TEMAS DE BACTERIOLOGA Y VIROLOGA MDICA

SECCIN

Aspectos generales
1. Biologa viral 2. Morfologa y estructura bacteriana 3. Fisiologa y metabolismo bacteriano 4. Gentica bacteriana 5. Mtodos de estudio de bacterias y virus. Mtodos diagnsticos 6. Mecanismos defensivos del husped contra los agentes infecciosos 7. Interacciones husped parsito. Flora normal

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Biologa viral
Juan R. Arbiza

Introduccin
Hasta fines del siglo XIX se haba avanzado en la etiologa de muchas enfermedades infecciosas, sin embargo, quedaban muchas enfermedades en el hombre, animales y plantas en las cuales no se identificaba un microorganismo causal. En el siglo XX se descubrieron los virus como causantes de enfermedades infecciosas para las cuales no se haba encontrado una bacteria, un hongo o un protozoario como responsable. Fue el desarrollo de nuevas tcnicas como los cultivos celulares, el avance en la microscopa y el advenimiento, a fines del siglo XX, de tcnicas de biologa molecular que han permitido aislar e identificar los virus; adems han permitido un avance extraordinario en el conocimiento molecular de la biologa de los mismos. Sin embargo, los virlogos tienen un doble desafo para el futuro: controlar los virus que ya se conocen, para los cuales no existen frmacos o vacunas efectivas hasta el momento y; aislar, identificar, caracterizar y controlar los virus emergentes o reemergentes (virus de la inmunodeficiencia humana, Ebola, Hantavirus, etc.).

Caractersticas generales
Las primeras caractersticas que diferenciaron a los virus de otros microorganismos fueron: el tamao, estimado por su capacidad de atravesar filtros que retienen a las bacterias y la incapacidad para reproducirse en medios biolgicos inertes como medios de cultivo para bacterias, requiriendo para su propagacin de animales o cultivos celulares. Hoy se sabe que estas caractersticas no alcanzan para diferenciar a los virus de otros agentes biolgicos, dado que existen bacterias cuyo tamao puede ser similar al de los virus ms grandes y algunas bacterias como Chlamydias y Rickettsias, son parsitos intracelulares obligatorios. La organizacin y composicin de las partculas virales ofrecen caractersticas que los diferencia de otros microorganismos. Los virus poseen un solo tipo de cido nucleico de pequeo tamao con respecto a otros agentes biolgicos, rodeado por una cscara o cpside formada por numerosas copias de una protena o de un nmero limitado de ellas. Algunos grupos de virus presentan por fuera de la cpside una envoltura lipdica de origen celular en la que se insertan glicoprotenas. No presentan sistemas enzimticos propios, por lo tanto no son capaces de replicarse por s solos y requieren de clulas animales, vegetales o bacterias para cumplir su ciclo de reproduccin; esto define su parasitismo celular obligatorio. Este tipo de reproduccin particular que tienen los virus, es la caracterstica que justifica su lugar en la escala biolgica. A diferencia de las clulas, en el momento de su multiplicacin,

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los virus no aumentan de tamao para su posterior divisin, por el contrario, ls partcula viral se desintegra y luego se sintetizan cada uno de sus componentes que se renen por ensamblaje. Esta forma de multiplicacin en la cual se producen rplicas del virus progenitor, es conocida con el nombre de replicacin viral y se diferencia del proceso de divisin celular usado por clulas procariotas y eucariotas. Se pueden citar dos definiciones de virus. La primera propuesta por Lwoff (1957): entidad estrictamente celular y potencialmente patognica con una fase infecciosa. Posee un solo tipo de cido nucleico, es incapaz de crecer y reproducirse por fisin binaria y carecen de enzimas para producir energa. La segunda, pertenece a Luria y Darnell (1967): los virus son entidades cuyo genoma se replica dentro de clulas vivas usando su maquinaria de sntesis. Esto determina la formacin de elementos especializados que permiten la transferencia del genoma viral a otras clulas.
VIROIDES

Son virus simples constituidos por cido ribonucleico (ARN) circular de muy bajo peso molecular, sin cpside protectora. Producen enfermedades hasta el momento conocidos exclusivamente en plantas.
PROVIRUS

El genoma viral se puede integrar al genoma celular por un proceso de recombinacin gentica, directamente en los virus cido desoxirribonucleico (ADN) o previa transcripcin inversa en los virus ARN. El genoma viral integrado al celular recibe el nombre de provirus.
PRIONES

Ciertos agentes causantes de afecciones degenerativas del sistema nervioso central del hombre, han sido clasificados como virus no convencionales, dado que no ha sido posible determinar una estructura similar a virus en el material infectante, ni el tipo de cido nucleico de dichos agentes. Son extremadamente resistentes a sustancias que inactivan los virus comunes. Algunos han propuesto que corresponderan a viroides patgenos del hombre. Los priones han sido descritos en los ltimos aos como causantes de muchas enfermedades del sistema nervioso comentadas anteriormente, principalmente el scrapie en el ganado ovino y la encefalopata espongiforme bovina (BSE) o comnmente conocida como sndrome de la vaca loca. En el hombre seran los agentes relacionados con la enfermedad de CreutzfeldJacob y Kuru. Son estructuralmente ms simples que los virus y estn formados solo por protenas. Cuando se descubrieron, pareca que se poda producir una gran revolucin en el conocimiento de la biologa, porque la idea de que una protena pudiera autorreplicarse sera opuesta al dogma central de que la informacin gentica es transmitida desde el cido nucleico a la protena. El hallazgo de los priones y el avance en el conocimiento de su biologa podrn dilucidar muchas enfermedades an sin resolver. Muchas son las investigaciones que se realizan en estos momentos y las hiptesis propuestas para explicar la biologa y permanencia de estas protenas extremadamente resistentes a sustancias que inactivan a los virus comunes.

Morfologa y estructura de los virus

TAMAO Y FORMA

Existe gran variedad de tamao y forma de los virus hasta hoy estudiados. Se puede obser-

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var un tamao entre 28 nm en los virus ms pequeos denominados picornavirus (pico de pequeo) hasta 300 nm en los virus ms grandes que se conocen como son los poxvirus (ver figura 1). La forma tambin es muy variada, pudindose observar formas icosahdricas o helicoidales en virus que no tiene envoltura por fuera de la cpside, hasta formas esfricas, filamentosa o pleomrficas en los virus con envoltura o muy complejos como el virus de la rabia (ver figuras 2 y 6).
ESTRUCTURA

Como ya se mencion la estructura de un virus est basada en su simplicidad, a pesar de esto existe cierta diversidad que es usada para la clasificacin de estos microorganismos. Virus desnudos La estructura de los virus ms simples est compuesta por un solo tipo de cido nucleico (ADN o ARN) rodeado de una cscara proteica que se denomina cpside (del griego capsa que significa caja). De la reunin de las subunidades proteicas codificadas por el genoma viral, que se ensamblan segn principios geomtricos, se forman diferentes tipos de simetras (icosahdrica o helicoidal). (Ver figura 2 y 3b) Esta estructura bsica de cido nucleico y cpside recibe el nombre de nucleocpside y constituye en los virus desnudos la partcula viral completa o virus. Esta se diferencia del trmino virin que es usado para las partculas virales o virus potencialmente infecciosas. Cuando se observa al microscopio electrnico una cpside viral, pueden observarse es-

E. coli Poxvirus

Rhabdovirus

Herpesvirus

Adenovirus

Parvovirus 1000 nm Fig. 1

Figura 1.

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A- Icosahedro desnudo B. Helicoidal desnudo

Figura 2.

C. Icosahedro envuelto
nucleocpside nucleocpside

protmeros (protena) capsmeros (protena)

D. Helicoidal envuelto

cido nucleico espculas (glicoprotenas) envoltorio (protenas y lpidos)

tructuras morfolgicas denominadas capsmeros que resultan de la unin por enlaces de las subunidades proteicas. La forma de distribucin de los capsmeros as como el nmero de ellos depende de cada tipo de virus. Virus envueltos La estructura de las partculas virales de los virus denominados envueltos, est formada adems de la nucleocpside por una envoltura de origen celular que la rodea (ver figuras 2 y 3a). Dicha envoltura se obtiene en el proceso de liberacin por gemacin (brotamiento) como se esquematiza en la figura 4. En sta se insertan glicoprotenas de origen viral que reciben el nombre de espculas o glicoprotenas de superficie y que tienen un papel importante de reconocimiento de receptores especficos de la superficie celular, en el paso inicial de relacin con la clula husped para la multiplicacin viral. cidos nucleicos El cido nucleico que lleva la informacin gentica y que constituye el genoma viral puede tener varias formas. Como ya se mencion, una partcula viral tiene en su estructura un solo tipo de cido nucleico (ADN o ARN), pero la forma de estos puede ser de doble o simple

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Figura 3.

a)

b)

cadena, segmentado o no, circular o lineal, determinando una gran diversidad de utilidad en la taxonoma viral (ver figura 5). En la figura 6 se representa un cuadro con los principales virus animales, con sus diferentes estructuras (con envoltura o sin ella, con simetra helicoidal o icosahdrica) y la composicin del cido nucleico. Estas dos caractersticas se combinan de diferentes maneras para determinar varios grupos de virus.

Multiplicacin viral
Una partcula viral puede encontrarse en dos estados: activa o inactiva. Para demostrar el estado inactivo basta incluir una suspensin de virus en un medio de cultivo y observar que son incapaces de cumplir actividades metablicas necesarias para su multiplicacin. Se deduce de ello, que los virus carecen como ya se mencion anteriormente de maquinaria enzimtica que les permita autorreplicarse, an cuando se les brinde nutrientes que seran adecuados para la propagacin de las bacterias ms exigentes. Pero si una partcula viral es incorporada a clulas vivas sensibles, se comporta en forma activa y por lo tanto tomar el comando de la maquinaria enzimtica de la clula husped, logrando as su replicacin.

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Virion

Figura 4.

Membrana Plasmtica

Protena vrica

Nucleocpside

RNA a) a)
Simple cadena

DNA
Simple cadena

Figura 5.

b)
Doble cadena

b)
Doble cadena

c)
Doble cadena fragmentado

c)

Circular (simple y doble cadena)

La multiplicacin de los virus animales, vegetales y bacterifagos es similar en sus principios pero, cada una de ellas tiene sus particularidades. Esto se basa principalmente en las diferencias entre las clulas que infectan. El desarrollo del conocimiento sobre la multiplicacin de los virus animales ha sido posible por el uso (en el laboratorio) de muchos sistemas de aislamiento de virus en los cuales se puede estudiar el proceso de multiplicacin viral. En un principio fueron animales y huevos embrionados los sistemas ms usados, pero actualmente se han sustituido por cultivos celulares que ha favorecido el conocimiento de las etapas de la multiplicacin viral. Existe gran variedad de cultivos de clulas, cultivos primarios o lneas celulares que pueden ser subcultivadas indefinidamente. Dichas lneas se asemejan mucho a las clulas transformadas debido a su gran potencial de crecimiento y a su aneuploida. Habitualmente se las usa para aislar virus, pero no se recomiendan para la produccin de vacunas virales humanas, dado que los virus propagados en esas lneas pueden adquirir caractersticas genticas oncognicas. Los cultivos primarios resultan de la dispersin de clulas diploides de un tejido, por digestin enzimtica de la sustancia intercelular; tambin son poco recomendadas para la produccin de vacunas, ya que pueden tener virus latentes propios de la especie de la que provienen. Los embriones de gallina y sus anexos siguen siendo muy usados porque ofrecen diferentes

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Figura 6.

tipos celulares a los que se puede llegar por diferentes vas (intraamnitica, intraalantoidea, en saco de yema, etc.).
INFECCIN VIRAL

La infeccin viral puede ser productiva o, en oposicin abortiva. Esta ltima cumple un ciclo incompleto en el que no se forman partculas virales infecciosas. Una infeccin productiva culmina con la generacin de una progenie viral infecciosa; este proceso requiere una serie de pasos o etapas que son diferentes en los distintos tipos de virus. Las etapas fundamentales de la infeccin viral son: adsorcin, penetracin, denudacin, eclipse, replicacin, maduracin y liberacin. Adsorcin Intervienen muchos factores. En principio existe una atraccin por fuerzas inicas. A pH neutro, los virus y las clulas tienen cargas negativas, por lo tanto son necesarios iones positivos;

ENVUELTOS

DESNUDOS

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Figura 7.

a) Fusin

b) Viropexis

Cell

Cell

dicho requerimiento lo cumple los iones de magnesio. Otro factor importante en esta etapa es la interaccin de sitios especficos de la partcula viral con receptores celulares especficos. Esto determina la especificidad de algunos virus para crecer en clulas de origen especfico; por ejemplo: el virus de la poliomielitis solo puede crecer en clulas humanas y de primates. Otros virus presentan estructuras en su superficie que les permiten cumplir con esta etapa de forma muy especializada. Estas son glicoprotenas que reconocen receptores celulares especficos. Hoy se pueden aislar esos elementos como complejos virus y clula. Luego de adsorbidos a una clula, los virus pueden ser recuperados conservando sus caracteres de partcula libre potencialmente infectante. Los poliovirus pueden ser separados de las clulas con soluciones salinas a altas concentraciones o con detergentes; los mixovirus (virus de la gripe) que usan tambin una estructura especializada, se separan de las clulas huspedes por accin de la neuraminidasa. Penetracin La penetracin de los virus una vez adsorbidos, puede realizarse de diferentes maneras, por: viropexis, penetracin o fusin (ver figura 7).
Viropexis

Es un proceso de fagocitosis, en el que se produce una invaginacin de la membrana plasmtica; as el virus queda englobado en una vescula dentro del citoplasma celular. Es el mecanismo ms comn de penetracin de los virus.
Penetracin

En algunos virus, la penetracin acontece por simple cruce de la membrana plasmtica; as la partcula viral queda directamente incluida en el citoplasma.

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Fusin

Otro tipo de penetracin se da por fusin de la envoltura viral con la membrana plasmtica. Tambin en este caso el virus es directamente incorporado al citoplasma. Denudacin y eclipse En esta etapa el virus se desintegra, dejando libre su cido nucleico que comanda su propia replicacin, adems de la sntesis de las protenas necesarias para integrar nuevas partculas. La manera en la que un virus pierde la cpside y su envoltura (si la tiene), es caracterstico de cada grupo viral. En los poliovirus parece existir una integracin con los constituyentes celulares tales como los receptores. En otros virus como los poxvirus y los reovirus el proceso es ms complejo. Los poxvirus pierden parte de su envoltura en las vacuolas fagocticas, mientras que un ARN mensajero (ARNm) es sintetizado por una transcriptasa que termina con la produccin de una enzima nueva que completa la denudacin. Los reovirus penetran en los lisosomas donde las enzimas proteolticas eliminan la cpside y promueven la transcripcin del genoma. Los fenmenos descritos (adsorcin, penetracin y denudacin) finalizan con la desintegracin de las partculas virales, pero no siempre el proceso progresa hasta la replicacin viral. Si interrumpimos el ciclo en esta etapa llamada eclipse, el cido nucleico liberado de sus envolturas puede recobrarse por disrupcin de la clula husped, pero habra perdido su capacidad de infectar (algunos autores opinan que an puede recobrarse intacto). Si el proceso normal contina, comienza la replicacin del cido nucleico y la sntesis de las protenas estructurales y no estructurales necesarias para la produccin de virus. Replicacin del cido nucleico La replicacin es un fenmeno muy heterogneo porque existe mucha variedad de cidos nucleicos de origen viral; se recordar que los hay de ADN y de ARN de una o dos hebras, segmentados o no, etc. Siempre el genoma viral es el elemento capaz de gobernar su autorreplicacin y de trasmitir la informacin estructural y funcional a la progenie resultante de una infeccin. No obstante la diversidad sealada, en la replicacin intervienen elementos comunes que vale la pena destacar tales como la formacin de un ARNm capaz de traducir en el ribosoma celular las protenas codificadas por el genoma viral. Adems, sea cual sea el cido nucleico, siempre se diferencian dos conjuntos de genes, los precoces y los tardos. Los primeros seran los encargados de codificar protenas necesarias para la copia de la molcula de cido nucleico y, los tardos seran los encargados de codificar las protenas estructurales y las protenas para el ensamblaje. La replicacin puede producirse en el ncleo o en el citoplasma de la clula, eso depender del tipo de cido nucleico que constituye el genoma viral. Los virus que contienen ARN se replican en el citoplasma, mientras que los que tienen ADN se replican en el ncleo; excepto el virus de la viruela que, aunque son virus ADN, su replicacin se realiza en el citoplasma. Los virus ADN sintetizan por medio de una polimerasa, ARNm que pasa al citoplasma donde se producir la sntesis proteica; de estas protenas algunas tienen funciones estructurales y formarn los capsmeros que al unirse entre s constituirn la cpside. Otras protenas tendrn funciones enzimticas, de polmeros y se introducirn en el cido nucleico promoviendo la replicacin del ADN viral. El tipo de replicacin es semiconservadora y los intermediarios replicativos, sern lineales o cclicos dependiendo si la molcula de ADN es lineal o cclica respectivamente. Como ejemplo de virus ADN podemos citar al grupo de los herpesvirus, quienes pierden la

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cpside en el citoplasma y penetran al ncleo iniciando la replicacin del cido nucleico. Hay sntesis de ARNm inducidos por el virus, enzimas relacionadas a la sntesis y fragmentacin del ADN. Los pasos biosintticos descritos pueden relacionarse con el desarrollo de cuerpos de inclusin nucleares y la formacin de partculas virales. Los virus ARN tienen un inters especial por la diversidad de formas de replicacin que presentan; esto depende de que el ARN pueda actuar como mensajero, denominado de polaridad positiva. De lo contrario, al ARN que posea la secuencia de bases complementarias a las del ARNm se le denomina de polaridad negativa. Cuando consideramos un ARN con polaridad positiva, ste acta como mensajero entrando en el ribosoma celular e iniciando una traduccin de polimerasas, necesarias para iniciar la replicacin del cido nucleico. Luego actuar la parte tarda del ARN traduciendo protenas para la formacin de la cpside y ensamblaje de la partcula viral. Un ejemplo de este tipo de replicacin son los poliovirus, que tienen como genoma un ARN de hebra nica con cido poliadenlico en un extremo. Dicho cido sirve inicialmente como molcula de ARNm para la sntesis de replicasa de ARN, producindose el intermediario replicativo de ARN, til para la sntesis de molculas de ARN virales de los descendientes. La replicacin del ARN viral es independiente de las sntesis de ADN de la clula husped. Por el contrario, si el ARN es de polaridad negativa, la molcula no tiene funcin mensajera y por lo tanto sintetiza una molcula complementaria a la original con funcin mensajera, que entra al ribosoma. En este grupo de virus aparece un nuevo concepto en la estructura viral porque, para sintetizar una copia se necesita una transcriptasa ARN dependiente que no se encuentra en las clulas. Por consiguiente, en estos virus adems del genoma y las protenas estructurales, son sintetizadas otras protenas que luego sern incorporadas a la partcula viral. Maduracin y liberacin Hay virus cuya nica cubierta es la cpside, virus desnudos, en oposicin a los que poseen envoltura por fuera de la cpside, virus envueltos. Es conveniente considerarlos por separado en esta etapa, que es la finalizacin de la formacin de una progenie viral. Para los virus desnudos, el fenmeno de maduracin consiste en la unin de los capsmeros para formar la cpside y la posterior unin de esta con el genoma. Parece existir una diferencia en la maduracin de este grupo de virus dependiendo si el cido nucleico del genoma es ADN o ARN. Para los primeros, la sntesis del ADN se realiza con anticipacin a la aparicin de los elementos estructurales, mientras que para los segundos, se ha demostrado con aminocidos radioactivos que las cadenas polipeptdicas se renen rpidamente en capsmeros y stos en cpside. Adems se destaca que existe concordancia con la sntesis de la molcula de ARN. La liberacin en este grupo de virus depende mucho del tipo de virus y de las caractersticas de la clula husped. Los poliovirus son liberados rpidamente de las clulas HeLa o HEp-2; dicha liberacin se realiza por rotura de vacuolas superficiales. En los virus ADN que maduran en el ncleo, el tiempo de liberacin es mayor que en el ejemplo anterior, porque la liberacin se produce por autolisis celular. En los virus con envoltura, la maduracin es ms compleja (ver figura 4). Adems de la unin del cido nucleico con la cpside, el virus debe rodearse de la envoltura. Luego de haberse formado la cspide, la partcula se aproxima a la membrana plasmtica y se produce la evaginacin de la membrana y luego el desprendimiento del brote. El brotamiento puede ser explicado por relacin entre las protenas de la membrana plasmtica y la nucleocpsi-

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de. Generalmente, la liberacin de la partcula se produce al finalizar el brotamiento de la membrana celular.

ALTERACIONES CELULARES PRODUCIDAS POR INFECCIN VIRAL

Las clulas pueden responder de diferentes formas ante una infeccin viral: sin alteracin aparente; con efecto citoptico, es decir muerte de la clula por lisis celular e hiperplasia, como en los poxvirus o; solo con hiperplasia, como en la transformacin viral en clulas malignas. Efecto citoptico El efecto citoptico consiste en alteraciones morfolgicas de las clulas, que resultan en la muerte celular. Este efecto es diferente dependiendo el tipo de virus. En cultivos infectados con adenovirus, las clulas se redondean y se agrupan como un racimo de uvas. En cambio, las clulas infectadas con poliovirus tambin se redondean pero se retraen y se lisan liberando muchos virus. El virus sincicial respiratorio, produce fusin de las membranas celulares, originando grandes sincicios. Cuerpos de inclusin Los cuerpos de inclusin son acmulos intracelualres de material nuevo. Algunos se producen por acumulacin de viriones o de subunidades virales no reunidas. Estos cuerpos de inclusin pueden romper la estructura celular o cambiar la funcin y producir la muerte celular. Otros corpsculos pueden desarrollarse en lugares donde existe sntesis viral, pero no tienen viriones detectables; por ejemplo los corpsculos eosinfilos intranucleares en las clulas infectadas por virus del herpes simple. Transformacin celular Algunos virus son productores de tumores o de leucemia. Pueden presentar muchos efectos en las clulas: estimulacin de la sntesis de ADN celular (virus del polioma); alteraciones de la superficie evidenciadas por especificidades antignicas nuevas (distintas de aquellas pertenecientes a las subunidades de los viriones); aberraciones cromosmicas y alteraciones del crecimiento celular. Este cambio de una clula normal a una maligna, ha sido llamado transformacin.

Bibliografa
Davis B, Dulbecco R, Ginsberg H. Microbiologia. San Pablo, Brasil Harper and Row, 3ra ed. 1985. Fields B, Knipe D. Virology. New York. Raven Press,2nd ed.. 1990. Joklik WK, Willett HP , Amos DB, Wilgert CM. editores, Zinsser Microbiologa. 20 ed. BsAs. Panamericana; 1994.

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