1.

EXPLICACION DE TRABAJOS PRACTICOS MICROBIOLOGIA GENERAL- BIOQUIMICA

-2007

MEDIOS DE CULTIVO
INTRODUCCION Las bacterias son organismos muy verstiles. Presentan un gran potencial en su capacidad de utilizar disitntas fuentes de alimentos, desde sustancias inorgnicas hasta materias orgnicas sumamente complejas. Muchas especies han aprendido a crecer en una amplia diversidad de nichos ecolgicos con temperatura, acidez o tensiones de oxgeno extremas. Es muy difcil estudiar microorganismos en forma individual; lo ms prctico es trabajar con poblaciones de los mismos. Para lograr estas poblaciones es necesario disponer de un medio artificial que brinde a los microorganismos todos los requerimientos nutricionales para desarrollarse. Este ambiente artificial se denomina MEDIO DE CULTIVO. * MEDIO DE CULTIVO es toda preparacin artificial, slida, semislida o lquida que suministra al microorganismo cada una de las sustancias fundamentales, una fuente de energa y condiciones ambientales adecuadas para la sntesis y mantenimiento de su protoplasma. CULTIVOS: son las poblaciones de microorganismos que se obtienen en los medios de cultivo. Los cultivos pueden ser: a) puros o axnicos, cuando la poblacin est constituida por una nica clase de microorganismos. b) mixtos, cuando la poblacin est constituida por ms de una clase de microorganismos. En la actualidad, la mayora de los grmenes patgenos se pueden cultivar fuera de su hbitat natural. Ciertos parsitos obligados como las Rickettsias, nunca han podido cultivarse en medios artificiales; requieren clulas vivas, cultivos de tejidos o embriones de pollo. CLASIFICACION DE LOS MICROORGANISMOS SEGN LA FUENTE DE ENERGIA Y CARBONO QUE UTILIZAN Al disear un medio de cultivo es importante conocer los requerimientos de energa y carbono de las especies a cultivar.

- Fuente de energia, puede ser:

- luz: energa luminosa que se convierte en energa qumica. Los microorganismos que utilizan esta fuente de energa se denominan fototrofos. - reacciones de oxido-reduccin a partir de compuestos qumicos inorgnicos u orgnicos. Los microorganismos que utilizan esta fuente de energa se denominan quimiotrofos. Todos los organismos requieren una fuente de energa para obtener ATP y generar poder reductor (NADH, NADPH) por alguno de los siguientes metabolismos: - respiracin aerobia: aceptor final de electrones O2 - respiracin anaerobia: aceptores finales de electrones: NO3-, SO4=, CO2, fumarato - fermentacin: conjunto de reacciones donde compuestos orgnicos sirven como donadores y receptores de electrones. Se produce ATP por fosforilacin a nivel de sustrato. - Fotosntesis
- Fuente de carbono, puede ser:

- CO2: los microorganismos que utilizan esta fuente de carbono se denominan autotrofos. - compuestos orgnicos carbonados (azcares, aminocidos, cidos grasos, etc). Los microorganismos que utilizan estas fuentes de carbono se denominan heterotrofos. De la combinacin de estas categoras surge la sig. clasificacin de microorganismos:
Fuente de energa Ejemplos Fuente de carbono Categora

Luz

CO2 acetato Alg. bacterias

Fotoautotrofos

Algas, cianobacterias Fotoheterotrofos

Reacciones CO2 Quimiolitotrofos Bacterias oxidantes de de xido-reduccin del azufre, de Fe2+ compuestos orgnicos Quimioorganotrofos Hongos, bacterias Fotoautotrofos = fotolitotrofos Fotoheterotrofos = fotoorganotrofos COMPOSICION QUIMICA DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

H2,

Cuando se disea la frmula del medio de cultivo, es necesario conocer en qu categora est incluido el microorganismo a cultivar para elegir acertadamente los componentes del medio: generalmente compuestos inorgnicos para microorganismos fototrofos y quimiolitotrofos, y orgnicos para quimioorganotrofos. Un medio de cultivo est integrado por: 1. Elementos energticos y constitutivos: a) Macroelementos (g/l): Fuente de carbono: puede ser CO2 compuestos carbonados orgnicos. Se utilizan en la construccin de innumerables molculas necesarias para la clula. Los hidratos de carbono se consideran fuente de carbono y energa por excelencia en los quimioorganotrofos. Los ms comunes son: hexosas como glucosa, fructosa, galactosa; pentosas como arabinosa, xilosa, ramnosa; disacridos como lactosa, sacarosa, maltosa; trisacridos como rafinosa; polisacridos como almidn, glucgeno; alcoholes como glicerol, sorbitol, manitol; y glucsidos como salicina, y esculina. Fuente de nitrgeno: muchos organismos son autotrofos respecto de la fuente de nitrgeno y pueden crecer utilizando molculas sencillas como NO3-, NH3 N2. El nitrgeno es metabolizado para proveer protenas, cidos nucleicos y polmeros de pared. Otros microorganismos pueden incorporar nitrgeno en forma de aminocidos, bases pricas o pirimdicas. ** En ciertos medios de cultivo para quimioorganotrofos, el aporte de nitrgeno es realizado por las peptonas, que son

los productos de la hidrlisis cida o enzimtica de protenas de origen animal o vegetal (carne, soja, casena, gelatina, harina de maz y girasol). Esos productos de hidrlisis pueden tener longitud variable, desde aminocidos, hasta dipptidos, tripptidos, polipptidos, albumosas, proteosas. La hidrlisis cida puede ser realizada con HCl H2SO4 y presenta las siguientes desventajas: - el triptofano se destruye - se pierde el 10% de vitaminas presentes - desaparecen casi completamente los polipptidos Se prefiere la hidrlisis enzimtica que emplea diferentes proteasas actuando a pH especficos, ej. papana a pH 6.5, tripsina a pH 8.5, pepsina a pH 2. Las peptonas son fuente de nitrgeno y, en ausencia de hidratos de carbono en el medio de cultivo complejo, cumplen la funcin de fuente de carbono y energa. Aportan vitaminas del grupo B, trazas de metales y fosfatos que dan carcter buffer al medio. Las peptonas de origen vegetal pueden aportar carbohidratos fermentables. Fuente de fsforo: se suelen agregar fosfatos de sodio o potasio que tambin confieren poder buffer al medio de cultivo (pH cercano a 7). Si se agrega yema de huevo al medio de cultivo, el aporte de P es realizado por los glicerofosfolpidos de la yema. El fsforo se incorpora a cidos nucleicos, fosfolpidos, polmeros de membrana, ATP, y sustancias de reserva (grnulos de volutina) Fuente de azufre: se adiciona como SO4=, cisterna o metionina. En la clula se incorpora a aminocidos y diferentes coenzimas. Fuente de calcio, magnesio y potasio: potasio, calcio y magnesio se adicionan como sales inorgnicas. Son cationes que estabilizan macromolculas aninicas. K+ acta como coenzima y estabilizador de RNA. Mg2+ se integra a colorofila en organismos fotosintticos. Ca2+ abunda en esporas como dipicolinato de calcio. Fuente de sodio: sodio contribuira a equilibrar la presin osmtica del medio extracelular. Es un catin requerido por bacterias haloflicas. Se suele suministrar como NaCl. b) Microelementos o trazas (mg ug/ml): suelen estar naturalmente presentes como contaminantes de los macroelementos.

* Frecuentemente esenciales: Mn: estimula el crecimiento, favorece la esporulacin. Fe: cofactor de enzimas para la funcin respiratoria en citocromos, catalasa y flavoprotenas. En adecuada concentracin favorece la sntesis de toxina diftrica. Co: interviene en la sntesis de vitamina B12. Cu: presente en oxidasa terminal de la cadena respiratoria. Esenciales en casos especiales: B, Al, Si, V, As, Se, Mo, Sn, Be, F, etc. Inhibidores del crecimiento: Au, Ag, Cd, Cr, Pb, y cualquier microelemento a concentracin mayor que 10-4 M puede resultar txico para el desarrollo de los microorganismos.
2. Factores de crecimiento

Son compuestos orgnicos especficos requeridos en muy bajas concentraciones que no pueden ser sintetizados por la clula que los necesita. Por esta razn, deben ser agregados al medio de cultivo. Ej.: principalmente vitaminas del grupo B, algunos aminocidos, purinas, pirimidinas, cidos grasos. Hay ejemplos clsicos como los factores X y V (porfirinas) de la sangre requeridos por la bacteria Haemophilus influenzae para crecer. El suero fetal bovino, que aporta numerosos factores de crecimiento, es imprescindible para el cultivo de clulas animales. Cmo surge la necesidad de un factor de crecimiento? La capacidad de sintetizar un compuesto esencial est relacionada con una secuencia de reacciones catalizadas por enzimas que se completa satisfactoriamente. Cuando por alteraciones genticas, alguna enzima de la secuencia no puede ser sintetizada, la serie de reacciones se bloquea en algn paso y no finaliza con xito. El compuesto que por esta razn dej de sintetizarse, se convierte en un factor de crecimiento. ** En ciertos medios de cultivo para quimioorganotrofos, los factores de crecimiento pueden ser aportados por diversos extractos: -Extracto de carne: su funcin es ser complemento vitamnico de las peptonas. Pero tambin aporta sustancias nitrogenadas como: aminocidos, bases pricas y pirimdicas, cidos orgnicos, creatina, xantina, hipoxantina, cido rico, urea, y sustancias no nitrogenadas como glucgeno, fosfatos de hexosas, cido lctico, sales inorgnicas. La calidad de este tipo de extracto vara con la carne empleada, el tiempo y la temperatura de extraccin.

-Extracto de levadura: se obtiene por autolisis o plasmolisis de las clulas de levadura. Su funcin es ser suplemento vitamnico de las peptonas, pero tambin aporta mezclas de aminocidos y pptidos, y carbohidratos. -Extracto de malta: es un interesante sustituto del extracto de levadura ya que posee adecuado contenido de vitaminas, carbohidratos y aminocidos. Es el extracto soluble en agua de la malta de cebada.
3. Agentes solidificantes

Su agregado al medio de cultivo es opcional. El ms usado: el agar, es un polisacrido cido derivado de algas marinas, formado principalmente por galactosa con un grupo sulfato cada 10 a 50 restos. Suele contener sustancias nutritivas en pequeas concentraciones, y por esto no puede ser utilizado en medios de composicin qumica estrictamente definida destinados a autotrofos. Se usa sin problemas en medios de cultivo complejos para quimioorganotrofos. Se agrega al 1.5-2% en medios de consistencia slida normal, al 0.2-0.3% en medios semislidos o blandos, al 5% en medios de consistencia muy firme para detener el crecimiento de grmenes muy mviles, y al 0% cuando se preparan medios lquidos (caldos). Sus caractersticas: Funde a 80-100C y permanece lquido hasta 50-55C. A 45-55C se pueden agregar suspensiones de clulas sin afectar la viabilidad (supervivencia) de las mismas. Permanece slido a 37C, temperatura de incubacin de la mayora de las bacterias patgenas del hombre. No es txico para las bacterias, ni es degradado por stas. Utilizado al 1.5-2%, permite el aislamiento de colonias (poblaciones de microorganismos derivadas de una nica clula), lo que resulta imposible en medios lquidos! Es transparente, lo que facilita la visualizacin de las colonias. Al solidificar, forma una trama suficientemente abierta para permitir la difusin de los nutrientes del medio de cultivo en todas direcciones, y suficientemente cerrada segn la concentracin empleada- para impedir la movilidad de los microorganismos.

Otros solidificantes:

Agarosa: es agar muy transparente libre de sulfatos. Se usa intensamente para fines especficos en Inmunologa y Biologa Molecular. - Silicagel: es silicato diluido en HCl. Se emplea en medios de cultivo para autotrofos, cuando debe excluirse materia orgnica del medio de cultivo. - Gelatina: es una protena obtenida por hidrlisis del colgeno. Fue el primer solidificante usado en Microbiologa, pero es degradado por la mayora de las bacterias (lo comen, por lo que el medio inicialmente slido termina convertido en medio lquido) y la temperatura de incubacin no puede ser mayor a 22C (es el punto de fusin) con lo que cultivos slidos a temperaturas ms altas resultan inviables. - Albmina de huevo, suero: a 80C estas protenas coagulan y solidifican el medio de cultivo.
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4. Agua El agua representa una altsima proporcin (80-90%) del peso total de una clula y es fundamental para la realizacin de todos los procesos metablicos, funciones enzimticas, solvatacin de materiales orgnicos e inorgnicos, donacin de electrones para organismos fotosintticos. Los medios de cultivo se preparan en el laboratorio con agua destilada lo que estandariza su composicin y asegura la ausencia de iones como Ca2+ y Mg2+ que pueden precipitar con fosfatos o generar reacciones indeseables. CONDICIONES FISICAS DE UN MEDIO DE CULTIVO An cuando las condiciones qumicas del medio de cultivo estn cubiertas, el crecimiento y desarrollo de los microorganismos no tendr lugar si se desconocen las siguientes condiciones fsicas: - temperatura: crecimiento. cada especie tiene su temperatura ptima de

* mesfilos: 35-37C * psicrfilos: 15-20C * termfilos: 50-60C -presin osmtica: la mayora de las bacterias crece en 0.1 a 1% NaCl. Las halfilas requieren concentraciones superiores. -presencia de oxgeno: segn sus requerimientos de O2 las bacterias se clasifican en:

* aerobios estrictas: requieren oxgeno para crecer. Metabolismo respiratorio. * microaerfilos: necesitan bajas tensiones de O2 y una atm enriquecida en CO2. Pueden realizar respiracin aerobia. *anaerobios obligados: el O2 les resulta txico. Crecen en medios muy reducidos (sin O2). Metabolismo fermentativo. * anaerobios aerotolerantes: crecen en ausencia de O2 (metabolismo fermentativo) y cuando son expuestos al O2 no mueren. *anaerobios facultativos: pueden crecer en condiciones aerobias (metabolismo respiratorio) como anaerobias (metabolismo fermentativo). -humedad: todas bacterias necesitan un ambiente mucho ms hmedo para su desarrollo que los hongos. En condiciones ambientales adversas, algunas especies producen estructuras de resistencia a la desecacin llamadas esporas que permanecen viables durante tiempo prolongado hasta que el ambiente sea propicio para la germinacin. Producen esporas los gneros Clostridium (ej. C. tetani,, C. botulinum), Bacillus (ej. B. cereus, B. subtilis), Sporosarcina, entre otros. - luz: es importante para los microorganismos fotosintticos. -pH: la mayora de las bacterias crece en medio neutro o ligeramente alcalino (7 7.6). Excepciones son los lactobacilos (pH 5, acidfilos), Vibrio cholerae (pH 8.6,). Los hongos crecen a pH menor que 7. CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO a) Por su consistencia (esto depende de la inclusin o no de un agente solidificante) -lquidos colonias) -slidos (permiten el aislamiento y observacin de colonias) b) Por su origen (esto depende de que la frmula se pueda describir qumicamente con precisin) -sintticos: estrictamente definidos desde el punto de vista qumico, generalmente (no permiten el aislamiento de

se usan para cultivar fototrofos y quimiolitotrofos. -naturales o complejos: se preparan a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal de composicin qumica no rigurosamente constante: leche, suero, macerado de maz, peptonas, ex tractos de carne, levadura. Son aptos para el cultivo de quimioorganotrofos. Son los que prepararemos y usaremos en el Laboratorio de Microbiologa. c) Por su composicin: - comunes: incluyen una frmula nutritiva bsica que permite el crecimiento de microorganismos poco exigentes. - enriquecidos: mejoran su calidad nutritiva por el agregado de componentes muy ricos como leche, sangre, huevo, lquido asctico, extracto proteico de cianobacterias. Se utilizan en el cultivo de bacterias exigentes. d) Por su funcin: - Medios de enriquecimiento: son medios lquidos que sembrados con poblaciones mixtas de microorganismos, favorecen la multiplicacin de ciertos grupos e inhiben el desarrollo de las especies restantes. Para funcionar de esta manera incluyen compuestos qumicos especficos o requieren condiciones fsicas especiales (temperatura, pH). Ej.: agua peptonada alcalina favorece el desarrollo de Vibrio cholerae tolerante a pH alto e inhibe otros microorganismos presentes en la misma muestra; caldo selenito contiene selenito de sodio que favorece la proliferacin de especies como Salmonella y Shigella pero inhibe otras enterobacterias; caldo EC a 44.5C, una temperatura que favorece a Escherichia coli y no a otras bacterias. - Medios selectivos: son medios slidos que de manera parecida a los anteriores, permiten el desarrollo de ciertos microorganismos e impiden el desarrollo de otros. La selectividad se logra alterando las condiciones fsicas del medio de cultivo o agregando compuestos qumicos inhibidores. Ej: - cambiando pH: para favorecer el desarrollo de Lactobacillus, un gnero implicado en la produccin de yogur, se puede agregar cido actico a los medios de cultivo para obtener un pH final de 5.4, totalmente inadecuado para muchas bacterias acompaantes.

- altas concentraciones osmticas: en agar manitol salado con una concentracin de NaCl de 7.5% muy pocas bacterias pueden crecer, salvo las que presenten una elevada tolerancia a NaCl, como Staphylococcus aureus - agregando antispticos: colorantes como verde brillante, cristal violeta y eosina, se utilizan para inhibir grmenes Gram positivos mientras los Gram negativos desarrollan sin dificultad. Las sales biliares se usan con el mismo propsito. - agregando antibiticos: en Ingeniera Gentica es prctica rutinaria la inclusin de antibiticos (ampicilina, tetraciclina) en los medios de cultivo para poner en evidencia la presencia de bacterias genticamente manipuladas. Estas clulas son resistentes a uno o ms antibiticos y pueden desarrollar en un medio que los incluye, mientras las clulas acompaantes, sensibles a los antibiticos, no pueden crecer. En Microbiologa Clnica, se usan antibiticos de espectro de accin reducido que inhiben o destruyen microorganismos cuyo estudio no interesa, a la vez que no afectan los grmenes que se estn investigando. -Medios diferenciales: permiten demostrar caractersticas metablicas de un determinado grupo de microorganismos. Por ej.: puede el germen A utilizar glucosa por una va fermentativa? Si agregamos glucosa a un medio de cultivo slido y un indicador de pH que indique por cambio de color si el azcar ha sido fermentado o no, estaremos analizando una caracterstica metablica de A. Existen medios diferenciales donde se pueden detectar varias caractersticas metablicas distintas. La clave es incluir en la frmula del medio de cultivo a usar: , el sustrato adecuado para la caracterstica metablica que se desea estudiar y un sistema indicador que refleje por variacin de color u otro fenmeno perceptible, los cambios que hayan tenido lugar. Las pruebas bioqumicas que veremos en los Trabajos Prcticos son claros ejemplos de medios de cultivo diferenciales. -Medios de transporte: se usan cuando se transcurre cierto tiempo entre la toma de una muestra y su procesamiento. Incluye compuestos que aseguran la supervivencia de las clulas hasta que sean sembradas en un medio de cultivo adecuado. IMPORTANTE: un gran nmero de medios de cultivo tienen funciones mixtas. Ej.: puede ser enriquecido porque lleva sangre y selectivo porque incluye algn antibitico. Puede ser selectivo porque incluye inhibidores y diferencial porque pone en evidencia propiedades metablicas.

EJERCICIOS DE APLICACIN
1. Para un microorganismo fotoautotrofo mencione qu componentes

tendra en cuenta para disear un medio de cultivo qumicamente definido o sinttico que incluye: - fuente de carbono: - fuente de energa: - fuente de nitrgeno:
2. Para un microroganismo quimioorganotrofo qu componentes

tendra en cuenta para disear un medio de cultivo complejo o qumicamente indefinido que incluye: fuente de carbono: fuente de nitrgeno: fuente de energa: 3. En el Trabajo Prctico tendremos ocasin de preparar algunos de los siguientes medios de cultivo: a) Caldo nutritivo Extracto de carne. 0.3 g a.1. Qu aporte realiza cada componente? Peptona de carne . 0.5 g a.2. Si no hay hidratos de carbono, qu componente aporta C? NaCl . 0.5 g a.3 Cul es la fuente de energa en el medio de cultivo? Agua destilada. 100 ml a.4. Clasifique este medio por su consistencia, origen y composipH: 7- 7.2 cin. Qu clase de microorganismos segn fuente de C y energa- creceran en l? b) Agar nutritivo Extracto de carne. 0.3 g b.1. Qu aporte realiza cada componente? Peptona de carne . 0.5 g b.2. Qu componente aporta los factores de crecimiento? NaCl . 0.5 g b.3 Cul es la fuente de energa en el medio de cultivo? Agar . 1.5 g b.4. Clasifique este medio por su consistencia, origen y composiAgua destilada. 100 ml cin. Qu clase de microorganismos segn fuente de C y pH: 7 -7.2 energa- creceran en l?

c) Medio BW3 K2HPO4 ... 0.25 g c.1. Mencione fuente de carbono y fuente de nitrgeno CO2 burbujeo constantec.2 Cul sera la fuente de energa? MgSO4 ... 0.0375 g c.3. Por su consistencia y su origen, cmo clasificara este medio? Na2MoO4... 2.5 x 10-3 g c.4. Para qu clase de grmenes segn fuente de C y de energaNaVO3 .. 1.24 x 10-4 g sera adecuado? KNO3 . 1 g Agua destilada 1000 ml d) Cul de los siguientes componentes agregara a un medio de cultivo comn para convertirlo en un medio enriquecido? - agua destilada -penicilina -suero fetal bovino -colorantes - sangre de oveja -leche -extracto proteico de cianobacterias -sales biliares -antispticos -yema de huevo -agar e) Se desea propiciar el desarrollo de un grupo A de microorganismos quimioorganotrofos, acidfilos y resistentes a penicilina, incluidos en una poblacin mixta formada por los grupos A, B y C. Los grupos B y C pertenecen a flora acompaante. e.1. Qu medio de cultivo sera ms adecuado para lograr ese propsito? (marque la/s respuesta/s correcta/s) - un medio de transporte - un medio enriquecido -un medio de enriquecimiento - un medio selectivo -un medio slo diferencial e.2. Disee un medio de cultivo complejo semislido que incluya una fuente de C, una fuente de energa, una fuente de N y factores fsicos y/o qumicos que favorezcan slo el desarrollo del grupo A.