Técnicas de microscopía

Microscopía
Definiciones

• MICROSCOPIO: instrumento modulador Instrumento óptico construido a base de lentes aplicado

de  la energía fotónica que a base del a la observación  de objetos que escapan del poder de
empleo de lentes ofrece una imagen
amplificada y nítida del objeto visión del ojo humano.
examinado.
• MICROSCOPIA: conjunto de técnicas y
métodos destinados a hacer visible los
objetos de estudio que por su pequeñez Técnica cuyo objetivo es la observación de estructuras
están fuera del rango de resolución del u objetos que por su dimensión no son observables a
ojo normal. simple vista y requieren del uso de lentes de aumento.

Arraiza et al.(2019)
 Antecedentes
históricos
• Galileo  Según los Italianos 
• Jansen  Según los Holandeses
• Publicaron un trabajo sobre la
observación microscópica del
1610 aspecto de una abeja.

• Malpighi: observo al
microscopio los capilares
sanguíneos
1660-1665 • Hooke: publico su obra
Micrographia.

• Leeuwenhoek describió por

primera vez Protozoos,
1700 Bacterias, Espermatozoides y
Glóbulos rojos.
Continuación…

1877
Abbe: publico su teoría
del microscopio

1816-1888 Antiguo
Carl Zeiss: Mejoro la Moderno
Microscopía de Inmersión,
2000 aumentos

1931
Max Knoll y Ernest Ruska
1942 se desarrolla el microscopio electrónico de barrido
(SEM). Utiliza un haz de electrones para enfocar la
muestra consiguiendo aumentos de 100.000 X
 El descubrimiento de
las células
generalmente se
atribuye a Robert
Hooke, un
microscopista inglés
que, a los 27 años,
recibió el puesto de Hooke intentó
conservador de la responder fue por
Continuación… Royal Society of
London
qué los tapones
hechos de corcho
(parte de la corteza
de los árboles) eran
• Las células solo se pueden observar tan adecuados para
con la ayuda de un microscopio, mantener el aire en
una botella
instrumento que proporciona una
imagen ampliada de un objeto
diminuto.
Hooke llamó a los
• Las lentes ópticas se hicieron por poros células,
primera vez en Europa, en el siglo porque le
xiii, y los primeros microscopios recordaban las
celdas habitadas
ópticos compuestos (de doble lente) Había observado por los monjes que
se construyeron a fines del siglo xvi. las paredes vivían en un
celulares vacías del monasterio.
• A mediados del siglo xvii, un tejido vegetal Uno de los microscopios compuestos
puñado de científicos pioneros muerto, paredes (doble lente) más ornamentados de
había utilizado sus microscopios que originalmente Robert Hooke. (Recuadro) Dibujo de
hechos a mano para descubrir un habían sido
Hooke de un corte delgado de corcho, que
mundo que nunca se habría producidas por las
células vivas que muestra la red de “células” en forma de
revelado a simple vista. las rodeaban. panal.
Iwasa, J., & Marshall, W. (2019).
 Antonie van Leeuwenhoek, un holandés ,
empleaba su tiempo libre moliendo lentes y
construyendo microscopios simples de notable
calidad
Continuación…
Durante 50 años, Leeuwenhoek envió cartas a la
Royal Society of London, en las que describía sus
observaciones microscópicas

Fue el primero en examinar una gota de agua

estancada bajo el microscopio y, para su
asombro, observó los “animálculos”
microscópicos que iban y venían de un lado a
otro ante sus ojos.

Fue el primero en describir diversas formas de

bacterias, las cuales obtuvo del agua en la que
había remojado pimienta y del raspado de sus
dientes

Iwasa, J., & Marshall, W. (2019).

Escala logarítmica de las
dimensiones microscópicas
Escala logarítmica de las
dimensiones
microscópicas
 Tipo de energía utilizada
para la generación de la
imagen
Clasificación y Microscopio
tipos de Microscopios
de Luz o
Fotónicos
microscopio Electrónicos

Microscopio Microscopio Compuestos

Simples (una
Electrónico Electrónico de (dos o mas
sola lente)
de Barrido Transmisión lentes)
 Microscopia
óptica

• Surge para poder visualizar

correctamente células vivas
o muestras no coloreadas,
para lo cual se emplean
filtros, condensadores
especiales, etc.

Arraiza et al.(2019)
 Microscopia
Óptica Simple
Esta provisto de una lente o sistema de
lentes convergentes dispuestas de
manera que proporcionan una imagen
virtual, derecha y mayor que el objeto,
que a su vez esta situado entre la lente y
el foco.

Este tipo de
microscopio se le
denomina Lupa y
pueden ser :

Arraiza et al.(2019)
Monoculares Binoculares
Microscopía de
campo oscuro
• Bloquea la parte central del rayo
de luz, por lo que la muestra
sólo recibe rayos oblicuos. El
objeto iluminado dispersa la luz
y se hace visible contra el fondo
oscuro que tiene detrás. Las
zonas transparentes de la
muestra quedan oscuras
mientras que superficies y
partículas se ven brillantes. Para
ello se usa un condensador
especial.

Arraiza et al.(2019)
Esta técnica se
emplea para:

Visualizar muestras
biológicas
transparentes y sin
pigmentos

Observar células
Estudiar procesos
móviles difíciles de
fisiológicos (mitosis
ver con microscopía
y migración celular).
óptica.

Arraiza et al.(2019)
Microscopía de
contraste de fases
• Similar al caso anterior, pero el
cono de luz es más estrecho, lo
que provoca un cambio de fase
en la longitud de onda. De esta
manera, se forman variaciones
en el índice de refracción de una
muestra transparente,
haciéndola visible.
Microscopía de
interferencia
• La luz se divide en dos haces, uno
atraviesa la muestra y el otro pasa
lateralmente y sirve de referencia
para cuando se juntan los haces de
nuevo. El resultado es una imagen
con coloración oscura o clara sobre
un fondo gris, lo que aporta
sensación de relieve, como si las
estructuras arrojaran sombras
hacia el lado.
• Se utiliza para células vivas y no
coloreadas, para muestras gruesas
o para fertilización in vitro.

Campus Formación Granada. (2020).

Microscopía de
fluorescencia
Es especialmente útil porque la molécula fluorescente,
pese a ser pequeña, puede visualizarse por el color que
emite. El marcaje selectivo de moléculas y otros
compuestos se realiza mediante inmunofluorescencia.

Para aplicar esta técnica se necesita una iluminación intensa y

de longitud de onda corta (para excitar la fluorescencia en el
espectro de cada flourocromo, como lámparas
de mercurio, luz UV o rayos láser) y filtros para dejar pasar la
luz y recoger el color del flourocromo.

Se emplea para marcar moléculas en células y tejidos

para su identificación, para estudiar células normales y
patológicas, así como en estudios inmunológicos.
Campus Formación Granada. (2020).
Microscopía de
luz ultravioleta
• Este microscopio proporciona
un mayor poder de resolución
que la luz visible. La imagen no
se observa directamente, ya que
es peligrosa, sino a través de
fluorescencia, fotografía o un
sensor digital. Es similar al
microscopio de fluorescencia,
pero cambia la fuente de
iluminación, usándose lámparas
de arco de mercurio o xenón.

Campus Formación Granada. (2020).

Microscopía de
polarización
• Es una técnica que mejora de
manera muy amplia la calidad
de la imagen, usando filtros
que recombinan las ondas
para enfocar mejor la muestra.
• Permite la visualización de
sustancias cristalinas o fibrosas
intracelulares (citoesqueleto) y
extracelulares (colágeno,
cristales de uratos…).

Campus Formación Granada. (2020).

 Microscopía
Electrónica
• Permite ver la ultra estructura
celular, alcanzando una
resolución unas 40.000 veces
superior al microscopio fónico.
• Utilizan haces de electrones y
depende del voltaje empleado
para acelerar los mismos.
• No es posible cambiar el
objetivo; el aumento se
obtiene variando el haz de
electrones y el voltaje

Rivera, M. (2019).
 Microscopía
electrónica de
barrido
• En el microscopio electrónico de
barrido (MEB), o microscopia de
exploración electrónica (SEM), los
electrones inciden desde arriba
sobre la preparación. Por ello la
muestra puede ser de cualquier
grosor o tamaño.
• Emplea dos técnicas
preparatorias:
• Secado por congelación
• Secado por punto critico
Pennycook, S. J. (2018).
No tiene la resolución
que alcanza con el
microscopio electrónico
de transmisión, pero su Aplicación:
ventaja es una
excelente impresión
• Estudio de la
tridimensional morfología de
células y tejidos, así
como de la
Se basa en el principio de la
amplificación electrónica de
morfología interna.
señales que genera al irradiar
la superficie de las muestras • Estudio de
con un haz muy estrecho de moléculas.
electrones .
Microscopía Esta basado en el hecho de
que la manera de actuar de
electrónica de un campo
electromagnético sobre un
transmisión haz de electrones es
análogo la acción de la
lente de cristal sobre el haz
de fotones.
Esta imagen a su vez
pasa por una lente
Tiene la limitación de proyectora hasta una
ser útil solo para un pantalla de material
grosor determinado fluorescente. Que
del objeto. brilla al recibir el
impacto de los
electrones.
La imagen se forma
sobre una pantalla
fluorescente como lo
haría en una pantalla
de televisor.
El haz de electrones
pasa a través de la
muestra estudiada y
posteriormente a
través de unas lentes
electromagnéticas
que dan lugar a una
imagen amplificada.
Técnicas que mas
se utilizan para
este tipo de
microscopio

Tinción Microtomí Congelació

negativa a n
 • Observar muestras con esta técnica
Procesamiento de requiere que sean procesadas
correctamente a través de los
tejidos para el MET siguientes pasos:

Fijación: el tejido es fijado, de manera que adquiera consistencia dura y se

preserve, manteniendo las membranas y proteínas celulares.

Contraste: las estructuras de interés deben contrastar con el fondo, para lo cual Aplicaciones del MET:
son cubiertas de sustancias como el tetróxido de osmio o el citrato de plomo.
• Estudios de la ultraestructura celular.
• Estudios de citoquímica,
Deshidratación: la muestra va a estar en el vacío y no puede contener agua para que no se histoquímica e inmunohistoquímica.
evapore y disperse los electrones, por lo que se deshidrata con alcoholes en grado creciente • Reconocimiento de virus y sus
de concentración. características.

Inclusión: la muestra deshidratada es incluida en óxido de propileo y resinas, de

manera que se endurece y forma un bloque duro.

Corte: se usa el ultramicrotomo, con cuchilla de diamante.

 Microscopia
confocal de
barrido láser
• Permite, utilizando la tecnología
láser:
• La observación de secciones
finísimas dentro de una espesa
muestra fluorescente
• Digitalizar y reconstruir a gran
velocidad las imágenes de alta
resolución en tres dimensiones.
Rivera, M. (2019).
Aplicaciones del Microscopio
Confocal:
a)Medir actividades
enzimáticas, reacciones de
oxidación, fagocitosis,
apoptosis…
b)Electrofisiología
c)Estudios de ADN y ARN
d)Morfología de orgánulos
citoplasmáticos
e)Cirugía y otros métodos
clínicos
 Otros tipos de microscopios
ópticos
Microscopio Microscopio Microscopio Microscopios de
estereoscópico quirúrgico invertido barrido con sondas

Proporciona una Se coloca la sonda cerca del objeto

Se emplea en Utilizado para generando una corriente eléctrica. El
imagen en 3D de la
microcirugía, proporciona cultivos celulares y sistema informático recibe la información
muestra, se usa para
buena iluminación y técnicas de y genera una imagen en 3D. Esto permite
especímenes de gran
aumento de estructuras reproducción distinguir incluso un átomo de otro.
tamaño, sin corte o
atómicas asistida
preparación previa