27.

Mtodos para la cuantificacin de protenas

Emilio Fernndez Reyes y Aurora Galvn Cejudo
Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-Crdoba

RESUMEN

En esta prctica se utilizaran tres mtodos para la cuantificacin de protenas: Biuret, Bradford y BCA. Para cada uno de los mtodos se realizaran: una curva estndar, el clculo del coeficiente de extincin y el rango de sensibilidad. Se realizar la cuantificacin de dos muestras problemas de baja y alta concentracin, respectivamente, y se discutir las ventajas e inconvenientes de cada uno de los mtodos. Palabras clave: cuantificacin de protenas, Biuret, Bradford, BCA Abreviaturas: BCA: cido bicinconnico

1. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS 1.1 Mtodos para inconvenientes la cuantificacin de protenas: ventajas e

Determinar la concentracin de protenas en una muestra biolgica es una tcnica de rutina bsica cuando se aborda un esquema de purificacin de una protena concreta, cuando se quiere conocer la actividad especfica de una preparacin enzimtica, para el diagnstico de enfermedades, as como para otros muchos propsitos. Existen diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas. Muchos de estos mtodos se basan en: a) la propiedad intrnseca de las protenas para absorber luz en el UV, b) para la formacin de derivados qumicos, o c) la capacidad que tienen las protenas de unir ciertos colorantes. En la Tabla I se recogen los mtodos ms usados as como sus respectivas sensibilidades. Cada uno de estos mtodos tiene sus ventajas e inconvenientes, las principales se recogen en la Tabla II.

Tabla I. Principales mtodos para la cuantificacin de protenas y sus rangos de sensibilidad Mtodo Mtodos de Absorcin A280 A205 A280 - A260 A235 - A280 A224 - A236 A215 - A225 Mtodos Derivados Colorimtricos Biuret Lowry Rango de sensibilidad (g) 100-3000 3-100 100-3000 25-700 5-180 2-45 Coeficiente de extincin o Clculo de la concentracin 280 = 1 mL/mg cm 205 = 31 mL/mg cm Protena (mg/mL) = (1.55A280 0.76A260) Protena (mg/mL) = (A235 A280)/2.51 Protena (mg/mL) = (A224 A236)/0.6 Protena (g/mL) = 144(A215 A225)

Bradford BCA Mtodos Derivados Fluorimtricos o-ftalaldehido

1000-10000 25-100 a 500 nm 2-30 a 660 nm 1-2 a 750 nm 1-15 0.5- 10 1-5 excitacin a 340 nm emisin a 475 nm

545 = 0.06 mL/mg cm Usar curva estndar 595 = 81 mL/mg cm Usar curva estndar

Usar curva estndar

Tabla II. Principales mtodos para la cuantificacin de protenas, principales ventaja e inconvenientes Mtodo Mtodos de Absorcin Mtodos Derivados Colorimtricos Biuret Ventajas No se pierden las muestras Inconvenientes Interfieren muchos compuestos que absorben en el UV

Lowry

Bastante especfico para protenas Muestra pocas interferencias Es barato Tiene bastante sensibilidad Muy sensible Es el mtodo mas sensible Es el que muestra menos interferencias

Tiene poca sensibilidad

Bradford BCA

No todas las protenas reaccionan igual Mustra muchas interferencias como detergentes no inicos, sulfato amnico etc. Muestra interferencias con detergentes

Mtodos Derivados Fluorimtricos o-ftalaldehido

Muy sensible

La interferencia de aminas contaminantes en la muestra No todas las muestras reaccionan igual

1.2. Mtodo de Biuret Se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptdicos en medio bsico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloracin es directamente proporcional a la cantidad de protenas (enlaces peptdicos) y la reaccin es bastante especfica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del mtodo es muy baja y slo se recomienda para la cuantificacin de protenas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero). 1.3. Mtodo de Bradford Se basa en la unin de un colorante, Comassie Blue G-250 (tambin Serva Blue) a las protenas. El colorante, en solucin cida, existe en dos formas una azul y otra naranja. Las protenas se unen a la forma azul para formar un complejo protena-colorante con un coeficiente de extincin mayor que el colorante libre. Este mtodo es sensible (1-15 g), simple, rpido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinacin. Entre las sustancias que interfieren estn los detergentes y las soluciones bsicas.

1.4. Mtodo de BCA El cido bicinconnico, sal sdica, es un compuesto capaz de formar un complejo prpura intenso con inones Cu1+ en medio alcalino. Este reactivo forma la base de un mtodo analtico capaz de monitorizar el in cuproso producido en una reaccin entre las protenas con Cu2+ en medio alcalino (reaccin de Biuret). La estabilidad del reactivo y el cromforo proporciona un mtodo para la cuantificacin de protenas que es sencillo, rpido, muy sensible, y que muestra una gran tolerancia a compuestos que afectan a otros mtodos.
Protena + Cu
2+

OH Cu1+

Cu1+ + BCA

complejo prpura BCA- Cu1+

1.5. Objetivos Con esta prctica se pretende introducir al alumno en los diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas: su fundamento, sus ventajas e inconvenientes. Se utilizarn tres mtodos (Biuret, Bradford y BCA), para cada uno de ellos se realizar una curva estndar, se determinar el coeficiente de extincin, el rango de sensibilidad, y se realizar la cuantificacin de dos muestras problemas. 2. LISTADO DEL MATERIAL NECESARIO Tubos de ensayo Pipetas de automticas regulables de 20-100 l y de 200-1000 l
3

Espectofotmetro Agua destilada Soluciones estndar de protena Reactivo de Biuret Reactivo de Bradford Reactivo de BCA 3. PROTOCOLO A REALIZAR 3.1. Mtodo de Biuret Aadir 1 ml del reactivo de biuret a los tubos estndar y muestras problemas preparadas como se indica en la Tabla III. Dejar a temperatura ambiente y leer la Absorbancia a 545 nm frente al blanco. El color es estable 1 hora.
Tabla III. Protocolo tipo para la cuantificacin de protenas por el mtodo de Biuret Reactivos Resultados Estndar A545 nm Tubos [protena] (20 mg/ml) H2O R. Biuret Blanco 1 ml 0 l 100 l 1 1 ml 25 l 75 l 2 1 ml 50 l 50 l 3 1 ml 75 l 25 l 4 1 ml 100 l 0 l Muestras M1 1 ml 100 l 0 l M2 1 ml 100 l 0 l

- Representa la curva estndar. - Calcula el coeficiente de extincin. - Calcula las concentraciones de protenas de las muestras M1 y M2. 3.2. Mtodo de Bradford Aadir 1 ml del reactivo de Bradford a los tubos estndar y muestras problemas preparadas como se indica en la Tabla IV. Dejar a temperatura ambiente y leer Absorbancia a 595 nm frente al blanco. El color es estable 1 hora.
Tabla IV. Protocolo tipo para la cuantificacin de protenas por el mtodo de Bradford Reactivos Resultados Estndar A595 nm Tubos [protena] (0,5 mg/ml) H2O R. Bradford Blanco 1 ml 0 l 100 l 1 1 ml 25 l 75 l 2 1 ml 50 l 50 l 3 1 ml 75 l 25 l 4 1 ml 100 l 0 l Muestras M1 1 ml 100 l 0 l M2 1 ml 100 l 0 l

- Representa la curva estndar. - Calcula el coeficiente de extincin. - Calcula las concentraciones de protenas de las muestras M1 y M2. 3.3. Mtodo de BCA Aadir 1 ml del reactivo de trabajo de BCA a los tubos estndar y muestras problemas preparadas como se indica en la Tabla V. Incubar 10 min a 60 C y leer Absorbancia a 562 nm frente al blanco.
Tabla V. Protocolo estndar para la cuantificacin de protenas por el mtodo de BCA Reactivos Resultados Estndar A562 nm Tubos [protena] (0,1 mg/ml) H2O R. BCA Blanco 1 ml 0 l 100 l 1 1 ml 25 l 75 l 2 1 ml 50 l 50 l 3 1 ml 75 l 25 l 4 1 ml 100 l 0 l Muestras M1 1 ml 100 l 0 l M2 1 ml 100 l 0 l

- Representa la curva estndar. - Calcula el coeficiente de extincin. - Calcula las concentraciones de protenas de las muestras M1 y M2. 3.4. Compuestos que interfieren en la determinacin de protenas Repetir las curvas estndar para cada uno de los tres mtodos pero incluyendo se pueden incluir : 10 l de 1M EDTA , 10 l de Tritn X-100, 10 l de SDS 20% Determinar cmo estos compuestos afectan a la cuantificacin de protenas por uno u otro mtodo. 4. RESULTADOS ESPERADOS El mtodo de Biuret (poco sensible) permitir cuantificar la cantidad de protenas en la muestra M1 pero no en la M2. Por el contrario los mtodos mas sensibles (Bradford y BCA) permitirn cuantificar la muestra M2, pero la M1 se saldr de rango. Para poder cuantificar la muestra M1 hara falta hacer diluciones de la misma. 5. EJERCICIOS, DISCUSIN Y COMENTARIOS Qu mtodo es el ms sensible?, y el menos sensible?. Qu problemas tienes para determinar la concentracin de protenas de las muestras M1 o M2. con cada una de estos mtodos?. Cmo lo resolveras?. Discute tus resultados de acuerdo con los datos de la Tabla VI .
5

Decide qu mtodo de determinacin de protenas elegiras para la cuantificacin de protenas en: suero, orina, LCR, durante una purificacin enzimtica, en un extracto bacteriano concentrado, en preparaciones de membranas plasmticas solubilizadas con SDS, en preparaciones de membranas mitocondriales solubilizadas con Tritn X-100.

Tabla VI. Algunos compuestos que interfiren en la determinacin de protenas Compuesto Interferencia en el Mtodo de Interferencia en el Mtodo de BCA Lowry 50 mM EDTA Si Si 4 M Cloruro de guanidina N0 Si 1% Triton X-100 No Si 40% Sacarosa No Si 20% Sulfato amnico Si Si 3% Sulfato amnico No Si

ANEXO 1: REACTIVOS Reactivo de Biuret Reactivo preparado del siguiente modo. Disolver 3,8 g de CuSO4.5H2O y 6,7 g NaEDTA en 700 ml de H2O. Mientras se agita aadir 200 ml de NaOH 5N y luego 1g de KI como estabilizante. Guardar en frasco de plstico. Reactivo de Bradford Reactivo preparado del siguiente modo: mezclar 10 mg de Comassie Blue G-250 con 10 ml de fosfrico al 88% y 4,7 ml de etanol absoluto. Aadir H2O hasta 100 ml. Filtrar a travs de papel de filtro y guardar en la oscuridad. Reactivo de BCA Reactivo preparado del siguiente modo. Reactivo A: BCA 1%, Na2CO3 2%, tartrato sdico 0,16%, NaOH 0,4% y NaHCO3 0,95%. Ajustar a pH 11,25 con NaOH. Reactivo B: CuSO4 al 4% Reactivo de trabajo: mezclar 100 volmenes de A con 2 volmenes de B. Soluciones estndar de protenas Seroalbmina bovina 20 mg/ml Seroalbmina bovina 0,5 mg/ml Seroalbmina bovina 0,1 mg/ml Muestras M1 y M2 La muestra M1 debe tener una concentracin de protenas entre 10 20 mg/ml La muestra M2 debe tener una concentracin de protenas entre 0,1- 0,5 mg/ml

6. BIBLIOGRAFA Bradford MM (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72: 248-254. Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ, Klenk DC (1985): Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem 150: 76-85. Suelter CH (1985): A Practical guide to enzymology, Editorial, John Wiley & Sons, New York.