ANLISIS Y CUANTIFICACIN DE AMINOCIDOS

Reaccin de la ninhidrina
(espectrofotomtrica)
Cromatografa de
intercambio catinico

Actualmente: HPLC

Reaccin con o-ftalaldehdo

(Fluorimtrica)

Cromatografa en capa fina (aminocidos)

PURIFICACIN Y AISLAMIENTO DE PROTENAS

Suspensin de
Clulas tejidos: Ultrasonidos
Detergente
mbolo rotatorio (potter aspas)

Homogenado

FRACCIONAMIENTO DEL HOMOGENADO CELULAR

CENTRIFUGACIN DIFERENCIAL
Centrifugacin a
baja velocidad
1000g, 10 min

Homogenado
celular

SOBRENADANTE
1

SOBRENADANTE
2

SOBRENADANTE
3

Velocidad
media
20000g, 20min

Velocidad alta
80000g, 1h

Velocidad
muy alta
150000g, 1h

PRECIPITADO 1
Clulas enteras,
ncleos,
citoesqueleto

PRECIPITADO 2
mitocondrias,
lisosomas,
peroxisomas

PRECIPITADO 3
Microsomas,
otras vesculas
pequeas

PRECIPITADO 4
Ribosomas,virus
macromolculas

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CENTRIFUGACIN ISOPCNICA

Centrifugacin

Muestra
Gradiente de
sacarosa
Componente
menos denso

Fraccionamiento

Componente
mas denso

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SEPARACIN Y PURIFICACIN DE PROTENAS

Se basa en la diferente:
Solubilidad
Tamao
Carga elctrica
Densidad
Afinidad por otras molculas

SEPARACIN DE PROTENAS
CROMATOGRAFA EN COLUMNA
Las diferentes protenas se retrasan segn sus interacciones con la
matriz, de acuerdo a su carga, hidrofobicidad, tamao o unin a
El solvente se aplica
grupos qumicos
Muestra contnuamente a la
aplicada boca de la columna

Matriz
slida

Molculas fraccionadas
eludas y recogidas

Tapn
poroso
Tubo de
ensayo

tiempo
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TRES CLASES DE CROMATOGRAFA EN COLUMNA

A) Intercambio inico:
en base a la carga
Depende del pH y
de la fuerza inica

Flujo de solvente

C) de Afinidad:

B) Filtracin en gel:
en base al tamao

Flujo de solvente

Flujo de solvente

Partcula cargada
positivamente
Partculas porosas
Molcula cargada
negativamente
unida
Molcula cargada
positivamente
libre

Molcula pequea
retrasada
Molcula grande
no retrasada

Partcula con
sustrato unido
covalentemente
Molcula de
enzima unida
Otras protenas
pasan de largo

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A: CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO

(Ej: intercambio catinico)
Las protenas se separan segn
su carga a un pH determinado

B: CROMATOGRAFA DE FILTRACIN O EXCLUSIN

MOLECULAR
Las protenas se separan
segn su tamao

C: CROMATOGRAFA DE AFINIDAD
Las protenas se separan en funcin de la
especificidad de unin a un ligando. En este ejemplo
el ligando es la glucosa y se separan aquellas
protenas que se unen a ella. Las protenas de inters
se eluyen aadiendo un exceso de ligando libre.

ELECTROFORESIS EN ACETATO DE CELULOSA

ELECTROFORESIS EN GEL
ELECTROFORESIS EN GEL:
Tras aplicar un campo elctrico las
protenas migran en funcin del
tamao y de la carga

Electroforesis en SDS-PAGE

(solubiliza
protenas)

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Ejemplo de anlisis de protenas por SDS-PAGE en cada paso

de una purificacin. En el ltimo paso hay una nica banda, lo
que indica que tenemos la protena de inters completamente
purificada

ISOELECTROENFOQUE
Es un tipo de electroforesis en gel con anfolitos que crean un
gradiente de pH. Cada protena migra hasta su punto
isoelctrico.

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Ejemplo de SDS-PAGE teido con azul de Coomassie

r
do
a
c
ar
M

PM
e
d

r
do
a
c
ar
M

PM
e
d

GELES
BIDIMENSIONALES (2D)
Primero isoelectroenfoque y
luego SDS-PAGE

Ejemplo de gel bidimensional

SEPARACIN Y PURIFICACIN DE PROTENAS

Se basa en la diferente:
Solubilidad
Tamao
Carga elctrica
Densidad (centrifugacin)
Afinidad por otras molculas

FRACCIONAMIENTO POR DISMINUCIN DE LA SOLUBILIDAD

(p.e. sulfato de amonio)

(Voet)

(Voet)