Ingeniera Gentica

Silvia L. Ara Rojas

Definiciones
Tcnica que consiste en la introduccin de genes en el genoma de un individuo que carece de ellos Se realiza a travs de enzimas de restriccin (ER) ADN recombinante (ADNr) = ADN formado luego de intercalar un segmento de ADN extrao en un ADN receptor

Transferencia de genes en animales

BIOTECNOLOGA
Cultivo de Clulas Vegetales Diagnsticos

Frmacos Anti-cncer

Solucin de crimenes Tecnologa del ADN Bancos de ADN, ARN Protenas Mapas de Genomas completos

Biologa Molecular
Ingeniera Gentica
Sntesis de Nuevas Protenas Nuevas Plantas y Animales Nuevos Alimentos Nuevos Antibiticos Clonacin Produccin de Protenas humanas Recursos humanos qumicos raros Terapia Gnica

Marcadores

Sntesis de Sondas de ADN

Localizacin desrdenes genticos

AVANCES HISTRICOS
1941 Genes codifican las protenas 1944 Prueba que el ADN porta la informacin gentica 1953 Determinacin de estructura del ADN 1961 Cdigo Gentico, ARN mensajero, regulacin gnica 1967 Wise y Richardson aislaron ADN ligasa 1970 Smith y colegas aislaron y caracterizaron la Hind III 1972 Janet Mertz y Ron Davis cortaron y pegaron mol de ADN 1973 Stanley Cohen y H. Boyer pusieron ADNr en bacterias 1977 Fred Sanger secuenci el virus de ADN X174 1978 Biblioteca gnica humana 1979-81 genes humanos clonados y secuenciados

R. ALEGRA CONACYT 2002

AVANCES HISTRICOS
1982 Tabaco, la primera planta modificada genticamente 1983 Kary Mullis concibe el PCR / Fred Sanger y colegas
publican la secuencia del lambda 1986 La secuenciacin del ADN es automatizada 1987 Inicia el Proyecto del Genoma Humano 1995 Es secuenciado la bacteria Haemophillus influenzae 1996 Es secuenciada la levadura Saccharomyces cerevisiae 1998 Es secuenciado el nemtodo Caenorhabditis elegans 1999 Es secuenciado el cromosoma 22 humano 2000 Es secuenciada la mosca de la fruta D. melanogaster / 26 de junio se presenta 90% borrador genoma humano 2000 14 de dic. secuencia de Arabidopsis thaliana 2001 26 de enero borrador genma del arroz Oriza sativa
R. ALEGRA CONACYT 2002

Tcnicas que incluye la IG

Tecnologa del ADN recombinante
Aislar y manipular un fragmento de ADN de un organismo para introducirlo en otro.

Secuenciacin del ADN:

Orden o secuencia de los nucletidos que forman parte de un gen.

Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

Aumentar el nmero de copias de un fragmento determinado de ADN

Tecnologa del ADNr

Permite obtener fragmentos de ADN en cantidades ilimitadas, que llevar adems el gen o los genes que se desee Este ADN puede incorporarse a las clulas de otros organismos (vegetales, animales, bacterias...) en los que se podr "expresar" la informacin de dichos genes.

En la tecnologa del ADN recombinante podemos diferenciar cuatro etapas bsicas:

1. 2. 3. 4. Corte especfico del ADN Hibridizacin de segmentos de restriccin Clonacin de genes Secuenciacin de genes

Enzimas de restriccin
Endonucleasas
Cortan los enlaces fosfodiester a partir de ua secuencia que reconocen.

Reconocen una secuencia palindrmica de 4-8 pb

Se lee igual en ambas direcciones

Sitio de reconocimiento = sitio de restriccin

Rompe enlace fosfodiester en la hebre de arriba y otro en la complementaria

Son extradas de bacterias

Actuan como mecanismo de defensa para degradar material gentico extrao que entre en la clula.

Nomenclatura
Nombre dado segn el gnero y la especie de la bacteria de donde se aisl por primera vez esta enzima La primera letra representa el gnero de la bacteria Las prximas dos indican la especie Una cuarta letra indica la cepa y un nmero al final indica la cantidad de enzimas que se han aislado de esa cepa. Ej:
Eco RI

E = gnero Escherichia co = especie coli R = cepa RV 13 I = primera endonucleasa aislada de esta cepa

Las enzimas de restriccin al cortar DNA pueden producir dos tipos de cortes:
Cohesivos o pegajosos: cortan a manera escalonada en dos puntos diferentes.

Abruptos: cortan en un slo punto.

Una molcula de DNA cortada con enzimas de restriccin genera diferentes fragmentos. Estos pueden ser separados en base a su tamao utilizando un gel de electroforesis. El gel puede estar hecho de agarosa o poliacrilamida

Concentracin de agarosa

Aplicaciones de las ER
Mapas de restriccin
plsmido o bacterifago.

Fragmentar DNA genmico para separacin de electroforesis Generacin de fragmentos para ser usados como sondas marcadas

Generacin de fragmentos para ser subclonados en los vectores apropiados, creacin de DNA recombinante

RFLP= Restriction Fragment Lenght Polymorphism

Polimorfismo de longitud de fragmentos de restriccin Anlisis que mide fragmentos de DNA que contienen pequeas secuencias que varan de indivduo a indivduo (VNTRs) Variaciones en las bases nitrogenadas en el sitio donde corta la ER Variaciones que afectan el tamao de los fragmentos resultantes

Aplicaciones de las RFLP

Identificacin de cepas Estudio de mutaciones genticas Estudios de paternidad Estudios forenses Etc.

Etapas
Extraccin (purificacin) de ADN
Amplificacin de 1 regin (PCR) Fragmentacin (ER) Separacin por Electroforesis

Estudio de paternidad

MADRE

PADRE

NIO 1

NIO 2

NIO 3

NIO 4

Anlisis por hibridizacin

Construccin de libreras
Vectores Clonacin

Vectores
Los vectores de clonacin son pequeas molculas de ADN con capacidad para autoreplicarse dentro de clulas hospedadoras Tipos
Plsmidos
ADN circular (origen de replicacin)5000 a 40000 pb Zonas de restriccin Genes de resistencia a antibiticos

Bacteriofagos (virus que infectan bacterias) Csmidos

Combinacin de fago y plsmido

BACs (bacterial artificial chromosome) YACS (yeast artificial chromosome)

Clonacin
Definicin
clonar es aislar y multiplicar en tubo de ensayo un determinado gen o, en general, un trozo de ADN
clonar significa obtener uno o varios individuos a partir de una clula somtica o de un ncleo de otro individuo, de modo que los individuos clonados son idnticos o casi idnticos al original

Definiciones
Clon segn Dic. R.A.E. (Del gr. , retoo).
1 m. Biol. Conjunto de clulas u organismos genticamente idnticos originados por reproduccin asexual a partir de una nica clula u organismo o por divisin artificial de estados embrionarios iniciales.

2 m. Biol. Conjunto de fragmentos idnticos de cido esoxirribonucleico (ADN) obtenidos a partir de una misma secuencia original.

Clonacin molecular
Obtencin de ADN donador Obtencin del gen de inters Insercin del gen en vectores de clonacin Introduccin del vector a clulas hospedadoras Comprobacin de la presencia y expresin del gen Clonado del ADN: multiplicacin de la clula hospedadora

Insercin en plsmidos

Insercin en bacteriofagos

Insercin en csmidos

Introduccin en clulas hospedadoras

ETAPAS DE UN EXPERIMENTO DE CLONADO

IN VITRO
E. coli K12 portadora del vector Clula que contiene el DNA de inters

IN VIVO
E. coli K12 a ser transformada

Clulas competentes

1 PURIFICACIN DEL DNA 4 TRANSFORMACIN

2 DIGESTIN

3 LIGACIN 5 SELECCIN DE CLONES TRANSFORMANTES 6 DETECCIN DE CLONES RECOMBINANTES

DETECCIN DE LOS CLONES RECOMBINANTES

REPLICA-PLATING

Placa de transformacin Ej.: medio con tetraciclina para la seleccin Se replica sobre el terciopelo, dejando material de las colonias en sus posiciones relativas Tambor recubierto de terciopelo estril

Placa de deteccin Ej.: medio con ampicilina Se posa sobre el terciopelo marcado con las colonias y el material pasa a la placa.

Se incuba.
Las colonias que crecen slo tienen vector. Las colonias que no crecen tienen plsmidos recombinantes.

Construccin de libreras
Librera genmica
Series de plsmidos que contienen una serie de trozos de ADN correspondientes a un genoma

Bibliotecas de ADN complementario o copia (ADNc)

Series de plsmidos que contienen trozos de ADN generado por transcriptasa reversa a partir de ARNm (librera de ADNc)

Secuenciacin de ADN
Mtodos
Qumico de Maxam y Gilbert Enzimtico de Sanger (terminadores de cadena) o del didesoxi Secuenciacin automtica

Mtodo de Sanger
Terminadores de cadena marcados
Dideoxinucletidos (ddNTPS) en baja concentracin
Similares a nucletidos pero carecen del grupo 3 OH Detienen elongacin por ADNpol

ADNpol
incorpora el ddNTP en una cadena en crecimiento mediante formacin de un enlace entre el grupo 5PO4del nuevo nucletido y el grupo 3OH del nucletido previo

Elementos y etapas
Mezcla
ADN molde Cebadores o primers marcados Deoxinucletidos normales (dNTPs)

Divisin en 4 tubos
A cada tubo un ddNTP diferente, marcado y en baja cc ADNpol (I de T4)

Electroforesis en poliacrilamida
Geles 0,5 mm de espesor y 50 cm long) Mezclas de reaccin desnaturalizadas y cargadas en pocillos diferentes

Autoradiografa del gel

Pelcula fotogrfica

Secuenciacin automtica
Emplean el mtodo enzimtico
Con sebadores fluorescentes Con terminadores fluorescentes

Por secuenciadores automticos

Secuenciadores capilares Secuenciadores en geles desnaturalizantes

Aplicaciones de la secuenciacin de ADN

Deteccin de mutaciones Secuenciacin de ADNs fsiles Diagnstico de enfermedades genticas Identificacin de especies y control de cruces entre animales Proyecto genoma humano

Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

Etapas: Desnaturalizacin (94C x 1 min) Alineamiento (40 a 72 C) Extensin (72C, 1 min C/1000 nt) Secuencia
Desnaturalizacin inicial Ciclo
Desnaturalizacin Alineamiento Extensin

Extensin final (5 min a 72C)

Ingeniera gentica en :
Medicina Veterinaria Agricultura

Ingeniera gentica en Medicina

Obtencin de protenas de mamferos
Hormonas: insulina, hormona del crecimiento Factores de coagulacin Clonacin de genes humanos en microorganismos

Obtencin de vacunas recombinantes

Vacuna contra la hepatitis B

Diagnstico de enfermedades de orgen gentico

Deteccin de Secuencias de genes anmalos

Obtencin de anticuerpos monoclonales

Lucha contra el cncer

Clonacin de animales
Por disgregacin de clulas embrionarias
Se basa en el mismo principio por el que nacen gemelos de forma natural.Se pueden separar las clulas de un embrin en diferentes estados de desarrollo, desde el estado de 2 clulas hasta el estado de mrula. Cada clula separada puede funcionar como un zigoto que puede desarrollarse para dar un individuo completo

Por transferencia nuclear

Se toman clulas embrionarias en fase de mrula o blstula, obtenidas por disgregacin Se cultivan in vitro,y despus se transfieren a ovocitos a los que se les ha quitado el ncleo Se provoca la fusin de las dos clulas animales de modo que el ncleo de la clula embrionaria quede en el interior del ovocito, pudiendo ste empezar a funcionar como un zigoto As se han obtenido 470 embriones clnicos de terneros de un nico embrin donante de clulas.

Ingeniera Gentica NUEVOS ANIMALES

1987 secrecin de Beta-lactoglobulina en leche de ratn.

Produccin de protena C humana en leche de cerdos, para desrdenes como hemofilia. Hormonas de crecimiento humano en tejido seminal de cerdo.
Antitrombina humana III, anticoagulante sanguneo secretada en leche de cabras transgnicas. Cabras transgnicas para producir BioSteel fibra hecha por el hombre con propiedades de tela de araa.

Ingeniera Gentica: NUEVOS ALIMENTOS Salmn transgnico por

(ISB, 2001, oct; Netlink, 2000). hormona de crecimiento. Producido por AF Protein Inc. Cuenta con el promotor de la protena de anticongelamiento de otra especie de pez. Crece de 4 a 6 veces ms rpido que un salmn no transgnico. Tiene un 20% en mejoramiento de la eficiencia de conversin del alimento. VACAS LECHERAS con incremento de protenas. En Nueva Zelanda se clonaron vacas con vulos mejorados genticamente, para mejorar la produccin del queso y crema, aumentando dos veces la kappa casena, crucial para hacer la cuajada y de 20% ms de beta caseina, que mejora la accin del cuajo

(Hoag, H. Nature, 27 enero 2003).

Ingeniera gentica en Agricultura

Plantas transgnicas
Protoplastos Tcnicas de modificacin gentica en cultivos celulares
Indirectas Transformacin de clulas mediante Agrobacterium tumefasciens (plsmido Ti) Directas Electroporacin Microinyeccin Liposomas Mtodos qumicos

Plantas transgnicas: caracteres transferidos

Resistencia a herbicidas, insectos y microorganismos
Algodn insensible a herbicidas Uso de Bacillus thuringiensis (toxina Bt) para control de insectos

Incremento del rendimiento fotosinttico Mejora en calidad de los productos

Transferencia de genes de la ruta fotosinttica de plantas C4
Soja transgnica que produce aceites modificados

Sntesis de productos de inters comercial

Plantas que producen anticuerpos, interfern, etc..

Asimilacin de nitrgeno atmosfrico

Transfeccin del gen nif responsable de la nitrogenasa de los microorganismos

Ingeniera Gentica NUEVOS ALIMENTOS

ARROZ DORADO con beta caroteno de

genes de narciso y de Erwinia uredovora, pigmentos que se transforman en provitamina A al ser ingeridos. ARROZ fortificado con un gen de la ferritina.

ARROZ con aa esenciales. ARROZ con enzima lactoferrina de leche

humana, que puede ser utilizada para mejorar las frmulas de leche infantil. Los nios la necesitan para usar eficientemente el hierro y pelear contra las infecciones

Ingeniera Gentica NUEVOS FRMACOS

PAPA

con la vacuna que previene la insulina dependencia de la diabetes mellitus 100 veces ms poderosa que la actual vacuna. con la sub-unidad B antignica de la enterotoxina del Vibrio cholerae causante del clera). F

RIJOL SOYA con anticuerpos que protegen contra el virus 2

de Herpes simplex (HSV).

TABACO con anticuerpos que previenen la caries

dental producida por Streptococcus mutans.