de velocidad de reacción; A es una constante

de la reacción, que representa la frecuencia del paso hacia el lado del
producto; R es la constante de los gases ideales, 8.315 J/mol °K; T es la
temperatura de la reacción en °K; y Ea es la energía de activación que se
quiere determinar.
5.2.2. Estudios de fluorescencia, dicroísmo circular y ultracentrifugación

analítica.
• Estudios de fluorescencia.
Las medidas de fluorescencia se realizaron en un espectrofluorímetro

modelo FR540 de la casa Shimadzu. Las medidas se llevaron a cabo usando
cubetas de 1 cm de paso. El espectro de emisión del Trp se realizó en un rango
desde 280 a 500 nm, tras la excitación a 295 nm. Todos los espectros de
emisión fueron realizados a una velocidad de 40 nm/min. La dependencia de
120

Estudios físico-químicos. 5.2. METODOLOGÍA.
los valores de fluorescencia a 335 nm se expresaron como un porcentaje del

valor encontrado para la enzima mantenida en las concentraciones de sal a
estudio después de la incubación, y corregidos por el valor encontrado a las
distintas concentraciones de sal en el tampon. Se realizaron espectros de
fluorescencia de muestras sin proteína para corregir las interferencias debidas
al ruido de fondo. Para estos experimentos se filtraron todos los tampones
utilizados.
Se realizaron los estudios de desnaturalización de la proteína por

incubación de la misma en distintas concentraciones de sal durante un período
de 24 h. Para ello de preparó un stock de proteína recombinante en tampon
Tris-HCI 20 mM pH 8 conteniendo 4 M de NaCl y concentración de proteína 7.3
mg/ml. Se prepararon diluciones de la enzima 1:200 en el tampon indicado con
distintas concentraciones de NaCl: O, 0.25, 0.50, 0.75, 1, 1.25, 1.50, 1.75, 2,
2.50, 3, 3.50, y 4 M. Se realizaron mediciones a tiempo O y después de 24 h de
incubación a 20°C.
Previo al ensayo de fluorescencia se realizó un ensayo de actividad

residual a las mismas concentraciones de NaCl y durante el mismo período de
incubación. Dicho ensayo se realizó por duplicado; por un lado en la División de
Bioquímica del Departamento de Agroquímica y Bioquímica y por otro lado en
el Laboratorio de Biofísica Molecular de Grenoble.
• Dicroísmo circular.
Se estudió la estabilidad de isocitrato deshidrogenasa de Haloferax

volcanii en función de la concentración de sal en el medio utilizando varias
condiciones de medida con la intención de obtener información estructural de la
enzima. Se realizaron ensayos de disociación enzimática frente al efecto de
aniones y de cationes.
Para las determinaciones de dicroísmo circular se utilizó un

espectropolarímetro Jobin Yvon CD6 con el habitáculo de la muestra
termostatizado. Se tomaron datos en un rango de 190 a 260 nm, a una
121

Estudios físico-químicos. 5.2. METODOLOGÍA.
temperatura de 25 °C, a intervalos de 1 nm y un tiempo de integración de 2

segundos, utilizando para ello células de 0.1 cm.
Se prepararon muestras con concentración de proteína 0.5 mg/ml en

disoluciones de Tris-HCI 50 mM pH 8 y se realizaron los correspondientes
espectros. Para cada espectro se realizó una corrección del blanco con
tampon. Los valores de elipticidad molar a 222 nm se expresaron en
porcentajes respecto al valor encontrado para la enzima mantenida en tampon
con 4 M de NaCI durante 24 h, y corregidos con el valor encontrado para la
enzima incubada en tampon con O M de NaCI durante el mismo período de
tiempo.
• Ultracentrifugación analítica.
Mediante ultracentrifugación analítica se determinó la velocidad de

sedimentación de la enzima recombinante en diferentes concentraciones de
NaCI.
Los experimentos se llevaron a cabo en una ultracentrífuga analítica

Beckman XLA equipada con un sistema de escaneo UV, y utilizando un rotor
de 4 huecos AN-60 Ti con doble eje de 1.20 cm de longitud de trayectoria. Se
tomaron doscientas medidas de absorbancia a 20 °C y 42000 rpm en varias
concentraciones de NaCI, y se analizó por el método de tiempos de derivación
(Philo, 2000). El valor del volumen específico parcial calculado en función de la
composición de aminoácidos de ICDH de Hfx. volcanii fue 0.7316. Las
longitudes de onda se eligieron de acuerdo con las características de la
muestra; los datos obtenidos se corrigieren en función de la densidad y
viscosidad de la muestra, y el cálculo de S2o,w para ICDH se realizó según el
método descrito, para proteínas halofílicas, por autores como Franzetti y col.
(2001) y Solovyova y col. (2001). Sabiendo que el valor del volumen específico
parcial calculado en función de la composición de aminoácidos de ICDH de
/-/fx. \/o/can//fue 0.7316.
122

Estudios físico-químicos. 5.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
5.3.1. Parámetros cinéticos y termoestabilidad.
• Parámetros cinéticos.
La actividad de la enzima nativa de Hfx. volcanii presenta una marcada

dependencia por la concentración de NaCl o KCI en tampon Tris-HCI con EDTA
y Mg^"', presentando máximos de dicha actividad a concentraciones de 0.5 M
de ambas sales (Camacho y col., 1995).
En ausencia de sal, la actividad catalítica fue significativa, entre 50-60%

para NaCl y KCI respectivamente, pero a elevadas concentraciones de sal se
observaba un efecto estimulador del KCI superior al que producía el NaCl.
La enzima recombinante presentó un máximo de actividad a 1 M de

ambas sales y el efecto estimulatorio a elevadas concentraciones de KCI fue
superior al producido por NaCl, con el que este comportamiento era
comparable al que presentaba la enzima nativa (Figura 34).
Las medidas de actividad para calcular los parámetros cinéticos se

realizaron con 0.5 M KCI en el tampon de reacción, para poder comparar con
los resultados que se obtenían con la enzima nativa.
123

FIGURA 34: Efecto de la concentración salina sobre la actividad de ICDH

recombinante. Actividad específica en función de la concentración de sal en el tampon
de reacción.

Por el procedimiento descrito en el apartado anterior se obtuvieron las

gráficas que se presentan a continuación (Figuras 35 y 36):
0,25
• 0.2 mM
• 0.5 mM
• 0.7 mM
• 1.0 mM
0,00
-0,20 -0,10 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40
[NADP*] (mM)
FIGURA 35: Representación de Cornish-Bowden para la obtención de Km y

Vmax para el coenzima NADP"^. En la leyenda aparecen las concentraciones de
isocitrato utilizadas para cada recta.
1,50
• 0.05 mM
• 0.15 mM
• 0.30 mM
• 0.40 mM
-0,50
-0,50 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00
[10] (mM)
FIGURA 36: Representación de Cornish-Bowden para la obtención de K^ y

Vmax para el sustrato isocitrato. En la leyenda aparecen las concentraciones de NADP*
utilizadas para cada recta.
125

Los datos de Km y Vmax obtenidos se expresan en la Tabla 19.
Tabla 19: Valores obtenidos para los parámetros cinéticos de NADP-isocitrato

deshidrogenasa recombinante de Hfx. volcanii.
NADP"*" IC
Km (i^M) Vmax (U/mg) Km (|iM) Vmax (U/mg)
93±2 77 + 11 105±16 63 ± 7
Los estudios cinéticos mostraron también cómo la proteína nativa y la

recombinante presentaban características similares (Tabla 20).
Tabla 20: Parámatros cinéticos comparativos de las enzimas nativas y

recombinante de Hfx. volcanii.
Km (|lM) Vmax (U/mg)

NADP* Isocitrato
Nativa 110±20 130 ± 2 0 68 + 4
Recombinante 93 + 2 105 + 16 77 ±11
Comparando con otras ICDHs NADP-dependientes de otros organismos

pertenecientes a Archaea se observa que existe una gran variedad en cuanto a
afinidades por cada uno de los sustratos y en cuanto a la velocidad máxima de
la reacción (Eguchi y col, 1989; Camacho y col., 1995; Steen y col, 1997; Roy y
Packard, 1998; Steen y col, 2001; Camacho y col, 2002), no encontrando un
determinado rango donde incluir los datos obtenidos por los diferentes autores
(Tabla 21). Este hecho pudiera ser debido a las diferentes condiciones de
purificación y medida de actividad que requiere la misma enzima obtenida de
los distintos organismos.
126

TABLA 21: Valores de los parámetros cinéticos encontrados en la bibliografía

para diferentes organismos (Eguchi y col, 1989 (5); Camacho y col., 1995 (1);
Steen y col., 1997 (4); Roy y Packard, 1998 (3); Camacho y col., 2002 (2);
Karlstronn y col., 2002 (7); Steen y col., 2002 (6)).
Fuente (ref.) Km (i^M) Vmax (U/mg)

NADP IC
Nativa Hfx. volcanii {^) 110±20 130 ± 2 0 68 ± 4
Rec. Hfx. volcanii (2) 93 ± 2 105±16 77 ±10
P. náutica (3) 24 ±1.5 15.2 ±0.3
A. fulgid US (4) 30 118 141
T. ttiermopliilus (5) 6.3 8.8 776
P. furiosus (6) 4400 126
A. pe mix (7) 44.4 200
7. marítima (7) 55.2 334
• Termoestabilidad.
Previamente al ensayo de termoestabilidad se diluyó la enzima hasta

obtener una actividad suficiente para llevar a cabo la experiencia, pero con la
que no se produjese agotamiento durante la realización de las primeras
medidas; ésta fue una dilución 1:20 en el tampon de renaturalización,
obteniéndose actividades del orden de 0.3 U/ml. Hay que señalar también que
la incubación de la enzima se realizó a 3M de NaCI porque es la concentración
de sal requerida para el plegamiento enzimático.
La enzima recombinante es sustancialmente estable a temperaturas

próximas a 60 °C, presentando total inestabilidad a partir de 75 °C. Un
esquema de la vida media de la enzima se muestra a continuación (Tabla 22).
127

TABLA 22: Efecto de la temperatura sobre la estabilidad deja enzima NADP-

ICDH de Hfx. volcanü.
Actividad residual a la temperatura indicada, hasta alcanzar la vida

nnedia de la enzima.
T (min.) 80 °C 75 °C 70 °C 68 °C 65 °C 60 °C
0 100 100 100 100 100 100
2.5 0.6 5 90 100 100 115
5 0 0 77 96 92 110
10 58 86 90 117
15 43 90 93 111
30 22 75 85 117
40 71 81 115
50 65 82 104
60 63 87 105
90 54 84 108
465 50 86
128

Estudios físico-químicos. 5.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La variación de la actividad con el tiempo en función de la temperatura

se puede observar también gráficamente representando el logaritmo del
porcentaje de actividad residual frente al tiempo (Figura 37).
• 80°C
• 75°C
• 70°C
• 68°C
65°C
• ecc
T ¡ 1 ¡ 1 p
O 200 400 600 800 1000 1200 1400
t (min.)
FIGURA 37: Efecto de la termoestabilidad de ICDH reombinante de Hfx.

volcanii. Representación gráfica de la variación del logaritmo de la actividad residual
con el tiempo. En colores aparece cada una de las temperaturas de incubación.
129

Tras hacer la representación de Arrhenius (Figura 38) se calculó la

energía de activación del proceso de inactivación térmica.
1/Tx10' ("K)
FIGURA 38: Representación de Arrhenius del proceso de inactivación de la

ICDH recombinante, a 3M de NaCi.
Tanto la enzima nativa como la recombinante presentaron el mismo

comportamiento, obteniéndose energías de activación para el proceso de
inactivación térmica de 610 y 625 KJ/mol, respectivamente, (Camacho y col.,
1995, 2002), por lo que se pudo concluir que ambas enzimas son igual de
termoestables, en comparación con la ICDH de cerdo, que presentó un valor
de 350 KJ/mol y con la de S. solfataricus, que fue de 550 KJ/mol (Camacho y
col., 1995).
Toda esta caracterización se realizó con el fin de comprobar si la enzima

obtenida por expresión heteróloga y posterior plegamiento presentaba el mismo
comportamiento cinético que la enzima nativa, ya que mediante expresión
heteróloga se obtienen 20 mg de proteína pura por litro de cultivo mientras que
de un extracto enzimático de Hfx. volcaniise obtienen 0.25 mg de proteína pura
por litro de cultivo. Es más, no sólo se ve afectada la cantidad de proteína
producida, sino que el tiempo de producción se ve reducido en dos veces.
130

Por lo tanto con la expresión heteróloga se obtiene. 80 veces más

proteína en la mitad de tiempo.
5.3.2. Efecto de la concentración de sal y de los cationes y aniones en la

estabilidad de ICDH de Hfx. volcanii.
• Estudios de fluorescencia.
Como se ha mencionado en el apartado 5.2.2., previamente a los

ensayos de fluorescencia se determinó el desplegamiento de la enzima en
función de la concentración salina del solvente por medición de la actividad
residual tras un período de incubación de 24 h. Se realizaron diluciones a las
mismas concentraciones de sal que se utilizarían posteriormente en los
estudios de fluorescencia y se representó gráficamente el porcentaje de
proteína plegada (en función de la actividad residual) frente a la concentración
de sai en la que se incubó la proteína durante el período mencionado con
anterioridad (Figura 39). Este ensayo se realizó por duplicado, en la
Universidad de Alicante y en el laboratorio de Grenoble, y se determinaron las
actividades por el procedimiento estándar. Se puede observar que los
resultados obtenidos son muy similares en ambos casos.
131

FIGURA 39: Estabilidad de ICDH de Hfx. volcanii a diferentes concentraciones

de NaCI, durante 24 h de incubación. Estudio realizado en la División de Bioquímica
de Alicante (azul) y en el Laboratorio de Biofísica de Grenoble (negro).
En cuanto a la fluorescencia, se realizaron medidas a las mismas

concentraciones de NaCI que en el caso de la espectrofotometría UV; en este
caso se determinó la desnaturalización de la enzima a las distintas
concentraciones por exposición de los residuos de Trp al medio, como se
detalla en el apartado 5.2, y se obtuvieron los datos que se muestran en la
Tabla 23.

Estudios fisico-quimicos. 5.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
TABLA 23: Datos obtenidos para la longitud de onda de emisión y la intensidad

de fluorescencia, de los espectros correspondientes para la proteína recombinante a
las concentraciones de sal enumeradas. La X excitación fue 295 nm.
•^ emisión (t—Oh)
[NaCI] (M) ^ emisión (t=24n) 1 fluorescencia
0.00 340 9
350 12
0.25 340 3
350 7
0.50 340 9
350 12
0.75 335 6
350 10
1.00 340 8
350 23
1.25 310 1
390 4
1.50 320 3
350 15
1.75 320 3
350 19
2.00 335 14
345 24
2.50 330 3
350 17
3.00 335 6
335 5
3.50 335 8
335 7
4 335 3
335 3
133

Respresentando gráficamente los datos obtenidos para la enzima

mantenida durante 24 h en distintas condiciones (4 M y O M de NaCI, y 4 M de
hidrocloruro de guanidinio) (Figura 40) se observa cómo aparece un máximo de
emisión a la longitud de onda de 335 nm (estado dimérico), mientras que a
concentraciones de sal bajas y en presencia de HCIGdn, se produce una
disminución de la fluorescencia y el pico máximo de emisión se produce a 350
nm debido a la exposición de los Trp al medio.
300 320 340 360 380 400
FIGURA 40: Espectro de fluorescencia obtenido para la enzima recomblnante

incubada a 4 M de NaCI (triángulos), a O M de NaCI y a 4 M de hidrocloruro de
guanidinio (cruces).
• Dicroísmo circular.
Los espectros obtenidos por DC después de incubaciones de la enzima

en distintas concentraciones de sal durante 24 h, se muestran en la Figura 41.
Cuando la proteína se incubó en tampon que contenía 4M de NaCI presentó un
espectro con un pico negativo a 222 nm específico de proteínas plegadas con
134

un alto contenido en hélices a. Después de la incubación de la enzima con 4 M

de hidrodoruro de guanidinio durante 24 h, se observó una pérdida completa
de la estructura secundaria. La muestra incubada a O M de NaCI presenta un
espectro de DC que indica que la proteína se encuentra parcialmente
desnaturalizada, ya que se dilucida una pérdida parcial de la estructura
secundaria con una baja cantidad de estructuras helicoidales, como se intuía
con el espectro de fluorescencia. Los resultados obtenidos para esta
concentración de sal son similares a los que se presentan con 4 M de
hidrodoruro de guanidinio.
FSGURA 4Í: Espectros de dicroísmo circular después de 24 h de incubación a

20 °C para los ensayos a 4 M NaCI (triángulos negros), O M NaCI (triángulos blancos)
y 4 M hidrodoruro de guanidinio (cruces).
Se determinó la actividad residual de las tres muestras de ICDHs de Hfx.

volcanii a las 24 h de incubación, por el método estándar, y se observó que a O
M de NaCI y 4 M de HCIGdn, la enzima era completamente inactiva a
diferencia de la enzima incubada a 4 M de NaCI que mantenía su actividad
inicial.

Se trató de determinar si el proceso de desnaturalización de la enzima,

causada por las bajas concentraciones de sal, era o no un proceso reversible.
Para ello, se incubó la muestra en distintas concentraciones de sal durante 24
h a 20 °C; dichas concentraciones fueron 0.2, 0.6 y 2 M de NaCI. Tras esta
incubación se realizó otra idéntica a 3.3 M. de sal. Esta concentración se
consiguió por adición de 5 M de NaCl a la muestra, y se determinaron las
actividades residuales (Figura 42). Las muestras que se habían mantenido a
0.6 y 2 M de NaCl presentaban el 100 % de la actividad residual, mientras que
la muestra mantenida a 0.2 M de sal presentaba sólo el 5 % de la actividad
residual. Esto indica que tras someter a la enzima a condiciones de sal
desnaturalizantes, ésta cae en un proceso de desnaturalización irreversible; es
más, en algunos casos, cuando la concentración de sal era baja, se formaban
pequeños precipitados sugiriendo que se producía una continua evolución de
proteína disociada a formación de agregados.
En el caso del DC, los datos se expresaron en porcentaje relativo al

\
valor obtenido entre 4 M (estado dimérico) y O M (parcialmente plegada, estado
monomérico). Las tres curvas obtenidas por los distintos métodos de estudio
son superponibles, lo que indica que cada método proporciona la misma
información para la disociación y el proceso de inactivación (Figura 42).
136

120
0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Concentration (M)
FIGURA 42: Efecto de la sal en la estabilidad de la enzima recombinante.

Porcentaje de actividad residual (cruces), fluorescencia (círculos) y DC (triángulos) a
varias concentraciones de NaCI. Los datos vienen expresados en porcentaje de
proteína plegada.
Estos datos indican que la inactivación debida a la incubación de la

enzinna a bajas concentraciones de NaCI, está relacionada con una disociación
irreversible de las especies diméricas nativas hacia una especie parcialmente
plegada, monómero inactivo. La exposición al medio de los residuos de
triptófano ocurre durante la disociación, lo que sugiere que éstos están
localizados en las proximidades de la interfase monómero-monómero que
constituye el dímero. Estos residuos se conservan en estas enzimas (Figura
16) y se identificaron posteriormente con la obtención del modelo teórico,
comparándose con las estructuras diméricas de 6. subtilis y E. coli. Hecho que
confirma que la inactivación y la disociación enzimática son, por tanto,
simultáneas.
La inactivación de proteínas halofílicas incubadas en soluciones de baja

concentración salina es un proceso cinético. Se comprobó que la inactivación
de la isocitrato deshidrogenasa de Hfx. volcanii sigue una cinética de primer
orden a varias concentraciones de sal. Este hecho se observó también en las
137

proteínas malato deshidrogenasa y glutamato deshidrogenasa de organismos

halófilos (Pundak y col., 1981; Bonneté y col., 1994; Madern y col., 1995 y
Bonete y col., 2003).
En cuanto al efecto de los iones, se ¿alizaron ensayos en los que se

incubó la enzima a 20 °C con distintas sales, CsCI, KCH3COO, KF, KCI,
NaCHsCOO, NaCI, NaF, NaBr, (NH4)2S04, NH4CH3COO, NH4CI, MgCla, y
CaCb (Figura 43), y se tomaron datos de DC y actividad residual. Se debe
tener en cuenta que estas medidas se realizaron por dilución a partir de un
stock de enzima que contenía NaCI, en las distintas sales, de forma que la
concentración de NaCI residual era de 0.2 M. Previamente se había
comprobado que esta concentración no es suficiente para mantener la
estabilidad de la enzima. Los datos se expresaron en porcentaje del estado
nativo, reflejando el efecto de la sal en la disociación, medidas por DC o
actividad. En cuanto a nuestro conocimiento se refiere, el efecto producido por
los cationes y los aniones en la estabilidad de proteínas halofílicas se limita a
los resultados obtenidos para la malato deshidrogenasa de Haloarcula
marísmortui, en la cual, tanto los aniones como los cationes producen efectos
diferentes durante la inactivación por bajas concentraciones salinas (Madern y
Zaccai, 1997).
En el caso del efecto producido por los cationes, estos estudios

revelaron que la ICDH dimérica es estable (activa y plegada) en un rango de 1
M a 4 M de cationes monovalentes como el Cs'^, K*, Na'', NH4'*' (Figura 43,
paneles A, B, C y D). La incubación de la ICDH de Hfx. volcanii a bajas
concentraciones de sal dio como resultado su inactivación, la cual está
relacionada con la disociación del dímero en el monómero inactivo. El paso a la
forma desplegada se observó cuando se disminuía la concentración de catión
por debajo de 1 M, independientemente de la naturaleza del catión. La
concentración para la cual el 50% de la proteína se encontraba disociada
(LSC50) era 0.6 M ± 0.15 M en todos los cationes probados.
138

Vi
I
_l I L.
* *
FIGURA 43;
I Efecto de las diferentes

sales en la estabilidad
de la enzima. La
actividad residual o DC
-Jl se determinó después
de 24 h de incubación a
\ varias concentraciones
de sal. Los datos se
expresan en porcentaje
de estado dimérico
fl " n
nativo. Panel A, CsCI
&
Vi
(círculos); panel B, KCI
I (círculos), KCH3COOO
(triángulos), KF
(cruces); panel C, NaCI
(círculos), NaF (cruces),
" o O o o O o " "
NaCHsCOOO
(triángulos), NaBr
I
(cuadros con cruces);
panel D, (NH4)2S04
(cruces), NH4CH3COO
(triángulos), NH4CI
B Q o>B
. •> <•
(círculos); panel E,
MgCb (círculos); panel
I F, CaCl2 (círculos).
o
O os 1 1 5 -»-*-
2 2.5 3 3 5 4
Concentration (M)
139

En el caso de cationes divalentes como el Mg^"^ o el Ca^*, las curvas de

estabilidad presentaron un comportamiento gaussiano, mostrando que la
enzima se inactiva incluso cuando la concentración de la sai era elevada. El
rango de concentraciones para el cual ICDH es activa fue 0.15 - 1.5 M y 0.3 -
2.0 M para el CaCb y el MgCl2, respectivamente. El LSC50 para la enzima fue
0.04 M en ambos casos (Figura 43, paneles E y F), el cual debe ser comparado
con el obtenido para los cationes monovalentes (0.6 M), concluyendo que los
cationes divalentes ejercen un efecto estabilizador sobre la ICDH de Hfx.
volcanii incluso a concentraciones salinas muy bajas.
Para la MDH de H. marismortui el valor de LSC50 para los cationes

monovalentes fue 1 M y el rango de concentraciones para los cationes
divalentes fueron: 0.35-0.5 M para CaCb, y 0.45-0.65 M para MgC^. Según
estos datos la ICDH presenta mayor resistencia a la inactivación por bajas
concentraciones salinas en el disolvente que la MDH.
Se determinó la actuación de los aniones en la estabilidad de la ICDH de

Hlx. volcanii y si ésta se comportaba de igual manera que en presencia de
cationes. Para ello se incubó la enzima en las siguientes sales: KCH3COO, KF,
KCI, NaCHsCOO, NaF, NaCI, (NH4)2S04, NH4CH3COO y NH4CI (Figura 43).
Los datos obtenidos se expresan en porcentaje de estado nativo, el cual refleja
el efecto de la sal en la disociación del dímero, bien sea por medidas de
dicroísmo circular o de actividad. Los resultados no mostraron una evidencia
clara de una fuerte modificación del LSC50 para los aniones, obteniéndose
valores idénticos en todos los casos (0.6 M ± 0.2 M); además, la enzima es
completamente estable en NaBr (Fig. 43, panel C), al contrario de lo que ocurre
en la enzima MDH de H. marismortui, la cual es inestable en presencia de este
anión independientemente del catión presente en el medio. Estos datos
muestran que la inactivación de ICDH de tifx. volcanii frente a bajas
concentraciones de sal no es sensible al efecto de los aniones.
De todo los expuesto se puede concluir que, en el caso de las

adaptaciones halofílicas, el extenso trabajo realizado con malato
deshidrogenasa de Haloarcula marismortui (Madern y col., 2000; Mevarech y
140

Estudios fisico-quimicos. 5.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
col., 2000) y la acumulación de datos sobre caracterización de. varias proteínas

sugiere que la estabilidad se debe a las interacciones proteina-disolvente, y
este tipo de interacciones están controladas, a su vez, por la naturaleza de la
sal (Ebel y col., 2002; Costenaro y col., 2002).
Se analizaron los datos bioquímicos de ICDH de Haloferax volcanii con

la intención de obtener información estructural de la enzima. El presente
estudio de DC muestra cómo en esta enzima la inactivación y la disociación
son concomitantes. Se estableció un orden de eficiencia de los cationes y
aniones, en función de su concentración, en la estabilidad de la enzima:
Ca^* lVlg2* » N H / , Na^ K^ Cs*

0.02 M 0.6-0.8 M
S04^", CH3COO-, F-, Cr, Br"

0.6-0.8 M
En todas las sales probadas con cationes monovalentes, las curvas de

transición ocurrían alrededor del mismo rango de concentración (± 0.2 M),
impidiendo la posibilidad de discriminar fácilmente en el orden relativo de sus
eficiencias. Un efecto similar se encontró en enzimas como seril-tRNA sintetasa
de H. marisortui (Taupin y col., 1997) o a-amilasa de Natronococcus
(Kobayashi y col., 1994).
De acuerdo con esto sería razonable enunciar dos íiipótesis en relación

con el efecto nulo que producen los aniones en ICDH de Hfx. volcanii:
La primera de ellas sería que no existen en la enzima fuertes sitios de

unión para aniones. La segunda es que, debido a que existen pocos centros de
unión a aniones, su papel en la estabilización de ICDH de Hfx. volcanii se
enmascara con la elevada estabilidad intrínseca de la enzima. En generla, la
estructura tridimensional de las proteínas se mantiene por un cúmulo de
enlaces débiles como fuerzas electrostáticas, de Van der Waals, puentes de
141

hidrógenos y efectos hidrofóbicos, todos ellos internos . en la cadena

polipeptídica y entre la proteína y el disolvente (Dill, 1990).
Hasta la fecha y a excepción de esta tesis, únicamente se ha

determinado el efecto de los cationes en la estabilización de las proteínas
halofílicas, mediante técnicas de DC y UCA, para la enzima malato
deshidrogenasa de Haloarcula marísmortui (Madern y Zaccai, 1997; y Ebel y
col., 1999). Los estudios termodinámicos de la hidratación y la solvatación de
proteínas mostraron que una variación en la composición de los cationes
presentes en el disolvente respecto de la capa de hidratación-solvatación de la
proteína, debería desestabilizarla desplegándola o haciendo que precipitase
(von Hippel y Schleich, 1969; Timasheff, 1992). Recientemente, varios
experimentos han demostrado que malato deshidrogenasa de H. marísmortui
es capaz de mantener la composición de la capa de hidratación muy similar a
la del disolvente, permitiendo así la estabilización y solubilidad de la estructura
nativa (Ebel y col., 2002; Costenaro y col., 2002)
En el presente trabajo, se ha sugerido que la estabilidad de ICDH de

Hfx. volcanii dependiente de la sal está controlada principalmente por cationes,
con un efecto fuertemente estabilizador incluso cuando las concentraciones de
sal (cationes divalentes) son inductoras de inactivación y desplegamiento. Este
efecto estabilizador a bajas concentraciones salinas, principalmene por
cationes divalentes, también se observó en la enzima MDH de H. marísmortui
(Madern y Zaccai, 1997; Ebel y col., 1999b). Los cationes divalentes favorecen
la estructuración del agua alrededor de la proteína gracias a su elevada
densidad de carga (Collins, 1997). La resistencia de la enzima a la
desnaturalización producida por esta elevada concentración de cationes
sugiere que la arquitectura global de ICDH de l-ifx. volcanii está mantenida
fuertemente. El análisis de la composición aminoacídica de la proteína
mostrada en la Tabla 8 indica que ésta es de naturaleza acídica (Camacho y
col., 2002). Se ha asumido que la superficie de la enzima estaría
mayoritariámente cubierta por estos residuos ácidos en contacto con el
disolvente, el cual jugaría un papel importante en la organización de la capa de
solvatación específica. Se ha demostrado, para la MDH de H. marísmortui,
142

cómo la capa de solvatación con una composición aproximada a la del

disolvente, contribuye a la solubilización de la proteína y estabilidad de la
estructura nativa (Ebel y coi., 2002; Costenaro y col., 2002). Numerosos
estudios han mostrado que las interacciones entre iones y proteínas
contribuyen fuertemente a la estabilidad de las proteínas halofílicas (Dill, 1990;
Madern y col., 2000; Mevarech y col., 2000; Minton, 2001; Costenaro y col.,
2002). Pero hasta este momento, sin información estructural de la enzima de
Hfx. volcanii, estos datos sugieren que la ICDH debe ser un nuevo tipo de
proteína halófila no descrita con anterioridad: una proteína halofílica
oligomérica desprovista de centros de unión para aniones en el espacio entre
subunidades. Estas diferencias encontradas entre las adaptaciones de las
proteínas halofílicas implican que las estrategias deben ser descritas a nivel de
proteínas individuales como se ha visto en el caso de la MDH del organismo
halófilo extremo Salinibacter ruber que presenta un comportamiento no
halofílico (Madern y Zaccai, 2004).
• ültracentrifugación diferencial.
Se ha encontrado que muchas ICDHs de Archaea son diméricas (Steen

y col., 2001). En muchos casos, la ültracentrifugación analítica (UCA) ha
permitido determinar los estados oligoméricos de las proteínas halofílicas, ya
que proporciona información sobre su hidratación específica y los cambios en
la densidad y la viscosidad de las soluciones estudiadas. Para estudiar el
efecto de la concentración de sal en la estructura de ICDH de Hfx. volcanii se
determinó su velocidad de sedimentación a varias concentraciones de NaCI,
como se describe en el apartado 5.2.2.
Se realizó un primer grupo de experimentos a 4 M NaCI con tres

concentraciones distintas de proteína. La distribución del coeficiente de
sedimentación [g(S*)], calculado para cada concentración de proteína, se
centró en la misma posición, demostrando que no se producía disociación a
bajas concentraciones de proteína. El efecto de la concentración de sal se llevó
a cabo con una cantidad constante de proteína de 0.5 mg/mi. El tiempo
transcurrido para la preparación de la muestra previa al comienzo de la UCA
143

fue de aproximadamente 1 h. Los perfiles de g(S*) calculados para 4.0, 2.0, 0.4
y 0.3 M de NaCI se presentan en la Figura 43. A elevadas concentraciones de
NaCI ios datos representaron a una única especie. El coeficiente de
sedimentación calculado para ICDH de Hfx. volcanii fue S2o,w = 5.4 S (en 4 M
NaCI), lo que está de acuerdo con los valores encontrados para otras ICDHs
diméricas de arqueas (Steen y col., 2001). Cuando se tomaron los datos para
una concentración de NaCI inferior a 0.5 M de NaCI los perfiles de g(S*) se
ajustaron a dos especies con diferentes coeficientes de sedimentación; por lo
tanto, cuando se disminuía la concentración de sal (0.4 - 0.3 M de NaCI), la
concentración de las especies diméricas (S2o,w = 5.4 S) disminuía y se
incrementaba la concentración de las especies más pequeñas (Sao.w *> 2.5 S).
Estos datos indican que a concentraciones bajas de sal, la ICDH de Hfx.
volcanii se encuentra en forma monomérica.
FIGURA 44: Análisis de la velocidad de sedimentación de la ICDH de Hfx.

volcanii. La figura representa la distribución de g(s*) calculado para la enzima
recombinante a varias concentraciones de NaCI. A elevada concentración de NaCI
(paneles superiores) únicamente se detecta una especie. A bajas concentraciones de
NaCI (paneles inferiores) aparecen dos especies (líneas grises). Los datos
experimentales son las cruces, y la línea negra corresponde al ajuste.

El peso molecular calculado para la ICDH de Hfx. volcanii en forma

dimérica, 91 kDa, resultó ser idéntico al peso molecular teórico obtenido según
la composición de aminoácidos del apartado 3.3.4. Por otro lado, el peso
molecular calculado para el monómero, 39 kDa, resultó en un valor cercano al
calculado de forma teórica, 45.5 kDa. Esta diferencia en el valor teórico y el
obtenido mediante AUC es debido a que el coeficiente de sedimentación se
calcula en función del coeficiente de fricción (f/fo), este es un parámetro que
refleja la estructura (configuración) de la proteína. El cálculo experimental del
valor de Sao.w para ICDH de Hfx. volcanii da un valor del coeficiente de fricción
para el monómero de 1.9. Para proteínas globulares compactas este
coeficiente presenta un valor de 1.25, el valor más alto encontrado para el
monómero de ICDH sugiere que este se encuentra en una conformación
extendida, parcialmente desplegada (Cantor y Schimmel, 1980).
La estabilidad de proteínas se refiere a la capacidad de mantener la

estructura nativa en condiciones desnaturalizantes. La diferencia en la energía
libre de estabilización entre estados plegados y desplegados se debe
únicamente a las pocas interacciones intermoleculares débiles de la proteína
en estado nativo (Dill, 1990).
Mediante estudios de estabilidad (Jaenicke y Bóhn, 1998; Scandurra y

col., 2000) y dinámica de proteínas extremofílicas (Fitter y col., 2001; Tehei y
col., 2001) se ha determinado que no existen unas reglas generales para la
estabilización del estado funcional bajo las condiciones ambientales dadas.
De acuerdo con estudios generales de estabilidad de proteínas en

función del efecto que producen las sales, elevadas concentraciones de
cationes divalentes favorecen la solubilidad dé la proteína y el desplegamiento
debido a la unión al esqueleto polipeptídico (von Hippel y Schleich, 1969;
Schellman, 1987; Timasheff, 1992). Este efecto también es válido para
proteínas halofílicas, pero la elevada resistencia de ICDH de IHfx. volcanii a la
desnaturalización por elevadas concentraciones de cationes divalentes
indicaría que se mantiene fuertemente su arquitectura de superficie. Estudios
estructurales sugieren que el aumento en el número de puentes salinos es uno
145

de los mecanismos principales seleccionados por la evolución para mejorar la

resistencia térmica y química de las proteínas extremófilas (Cobucci-Ponzano y
col., 2002).
El mantenimiento de la estructura de las proteínas se debe a un cúmulo

de interacciones débiles en el interior de la cadena polipeptídica y de las
interacciones de la proteína con el disolvente. En enzimas como malato
deshidrogenasa de H. marismortui se ha encontrado que presenta mayor o
menor estabilidad en función de la sal presente en el disolvente (Tehei y col.,
2001). Por el contrario, ICDH de Hfx. volcanii presenta igual resistencia a la
disociación, sea cual sea la sal en el disolvente. Este dato, combinado con las
observaciones previas, indicó que las interacciones entre el disolvente y la
proteína jugaban un papel poco importante en la estabilidad de la enzima, y en
cambio cobraban mayor importancia las interacciones internas proteína-
proteína.
146

6. INGENIERÍA DE PROTEÍNAS.

Ingeniería de proteínas. 6.1. INTRODUCCIÓN.
6.1. INTRODUCCIÓN.
6.1.1. Modelado de proteínas.
Durante el planteanniento y desarrollo de experimentos orientados al

análisis de la función de la proteínas, disponer de una estructura tridimensional
de la proteína objeto de interés es sin duda de un valor inestimable; aunque es
bien cierto que a medida que se profundiza en el estudio de genomas
completos, son cada vez más frecuentes los casos de proteínas de estructuras
conocida cuya función todavía es aún un completo misterio.
Un número de aproximaciones experimentales afrontan el problema

utilizando la cristalografía por rayos X o resonancia magnética nuclear como
métodos capaces de proporcionar modelos aproximados de la estructura y
dinámica de las proteínas.
Desde un punto de vista más general, es evidente que estas técnicas

tienen limitaciones en cuanto a su posible aplicación y a su capacidad para
resolver la estructura de todas las proteínas conocidas. De hecho, a pesar de la
sistematización de las técnicas experimentales y el considerable progreso en la
resolución experimental de estructuras, la brecha con el número de secuencias
conocidas crece cada vez más rápidamente (Gómez-Moreno y Sancho, 2003).
En este contexto, los métodos de predicción de estructuras de proteínas

tienen como objetivo cerrar en la medida de lo posible esta brecha,
contribuyendo, por una parte, a crear modelos de las proteínas con homólogos
conocidos (por ejemplo, todas las secuencias de una determinada proteína en
distintas especies) y, por otra, a generar modelos para las proteínas sin
homólogos conocidos, para las que aún no existe ninguna estructura
tridimensional válida como molde.
Es todavía muy controvertido cuántas estructuras tendrán que resolverse

experimentalmente para poder completar el espacio de las secuencias, es
decir, para poder generar modelos fiables para todas las secuencias conocidas.
148

Este cálculo depende directamente de la definición de nnodelos fiables

(proximidad entre secuencias a modelar y estructuras) y del número de familias
de proteínas. Las estimaciones existentes están basadas en extrapolaciones
de las observaciones realizadas en los últimos años, en términos de cuántas
estructuras se han descubierto, a qué familias corresponden, y en qué medida
corresponden a estructuras capaces de actuar como representantes de familias
completas. Utilizando este tipo de aproximaciones, se ha estimado que existen
unas pocas familias muy grandes representabas con unas pocas estructuras.
Estos superfold deben haber aparecido más de una vez durante la evolución,
puesto que secuencias sin aparente relación filogenética llegan a obtenerlos
por caminos totalmente diferentes. Unos pocos miles de familias de tamaño
más pequeño serian representables mediante una sola estructura (unos pocos
miles de common folds), mientras que para varias decenas de miles de familias
con parecido en muy pocas secuencias (minifolds) sería necesario obtener
experimentalmente suficientes estructuras específicas. En cualquier caso, este
tipo de estimaciones debe tomarse con ciertas precauciones, puesto que no
hay una garantía real de que las estructuras que se han resuelto
experimentalmente sean representativas del espacio de secuencias y/o de las
estructuras que se obtendrán durante los próximos años con nuevas técnicas
(Gómez-Moreno y Sancho, 2003).
El conocimiento detallado de los pasos discretos que ha sufrido la

evolución de una familia particular de proteínas, desde su posible miembro
ancestral hasta los representantes actuales, cubriendo un amplio espectro
dentro del espacio de funciones y de estructuras, permitiría sin duda conocer
con detalle las variaciones en la función asignada a cada posición especial de
cada residuo constituyente de la cadena polipeptídica de cada una de las
proteínas homologas. Sin embargo, la falta absoluta de conocimiento a cerca
de tales estudios evolutivos obliga a concentrarse en métodos capaces de
reproducir las correspondencias entre aminoácidos a partir del conocimiento
actuar de las secuencias y estructuras disponibles de las diferentes proteínas
objeto de análisis. De esta forma, y a partir del estudio bioquímico de un
número discreto de representantes, se pueden inferir las propiedades
funcionales y estructurales del resto de la familia.
149

6.1.2. Mutagenesis dirigida.
Estudios evolutivos indican que isocitrato deshidrogenase NADP"^-

dependiente de eubaoterias ennergió de un precursor NAD*-dependiente hace
aproximadannente 3.5 billones de años. La selección a favor de utilizar NADP""
fue, probablemente, un resultado de la expansión del nicho al crecinriiento en
acetato, en el cual la isocitrato deshidrogenasa aporta el 90% del NADPH
necesario para la biosíntesis. Los aminoácidos implicados en la especificidad
por el coenzima se han identificado por cristalografía de rayos X en especies
como Escherichia coli y Thermus thermophilus, bastante alejadas
evolutivamente. Por mutagenesis dirigida se ha conseguido invertir la
especificidad de la enzima por el coenzima en ambas especies. La
reconstrucción de las secuencias iniciales indica que estos cambios son
ancestrales, de modo que la historia de la evolución molecular esté sometida a
la investigación experimental (Dean y Golding, 1997).
Estructuralmente, NADP"" difiere de NAD"" sólo por un grupo fosfato

esterificado en el 2'C de la ribosa adenosine, una diferencia que se refleja en
los papeles enzimáticos: deshidrogenases NAD'^-dependientes están
implicadas generalmente en reacciones catabólicas, mientras que las enzimas
NADP'^-específicas están implicadas principalmente en rutas biosintéticas. Las
marcadas especificidades presentadas por deshidrogenases a través de NAD''
y NADP"" han proporcionado sistemas modelo atractivos para entender el
proceso de reconocimiento molecular mediante ingeniería de proteínas (Chen y
col., 1997b).
Les técnicas de mutagenesis dirigida son una herramiente valiosa para

el estudio de las relaciones entre estructura y función de proteínas, la expresión
de genes y pare realizar modificaciones en vectores. Se han publicado algunas
aproximeciones de esta técnica, pero generalmente estos métodos requieren
como muestra DNA de cadena sencilla y ésta es una labor que dificulta el
proceso.
150

Mediante varias connbinaciones de oligonucleótidos mutagénicos se

puede adicionar, delecionar o sustituir nucieótidos en un segmento de DNA
cuya secuencia es conocida. Así es posible alterar codones en secuencias
proteicas, o generar cannbios definidos en secuencias que tienen una función
reguladora, para la construcción de nuevos vectores y genes quiméricos, etc.
(Cerdánycol,, 1997).
La DNA polimerasa Pfu replica las dos hebras de DNA con alta fidelidad
y sin desplazar la mutación que se inserta con el oligonucleótido mutagénico. El
procedimiento básico utiliza el vector de DNA con el inserto de interés de doble
cadena superenrollado (no es necesario DNA monohebra) y dos
oligonucleótidos que contienen la mutación deseada (Figura 44). Los
oligonucleótidos, cada uno de ellos complementario a una de las cadenas
opuestas, se utilizan como cebadores en la amplificación del DNA por la
enzima Pfu, produciéndose la incorporación de dichos oligos generados a un
plásmido ya mutado que contiene muescas (Sambrook y Rusell, 2001).
Finalizados los ciclos de amplificación, el producto obtenido se trata con

la enzima de restricción Dpn I. Esta endonucleasa es específica de regiones
metiladas y hemimetiladas de DNA (secuencia diana 5'-GmÂTC-3') y se utiliza
para digerir el DNA molde y seleccionar el DNA mutado sintetizado.
Prácticamente todo el DNA aislado de Escherichia coli está dam metilado y por
lo tanto es susceptible de la digestión con Dpn I. El vector con las muescas que
contiene la mutación deseada se transformará en la cepa XL1-Blue de E. coli.
La pequeña cantidad que se requiere de DNA muestra para realizar el

método, la elevada fidelidad de la DNA polimerasa Pfu, y el número tan bajo de
ciclos de amplificación necesarios contribuyen a elevar la eficacia de la
mutación y disminuir el potencial para producir mutaciones aleatorias durante la
reacción (QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit, Stratagene(2001)).
151

Pldsmido con el gen que

contiene las dianas de
mutagenesis
MEZCLA
Olígos mutagénicos
CICLOS PCR para síntesis de

plósmido mutagénico
DI&ESTION
Digestión de la molécula
parental
TRANSFORMACIÓN Plósmido mutúdo
Transformación con las

moléculas mutadas
Después de la transformación
E co/i repara las roturas
Figura 44: Esquema del método de mutagenesis dirigida empleando las

enzimas Pfu y Dpn I.
152

Ingeniería de proteínas. 6.2. METODOLOGÍA.
6.2. METODOLOGÍA.
6.2.1. Obtención de modelo teórico.
Se realizó el alineamiento de secuencias entre la isocitrato

deshidrogenasa de Hfx. volcanii y las enzimas de E. coli y 6. subtilis, cuyas
estructuras cristalinas están resueltas a 2.5 y 1.55 A, respectivamente. Para
ello se introdujo la secuencia de Hfx. volcanii en el servidor ExPASy Molecular
Biology, en la base de datos Swiss-Model Repository. El ExPASy (Expert
Protein Análisis System) es un servidor de herramientas proteómicas del
Instituto de Bioinformática suizo (SIB) y se dedica al análisis de secuencias y
estructuras de proteínas, así como a las electroforesis en gel de poliacrilamida
bidimensionales.
El programa informático Swiss-Model realizó un modelo teórico para la

secuencia mediante algoritmos de homología. Permite la construcción del
modelo de forma totalmente automática, o mediante el programa asociado
Swiss-Pdb-viewer, que permite el refinamiento manual del proceso de
modelado. Utiliza Blast y la base de datos ExNRL-3D (derivada de PDB) para
realizar la búsqueda de posibles proteínas molde. Se escogen dichas proteínas
con más de 20 aminoácidos de longitud y más del 25 % de identidad de
secuencia. La construcción del modelo estructural se realiza con el programa
Promodll y la minimización de energía con Gromos96. E! programa calcula
todos los grados de identidad entre la muestra problema y la secuencia patrón,
y la desviación estándar relativa a la media de los modelos correspondientes a
las estructuras experimental y control. Por ejemplo, el 63 % de las secuencias
que presentan un 40-49 % de identidad con la muestra patrón, que se realizan
en el programa Swiss-Model con "First Approach Mode", presentan una
desviación menor de 3 Á respecto la estructura control. Este númeo aumenta a
un 79 % para identidades de secuencia entre el 50-59 %. Además para este
tipo de secuencias, se observa un núcleo de proteína con una desviación de 1
Á (Chotia y Lesk, 1986).
153

Ingeniería de proteínas. 6.2. METODOLOGÍA.
6.2.2. Mutagenesis de los residuos implicados en la unión, de coenzima.
Los alineamientos iniciales se realizaron con el programa CLUSTAL W

(Thompson y col., 1994). Para ello se utilizaron las secuencias de las isocittrato
deshidrogenasas NADP^-dependientes de 6. subtilis (Singh y col., 2001) y E.
coü (Hurley y col., 1989) y la isopropilmalato deshidrogenasa NAD"^-
dependiente de 7. thermophilus (Imada y col., 1991). La estructura cristalina de
todas ellas se resolvió por rayos X con anterioridad; por este motivo fueron
estas secuencias las que se incluyeron en el alineamiento y no las que se
habían utilizado en el apartado 3.3.4. A pesar de que estos organismos son
divergentes, lo que implicaría que sus secuencias también son divergentes, los
residuos implicados en la unión del sustrato se identificaron por cristalografía
de rayos X. Los aminoácidos implicados en la unión del coenzima también se
identificaron en las estructuras de la isocitrato deshidrogenasa (NADP"^) de E.
coli (Hurley y col., 1991) y en la isopropilmalato deshidrogenasa (NAD*) de T.
thermophilus (Hurley y Dean, 1994).
• Diseño de los oligonucleótidos mutagénicos.
Para realizar el cambio en la especificidad de la NADP'^-ICDH de Hfx.

volcanii por el coenzima, de NADP"" a NAD"^, se requería mutar cinco
aminoácidos implicados en el centro activo de la enzima. Estos cinco
aminoácidos son:
- Arg 291 que pasa a Ser 291
- Lys 343 que pasa a Asp 343
- Tyr 344 que pasa a lie 344
- Val 350 que pasa a Ala 350
- Tyr 390 que pasa a Pro 390.
Para llevar a cabo cada una de las mutaciones se diseñaron dos

, oligonucleótidos complementarios a cada una de las hebras de DNA
parentales, de forma que se crearon cinco parejas de oligonucleótidos
mutagénicos. Las secuencias de los oligos se muestran a continuación. En
cada una de las secuencias aparece, marcado en rojo, el o los nucleótidos
154

Ingeniería de proteínas. 6.2. METODOLOGÍA
variados para producir el cannbio de anninoácido, y como superíndice la base

original:
- Arg291 por Ser 291:
5' GCTTCTCACCA^GCACCGCCAACTAC 3'

5' GTAGTTGGCGGTGCT°GGTGAGAAGC3'
= Lys 343 por Asp 343:
5' C T C C G C A C C C G ' ^ A C ^ T A C G C C G G C A A G 3'
5' CTTGCCGGCGTAG^TC^GGGTGCGGAG 3'

- Tyr 344 por lie 344:
5' CGCACCCGACA^T^CGCCGGCAAGGAC 3'

5' GTCCTTGCCGGCGA'^T^GTCGGGTGCG 3'
- Val 350 por Ala 350:
5' CAAGGACAAGGC^CAACCCGACCGCG 3'

5' GCGCCTCGGGTTGG^CCTTGTCCTTG 3'
- Tyr 390 por Pro 390:
5' CGACGTGACCC^C'^CGACCTCGAACGC 3'

5' GCGTTCGAGGTCGG^G^GGTCACGTCG 3'
• Protocolo de mutagenesis.
El protocolo de mutagenesis utilizado fue el recomendado por

Stratagene en su "QuickChange TM Site-Directed Mutagenesis kit" (2001). Éste
consta de dos pasos, para cada una de las mutaciones generadas la reacción
de PCR con la enzima Pfu Turbo y la posterior digestión de las moléculas
parentales con la enzima de restricción Dpn I. Tras estos dos pasos se
155

Ingeniería de proteínas. 6.2, METODOLOGÍA.
generaron las mutaciones necesarias, pero para poder aislar los plásmidos
nnutagénicos se precisó la transformación de las células XL1-Blue de E. coli.
a) PCR.
La reacción de PCR contenía la mezcla de reacción que aparece en la
Tabla 24:
Tabla 24: Volúmenes y concentraciones de todos los componentes de la

reacción utilizada para generar cada uno de los plásmidos mutados.
REACTIVOS VOL- CONC. FINAL

Tampon de reacción 5|il-1X
Oligo directo 2)11- 130 ng
Oligo reverso 1 ^1-135 ng
12.5mMdNTPs 1 |.il-0.12mM
Plásmido 4|il
Pfu Turbo 1 i-il
Agua ultrapura Hasta 50 |al
Los ciclos de PCR fueron los siguientes:
Un ciclo inicial de 95°C 30 seg.; 16 ciclos de 95°C 30 seg., SS'^C 1 min, y

68°C 12 min.; y un último ciclo de 4°C 2 min.
95°C 95°C 68°C

30" 30" \ 55°C
12' 4°C
2'
r
16 ciclos
156

Ingeniería de proteínas. 6.2. IVIETODOLOGÍA.
b) Digestión con Dpn I.

La digestión con Dpn I no precisa de la adición de ningún tampon
específico. Esta enzinna es capaz de digerir las moléculas de DNA parental
directamente en la reacción de PCR, de forma que la digestión se llevó a cabo
con 1 1^1 de Dpn I (10 Unidades) añadido directamente al tampon y se incubó
durante 1 hora a 37°C.
o) Transformación de las células XL1-Blue con la digestión, aislamiento

de los plásmidos y secuenciación.
Se transformaron las células de £. coli con 5 p,l de la reacción de
digestión por el método físico-químico, y se sembraron en placa. Una vez
crecidas se pasó un número representativo de colonias a medio líquido para el
posterior aislamiento del plásmido y secuenciación.
• Caracterización de los mutantes. Obtención de los parámetros

cinéticos.
La determinación de los parámetros cinéticos de los mutantes se llevó a

cabo de forma análoga a la utilizada para la enzima recombinante (apartado
5.2.1) obteniéndose los valores correspondientes de Km y Vmax para el NADP"" o
el NAD* y del isocitrato, en función de los casos, así como los valores del
número de recambio y eficacia catalítica para cada uno de los mutantes.
157

Ingeniería de proteínas. 6.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
Una de las características más interesantes de las proteínas es el hecho

de haber conservado en su secuencia de aminoácidos una considerable
memoria sobre su historia evolutiva. Sorprendentemente, proteínas homologas
en organismos que divergieron hace miles de millones de años están todavía
suficientemente conservadas como para que podamos reconocer su parecido,
estudiar su organización en regiones conservadas y variables e incluso
utilizarlas como marcadores del propio proceso evolutivo. Este tipo de
comparaciones se realiza utilizando alineamientos de secuencias de proteínas
obtenidos con distintos algoritmos y que tratan de representar en las
correspondientes columnas aquellos aminoácidos con origen común y una
posición similar en las correspondientes estructuras tridimensionales de cada
proteína.
La evolución molecular está basada en el uso de estos alineamientos

múltiples de familias de proteínas, para reconstruir árboles de genes que
representen de la forma más aproximada posible el proceso histórico de
divergencia de secuencias. Esta reconstrucción requiere el desarrollo de
modelos estadísticos capaces de reproducir el proceso de mutación, deriva y
selección.
Si se representa el alineamiento estructural de una familia de proteínas

en forma de su secuencia lineal de aminoácidos se puede constatar que la
correspondencia espacial de aminoácidos idénticos queda patente en forma de
identidad de secuencia, mientras que la presencia de inserciones y deleciones
de partes concretas de la estructura se revela en forma de huecos o gaps
El objetivo de los algoritmos de alineamiento de secuencia de

aminoácidos consiste en el posicionamiento correcto de los diferentes residuos,
de manera que corresponda con la mayor exactitud a sus correspondencias
estructurales relativas. Sin embargo, debido a la enorme diferencia en el
tamaño de las bases de datos de secuencias de proteínas y de estructuras
158

En esencia, el modelado connparativo consiste en la extrapolación de la

estructura para una nueva secuencia aminoacídica (nnodelo) a partir de una
estructura tridimensional conocida de uno o más miembros (moldes) de la
misma familia de proteínas. Los modelos así obtenidos contienen suficiente
información.para permitir el diseño de abordajes experimentales con un grado
aceptable de fiabilidad, o para permitir la comparación estructural de proteínas
Uno de los objetivos para los que se requiere el paso previo de

obtención del modelo teórico (Figura 46), es la realización de mutaciones en la
secuencia que permitan cambios en alguna de las características bioquímicas
de la proteína, como puede ser la variación en la especificidad por el coenzima.
• Alineamiento de secuencia.
Estudios previos revelaron que, utilizando la homología de secuencia

como guía estricta para la realización de sustituciones de aminoácidos, el
proceso resulta satisfactorio casi tantas veces como falla (Chen y Nadal, 1990;
Scrutton y col., 1990; Bocanegra y col., 1993). Las ICDHs pertenecen a una
familia antigua y divergente de deshidrogenasas descarboxilativas entre las
que se incluyen las isopropilmalato deshidrogenasas (IMDH) (Dean y Golding,
1997). Además todas ellas presentan un plegamiento característico,
topológicamente distinto de otras deshidrogenasas de estructura conocida, la
pérdida del motivo característico apap típico del sitio de unión al nucleotide, el
Plegamiento de Rossmann. Estas enzimas adquieren el motivo de unión al
coenzima mediante la adquisición de la estructura cuaternaria. En lugar de este
motivo, en las isocitrato deshidrogenasas, la adenosina del coenzima se une en
un bolsillo construido por dos lazos y una hélice a, posteriormente éste fue
sustituido por una hoja p en las isopropilmalato.
159

Las deshidrogenasas discrinninan entre coenzimas a través de las

interacciones establecidas entre la proteína y el 2'-fosfato del NADP'^ y el 2'- y
3'-hidroxito del NAD"^ (Chen y col., 1996). La ingeniería de proteínas de las
enzimas dihidrolipoamida deshidrogenasa y malato deshidrogenasa
demostraron que la preferencia por NAD^ puede obtenerse mediante la
introducción de residuos cargados positivamente que neutralicen las cargas
negativas del 2'-fosfato del NADP* (Bocanegra y col., 1993; Nishiyama y col.,
1993).
La especificidad en la ICDH de E. coli la confieren las interacciones entre

Arg395, Lys344, Tyr345, Tyr391 y Arg292' (la ' indica que pertenece a la
segunda subunidad del homodímero) con el 2'-fosfato del NADP* unido (Hurley
y col., 1991). Estos residuos están conservados en las ICDHs NADP"^-
dependientes de procariotas y están reemplazados por una gran variedad de
residuos en las ICDHs NAD'^-dependientes (Steen y col., 1997; Lloyd y
Weitzman, 1988). En la IMDH de T. thermophilus (Hurley y Dean, 1994) no
existe una posición equivalente a la Arg395, mientras que las sustituciones
Ser292', Ile345 y Pro391 eliminan todas las interacciones favorables con el 2'-
fosfato. En la IMDH la especificidad por el NAD'^ la confiere el residuo de
Asp344 conservado, el cual forma un doble puente de hidrógeno con el 2'- y 3'-
hidroxilo de la adenosina ribosa del NAD"". Estos movimientos no sólo son
incompatibles con las fuertes interacciones con el 2'-fosfato vistas en las
NADP^-ICDHs, sino que la carga negativa del Asp344 repele al NADP"".
Los alineamientos de secuencia de las ICDHs de Hfx. volcanii, E. coli y

6. subtHis con la IMDH NAD'^-dependiente de T. thermophilus (Figura 45)
muestra que los residuos implicados en la unión al NADP"^ están conservados
en las tres primeras enzimas y que dichos residuos pertenecen al bolsillo
característico construido por los dos lazos y la hélice a. En la IMDH de T.
thermophilus, este bolsillo cambia a dos lazos y una hoja p (Dean y Golding,
1997).
160

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3€3 250 390
FIGURA 45: Alineamiento de las secuencias de las enzimas NADP"^-

dependientes de Hfx. volcanii, E. coli y 6. subtilis y la IMDH NAD'^-dependiente de T.
thermpohilus. Los aminoácidos cambiados por los correspondientes en IMDH para
invertir la especificidad del coenzima aparecen indicados en cajas negras, y los
números corresponden a las posiciones relativas en el gen de ICDH de Hfx. volcanii.
• Mutagenesis dirigida.
Todas las mutaciones de este estudio están basadas en homología de

secuencia, y se utilizó la técnica de mutagenesis dirigida para reemplazar los
aminoácidos Arg291 por Ser, Lys343 por Asp, Tyr344 por líe, Val350 por Ala y
Tyr390 por Pro. Los cambios producidos son residuos cargados positivamente
como Arg y Lys, por aminoácidos sin carga, como Ser; o cargados
negativamente, como Asp. La Lys es un residuo que aparece conservado en
gran número de especies, lo que podría implicar que su carga positiva sería
crucial para el correcto funcionamiento de la enzima (Lee y Colman, 2002).
Otra variación posible es la de Arg395 por Ser, este cambio produciría una
alteración en los puentes de hidrógeno entre la Arg395 y el NADP'*'. Este
cambio, además de los arriba mencionados, se ha utilizado en el organismo E.
coli para producir el cambio de especificidad por el coenzima (Chen y col.,
1995).
161

La prinnera nnutación fue R291S, en la cual la Arg forma un puente de

hidrógeno con el 2'-fosfato del NADP* del dominio pequeño de la segunda
subunidad; en la IMDH de 7. thermophilus se reemplaza con Ser. La segunda
mutación fue Tyr390. Este aminoácido se reemplazó con Pro, al igual que en la
IMDH de T. thermophilus, con el objetivo de alterar la estructura secundaria de
forma local convirtiendo una hélice a en una hoja (3. En £. coli, la sustitución de
la Tyr390 por Lys elimina el puente de hidrógeno que existe entre el 2'-fosfato y
el residuo, pero no altera la estructura secundaria local de la enzima pasando
de a-hélice a giro-|3. La prolina, que aparece comúnmente en IMDHs, no suele
aparecer en ICDH para evitar la destrucción de la a-hélice. Este cambio de
Tyr390 por Pro se llevó a cabo aunque estudios preliminares mostraron que
esta modificación en la estructura secundaria no es necesaria para eliminar las
interacciones con el 2'-fosfato del NADP"", así, en la enzima de E. coli, Arg391
se sustituyó por Lys y la Arg395 por Ser. Estos cambios por aminoácidos
polares mantienen la integridad de la hélice a y eliminan los enlaces de
hidrógeno del 2'-fosfato. Pero aunque no produzca esta alteración en la
estructura secundaria, la Pro390, junto con la Ser291 e Ile344 eliminan todas
las interacciones favorables con el 2'-fosfato del NADP'*'(Dean y Golding, 1997).
Las siguientes mutaciones fueron, de forma secuencial, Lys343 y Tyr344

por Asp e lie, respectivamente. Ambas mutaciones, Asp343 e lle344 son
idénticas en todas las deshidrogenasas descarboxilativas NAD"*'-dependientes
procarioticas. Como se esperaba la afinidad por el NADP"^ se redujo
drásticamente debido a la pérdida del puente de hidrógeno y la introducción de
un aspártico potencialmente repulsivo, pero no apareció actividad con NAD"^. El
residuo de Tyr344 aporta el grupo hidroxilo necesario para establecer un
puente de hidrógeno con el 2'-fosfato del NADP"" (Lee y Colman, 2002; Chen y
col., 1997) y la Lys343 también está implicada en la unión del fosfato al bolsillo
de unión del coenzima. Ile344 implica una desestabilización del puente de
hidrógeno puesto que es necesario el grupo hidroxilo de la Tyr para permitir el
e nía ce.
162

La últinna nnutación fue Val350; este residuo está conservado en las

ICDHs NADP^-dependientes y sustituido por Ala en las ICDHs NAD*-
dependientes y en las IMDHs NAD'"-dependientes (Dean y Golding,1997). El
modelado de otras enzimas sugiere que el volumen reducido que ocupa la Ala
puede permitir el movimiento de la adenosina, atrayendo el 2' y 3'-hidroxilo si la
ribosa unida se encuentra cerca del Asp344, Estudios realizados en estas
enzimas han dado como resultado un incremento de 4 veces la preferencia por
NAD'' respecto a NADP"" (Chen y col, 1995). En el caso de ICDH de Hfx.
volcanii no se apreció actividad con NAD'^ para esta mutación, aunque si se
observó una disminución en la afinidad por el NADP"".
Después de haber realizado los cinco cambios en los aminoácidos,

apareció actividad con el NAD'^, mientras que la actividad con el NADP'"
desapareció completamente. La primera mutación fue R291S y desde este
momento la especificidad por el NADP* se vio disminuida pero no apareció
especificidad para NAD*. La última mutación fue V350A y en este momento se
produjo la variación en la especificidad por el coenzima. Se comprobó que
cuando la primera mutación era V350A, la especificidad por el coenzima no
cambiaba pero sí se producía una disminución en la afinidad por el NADP""
como ocurría en el caso anterior.
Los modelos moleculares, tanto de la enzima nativa como de la muíante,

no presentaron cambios significativos en cuanto a estructura secundaria al
compararlas con el modelo de ICDH de E. coli (Figuras 46 y 47), y entre ellos
(Figura 48). La gran identidad de secuencia que presenta la isocitrato
dehidrogenasa del organismo halófilo con la de E. coli (56.6 %) permite la
realización de un modelo fiable que según Chothia presentaría una desviación
de 1 Á.
163

Figura 46: Solapamiento del modelo teórico de ICDH de Hfx. volcanii nativa
(azul), y el modelo de la misma enzima en E. coli (blanco).
Figura 47: Solapamiento del modelo teórico de ICDH de Hfx. volcanii mutante
(azul), y el modelo de la misma enzima en £ coli (blanco).
Las mutaciones introducidas en la ICDH de Hfx. volcanii, no producen

cambios aparentes en la estructura de la enzima. Por lo tanto, el cambio de
especifídad por el coenzima se habría producido por la eliminación de los
puentes de hidrógeno que se forman entre los aminoácidos implicados en la
164

unión del NADP"" y éste. La sustitución de Tyr390 por prolina no produce un

cambio de a-hélice a hoja-p. En estudios preliminares se comprobó que este
cambio conformacional no era necesario para producir un cambio en la
especificidad por el coenzima sino que es la eliminación del puente de
hidrógeno entre la Tyr y el 2' fosfato del NADP"" (Chen y col., 1995) el
responsable del cambio en la especificidad. Las mutaciones de Lys343 y
Tyr344 por Asp e lie respectivamente tampoco producen un cambio estructural
en el lazo pero si afectan a la unión por puentes de hidrógeno con el fosfato de
coenzima.
(a) (b)
FIGURA 48: Modelo teórico de la ICDH de Hfx. volcanii nativa (a). Modelo
teórico de la ICDH de de Hfx. vo/can/7mutante(b).
En cuanto a la posición que ocupa el NADP"" en la enzima nativa, se

puede observar, comparando con el modelo de E. coli, cómo se forma el mismo
lazo para alojar el coenzima (Figura 49). Este lazo también se ha observado en
la estructura tridimensional de la ICDH de B. subtilis (Singh y col., 2001), la cual
presenta una estructura tridimensional muy similar a la enzima de £. coli.
165

FIGURA 49: Modelo teórico de la ICDH de Hfx. volcanii nativa (a). Modelo
teórico de la ICDH de E. coli (b).
Podría predecirse que la formación del dímero en ICDH de Hfx. volcanii

ocurre como en las enzimas de E. coli y B. subtilis (Singh y col., 2002). Para
ello podríamos dividir la estructura del monómero en tres dominios, el dominio
grande, el pequeño y el dominio de unión o "bisagra" (Figura 50). El enlace de
los dos monómeros se produce a través del dominio de unión de cada uno de
ellos (Figura 51). Entre ellos encontraríamos los Trp conservados en estas
enzimas (como se presuponía en el apartado 5.3.2.) y que quedan expuestos al
medio durante la disociación del dímero en condiciones de baja concentración
de sal (Figura 50C). Los aminoácidos implicados en la unión del coenzima, y
mutados en este trabajo, se localizan en el dominio grande (Lys343, Thr344,
Val350, y Tyr390) y en el dominio pequeño (Arg291) (Figura 52). Durante la
formación del dímero se ponen en contacto los aminoácidos del dominio
grande con la Arg291 del dominio pequeño, como ocurre en las enzimas de E.
coli y B. subtilis.

FIGURA 50: Identificación de los tres dominios del monómero de Hfx. volcanü
(C), por comparación con la estructura del monómero de B. subtilis (A) y E. coli (B).
Localización de los triptófanos en el monómero de Hfx. volcanü (C).

FIGURA 51: Formación del dímero en los organismos 6. subtilis (A) y E. coli
(B) (Singh y col., 2002).
FIGURA 52: Localización de los aminoácidos mutados en el monómero de Hfx.

volcanii.
\

Ingeniería de proteínas. 6.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Según el modelo obtenido para la ICDH de Hfx. volcanii, se predijo la

distribución de cargas (Figura 53a) y el potencial electrostático en la superficie
molecular (Figura 53b). Cabría esperar una superficie mayoritariamente acídica
como otras proteínas halofílicas en las que se ha resuelto su estructura
tridimensional; un caso reciente es la glucosa deshidrogenasa (GlcDH) de Hfx.
mediterranei (Esclaplez, 2004). Sin embargo, la densidad de carga negativa en
superficie no es tan elevada como en la glucosa deshidrogenasa; en el caso de
la ICDH aparecen residuos negativos en superficie (rojos), pero también
aparecen gran cantidad de residuos cargados positivamente (azules) y sin
carga (blancos) (Figura 53a). En cuanto al potencial electrostático, la ICDH
presenta mayoritariamente carácter ácido como la GlcDH (Figura 53b) pero en
menor proporción. Este hecho podría explicar el comportamiento tan peculiar
que presenta la enzima ICDH a bajas concentraciones salinas, mostrando
elevada tolerancia a estas condiciones de sal restringidas y a los iones
presentes en el medio.
A B
FIGURA 53(a): Densidad de carga en superficie del monómero de ICDH de
Hfx. volcanii (A) y de GlcDH de Hfx. mediterranei (B). En color rojo aparecen los
grupos carboxilo de los aminoácidos cargados negativamente, en azul los grupos
amino de los aminoácidos cargados positivamente, en blanco las cadenas laterales de
los aminoácidos apelares y en amarillo las cadenas laterales de los aminoácidos que
contienen azufre.
169

FIGURA 53(b): Potencial electrostático en superficie del monómero de ICDH

de Hfx. volcanii (A) y de GlcDH de Hfx. mediterranei (B). En color rojo aparece el
carácter acidice y en azul el carácter básico.
• Ensayos enzinnáticos.
La NADP*-ICDH de Hfx. volcanii salvaje presenta total dependencia por

NADP^, con una constante de Michaelis para el coenzima de 101 ± 30 [M y
una kcat de 0.176 ± 0.020 min'^ (Tabla 25). La afinidad por el coenzima NAD""
no se observó hasta que se hubieron realizado todas las mutaciones, pero
desde el primer momento, la especificidad por el coenzima NADP* disminuyó.
El mutante final (SDIAP) presentó preferencia por el NAD"^ sobre el NADP"^, la
constante de Michaelis para este coenzima fue 144 ± 60 \xM, y la kcat 0.0422 +
0.0017 min"^ (Tabla 25). El valor de Km para el NADP" aumentó desde el
mutante R291S y se mantuvo en los tres mutantes siguientes. La eficacia
catalítica (kcat/Km) con NAD"" fue aproximadamente 6 veces menor que la de la
enzima con NADP*.
Estos resultados sugieren que los puentes de hidrógeno entre la

adenosina de la ribosa del NAD"*" y el Asp343, como se vio en la estructura
resuelta por rayos X del complejo binario de la IMDH de 7. thermophilus (Dean

y Golding, 1997) se establecieron correctamente. Observando la Tabla 25 se

puede comprobar que la constante catalítica para el NAD* es, de forma
general, menor que la obtenida para el NADP* en la enzima nativa y algunos
de los mutantes obtenidos. Además, los valores calculados tampoco se
aproximan al que presenta la enzima en su estado nativo. Estos datos podrían
interpretarse como que los cambios producidos en la especificidad del
coenzima se basan en la discriminación de la unión de uno u otro, pero no se
ha producido una mejora en la eficacia catalítica con respecto a la enzima
nativa.
Por otro lado, la constante de Michaelis para el sustrato isocitrato cambió

de 108 + 30 [iM para la enzima en su estado nativo, a 11 + 1 )aM para ei último
mutante, y la kcat para este disminuyó aproximadamente 4 veces en este
proceso (Tabla 25). La eficacia catalítica también disminuyó como ocurre con el
NAD*, en los mutantes que no presentan especificidad para este coenzima,
aumentando cuando se producía la completa reversión en la especificidad.
Este efecto sugirió que los primeros mutantes eran menos eficientes en la
catálisis que la enzima nativa y la enzima mutante. Al igual que ocurrió con la
especificidad para ei NADP*, también se produjeron cambios para la
especificidad del isocitrato desde la primera mutación, pero en ese caso, el
efecto fue el opuesto; la especificidad por el isocitrato aumentó de tres a diez
veces, sugiriendo que las mutaciones realizadas favorecían la unión del
sustrato. Ei valor de Km para el isocitrato iba disminuyendo a medida que se
hacían las mutaciones hasta un valor mínimo cuando la enzima trabaja
únicamente con NAD* (SDIAP).
171

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172

Las mutaciones realizadas no están relacionadas con los aminoácidos

implicados en la unión del sustrato. Estos aminoácidos se identificaron por
homología de secuencia (Figura 54) y ninguno de ellos corresponde con los
aminoácidos mutados. Estos resultados indican que las mutaciones realizadas
influyen de una manera importante no sólo en el valor de Km para el NADÍP)"",
sino que también lo hacen para el del isocitrato.
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351 NPTAMILSGR LMFEYMGWKD AGKLIRDTVE KTISDGDVTY |D|LERQIEGGN
401 KLATSEYADK VVENIKELA*
FIGURA 54: Aminoácidos implicados en la unión del sustrato y del coenzima.

Los residuos que se han mutado y forman parte de la unión del coenzima aparecen en
cajas blancas, y los implicados en la unión del sustrato aparecen en cajas negras.
Todos los aminoácidos has sido identificados por homología de secuencia.
El efecto de las mutaciones en la eficacia para cada coenzima podría ser

evaluado con la incorporación de la Km para el sustrato. Este parámetro se
denomina eficacia catalítica global, y viene definida por la expresión
matemática kcat/(Km,¡socitrate X Km,NAD(P)) (Tabla 25) (Nishiyama y col., 1993). Las
mutaciones introducidas en la malato deshidrogenase de Thermus flavus
(Nishiyama y col., 1993) incrementaron el valor de Km no sólo para el NADH
sino también para el oxalacetato con NADH, acompañado de un descenso en
el valor de Km para el oxalacetato en presencia de NADPH, pero no de una
disminución en el valor de Km para este coenzima. Probablemente, estos datos
puedan sugerir que se producen algunas interacciones específicas entre el
sustrato y el NADP^, que difiere del complejo productivo sustrato-coenzima, las
cuales podrían ser responsables de la disminución de la actividad.
173

Se podría pensar que un cambio en la conformación local específica

inducido por la unión de NADP* o NAD*, es el responsable de la variación en el
comportamiento de la enzima de Hfx. volcanii frente al isocitrato. Este efecto,
probablemente se debe a una menor repulsión de las cargas en el centro
activo.
La comparación de la secuencia con la de IMDH de T. thermophilus

(Imada y col., 1991) revela un marco consistente en la evolución de la
especificidad por el sustrato de las deshidrogenasas descarboxilantes de la
clase de las isocitrato deshidrogenasas. Todos los residuos (R117, R127,
R151, Y158, y K228) interaccionan con los grupos a- y p-carboxilatos y a-
liidroxilos del isocitrato, los cuales son comunes con isopropilmalato y malato;
todos los residuos se encuentran conservados en las ICDHs y todas la IMDH
conocidas. Los dos aspárticos, D282 y D306, coordinan el Mg^"^ y también
están conservados en todas las secuencias disponibles. Los residuos que
interaccionan con el y-carboxilato del isocitrato. S111 y N113 (la numeración
corresponde a ICDH de Hfx. volcanii), únicamente se encuentran en las ICDHs,
no conservándose en las secuencias de IMDHs. Las características comunes
de ICDH e IMDH se deben a residuos conservados que interaccionan con los
grupos a- y p- y el ion metálico, con diferencia de la especificidad del sustrato
que viene determinada por residuos no conservados que interaccionan con el
grupo y- (Hurley y col., 1991).
La completa reversión de la especificidad en IMDH de T. thermopiíilus,

ICDH de E. coli, y posiblemente en ICDH de Hfx. volcanii, demuestra que la
especificidad por el coenzima en las deshidrogenasas p-descarboxilantes, al
menos en los dos primeros casos, está determinada principalmente por
interacciones entre nucleotides y la superficie de los residuos de aminoácidos
que forman el bolsillo de unión (Hurley y col., 1991).
174

7. CONCLUSIONES.

7. CONCLUSIONES.
7.1 La secuencia de isocitrato deshidrogenasa de Haloferax volcanii

consta de 1260 pb, que codifican a 419 aminoácidos y en las que se pueden
identificar las regiones de unión al coenzima, al sustrato, así como los motivos
de estructura secundaria. Al igual que en otras isocitrato deshidrogenasas, no
se observa el plegamiento de Rossman, motivo de unión al coenzima típico de
otras deshidrogenasas. El análisis filogenético revela una estrecha relación
entre las isocitrato deshidrogenasas diméricas de bacterias y las isocitrato
deshidrogenasas de arqueas, y muestra que la isocitrato deshidrogenasa es
una enzima relativamente conservada en la evolución, ya que organismos que
divergen en los análisis filogenéticos realizados por otras vías, convergen
cuando se realiza el análisis comparando la secuencia de esta enzima.
7.2 La expresión heteróloga de la isocitrato deshidrogenasa proporciona

un método rápido, sencillo y eficaz para la obtención de la enzima pura a
elevada concentración con un rendimiento final del 72 % sobre la cantidad
inicial de proteína.
7.3 La enzima sobrexpresada presenta un comportamiento cinético y

una termoestabilidad idénticos a la proteína nativa de Haloferax vocanii y una
dependencia de la sal comparable con la de dicha enzima. Respecto a esta
dependencia, estudios de fluorescencia, dicroísmo circular y ultracentrifugación
analítica demuestran que la isocitrato deshidrogenasa incubada a
concentraciones de sal por debajo de 1 M se inactiva completamente y se
disocia en sus dos monómeros constituyentes de forma irreversible. En
concreto, este proceso se ve claramente influido por la baja concentración de
cationes en el disolvente, tanto mono como divalentes, no presentando
dependencia alguna por los aniones presentes. Pero hasta este momento, sin
información estructural de la enzima de Haloferax volcanii, estos datos sugieren
que la isocitrato deshidrogenasa debe ser un nuevo tipo de proteína halófila no
descrita con anterioridad: una proteína halófila oligomérica desprovista de
centros de unión para aniones en el espacio entre las subunidades.
177

7. CONCLUSIONES.
7.4 La realización de cinco mutaciones en algunos de. los anninoácidos

implicados en la unión del coenzima produce una variación en la especificidad
de la enzima, de NADP* a NAD'*', sin ocurrir un cambio apreciable en la
estructura de la proteína mediante su modelado teórico. El modelo teórico de la
isocitrato deshidrogenasa cumple los requisitos mínimos de fiabilidad debido a
que esta enzima está muy conservada en la evolución en cuanto a secuencia
primaria. El mutante final presentó una dependencia absoluta para NAD"",
aunque su eficacia catalítica y su número de recambio son menores que la
enzima en su estado nativo. Por otro lado, la afinidad por el sustrato isocitrato
aumentó aproximadamente diez veces respecto a la enzima salvaje.
CONCLUSION FINAL.
La enzima isocitrato deshidrogenasa de Haloferax volcanii, es una

proteína conservada en multitud de especies divergentes evolutivamente.
Presenta un comportamiento halofílico típico salvo en io que se refiere a su
interacción con los aniones presentes en el medio. Esto permitiría diferenciarla
del resto de proteínas halofílicas caracterizadas con anterioridad. En cuanto a
los estudios de mutagenesis, todavía resta muclio trabajo por realizar, ya que a
medida que se avanza en el estudio molecular se descubren nuevas vías de
investigación; como el papel de determinados residuos en la unión del
isocitrato y del magnesio, así como posibles mecanismos de regulación post-
traduccional.
178

8. BIBLIOGRAFÍA.

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9. APÉNDICES.

9. APÉNDICES.
9.1. Abreviaturas.
C-term: Residuo terminal de una cadena polipeptídica cuyo último

aminoácido libre contiene el grupo carboxilo.
DMSO: Dimetil sulfoxide.
DNasa: Desoxirribonucleasa.
DTT: Ditiotreitol.
EDTA: Etilendiaminotetraacetato
kb: Kilopares de bases de una molécula de DNA.
kDa: KiloDalton
IPTG: Isopropil-p-tiogalactopiranósido.
LB: Medio Luria Bernati.
NAD"^: Dinucleótido de nicotinamida y adenina oxidado.
NADH: Dinucleótido de nicotinamida y adenina reducido.
NADP'': Dinucleótido de nicotinamida y adenina fosfato oxidado.
NADPH: Dinucleótido de nicotinamida y adenina fosfato reducido.
ORF: Open Ready Frame (Fragmento de DNA que podría codificar a

una proteína).
pb: par de bases de una molécula de DNA.
208

9. APÉNDICES.
PBS: Phosphate buffered saline
PCR: Polymerase Reaction Chain (Reacción en cadena de la

polimerasa).
PHB: Poli-(3-hidroxibutirato.
p/v: peso/volumen.
RNasa: Ribonucleasa.
SDS: Dodecil sulfato sódico.
SSC: Standard saline citrate o Saline sodium citrate.
TAE: Tris / Acetato / EDTA.
Tris: Tris(hidroximetil)aminometano.
v/v: volumen / volumen.
209

9. APÉNDICES.
9.2. Nucleótidos.
A; dATP; 2'-desoxiadenosina ddATP; 2',3'-didesoxiadenosina

G; dGTP; 2'-desoxiguanosina ddGTP; 2',3'-didesoxiguanosina
T; dTTP; 2'-desoxitimidina ddTTP; 2',3'-didesoxitimidina
C; dCTP; 2'-desoxicit¡dina ddCTP; 2',3'-didesoxicitidina
N; 2'-desoxinucleótido indeterminado
R; Equivale a A ó G W; Equivale a A ó T
Y; Equivale a C ó T B; Equivale a C, G ó T
K; Equivale a G ó T D; Equivale a A, G ó T
M; Equivale a A ó C H; Equivale a A, C ó T
S; Equivale a G ó C V; Equivale a A, C ó G
210

9. APÉNDICES.
9.3. Nomenclatura de los aminoácidos y código genético.
Aminoácido Símbolo Codones
Alanina A Ala GGA GCC GCG GCT

Cisteína C Cys TGC TGT
Ácido aspártico D Asp GAC GAT
Ácido glutámico E Glu GAA GAG
Fenilalanina F Phe TTC TTT
Glicina G Gly GGA GGC GGG GGT
Histidina H His CAC CAT
Isoleucina 1 He ATA ATC ATT
Lisina K Lys AAA AAG
Leucina L Leu TTA TTG CTA CTC CTG CTT
ÍVletionina M Met ATG
Asparagina N Asn AAC AAT
Prolina P Pro CCA CCC CCG CCT
Glutamina Q Gln CAÁ CAG
Arginina R Arg AGA AGG CGA CGC CGG CGT
Serina S Ser AGC AGT TCA TCC TCG TCT
Treonina T Thr ACÁ ACC ACG ACT
Valina V Val GTA GTC GTG GTT
Triptófano W Trp TGG
Tirosina Y Tyr TAC TAT
* TGA
Terminación Stop TAA TAG
21-

9. APÉNDICES.
9.4. Disoluciones.
lOxTAE
tris 0.4 M
Acetato sódico 0.2 M
EDTA 10 mM
Ajustar el pH a 7.2 con ácido
acético.
20 X SSC
NaCI 3M
Ñas Citrato • 2 H2O 0.3 M
Ajustar el pH a 7.0 con HCI
Blocking Stock Solution

Blocking Reagent (Roche
Molecular Biochemicals) 10%
(p/v) en tampon 1. Se disuelve
calentando, se esteriliza en el
autoclave y se guarda a 4°C
Tampon 1
Acido maleico 0.1 M
NaCI 0.15 M
Ajustar e! pH a 7.5 con NaOH
sólido, esterilizar en autoclave
212

9. APÉNDICES.
Solución de hibridación
5 X SSC
Blocking stock solution 10% (v/v)
N-lauriIsarcosina sódica 10% (p/v)
SDS 0.02%
Solución de desnaturalización
NaOH 0.5 N
NaCI 1.5 M
Solución de neutralización
Tris-HCI pH 7,5 1.0 M

NaCI 1.5 M
Medio LB Luria-Bertani
Triptona 1%
Extracto de levadura 0.5%
NaCI 1%
Ajustar el pH a 7.4 con NaOH y
esterilizar en el autoclave
Medio LB + 2% agar
Triptona 1%
NaCI 1%
Ajustar el pH a 7.4 con NaOH, añadir agar
al 2% (p/v) y esterilizar en el autoclave
213

9. APÉNDICES.
Top Agar
Triptona 1%
NaCI 1%
Ajustar el pH a 7.4 con NaOH, añadir
agarosa al 0.7% (p/v) y esterilizar en el
autoclave
SM buffer (por litro)

NaCI 5.8 gr
MgS04- 7H2O 2.0 gr
Tr¡s-HCI1M(pH7.5) 50.0 ml
gelatina 2% (p/v) 5.0 mi
Añadir agua destilada hasta 1 L y esterilizar en
autoclave
lOxPBS (por litro)
NaCI 80 gr
KCI 2gr
Na2HP04 • 7 H20 26.8 gr
KH2P04 2.4 gr
Ajustar el pH a 7.4
Añadir agua destilada hasta 1 L y esterilizar en autoclave.
2 X Sample buffer
DTT 100 mM
SDS 2%
Tris-HCI (pH 6.8) 80 mM
Azul de bromofenol 0.006%
Glicerol 15%
214

Isocitrato Deshidrogenasa

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Estudios moleculares, físico-químicos e ingeniería proteica de isocitrato deshidrogenasa de Haloferax volcanii. Adoración Rodríguez Arnedo.

Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 2004

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Alicante, Octubre de 2004

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Memoria presentada para optar al grado de Doctora en Biología por la

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Camacho, M., Rodríguez-Arnedo, A. y Bonete, M. J. (2002) NADP-

Madern, D., Camacho, M., Rodríguez-Arnedo, A., Bonete, M. J. y Zaccai,

Rodríguez-Arnedo, A., Camacho, M., Llorca, F. y Bonete, M. J. (2004)

Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 2004

Deseo expresar mi más sincero agradecimiento a todas aquellas

En primer lugar, a la Dra. María José Bonete y a la Dra. Monica

En segundo lugar, al Dr. Francisco Llorca por su apoyo y por tratarme

A los chicos de "micro"; Lenin, Fernando y Arancha, y a sus directores, la

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En especial, a "mis chicas", Belén, Julia y Vanesa, y a José Luís por

A Elena Soria, desde que empezamos juntas en los departamentos

A toda mi familia, en especial a mis padres, pues sin su ayuda no habría

Y en especial a mi "sol", que me mantiene viva todos los días, tú sufres

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En particular, en la enzima de E. coli, se han realizado estudios de

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Para realizar la gran mayoría de estos estudios es necesario obtener

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3.3.2. Amplificación de la genoteca. 48

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6. Ingeniería de proteínas. 147

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1.1 Obtener la secuencia completa del gen que codifica a la proteína

1.2 Realizar análisis filogenéticos y determinar las regiones clave en la

1.3 Expresar de forma heteróloga el gen que codifica la isocitrato

1.4 Obtener información estructural y de cinética del plegamiento de la

1.5 Realizar estudios de mutagenesis dirigida para cambiar la especificidad

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Antecedentes 2.1. FILOGENIA

El acontecimiento más importante referente al conocimiento completo de

D-isocitrato^^-' + NADCP)"" ^ — • 2-oxoglutarato<2-' + CO2 + NAD(P)H + H