MÉTODOS GENERALES DE

ANÁLISIS MICROBIOLOGICO

Biól. Osmar Uriel Reyes Ascencio

MÉTODOS GENERALES DE ANÁLISIS
MICROBIOLOGICO
 Recuento de microorganismos viables y totales.
 Métodos físicos para la detección de microorganismos.
 Métodos químicos para la detección de microorganismos.
 Métodos inmunológicos.
 Exámen de superficies.
 Recuentos de mohos y levaduras.
Recuento de
microorganismos viables y
totales. (Muestras líquidas
u homogeneizadas).
AISLAMIENTO Y CUANTIFICACIÓN DE
MICROORGANISMOS
 Recuento de microorganismos viables y
totales. (Muestras líquidas u homogeneizadas).
 Se trata de conocer el número total de
microorganismos presentes en el
alimento. Este número no guarda
relación con el de microorganismos
patógenos por lo que no puede usarse
como índice de su presencia y sólo
debe considerarse un indicador de las
características higiénicas generales del
alimento. ­
 Dependiendo de las características del medio
utilizado (medio rico, medio limitado en
nutrientes para medida de la flora no láctica de
alimentos fermentados) y de las condiciones de
incubación (mesófilos, psicrófilos) los
microorganismos analizados serán miembros de
poblaciones diferentes.

 En general se investiga la presencia de

microorganismos aerobios o aerotolerantes
(anaerobios facultativos); aunque, en ciertas
situaciones (alimentos envasados al vacío),
puede ser de interés hacer recuentos de
anaerobios totales.
 AISLAMIENTO
Consiste en separar los
microorganismos de interés de una
comunidad microbiana, el aislamiento
es importante por que se obtienen
cultivos para estudios detallados y
controlados de laboratorio aplicación
en biotecnología y en
microbiología y parasu ambiental e
industrial.
 ¿COMO SE LOGRA?
El aislamiento se logra por medio de cultivo selectivo para
el organismo que se desea aislar, e inhibir el crecimiento
de otros microorganismos no deseados pero sin afectar a
la especie o grupo que se desea aislar.
MEDIO DE CULTIVO CLASIFICACION EJEMPLO DE M.O AISLADOS

EMB SELECTIVO Y Escherichia coli

DIFERENCIAL Klebsiella pneumoniae
Enterococcus faecalis

SAL Y MANITOL SELECTIVO Y Staphylococcus auerus

DIFEENCIAL Escheriachea coli
Klebsiella pneumoniae

S-110 SELECTIVO Staphylococcus aureus

MAC CONKEY SELECTIVO Y Shigella flexneri
DIFERENCIAL Proteus mirabilis
E. Coli

CHAPMAN SELECTIVO S . aureus

¿CÓMO LOGRO UN AISLAMIENTO?

Separando los microorganismos físicamente

mediante diluciones o por agotamiento (estría).

 Utilizando medios de cultivo selectivos para

inhibir los m.o no deseados.
 CUANTIFICACION

Es un método muy utilizado en diferentes áreas

como por ejemplo:

 Industria alimenticia (leches, jugos, néctares)

 Hospitalaria (procesos patológicos infecciosos)
 MÉTODOS DE CUANTIFICACION
Existen métodos que permiten establecer el número de
microorganismos o en una muestra dada.
Hay métodos que cuantifican el numero de células, y
existen otros que cuantifican la masa total de la
población.
|
 ¿COMO SE CUENTAN LAS COLONIAS POR
VACIADO EN PLACA?
El método más usual para realizar el conteo de células
viables se basa en contar el número de células de una
muestra que es capaz de formar colonias al sembrarlo en
un medio adecuado.

 Método de extensión en placa.

 Método de vertido en placa (o diluciones).
FUNDAMENTO
 Se basa en la extensión de la muestra, agregada con un asa
calibrada sobre una placa seca.
RECUENTO EN PLACA POR
EXTENSION SUPERFICIAL

Ventajas Desventajas
rápido Poco exacta
No diluciones Carencia de uniformidad
en la extensión
Muy poca muestra tiempo
Evita el contacto de las
células con el agar
fundido
SIEMBRA POR VERTIDO DE PLACA
Ventajas
Mide el No. de células
viables
Microorganismos sensibles al
calor pueden resultar
dañados por el agar fundido
Desventajas
Requiere bastante tiempo
(24 horas o más)
Las bacterias crecen en
unidad, en cadenas o como
grumos.
En medios diferenciales las
colonias que se forman
debajo de la superficie no son
adecuadas (solo las de la
superficie)
FACTORES QUE AFECTAN EL
VACIADO EN PLACA
• Tipo de muestra y microorganismos presentes en ella.

• Procesamiento de la muestra.

• Temperatura del medio de cultivo.

• Tipo de diluyentes.

• Es importante que haya un númer

determinado de colonias en la placa (30-300).
 RECUENTO EN PLACA POR FILTRO
DE MEMBRANA
Fundamento

Paso de la muestra a
través de una membrana
porosa que retiene los
microorganismos y que
posteriormente se coloca
sobre una placa.
RECUENTO EN PLACA POR FILTRO
DE MEMBRANA
Ventajas Desventajas

Mide el no. De células Requiere bastante tiempo (24

viables horas o más)

Las bacterias crecen en

unidad, en cadenas o como
grumos
DILUCIONES SERIADAS
VENTAJA DESVENTAJAS
S
Es  Afecta el no hacer bien las
diluciones.
fácil.  No homogenizar bien la
muestra.
 No contar correctamente.
 Cuenta los viables mesofilos.
 No cuenta anaerobios.
 Cuantifica muestras solidas y trabajar
mas.
 No cuantifica bacterias exigentes
nutricionalmente.
 ASA CALIBRADA
Las asas calibradas para la
cuantificación de unidades
formadoras de colonias
bacterianas transfieren un
volumen de muestra
“exactamente conocido” y han
sido herramientas de gran
importancia para laboratorios
de control de calidad,
investigación y clínico.
 VENTAJAS DESVENTAJAS
Su rapidez. El tiempo.
No ocupas material de
laboratorio.
Se utiliza poca
muestra.
No hay restricción de
unidades formadoras
de colonias.
MILES-MISRA
 FUNDAMENTO:
Nùm. De bacterias (mL) = NxF/V

DESVENTAJAS

No es fácil.
Hay restricción.
El tiempo.
Es difícil al manejar una gran carga
bacteriana
 MÉTODO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP)

FUNDAMENTO:
Es un método estadístico que se fundamenta en
la teoría de la probabilidad.
En él se preparan múltiples series de diluciones
decrecientes, con cada dilución se inoculan varios tubos
que contienen el medio de cultivo adecuado.
 Para calcular la densidad poblacional de la muestra, entonces tendrá que multiplicar el NMP
sin ajustar por el factor de corrección de volumen por el recíproco del factor de dilución menor
inoculado en la placa (ej., 5-5-3-2-0: 1,383 X 200 X 1000 = 2.78 x 108 células/g 
 APLICACIONES
Este método se utiliza para contar microorganismos
difíciles de cultivar en medio sólido, o para determinar el
número de células que pueden crecer en un medio líquido
determinado, como el análisis para determinar la
contaminación del agua potable.
Muestra de Leche
 RECUENTO MICROSCOPICO
 RECUENTO EN CAMARA DE PETROFF-HAUSER

Un volumen conocido de muestra es depositado en un portaobjetos

especial para cuenta, esta consiste de un portaobjetos excavado y
cuadriculados que facilitan el recuento por unidad de superficie y de
volumen.
 CUANTIFICACION
 1/Dilución: Inversa de la dilución utilizada para llenar la cámara de
recuento.

 Número de cuadrados contados: Cantidad de cuadrados de la

cámara que se utilizaron para contar un el número de bacterias.

 Volumen del cuadrado: Volumen de cada cuadrado de la cámara.

Depende del tipo de cuadrado en donde se realizó el recuento. Por
ejemplo, cada cuadrado pequeño tiene un volumen de 5 x 10-8 ml
(50 µm x 50 µm x 20 µm = 5 x 104 µm3 = 5 x 10-8 ml)
 CUANTIFICACION
Tipo de Area Volumen Factor
cuadro [cm2] [ml] [1/Volumen]

Cuadrado 1.00 x 10-2 2.00 x 10-5 5.00 x 104

total
Cuadrado 4.00 x 10-4 8.00 x 10-7 1.25 x 106
grande
Cuadrado 2.50 x 10-5 5.00 x 10-8 2.00 x 107
pequeño
 MÉTODO DE BREED
FUNDAMENTO:
 Es un método directo para cuantificar células totales en el cual un
volumen conocido de la muestra diluida se extiende
uniformemente sobre la superficie de un portaobjetos normal.
 Observando al microscopio el campo de observación contando los
microorganismos en diversos campos microscópicos.
 Se obtiene el valor medio de células por campo que se logra
multiplicando el número de campos microscópicos comprendidos
en la preparación.
 Ello da el número de microorganismos existentes en el volumen
conocido que a su vez al multiplicarse por 100 indica el total de
microorganismos /ml o g de muestra original.
 VENTAJAS

Es un método rápido

Es un método económico
 DESVENTAJAS
Es imposible diferenciar a las células vivas de las
muertas.
Cuando se tienen muestras que contienen poblaciones
pequeñas, el margen de error es grande.
El método no suele ser adecuado para suspensiones
con baja densidad celular.
Las pequeñas células son difíciles de ver.
 APLICACIÓN
Utilizada para contar bacterias de la leche.
Es usado para diagnóstico de mastitis bovina
(diagnóstico subclínico).
 NEFELOMETRÍA (TURBIDEZ)
FUNDAMENTO.
En una suspensión microbiana, la cantidad de m.o. está
directamente relacionada con la turbiedad o densidad óptica
de la misma, e inversamente relacionada con la cantidad de
luz que pasa por la misma. A mayor turbidez mayor número
de bacterias.
 ESCALA MCFARLAND
Es una curva estándar construida con una suspensión
testigo de concentración celular conocida. Se basa en la
mezcla de concentraciones crecientes de BaCl2 con
concentraciones decrecientes de ácido sulfúrico
obteniéndose un precipitado de Sulfato de bario en
cantidades diferentes.
 VENTAJAS
 Rápido

 Poca muestra

 Sensible
 DESVENTAJAS
 No debe tener materia orgánica en
suspensión.
 No debe tener color.
 Es total.
 La curva no esta hecha a base de bacterias si no de
sales.
 RECUENTO ELECTRONICO
 CONTADORES ELECTRONICOS
Un volumen fijo de una suspensión bacteriana es forzada a pasar
desde un compartimiento al otro a través del pequeño conducto, en
un muy breve intervalo de tiempo. Cuando un microorganismo pasa
al nuevo compartimiento, la resistencia de éste se incrementa debido
a que la conductividad de la célula es menor que la del medio. Estos
cambios en la resistencia son convertidos en pulsos o voltaje y
contados
 RECUENTO ELECTRONICO
 Es posible contar y medir varios miles de partículas por segundo,
independientemente de su forma, color y densidad.

 Ciertas bacterias muy pequeñas producen cambios en la

resistencia que son comparables al "ruido" generado por la
turbulencia que se desarrolla al pasar el fluido por el orificio.
 Bibliografía

Vullo. Microbiología en la práctica. Editorial atlante. Buenos Aires Argentina.

2000. pág 61-73

Dauget. Técnicas en bacteriología. Editorial Jims. Barcelona España. 1977.

pág. 82-86.

Alejandro Camacho; Ruth Alvarez. Manual de microbiología