Métodos de cultivo

Técnicas de aislamiento Mantenimiento y

preservación de cultivos puros
 El cultivo puro representa las condiciones artificiales
para el desarrollo de las bacterias y otros
microorganismos y las condiciones impuestas a los
microorganismos mediante el manejo del
laboratorio.

 Para determinar las características de especies

concretas de microorganismos, es imperativo que el
organismo se aislé y se desarrolle en el laboratorio
como un cultivo libre de otras especies.
 ¿Qué condiciones requiere el crecimiento microbiano?
medio de cultivo: Una solución acuosa con los nutrientes y factores de
crecimiento necesarios.

Los μorganismos crecen en un

medio de cultivo artificial se
requieren condiciones como:
temperatura,
grado de humedad y
presión de oxígeno
asi como un grado correcto
de acidez o alcalinidad

.
CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Según su estado físico
Líquidos
Usualmente se denominan caldos ya que contienen los nutrientes
disueltos en agua. Permiten obtener suspensiones con un elevado
número de microorganismos. Ej. Caldo nutritivo.
Sólidos
Se pueden preparar a partir de medios líquidos a los cuales se les
añaden agentes solidificantes como agar, gelatina o sílica gel. Se
utilizan con frecuencia en el aislamiento y mantenimiento de los
microorganismos en el laboratorio. Ej. Agar nutritivo.
• Según la naturaleza de sus constituyentes

• Medios naturales o complejos (Indefinidos)

• Están constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal y
usualmente se complementan con el añadido de minerales y otras
sustancias. No se conocen todos los componentes del medio de cultivo, ni
las cantidades exactas en que están presentes.
• Ej. Extracto de carne,
• extracto de levaduras.

• Medios sintéticos (químicamente definidos)

• Se preparan a partir de ingredientes químicamente puros y por lo tanto,
• Se puede conocer exactamente su composición cuali y cuantitativa.
• Por su costo sólo se emplean en procedimientos especiales.
E. coli

Medio definido Medio Complejo

K2HPO4 7g Glucosa 15 g
KH2PO4 2g Extracto de levadura 5g
(NH4)2SO4 1g Peptona 5g
MgSO4 0.1 g K2HPO4 2g
CaCl2 0.02 g Agua destilada 1000 ml
Glucosa 4-10 g pH 7
Elementos traza (Fe, Co, 2-10 µg
Mn, Zn, Cu, Ni, Mo)
Agua destilada 1000 ml
pH 7
• 3. Según sus propósitos de uso

Medios de enriquecimiento
• Al cultivo en medio líquido que resulte en un incremento en
el número de un tipo dado de μorganismo en relación con el
número de otros tipos de μorganismos que puedan estar en
el inoculo.

• Puede contener sustancias que favorezcan el crecimiento del

μorganismo que nos interesa o que inhiban el crecimiento de
los otros tipos de microorganismos presentes.

• La selectividad de un cultivo de enriquecimiento no está

determinada únicamente por la composición química, sino
que puede ser variada significativamente modificando otros
factores tales como: temperatura, pH, fuerza iónica,
iluminación, aireación etc.
 Ej. Caldo tetrationato utilizado para el enriquecimiento
de las especies del género Salmonella provenientes de
muestras de heces, orina, agua o alimentos

• Adición de sangre, suero o extracto de tejidos de animales y plantas.

Medios selectivos
• Se diferencian de los enriquecidos por ser medios sólidos y están
diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos.

• Ej. CO2 como fuente de carbono es selectivo para autótrofos, la

adición de cristal violeta se inhibe el crecimiento de los Gram+,
utilizando maltosa como única fuente solo crecerán los que usen
maltosa.
Medios diferenciales
• Son aquellos destinados a facilitar la discriminación
de microorganismos de una mezcla por sus
propiedades diferenciales de crecimiento en dichos
medios.

• contienen indicadores de productos derivados de la

actividad metabólica de los μorganismos sobre
algunos de los componentes del medio.

Ej.: Agar base rojo fenol utilizado para detectar

fermentación de carbohidratos.
 Agente Azúcar Sistema
Medio de cultivo Tipo de medio
bacteriostático fermentable Indicador
ALRF (agar diferencial (no
----- lactosa rojo fenol
lactosa rojo fenol) selectivo)
bromuro de
Agar Cetrimide selectivo cetiltrimetil ------- --------
amonio
Agar Mac selectivo y cristal violeta,
lactosa rojo neutro
Conkey diferencial sales biliares
SS agar
selectivo y verde brillante, rojo neutro,
(Salmonella lactosa
diferencial sales biliares citrato férrico
Shigella)
VRBA (violeta selectivo y cristal violeta,
lactosa rojo neutro
rojo bilis agar) diferencial sales biliares
Manitol Salt Agar selectivo y
cloruro de sodio manitol rojo fenol
(Chapman) diferencial
EMB agar (eosin selectivo y eosina y azul de eosina y azul de
lactosa
methylen blue) diferencial metileno metileno
rojo fenol, citrato
XLD agar (xilosa lactosa,
selectivo y desoxicolato de férrico amónico y
lisina xilosa,
diferencial sodio tiosulfato de
desoxicolato) sacarosa
sodio
indicador de
BiS agar (bismuto selectivo y verde brillante,
glucosa sulfito de Bi y
sulfito) diferencial sulfito de bismuto
sulfato ferroso
selectivo y Cloruro de litio y yema de huevo,
Baird Parker agar ------
diferencial telurito de potasio telurito de potasio
enriquecimiento
TSB + 10% NaCl cloruro de sodio ------ -------
selectivo
Caldo enriquecimiento Tetrationato, sales
------ ------
Tetrationato selectivo biliares
CLBVB (caldo
enriquecimiento verde brillante,
lactosa bilis verde lactosa producción de gas
selectivo sales biliares
brillante)
• Medios de mantenimiento
Suelen ser distintos a los de crecimiento óptimo ya
que el crecimiento y prolífico suele ocasionar la
muerte rápida de las células.

Ej. Añadir glucosa y utilizarla los microorganismos

producen ácidos, acidificándose el medio por lo
que es preferible no utilizar glucosa en los
medios de mantenimiento
 Importancia del cultivo de microorganismos:
•Obtención de cultivos puros.
•Análisis morfológico, fisiológico, genético y otras
características.
•Producción.
•Conteo de colonias (UFC)

• Métodos especiales de cultivo

Siembra en superficie sobre medio sólido
Siembra en profundidad (vertido en placa)
Dilución y solidificación en tubo
Cultivo en células vivas
Cultivo en animales Mycobacterium leprae
 Siembra por estrías

Dilución en serie
Técnica de las diluciones en serie

Dilución Tipo de microorganismo

10-1 a 10-3 Hongos

10-4 a 10-6 Levaduras

10-7 a 10-10 Bacterias

 Para el aislamiento de microorganismos se puede

aplicar la técnica de aislamiento por estría o por
extensión en superficie (se trasfiere de 0.1 a 0.5
ml.)
 Mantenimiento y preservación de cultivos puros.

- Resiembra periódica en medios frescos.

 Depende de el medio de cultivo
 Temperatura propia para mantener los cultivos
 El tiempo de resiembra.

- Preservación de cultivos con una capa de aceite

mineral.
 Para cultivos en agar inclinado el aceite deberá cubrir mas o menos
1.5 cm. Del pico de flauta del agar inclinado.
Mantenimiento y preservació n de cultivos puros.

- Liofilización. Proceso utilizado para la eliminación de agua,

mediante desecación al vacío y a muy bajas temperaturas.

- Almacenamiento a temperaturas muy bajas en presencia de

agentes estabilizantes como glicerol, dimetilsulfóxido,
nitrógeno líquido
(-196ºC)
 CONTROL
MICROBIANO
MÉ TODOS DE CONTROL
Son técnicas para destruir microorganismos y se dirige hacia la
destrucción completa de cualquier área donde puedan hacer daño.

MÉTODOS FÍSICOS
Y
MÉTODOS QUÍMICOS
ESTERILIZACIÓ N MEDIANTE PRINCIPIOS FÍSICOS

• TEMPERATURA: Influyen directamente sobre el metabolismo celular, las

proteínas se desnaturalizan al romperse los enlaces de H y S en sus
estructuras secundarias y terciarias, bajo estas circunstancias se pierden
las actividades funcionales de dichas proteínas como la funcionalidad
enzimática .

Mesofílicas: 25ºC – 37ºC

Psicrofílicas: 4ºC – 10ºC
Termofílicas: 80ºC

Clostridium botulinum

endosporas
Clostridium tetani
La aplicació n de calor representa uno de los mecanismos má s
importantes para producir esterilidad.

El ambiente es un factor importante para la destrucció n de

μorganismos, el calor debe alcanzar al μorganismos.

• Calor Húmedo: 1.- Desnaturalización de proteínas

2.- Oxidación de proteínas
• Calor Seco: 1.- desnaturalización de proteínas
2.- Daño oxidativo
3.- Efecto tóxico por alta
concentración de electrolitos.
Efecto del calor

• Daño en el inicio de la síntesis de proteínas.

• Salida de aa y de iones K+
• Autodegradación de ácidos nucleicos
• Daño en la membrana celular afectando el paso
de solutos al interior y la salida de estos.
• Daño en la respiración, el mecanismo reside en
la membrana.
Métodos por CALOR SECO:
• estufas de aire caliente. Estas constan de una doble
cámara, el aire caliente generado por una resistencia
eléctrica circula por la cavidad principal y por el
espacio entre ambas cámaras, a temperaturas
variables, entre 180ºC – 250ºC, ciclos de 1-2 h.
• Indicador Biológico: B. Subtilis var. Niger

• Tipo de material:
• Instrumental quirúrgico (metálico)
• Material de vidrio, porcelana y metal
• Polvos termoestables
• Grasas, aceites, parafinas, ceras....
 Llama directa
• Consiste en colocar el material directamente al fuego hasta que
éste se ponga al rojo vivo. De esta forma se queman los
contaminantes hasta reducirlos a cenizas.
• microbiología para esterilizar el asa
• con la llama del mechero.
.
 • Incineración
El material a esterilizar se coloca en cámaras especiales que alcanzan
elevadas temperaturas. Con este método se queman los contaminantes
hasta reducirlos a cenizas.
Es una forma efectiva de esterilizar el material contaminado a descartar tales
como
bolsas, papel, uniformes desechables, cadáveres de animales,
CALOR HÚ MEDO
• – Elementos autoclave El vapor bajo presión es el
agente de esterilización más eficiente confinamiento
de vapor en un recipiente cerrado, la presión se eleva
y la temperatura aumenta en forma correspondiente.
Con una presión de 1.05 Kg/cm3, la temepartura del
vapor alcanza 121ºC, con una atmósfera libre de aire.

• Elementos del autoclave:

• Sistemas control de presión y válvulas
seguridad
• Llave de purga para eliminar el aire
Indicador Biológico:
Bacillus sterothermophillus
Ventajas
• Rápido calentamiento y penetración
• Destrucción de bacterias y esporas en corto tiempo
• No deja residuos tóxicos
• Hay un bajo deterioro del material expuesto
• Económico
 Desventajas
• No permite esterilizar soluciones que formen
emulsiones con el agua
• Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metálicos
• Agua en ebullición.
• El efecto letal aumentará si se le adiciona carbonato de sodio al 2%
o detergentes, las esporas que son resistentes al agua en ebullición
x + de 2 h, pueden morir a 98ºC en 10 a 30 min. En sol. De
carbonato de sodio al 2%.
PASTEURIZACIÓ N
• Pasteurización Lenta: 62.9ºC por 30 min., seguido de
un enfriamiento rápido a 4ºC.

• Pasteurización Rápida: 71.6ºC – 80ºC durante 15

segundos y rápidamente refrigerarla.

• Ultrapasteurización: 100 ºC durante fracciones de

segundos procediendo a la inmediata refrigeración.

• Principales μorganismos patógenos que provocan

tuberculosis, brucelosis, fiebre de tifoidea, difteria,
escarlatina y la fiebre Q, como la mayor parte de los
μorganismos que provocan que la leche se agrie.
 Tyndalización:
• Esterilización por acción discontinua del vapor de agua, se basa en el
principio de Tyndall.

• Las bacterias que resisten una sesión de calefacción, hecha en

determinadas condiciones, pueden ser destruidas cuando la misma
operación se repite con intervalos separados y en varias sesiones.

Se efectúa por medio del autoclave de Chamberland, dejando abierta

la válvula de escape, o sea funcionando a la presión normal. Puede
también realizarse a temperaturas más bajas, 56º u 80º para evitar la
descomposición de las sustancias a esterilizar, por las temperaturas
elevadas.
FILTRACIÓ N
• Este procedimiento es aplicable a la esterilización de líquidos
y gases, especialmente los primeros. Cuando el líquido a
filtrar no puede resistir, sin descomponerse , la acción del
calor, se aplica la técnica de filtración, la que puede
efectuarse mediante presión o aspiración.

• filtros de porcelana "de Chamberland" y los de tierras

infusorias calcinadas "Berkefield"
• Esponjas de asbesto “filtros de Sietz”
• Membrana de ester de celulosa de 8 – 0.25 μ
• Ej. Vacunas, cuantificación bacterias en agua y aire, separar
toxinas de las bacterias, antibióticos, proteínas, cateter,
RADIACIÓ N

Como la transmisión de energía a través del espacio.

• Radiaciones ionizantes: ( rayos x, rayos gamma y rayos

catódicos) y rayos ultravioleta,
Ej. Artículos farmacéuticos, plásticos como cajas de petri,
jeringas, catéteres.
Rayos x para preservar frutas, vegetales y carne de cerdo.

• Luz ultravioleta, longitud de onda corta cubre un espectro

que va desde una manera parcial visible hasta una totalmente
obscura, longitud de onda desde 390 a 40 nm, con un efecto
letal máximo a 260 nm
MÉ TODOS QUÍMICOS
AGENTES QUÍMICOS

• Son agentes que matan o inhiben el crecimiento de los

μorganismos.

• Antiséptico
• Desinfectante
• Conservadores
ANTISÉ PTICO

• Agentes microbicidas que pueden aplicarse sobre la piel y

mucosas, pero no pueden usarse internamente.
Desinfectantes

• Agentes que matan μorganismos pero no necesariamente sus

esporas y no deben aplicarse sobre tejidos sino sobre objetos
inanimados como mesas, pisos, utensilios, etc.
Ejemplos: cloro, hipoclorito, compuestos clorados, soda, sulfato de
cobre, compuestos de amonio cuaternario, etc.
Conservadores

• Agentes usados frecuentemente en alimentos pero también

en productos farmacéuticos para inhibir el crecimiento de
μorganismos Por consiguiente al ser ingeridos no deben ser
tóxicos.

Ej: propionato de calcio, benzoato de sodio, formaldehído,

nitrato, dióxido de azufre.
Etanol (50-70%)Desnaturaliza proteínas y solubiliza
lípidos 
 
Isopropanol (50-70%) Desnaturaliza proteínas y
solubiliza lípidos 

Formaldehído (8%) Reacciona con grupos-NH2, -SH y

-COOH Desinfectante, mata endosporas

Cloro (Cl2) gas .Forma ácido hipocloroso (HClO), un

fuerte agente oxidante Desinfección en general y en
particular para agua potable

Detergentes (ej. amonios cuaternarios). Ruptura de

membranas celulares Desinfectantes y antiséptico de
piel 
 Conservadores

• Ácido propionico y propionatos0,32% Agente antifúngico en panes,

quesos
• Acido sórbico y sorbatos0,2% Agente antifúngico en quesos,
mermeladas, jugos
• Acido benzoico y benzoatos 0,1% Agente antifúngico en margarina,
sidra, bebidas gaseosas.
• Acido láctico variable Agente antimicrobiano en queso, manteca,
yogur.
• Dióxido de azufre, sulfitos 200-300 ppm Agente antimicrobiano en
frutas secas, uvas.
• Nitrito de sodio 200 ppm Agente antimicrobiano en alimentos
curados, pescado
• Cloruro de sodio variable Previene el deterioro microbiano en carnes,
pescado, etc.
• Azúcar variable Previene el deterioro microbiano en mermeladas,
jugos, jaleas, etc.
Agentes bioló gicos
• son sustancias sintéticas, semisintéticas o producidas por
μorganismos capaces de matar o inhibir el desarrollo de otros
μorganismos.
• Los agentes antivirales, antibacterianos y antifúngicos,  se definen
como aquellos agentes biológicos capaces de inactivar virus,
bacterias y hongos, respectivamente.
• pueden variar según la toxicidad selectiva que
presenten, los antibióticos no actúan de manera
similar en todos los tipos celulares -por el contrario-
presentan una toxicidad selectiva y según se trate de
una agente antifúngico o uno antibacteriano,
inactivará células fúngicas o bacterianas.

• Para el control de las enfermedades infecciosas en

plantas, animales y humanos es  indispensable el uso
de antibióticos con la capacidad para inhibir las
bacterias u otros m.o. sin causar daño al huésped.
Mecanismos de acció n
• 1- Inhibición de la síntesis de peptidoglicano
• a- Antibióticos beta-lactámicos naturales y semisintéticos (penicilinas,
cefalosporinas, carbapenems, monobactam)
• b- Vancomicina (natural)
• c- Bacitracina (natural)
• 2- Alteración de la membrana citoplasmática
• a- Polimixina B (natural)
b- Anfotericina B (natural)
c- Nistatina (natural)
d- Imidazoles (natural)
• 3- Inhibición de la síntesis proteica
• Bloqueo de la transcripción (prevención de la síntesis de ARN)
• a- Rifampicina (natural)
  b- Etambutol (no natural)
• Bloqueo de la traducción (alteración de ribosomas bacterianos)
•   a- aminoglicósidos (natural)
  b- tetraciclinas (natural)
  c- Lincosamina y clindamicina (natural)
  d- macrólidos (naturales y semisíntéticos)
• 4- Interferencia con la síntesis de ADN
• a- Fluoroquinolonas (no natural, Ej: ciprofloxacina)
b- Sulfonamidas y trimetroprim (no naturales)
Gracias…………..