S.E.P.

Tecnológico Nacional de México

Instituto Tecnológico de Tuxtepec
MAESTRÍA EN CIENCIAS EN ALIMENTOS

ESPECTROFOTOMETRÍA
ULTRAVIOLETA Y VISIBLE
ANÁLISIS DE LOS ALIMENTOS
Presenta:
Alma Angelina Lerdo Reyes

Catedrático:
TUXTEPEC, OAX. Dra. Ivet Gallegos Marín Abril 2019
Espectrofotometría ultravioleta-visible

La espectroscopia ultravioleta-visible (UV/VIS) es una

espectroscopia de emisión de fotones y una
espectrofotometría. Utiliza radiación electromagnética (luz)
de las regiones visible, ultravioleta cercana (UV) e infrarroja
cercana (NIR) del espectro electromagnético, es decir, una
longitud de onda entre 380nm y 780nm.
 Espectro visible
Se llama espectro visible a la región del espectro electromagnético que el ojo humano
es capaz de percibir. A la radiación electromagnética en este rango de longitudes de
onda se le llama luz visible o simplemente luz. No hay límites exactos en el espectro
visible: el ojo humano típico responderá a longitudes de onda de 390 a 750 nm, aunque
algunas personas pueden ser capaces de percibir longitudes de onda desde 380 hasta
780 nm. Los arcoíris son un ejemplo de refracción del espectro visible.
Radiación ultravioleta

Se denomina radiación UV a la radiación electromagnética cuya

longitud de onda está comprendida aproximadamente entre los
400 nm (4x10−7 m) y los 15 nm (1,5x10−8 m). Su nombre
proviene de que su rango empieza desde longitudes de onda
más cortas de lo que los humanos identificamos como el color
violeta, pero dicha luz o longitud de onda, es invisible al ojo
humano al estar por encima del espectro visible.
Características de las especies absorbentes de UV-Vis

La absorbancia de la radiación UV-Vis está

asociada con excitaciones electrónicas dentro de
átomos y moléculas. Los métodos analíticos más
comunes basados en la espectroscopia UV-Vis no
utilizan radiación UV por debajo de 200 nm.

Por lo tanto, en el punto de interes en la espectroscopia UV-Vis tradicional son el

resultado de la presencia de electrones no unidos en las moléculas absorbentes.
 Bases de la espectrofotometría de absorción cuantitativa

La espectrofotometría utiliza el
espectrofotómetro, que es un instrumento
que permite comparar la radiación
absorbida o transmitida por una solución
que contiene una cantidad desconocida
de soluto, y una que contiene una
cantidad conocida de la misma sustancia.
 OBJETIVO Se basa en la medición
Determinar la de la cantidad de luz
concentración de absorbida por un haz
analito en una solución de referencia a medida
de muestra dada. que pasa a través de la
solución de muestra.

¿Qué pasa con los analitos que no

absorben radiación en el rango UV-
Vis
El analito puede absorber naturalmente la
radiación en el rango UV-Vis, de modo que
la naturaleza química del analito no se
modifique durante el análisis.

Los analitos que no absorben radiación en

el rango UV-Vis se modifican
químicamente durante el análisis,
convirtiéndolos en una especie que
absorbe radiación de la longitud de onda
apropiada.
 La disminución en el poder radiante a medida que el haz pasa a través de la
solución se debe a la captura (absorción) de Fotones por las especies absorbentes.

La transmitancia (T) de una solución se define como la relación de P a P0 como se

indica en la ecuación 1:
T = P/P0
La transmitancia también se puede expresar como un porcentaje como se indica en
la ecuación 2:

%T = (P/P0) × 100
dónde:
T = transmitancia
P0 = potencia radiante del haz incidente en la celda de absorción
P = potencia radiante del haz que sale de la celda de absorción
% T = porcentaje de transmitancia
Los términos T y% T son intuitivamente atractivos, ya que expresan la fracción de
la luz incidente absorbida por la solución. Sin embargo, T y% T no son
directamente proporcionales a la concentración del analito absorbente en la
solución de la muestra.
Un segundo término usado para describir la relación entre P y P0 es absorbancia (A). La
absorbancia se define con respecto a T como se muestra en la ecuación [3].

A = log(P0/P) = −log T = 2 − log %T

dónde:
A = absorbancia
T y% T = como en las ecuaciones [1] y [2],
respectivamente
La absorbancia es una expresión conveniente ya que, bajo condiciones apropiadas, es
directamente proporcional a la concentración de la especie absorbente en la solución.

En la espectroscopia cuantitativa, la fracción del haz incidente que no se transmite no es

igual a la absorbancia de la solución (A).

La relación entre la absorbancia de una solución y la concentración de la especie

absorbente se conoce como ley de Beer (Ecuación [4]).

A = abc
dónde:
A = absorbancia
c = concentración de especies absorbentes
b = longitud del camino a través de la solución (cm)
a = absortividad
La absortividad, a, de una especie dada es una constante de
proporcionalidad que depende de las propiedades moleculares de la
especie.

La capacidad de absorción depende de la longitud de onda y puede variar

según el entorno químico (pH, fuerza iónica, disolvente, etc.) que
experimenta la especie absorbente.

En el caso especial donde la concentración del analito se reporta en

unidades de molaridad, el término de absortividad tiene unidades de
(cm)−1 (M)−1. En estas condiciones, se designa con el símbolo ε, que se
conoce como la absortividad molar.
 Ley de Beer

Ley de Beer declara que la cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende de la
concentración en la solución.

la ley de Beer se aplica solo a soluciones diluidas, hasta aproximadamente 10 mM

para la mayoría de los analitos. La concentración real a la cual la ley se vuelve
limitante dependerá de la química del analito.

A medida que aumentan las concentraciones de analito, las distancias

intermoleculares en una solución de muestra dada disminuirán, llegando a un punto
en el que las moléculas vecinas afectarán mutuamente la distribución de carga de la
otra.
La ley de Beer se aplica estrictamente a situaciones en las que la radiación que pasa a
través de la muestra es monocromática, ya que en estas condiciones, un solo valor de
absorbeancia describe la interacción del analito con toda la radiación que pasa a
través de la muestra.

Si se alcanzará un valor de absorbancia limitante como P0 > P, que se producirá en

concentraciones relativamente altas del analito.

A = log(P0 + Ps)/(P + Ps)

dónde:
Ps = poder radiante de la luz dispersa
A = como en la ecuación [3]
P y P0 = como en la ecuación [1]
La ley de Beer expresada en términos de la absortividad molar se da en la
Ecuación [5]. En este caso, c se refiere específicamente a la concentración
molar del analito.

A = εbc [5]

donde:
A y b = como en la ecuación [4]
ε = absortividad molar
c = concentración en unidades de
molaridad
 Una celda de referencia es una que, en
teoría, coincide exactamente con la celda
de absorción de muestras, con la
excepción de que no contiene analito.

Se prepara agregando agua destilada a

una celda de absorción.

Factores que contribuyen a Esta celda de referencia se coloca luego

la atenuación de un haz de
radiación cuando pasa a
en la trayectoria del haz de luz, y la
través de una cubeta que potencia de la radiación que sale de la
contiene una solución celda de referencia se mide y se toma
absorbente. como P0 para la celda de muestra.
Este procedimiento asume que todos los procesos, excepto la absorción selectiva de
radiación por el analito, son equivalentes para la muestra y las células de
referencia.
La absorbancia realmente medida en el laboratorio se aproxima a la ecuación
[5].
A = log(Psolvent/Panalyte solution) ∼ = log(P0/P) [5]

donde:
Psolvent = potencia radiante de la celda que sale del haz
que contiene solvente (blanco)
Solución de Panalyte = potencia radiante de la celda que sale del haz que contiene
solución de analito
P0 y P = como en la ecuación [1]
A = como en la ecuación [3]
 CONSIDERACIONES DE PROCEDIMIENTO
PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIÓN DE REFERENCIA
MUESTRAS

Homogeinización Solvente de muestra el

Clarificación (agua)

SITUACIONES COMPLEJAS
El analito puede necesitar
modificado químicamente
Ayudará a corregir cualquier
absorbancia debida a los propios
ser reactivos modificadores y no al
analito modificado.
 CELDAS

Debe estar compuesta de un material que no absorba

la radiación en la región espectral que se está
utilizando.

UV: cuarzo o sílice fundida.

Vis: vidrio de silicato, plástico

Dimensiones de la celda
Serán importantes con respecto a la cantidad de
solución requerida para una medición y con respecto
al término de la longitud utilizado en la ley de Beer.
1 cm2 y aproximadamente 4.5 cm de largo
SELECCIÓN DE LA LONGITUD DE ONDA

Es mejor elegir la longitud de onda en la

que el analito demuestra la absorbancia
máxima y donde la absorbancia no cambia
rápidamente con los cambios en la longitud
de onda

VENTAJAS
(1) Sensibilidad máxima,
(2) Mayor adherencia a la ley de Beer
 CURVAS DE CALIBRACIÓN

Se utilizan para medir cuantitativamente

Establecer la relación entre la concentración de
analitos y la absorbancia.

Lineales: para aquellos sistemas que

obedecen la ley de Beer.

No lineal: Pueden deberse a cambios

dependientes de la concentración en la
química del sistema o debido a las
limitaciones inherentes a los instrumentos
utilizados para el ensayo
 Instrumentación

Las fuentes de luz

Son utilizadas en los espectrofotómetros deben emitir continuamente una fuerte
banda de radiación que abarca todo el rango de longitud de onda para el que está
diseñado el instrumento.
Monocromador
El componente que funciona para aislar el grupo específico, estrecho y continuo de
longitudes de onda que se utilizará en el ensayo espectroscópico es el monocromador.
El monocromador se llama así porque la luz de una sola longitud de onda se
denomina monocromática.
Detector
En una medición espectroscópica, la luz transmitida a través de la celda de referencia o
muestra se cuantifica por medio de un detector. El detector está diseñado para producir
una señal eléctrica cuando es golpeado por fotones.
Dispositivo de lectura
La señal del detector generalmente se amplifica y luego se muestra al analista de forma
utilizable. La forma final en la que se muestra la señal dependerá de la complejidad del
sistema.

Señal análoga Señal digital

Medidor analógico a través Expresan la señal como números.

de la posición de una aguja
en una cara del medidor
calibrada en porcentaje de
transmitancia o absorbancia.
El procesador de señales es capaz de
presentar la lectura final en términos de
absorbancia o transmitancia.
Las lecturas de algunos espectrofotómetros
pueden estar en unidades de concentración