AVANCES

. EN EL
DIAGNOSTICO MOLECULAR
DE Mycobacterium
tuberculosis .
PRESENTACIÓN DEL ARTÍCULO.
 INTRODUCCIÓN
La tuberculosis es una infección que afecta los pulmones
principalmente; es causada por Mycobacterium tuberculosis.
Actualmente se utilizan métodos rápidos, sencillos, más sensibles y
específicos, que permiten la identificación de M. tuberculosis, entre los
métodos moleculares están IS 6110 –RFLP, SPOLIGOTYPING, LAMP,
MIRU-VNTR, Xpert MTB/RIF, donde MIRU-VNTR es la técnica de oro
para el diagnóstico.
PRUEBAS MOLECULARES PARA LA IDENTIFICACIÓN
DE Micobacterium tuberculosis.

AMPLIFICACIÓN
ISOTÉRMICA
MEDIADA POR Xpert
IS 6110 –RFLP. BUCLE (LAMP). MTB/RIF.

SPOLIGOTYPING. MIRU-VNTR.
IS 6110 – RFLP
 Enzima de restricción Pvu II.
 Secuencia IS 6110.
 SPOLIGOTYPING (TIPIFICACIÓN DE
OLIGONUCLEÓTIDOS ESPACIADORES).

DETECTA: Secuencias espaciadoras (35-41pb) de M. tuberculosis,

separan los loci de repeticiones directas (DR) formadas por 36pb.

 Basado en PCR , simple y rentable.

 AMPLIFICACIÓN ISOTÉRMICA MEDIADA POR BUCLE (LAMP)

 Es muy sencilla, eficiente, específica y rentable.

USAN:
 4 primers, los cuales hibridan dos a los extremos (F3 y R3) y dos en la parte interna (FIP ( F1c-F2) y BIP (R1c-R2) de la
secuencia diana.
 Polimerasa termoestable de Bacillus stearothermophilus (65°).

Productos: se pueden observar por turbidez o florescencia.

En 1 hora aproximadamente.

• En el año 2000, Notomi y colaboradores, publicaron un estudio sobre una nueva prueba molecular
llamada LAMP, que consiste en la amplificación de ácidos nucleicos en condiciones isotérmicas.
  Primers
Los dos cebadores internos:

Forward Inner Primer (FIP): secuencia F1c. Los dos cebadores externos
Un espaciador de TTTT.
La secuencia F2 complementaria a F2c. Consisten en B3 y la secuencia F3
complementaria a F3c.
Bac-kward Inner Primer (BIP): secuencia B1c complementaria a B1
Un espaciador de TTTT
B2.

Contienen dos secuencias distintas : sentido

antisentido del ADN blanco.
• Uno para cebar en la primera etapa y el otro para
auto-cebarse en etapas posteriores.
AMPLIFICACIÓN
NO CÍCLICO 

1. FIP se une a su región complementaria F2c y así

comienza a sintetizar la hebra complementaria del DNA
blanco.

2. F3 se une a la región F3c complementaria del DNA

blanco.

3. La Bst polimerasa tiene una cualidad, esta actúa también

como helicasa lo que ocasiona que la doble hebra se abra y
la F3 pueda seguir con su camino.

4. Por el otro extremo tanto BIP como B3 siguen los mismo

paso.
2. CICLIZACIÓN.

1. En la secuencia madre, interactúan

nuevamente el cebador FIP donde la
región F2 se una a su región F2c de la
hebra complementaria realizando la
hibridación

2. También por el otro extremo BIP donde

la región B2 se une a su región B2c de la
hebra complementaria, en el transcurso
de la polimerización las secuencias
sintetizadas van adquiriendo una forma de
coliflor.
 Detección
Forma de coliflor.
• Turbidez

• Detección visual por fluorescencia

  MIRU-VNTR
(Análisis de unidades repetitivas micobacterianas interespaciadas – Número variable de repeticiones en tándem )

 fue estandarizada por Supply et al.

(1997).
 Basado en PCR.
 DETECCIÓN: De VNTRs dispersos en todo el
genoma (su tamaño oscila entre 40 y 100pb
M. tuberculosis).
 Utilizan primers específicos para cada
locus.
 Es confiable y reproducible para
analizar la estructura de la población de
MTB.
 PASOS DE LA TÉCNICA MIRU-VNTR.
Determinación
del Linaje.
Cálculo del
número de copias
Electroforesis para MIRUs de acuerdo
visualizar al peso molecular
productos de de las
PCR -12 ,15, 24 amplificaciones.
locus MIRUs. amplificación.
Colecta la
muestra.

www.miru-vntrplus.org
 MIRU-VNTR

En el año 2018, Golestan, Irán

164 aislamientos.
Determinar la variabilidad genética
 Xpert MTB/RIF.

 Basado en PCR en tiempo real.

 Se amplifica los perfiles genéticos IS6110,
reconociendo las cinco regiones
del gen rpoB de MTB.
 Se aplica en diferentes muestras.

A. Muestra el gen rpoB, su respectiva secuencia y la posición de las sondas moleculares beacon complementarias a la
secuencia diana.
B. B. La sonda molecular beacon marcada con un florocromo se une a la cadena de ADN complementaria, que al hibridar
emite la florescencia.
 Xpert MTB/RIF.
P Kolia-Diafouka, en el año 2019, comprobó mediante un estudio, la alta sensibilidad de la técnica para
detectar TBC pulmonar con baciloscopías negativas (Kolia-Diafouka, 2019)

Laura Maynard-Smith, en un estudio de revisión sistémica realizado a través de bases de datos como
Medline, EMBASE, por medio de las cuales extrajeron resultados de diferentes estudios, concluyendo que
la sensibilidad de la prueba depende de la muestra analizada(Maynard-Smith, 2014).

Zahra Hasan, en un estudio en Karachi, Pakistán, evaluó el rendimiento de la prueba en muestras de heces,
lo cual arrojo resultados considerables con una sensibilidad del 81,8% y especificidad de 94.7%, mejorando
el diagnóstico microbiológico y la confirmación de tuberculosis en heces, ya que estas muestras, son fáciles
A de obtener y no es un método invasivo. (Hasan, 2017).
VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LAS TÉCNICAS.
TECNICA VENTAJAS DESVENTAJAS
 Altamente  Necesita gran.
reproducible cantidad de ADN. TECNICA VENTAJAS DESVENTAJAS
 No requieren  Costosa .
 Mas especifica  respecto a
información acerca  requieren tiempo y que los XPERT/RIF
de la secuencia de uso de sondas
ADN. radioactivas.
spoligotyping demora 3 dias en
RFLP
 Proporciona  No necesita emitir un
MIRU/VNTR purificacion del resultado
marcadores
codominantes. ADN
   

 Alta sensibilidad  Costosa

 Reproducible  Bajo poder
 Requieren poca discriminatorio
y especificidad  Poca
cantidad de ADN  Diagnostico accesibilidad
SPOLIGOTYPING  Resultados en poco rapido
tiempo.  No son
  necesarias las
medidas
 No requiren  Diseño complicado XPERT/RIF especiales de
termocicladores, la de cebadores. bioseguridad
amplificacion se  Disponibilidad  No necesita
puede lograr con restringida de equipos
baño maria. equipos y reactivos. especializados
LAMP  Los resultados Se  
pueden apreciar a
simple vista.
 
 CONCLUSIÓN.

A pesar de los avances de la biología molecular, las pruebas tradicionales siguen siendo utilizadas en el
diagnóstico de MTB, ya que existen laboratorios de bajo nivel, que no tienen capacidad de adquirir estos
nuevos métodos. Estas técnicas moleculares, presentan una alta sensibilidad en el diagnóstico, que las hace
eficientes y confiables, además de que determina en poco tiempo un resultado oportuno. Sin embargo, estas
técnicas presentan limitaciones o desventajas que van a variar según el método utilizado; actualmente la
técnica gold standar es MIRU-VNTR, que es un método que permite clasificar a una cepa; aunque a partir
del año 2010 la OMS recomendó el empleo de XPERT MTB/RIF, ya que detecta a M. tuberculosis y la
resistencia de ésta a la rifampicia, además el diagnóstico es mucho más rápido con un plazo menor a una
hora.